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Neuroscience

Um modelo para o tratamento da encefalomiossinangiose após acidente vascular cerebral induzido pela oclusão da artéria cerebral média em camundongos

Published: June 22, 2022 doi: 10.3791/63951
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 1
1Department of Neuroscience, UConn School of Medicine, 2Division of Neurosurgery, UConn School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

O protocolo tem como objetivo fornecer métodos para encefalomiossinangiose - enxerto de um retalho vascular do músculo temporal na superfície pial do tecido cerebral isquêmico - para o tratamento de acidente vascular cerebral isquêmico agudo não-moyamoya. A eficácia da abordagem no aumento da angiogênese é avaliada usando um modelo transitório de oclusão da artéria cerebral média em camundongos.

Abstract

Não há tratamento eficaz disponível para a maioria dos pacientes que sofrem de acidente vascular cerebral isquêmico, tornando imperativo o desenvolvimento de novas terapêuticas. A capacidade do cérebro de se auto-curar após o acidente vascular cerebral isquêmico é limitada pelo suprimento inadequado de sangue na área afetada. A encefalomiossinangiose (EMS) é um procedimento neurocirúrgico que atinge a angiogênese em pacientes com doença de moyamoya. Envolve craniotomia com colocação de um enxerto de músculo temporal vascular na superfície cerebral isquêmica. EMS nunca foi estudado no contexto de acidente vascular cerebral isquêmico agudo em camundongos. A hipótese que conduz este estudo é que o EMS aumenta a angiogênese cerebral na superfície cortical ao redor do enxerto muscular. O protocolo mostrado aqui descreve o procedimento e fornece dados iniciais que apoiam a viabilidade e a eficácia da abordagem EMS. Neste protocolo, após 60 min de oclusão transitória da artéria cerebral média (MCAo), os camundongos foram randomizados para o tratamento com MCAo ou MCAo + EMS. O EMS foi realizado 3-4 h após a oclusão. Os camundongos foram sacrificados 7 ou 21 dias após o tratamento com MCAo ou MCAo + EMS. A viabilidade do enxerto temporal foi medida usando o ensaio de nicotinamida adenina dinucleotídeo redutase reduzida-tetrazólio. Uma matriz de angiogênese de camundongo quantificou a expressão de proteínas angiogênicas e neuromoduladoras. A imuno-histoquímica foi utilizada para visualizar a ligação do enxerto com o córtex cerebral e a alteração na densidade dos vasos. Os dados preliminares aqui apresentados sugerem que o músculo enxertado permaneceu viável 21 dias após a EMS. A imunocoloração mostrou sucesso no implante do enxerto e aumento da densidade dos vasos próximos ao enxerto muscular, indicando aumento da angiogênese. Os dados mostram que o EMS aumenta o fator de crescimento de fibroblastos (FGF) e diminui os níveis de osteopontina após o acidente vascular cerebral. Além disso, a EMS após acidente vascular cerebral não aumentou a mortalidade, sugerindo que o protocolo é seguro e confiável. Este novo procedimento é eficaz e bem tolerado e tem o potencial de fornecer informações de novas intervenções para angiogênese aumentada após acidente vascular cerebral isquêmico agudo.

Introduction

O acidente vascular cerebral isquêmico é uma lesão neurovascular aguda com sequelas crônicas devastadoras. A maioria dos sobreviventes de AVC, 650.000 por ano, nos EUA sofre de incapacidade funcional permanente1. Nenhum dos tratamentos disponíveis confere neuroproteção e recuperação funcional após a fase aguda do AVC isquêmico. Após um acidente vascular cerebral isquêmico agudo, os estoques sanguíneos diretos e colaterais são diminuídos, o que leva à disfunção das células e redes cerebrais, resultando em déficits neurológicos súbitos 2,3. A restauração do suprimento de sangue para a região isquêmica continua sendo o principal objetivo da terapia de AVC. Assim, o aumento da angiogênese para promover o suprimento sanguíneo no território isquêmico é uma abordagem terapêutica promissora; no entanto, métodos previamente estudados para promover a angiogênese pós-AVC, incluindo eritropoietina, estatinas e fatores de crescimento, têm sido limitados por níveis inaceitáveis de toxicidade ou traduzibilidade4.

A encefalomiossinangiose (EMS) é um procedimento cirúrgico que aumenta a angiogênese cerebral em humanos com doença de moyamoya, uma condição de artérias cranianas estreitadas que muitas vezes leva a acidente vascular cerebral. EMS envolve o descolamento parcial de uma seção vascular do músculo temporal do paciente do crânio, seguido de craniotomia e enxerto do músculo no córtex afetado. Esse procedimento é bem tolerado e induz angiogênese cerebral, reduzindo o risco de acidente vascular cerebral isquêmico em pacientes com doença de moyamoya 5,6. Assim, o procedimento serve em grande parte um papel preventivo nesses pacientes. A angiogênese provocada por esse procedimento também pode ter um papel na promoção da proteção e recuperação neurovascular no contexto de acidente vascular cerebral isquêmico. Este relatório apoia a hipótese de que a angiogênese provocada pela EMS tem o potencial de expandir a compreensão e as opções terapêuticas para isquemia cerebral.

Além do EMS, existem várias abordagens farmacológicas e cirúrgicas para melhorar a angiogênese, mas elas têm várias limitações. Abordagens farmacológicas, como a administração de fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), mostraram-se insuficientes ou mesmo prejudiciais devido a diversas limitações, incluindo a formação de plexos vasculares caóticos, desorganizados, com vazamento e primitivos, que se assemelham aos encontrados nos tecidos tumorais 7,8 e não têm efeitos benéficos em ensaios clínicos9.

As abordagens cirúrgicas incluem anastomose direta, como anastomose superficial da artéria temporal média-artéria cerebral, anastomose indireta, como encefalo-duro arterio-synangiose (EDAS), encefalomiossinangiose (EMS) e combinações de anastomose direta e indireta10. Todos esses procedimentos são tecnicamente muito desafiadores e exigentes em pequenos animais, exceto no EMS. Enquanto os outros procedimentos requerem anastomose vascular complexa, o EMS requer um enxerto muscular relativamente simples. Além disso, a proximidade do músculo temporal com o córtex o torna uma escolha natural para o enxerto, pois não precisa ser completamente excisado ou desconectado de seu suprimento sanguíneo, como seria necessário se um músculo mais distante fosse usado para enxerto.

A EMS tem sido estudada em modelos de hipoperfusão cerebral crônica em ratos 7,11. No entanto, o EMS usando um enxerto de músculo temporal nunca foi estudado no acidente vascular cerebral isquêmico agudo em roedores. Aqui, descrevemos um novo protocolo de EMS em camundongos após um acidente vascular cerebral isquêmico via modelo de oclusão da artéria cerebral média (MCAo). Este manuscrito serve como uma descrição de métodos e dados iniciais para esta nova abordagem de EMS em camundongos após MCAo.

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Protocol

Todos os experimentos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da UConn Health e conduzidos de acordo com as diretrizes dos EUA. O protocolo a seguir deve funcionar em qualquer espécie ou cepa de roedor. Aqui, foram utilizados camundongos machos C57BL/6 do tipo selvagem C57BL/6 de 8 a 12 semanas de idade, idade e peso. Os ratos foram alimentados com dieta de ração padrão e água ad libitum. As condições padrão de alojamento foram mantidas a 72,3 °F e 30%-70% de umidade relativa com um ciclo claro/escuro de 12 h.

1. Preparação pré-cirúrgica

  1. Esterilizar todos os instrumentos por autoclave antes da cirurgia. Higienize a superfície de operação com etanol a 70% e aqueça a superfície de operação a 37 °C com uma almofada de aquecimento elétrico.
  2. Use uma câmara de indução para anestesiar o camundongo com isoflurano a 4% a 5% para indução. Administrar 1,5%-2,0% de isoflurano via cone nasal para manutenção até o final da cirurgia. Certifique-se, antes da cirurgia, de que o rato está devidamente anestesiado, avaliando a falta de uma resposta a uma pitada firme do pé traseiro e a perda da reação postural e do reflexo de endireitamento.
  3. Coloque o rato no seu lado esquerdo na superfície de operação e aplique pomada ocular para proteger ambos os olhos.
  4. Raspe o cabelo sobre o campo cirúrgico (ou seja, crânio lateral direito entre o olho e a orelha) com cortadores elétricos. Limpe o campo cirúrgico em círculos concêntricos para fora do meio do local cirúrgico, com etanol a 70% seguido de solução de povidona, e repita esses passos 2x.
    NOTA: Devido ao local da cirurgia estar perto do olho, a remoção de 150% da área ao redor de um local cirúrgico pode não ser possível evitar irritação ou lesão acidental no olho.
  5. Administrar uma dose única de bupivacaína a 0,25% (até 8 mg/kg de peso corporal) por injeção subcutânea como analgesia pré-operatória no local da cirurgia.
  6. Configure um microscópio cirúrgico com ampliação de 4x. O microscópio é usado para todas as etapas cirúrgicas.

2. Procedimento cirúrgico

NOTA: As etapas da cirurgia são apresentadas na Figura 1. Para este protocolo, três camundongos foram alocados no grupo simulado, três camundongos apenas para EMS, 12 camundongos para MCAo e 23 camundongos para o grupo MCAo + EMS.

  1. Cirurgia MCAo
    NOTA: O MCAo é um modelo bem caracterizado de acidente vascular cerebral isquêmico em roedores, conforme descrito por nós e outros12,13,14. As etapas da cirurgia são descritas em resumo aqui. A isquemia cerebral transitória focal foi induzida por um MCAo direito de 60 minutos sob anestesia com isoflurano seguido de reperfusão por 7 ou 21 dias.
    1. Faça uma incisão no pescoço ventral da linha média seguida de MCAo direito unilateral, avançando um monofilamento revestido de borracha de silicone de 6,0 mm de 10-11 mm de comprimento da bifurcação da artéria carótida interna através de um coto externo da artéria carótida. Em camundongos simulados, realizar cirurgias idênticas, exceto para o avanço da sutura na artéria carótida interna.
    2. Meça as temperaturas retais usando um sistema de controle de temperatura, mantendo a temperatura em ~ 37 ° C durante a cirurgia com uma almofada de aquecimento automática.
    3. Utilizar a dopplerfluxometria a laser para medir o fluxo sanguíneo cerebral antes da inserção da sutura, colocando a sonda Doppler contra o crânio lateral (correspondente ao território da ACM) e registrando o valor8. Para confirmar a redução da oclusão para 15% do fluxo sanguíneo cerebral basal, use o mesmo procedimento após o avanço da sutura. Para confirmar a reperfusão, use o mesmo procedimento após a sutura ser removida.
    4. Alimente todos os animais com mosto molhado até o sacrifício e/ou 1 semana após a cirurgia para garantir uma nutrição adequada para desfechos crônicos, pois os animais apresentam déficits de criação após acidente vascular cerebral.
  2. Cirurgia EMS
    1. Após 60 minutos de MCAo, randomize os camundongos em grupos somente MCAo ou MCAo + EMS. Realizar EMS 4 h após MCAo (grupo MCAo + EMS) ou cirurgia simulada para experimentos selecionados (grupo somente EMS). Mude para um novo par de luvas cirúrgicas estéreis antes da cirurgia.
      NOTA: Os camundongos se recuperaram da anestesia após 60 minutos de MCAo e foram reanestesiados antes da cirurgia EMS.
    2. Para grupos que recebem EMS (MCAo + EMS ou grupos somente EMS), faça uma incisão de pele de 10-15 mm com tesoura, estendendo-se de 1-2 mm rostral para a orelha direita para 1-2 mm caudal para o olho direito.
      NOTA: Tesouras estéreis foram usadas para evitar danos acidentais aos músculos temporais por baixo.
    3. Retraia os retalhos cutâneos usando grampos e identifique visualmente o músculo temporal e o crânio.
    4. Disseque sem rodeios o músculo temporal para longe do crânio usando uma tesoura com uma técnica de espalhamento. Realizar uma miotomia de 2-3 mm direcionada ventralmente ao longo da borda caudal do músculo para facilitar a reflexão ventral.
    5. Realize uma craniotomia ~ 5 mm de diâmetro no crânio sob o músculo temporal refletido usando uma microbroca.
    6. Remova a dura-máter com uma pinça para expor a superfície pial do cérebro. Tenha extrema cautela para evitar lesões acidentais no cérebro.
    7. Suture a borda dorsal do músculo temporal para o tecido subcutâneo do retalho cutâneo dorsal com filamentos monocrilos 6-0, tornando-o nivelado ao córtex cerebral exposto.
    8. Feche a incisão da pele com sutura de monofilamento 6-0. Coloque o rato de volta na gaiola e monitorize até à recuperação da anestesia. Devolva o mouse ao seu compartimento.

3. Considerações pós-operatórias

  1. Monitore os ratos para a doença e o local cirúrgico para a infecção diariamente. Dê solução salina normal subcutânea (1% de volume por peso corporal) diariamente para apoiar a hidratação.
  2. Monitore a desidratação grave (perda de peso corporal >20%) até 7 dias após a cirurgia. Administrar um bolus adicional de solução salina normal subcutânea 1% em volume por peso corporal se >20% de perda de peso.
  3. Prossiga com injeções, monitoramento fisiológico e outros testes sem considerações especiais.
    NOTA: Neste procedimento, o uso de opioides ou anti-inflamatórios não esteroidais (AINEs) para o tratamento pós-operatório foi evitado devido aos efeitos conhecidos desses agentes no desfecho do AVC ou no tamanho do infarto em consulta com o comitê institucional interno de cuidados e uso de animais15,16,17,18. No entanto, o uso de analgesia pós-operatória é altamente encorajado para a cirurgia EMS com outros modelos. Consulte o Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) para isso.

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Representative Results

Um total de 41 camundongos foram utilizados para este estudo. Após três mortalidades, uma em MCAo e duas em MCAo + EMS, um total de 38 camundongos foram utilizados para a obtenção dos resultados apresentados.

Estatística
Os dados de cada experimento são apresentados como média ± desvio padrão (S.D.). A significância foi determinada usando o teste t de Student não pareado para comparar dois grupos ou ANOVA one-way para mais de dois grupos, com um teste post-hoc de Newman-Keuls para corrigir comparações múltiplas.

Nicotinamida adenina dinucleotídeo (reduzida)-tetrazólio redutase (NADH-TR) coloração
Essa coloração foi feita para avaliar a viabilidade a longo prazo do músculo enxertado, como em Turoczi et al.19. Resumidamente, no momento do sacrifício, o retalho muscular enxertado foi cuidadosamente extirpado, fixado com paraformaldeído a 4% por 30 min e criopreservado em meio de temperatura ótima de corte (OCT) a -80 °C. Várias criosecções de 12 μm de espessura do tecido muscular temporal foram coradas para reação enzima-histoquímica NADH-TR. As lâminas foram incubadas por 30 min a 37 °C em solução de nitroazul tetrazólio (1,8 mg/dL) e NADH (15 mg/dL) em tampão Tris 0,05 M (pH 7,6). O reagente de tetrazólio não utilizado foi removido usando aumento seguido de diminuição das concentrações de acetona. A avaliação quantitativa do músculo corado com NADH-tetrazólio foi realizada em imagens musculares obtidas com aumento de 40x.

Estudos de imunocoloração
A imunocoloração foi utilizada para visualizar a ligação do enxerto muscular com o córtex e a densidade dos vasos sanguíneos na junção do músculo e do córtex20,21. Para visualização da ligação muscular com o tecido cerebral, ratos que foram submetidos à cirurgia EMS foram usados aqui. Ao final de cada respectivo momento, os camundongos foram anestesiados com injeção de avertina (50 mg/kg de peso corporal), seguida de perfusão com 1x PBS contendo ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) a 5 mM e fixação com paraformaldeído a 4%. O crânio foi cuidadosamente cortado para evitar o descolamento acidental do enxerto de músculo temporal (MT) do córtex cerebral. O enxerto de MT acima do córtex cerebral foi então separado do músculo temporal restante. O cérebro foi cuidadosamente removido e pós-fixado em paraformaldeído a 4% durante a noite. O cérebro fixo foi então desidratado com 30% de sacarose em 1x PBS até que o cérebro afundasse no fundo do frasco para injetáveis (aproximadamente 1-3 dias). Cortes teciduais de 30 μm foram cortados com micrótomo de congelamento e montados em lâminas.

Para a imunocoloração dos vasos sanguíneos no córtex cerebral ipsilateral, os camundongos MCAo e MCAo + EMS foram sacrificados, perfundidos, fixados e processados como acima. Fatias cerebrais de 30 μm de tamanho foram seccionadas em um micrótomo de congelamento e montadas em um lado de vidro. A recuperação do antígeno foi realizada com tampão citrato (pH 6,0) e os cortes foram incubados com tampão bloqueador seguido de incubação durante a noite com anticorpos primários, anti-alfa músculo esquelético actina 1:200 e lectina-Dy59421,22. Três cortes cerebrais coronais por camundongo (n = 5 camundongos/grupo; total = 15 cortes) foram retirados entre 0,45 mm e 0,98 mm do bregma, corados e visualizados para quantificação em 20x de ampliação na junção das regiões do núcleo isquêmico e da penumbra. Um observador cego quantificou a densidade de vasos positivos para lectina no parênquima cerebral usando o software ImageJ.

O enxerto muscular permanece viável aos 21 dias após o EMS
Um pré-requisito para o sucesso desta cirurgia é a viabilidade a longo prazo do músculo temporal enxertado. O enxerto de MT mostrou dano transitório das células musculares aos 7 dias após a cirurgia no músculo enxertado vs. músculo controle (71,32% de sobrevida das células musculares ± 16,64% vs. 97,19% ± 3,81%). No entanto, essa diferença entre o enxertado e o músculo controle desapareceu, e os músculos se recuperaram completamente 21 dias após a cirurgia (98,22% ± 3,965 vs. 96,87% ± 2,27%; Figura 2A).

Enxertos musculares fazem ligações soltas com o tecido cerebral
O enxerto bem-sucedido do músculo temporal na superfície do córtex cerebral é um requisito primordial para o sucesso deste modelo. Tanto no modelo EMS + MCAo quanto no EMS-only, os enxertos de músculo temporal aderiram à superfície cortical 21 dias após o EMS, sugerindo sucesso na cirurgia, implantação do enxerto e ligação (Figura 1B e Figura 2B).

A densidade dos vasos sanguíneos aumenta no córtex perilesional após o EMS
O AVC agudo leva à redução aguda do fluxo sanguíneo cerebral, ao recrutamento impedido de vasos colaterais, ao brotamento vascular anormal e à angiogênese disfuncional, que contribuem para os maus desfechos do AVC23. O EMS aumenta significativamente a área de superfície dos vasos sanguíneos e a densidade integrada no córtex perilesional após acidente vascular cerebral (p < 0,05 vs. apenas MCAo; Figura 3).

Análise de proteínas angiogênicas e neuromoduladoras
Uma matriz de angiogênese em camundongo foi usada para comparar a expressão de proteínas angiogênicas e neuromoduladoras 7 dias e 21 dias após o MCAo em camundongos somente MCAo versus MCAo + EMS, de acordo com as instruções do fabricante24. O software ImageJ foi utilizado para quantificar a densidade de pixels para cada ponto de dados da mancha de pontos de proteína. Os dados foram registrados como a razão entre a densidade de cada proteína analisada e a densidade média dos padrões para cada blot.

O fator de crescimento de fibroblastos (FGF)-ácido é regulado para cima e a osteopontina é regulada negativamente após o EMS
Os resultados do arranjo proteico mostraram um aumento significativo nos níveis proteicos de FGF-ácido (0,677 ± 0,007 vs. 0,585 ± 0,014, p = 0,045), um potente fator angiogênico, e diminuição nos níveis de osteopontina, uma molécula multifuncional expressa em condições inflamatórias (0,692 ± 0,007 vs. 0,758 ± 0,014, p = 0,048) no grupo MCAo + EMS 21 dias após acidente vascular cerebral, sugerindo melhora da angiogênese e neuroproteção (Figura 4A).

Resultados de mortalidade por EMS após acidente vascular cerebral
Tanto o MCAo quanto o EMS são técnicas cirúrgicas invasivas que podem causar alguma mortalidade em camundongos. Neste experimento, houve entre 10% e 11% de mortalidade em camundongos 21 dias após a cirurgia MCAo, que é uma taxa de mortalidade aceita para camundongos submetidos a 60 min de MCAo14. A realização de EMS em camundongos após MCAo não aumentou a mortalidade (Figura 4B), sugerindo tolerância à cirurgia EMS mesmo após MCAo.

Figure 1
Figura 1. Procedimento de EMS stepwise após oclusão da artéria cerebral média (MCAo): (A) Passo 1. Uma incisão na pele é feita sobre o território da artéria cerebral média direita. A pele e os tecidos subcutâneos são refletidos, expondo o crânio e o músculo temporal. Passo 2. O músculo temporal é dissecado para longe do crânio e refletido ventralmente. Passo 3. Uma craniotomia é realizada (4-5 mm) e a dura-máter é suavemente removida. Passo 4. O músculo temporal é colocado diretamente na superfície do cérebro para cobrir o córtex exposto. Passo 5. A borda dorsal do músculo temporal é suturada ao tecido subcutâneo do retalho dorsal da pele, nivelada com a superfície do cérebro. Passo 6. A incisão é fechada e o rato é removido da anestesia e devolvido à sua gaiola. Esta parte do número foi modificada de25. (B) Esquema conceitual para o tratamento da encefalomiossinangiose (EMS) do AVC induzido por MCAo. Abreviaturas: FGF = Fator de crescimento de fibroblastos. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2. Estudos de imunocoloração. (A) Os enxertos de músculo temporal mantêm a viabilidade. Os enxertos de músculo temporal (EMS) no tecido do córtex isquêmico mantêm alta viabilidade. (Esquerda) Imagem representativa de células do tecido muscular coradas com nicotinamida adenina dinucleotídeo (reduzido)-tetrazólio redutase do controle (músculo ingênuo do lado contralateral) e do músculo enxertado aos 7 dias após a cirurgia de oclusão da artéria cerebral média (MCAo) + encefalomiossinangiose (EMS). Seta preta () mostra células danificadas. (Direita) Quantificação de células musculares vivas/mortas. As células musculares aos 7 dias após o EMS mostram algum dano leve (p < 0,1; teste t) que se recuperaram completamente aos 21 dias. (n = 5 camundongos/pontos de tempo = total de 10 camundongos neste grupo) Os dados são médios ± barra da Escala S.D. = 20 μm. (B) Ligação do músculo temporal enxertado com o córtex cerebral 21 dias após a cirurgia EMS. Tecidos EMS corados com anti-alfa actina muscular esquelética (verde) e anticorpo Lectin-Dy594 (vermelho; marcador de vasos sanguíneos) (n = 3 camundongos). Barra de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: A cirurgia de encefalomiossinangiose (EMS) aumenta a densidade dos vasos sanguíneos em lesões isquêmicas 21 dias após acidente vascular cerebral. (A) Imagens representativas de cortes cerebrais coronais de camundongos submetidos à oclusão da artéria cerebral média (MCAo) (esquerda) ou MCAo + EMS (direita) e corados com L. esculentum (Tomate) Lectina-Dy594, que se liga a glicoproteínas na membrana basal das células endoteliais. Os gráficos são áreas quantificadas. Os camundongos MCAo + EMS apresentaram maior rede endotélia usando parâmetros como área da fração vascular ( B) e densidade integrada (C). **p < 0,01 (teste t não pareado), enquanto camundongos somente com MCAo apresentaram dano próximo à lesão isquêmica (linha tracejada). N = 5 camundongos/grupo= 10 camundongos no total. Os dados são médios ± barra da escala S.D. = 100 μm. Abreviaturas: Contra = lado contralateral; Ipsi = lado ipsilateral. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: A encefalomiossinangiose modula proteínas angiogênicas após acidente vascular cerebral. (A) Uma matriz de angiogênese de camundongo (ARY015) foi usada para avaliar simultaneamente os níveis relativos de 53 proteínas relacionadas à angiogênese de camundongos após oclusão da artéria cerebral média (MCAo) e MCAo + EMS (dia 21 após MCAo) em lisados de tecido cerebral do córtex perilesional. A análise quantitativa mostra que a cirurgia EMS reduziu significativamente a osteopontina e aumentou a proteína ácida do fator de crescimento de fibroblastos (FGF) após acidente vascular cerebral (*p < 0,05 ou **p < 0,01) vs MCAo ipsilateral. Os dados são médios ± S.D.; n = 3 camundongos/grupo/ponto de tempo = total de 15 camundongos. (B) A EMS não aumentou a mortalidade após acidente vascular cerebral (MCAo). A curva de sobrevida de Kaplan Meier mostra que EMS + MCAO não alterou a mortalidade pós-AVC versus MCAO isoladamente (p = 0,54). Para EMS n = 3; para MCAo n = 11; e para MCAo + EMS n = 21. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Este protocolo descreve um procedimento EMS bem-sucedido em um modelo de camundongo de acidente vascular cerebral induzido por MCAo. Os dados mostram que o tecido enxertado permanece viável e pode formar ligações com o córtex cerebral muito tempo após a cirurgia EMS. Esses achados apoiam a lógica para o uso de um enxerto muscular cerebral para desenvolver gradualmente um ambiente trófico ricamente vascular no local do acidente vascular cerebral. EMS é uma terapia promissora para potencialmente reparar o tecido cerebral infartado no mesmo ambiente.

As etapas críticas do protocolo incluem a etapa 2.2.4: essa etapa causa trauma inevitável à MT, o que pode reduzir sua capacidade de se ligar ao córtex e liberar fatores tróficos. Tome cuidado para limitar o trauma da MT na medida do possível. Uma estratégia alternativa para reduzir o trauma tecidual é dissecar sem rodeios a MT do crânio apenas em sua borda dorsal e renunciar à miotomia. Neste caso, a MT seria levantada para longe do crânio (em vez de totalmente refletida), e a craniotomia seria realizada com a broca de craniotomia sob o músculo. Isso reduz a quantidade de espaço disponível para realizar essa etapa, mas novamente pode reduzir o trauma da MT. Além disso, extremo cuidado e prática são necessários nas etapas 2.2.5 e 2.2.6, para prevenir lesões no córtex cerebral subjacente durante a craniotomia e manipulação da dura-máter.

Este modelo EMS é um complemento natural ao modelo MCAo bem estabelecido. Como o modelo MCAo simula de perto a fisiopatologia da isquemia e do dano à rede vascular, que é comum em pacientes humanos, o modelo MCAo + EMS provavelmente terá um alto nível de traduzibilidade para humanos. O modelo EMS aqui apresentado é a primeira intervenção terapêutica que foi estudada para acidente vascular cerebral isquêmico no cenário pré-clínico que depende apenas de tecido autólogo. Além disso, como o enxerto de MT é orgânico e autólogo, ele pode demonstrar interações de sinalização parácrina com o cérebro lesionado adjacente que servem para regular a liberação de fatores tróficos para níveis ótimos em vários momentos de tempo.

Enquanto o AVC cria um ambiente proangiogênico e estimula a própria angiogênese26, a resposta intrínseca pós-AVC não é suficiente para melhorar o suprimento vascular na região danificada devido aos níveis sublimiares de fatores angiogênicos. Aqui, o EMS melhorou ainda mais a expressão de proteína ácida por FGF em comparação com animais apenas com acidente vascular cerebral. Esta proteína controla indiretamente a neovascularização em conjunto com outros fatores de crescimento. O FGF-ácido também atua como fator neurotrófico, promovendo neuroproteção e neurogênese27,28. Alguns dos efeitos neuroprotetores do FGF-ácido são mediados pela ativação das vias AKT e MAPK/EPK29. Além da FGF, também houve redução da expressão da proteína osteopontina. A osteopontina é uma citocina pleotrópica pró-inflamatória que está sendo cada vez mais reconhecida por seu papel em múltiplas neuropatologias e processos de remodelação tecidual, entre outras funções. O papel da osteopontina no AVC ainda é incerto30. No entanto, estudos recentes em humanos apontam para a osteopontina como um fator de prognóstico ruim após o acidente vascular cerebral. Uma diminuição nos níveis séricos de osteopontina após acidente vascular cerebral foi mostrada em um estudo para prever desfechos favoráveis (pontuação modificada da escala de Rankin < 2 aos 90 dias) em pacientes humanos com acidente vascular cerebral31. Outro estudo mostrou uma relação dose-dependente entre níveis mais elevados de osteopontina plasmática e desfechos de morte e incapacidade em pacientes humanos após acidente vascular cerebral32. De acordo com esses estudos clínicos, os dados aqui sugerem que a osteopontina reduzida após EMS pode promover um ambiente anti-inflamatório para aumentar a formação de neovasos. No geral, a expressão diferencial de FGF-ácido e osteopontina aponta para mecanismos que regem a angiogênese após EMS neste modelo de camundongo e aumenta a probabilidade de que o procedimento que também pode trazer neuroproteção e neuro-regeneração, além da angiogênese.

Existem algumas limitações potenciais deste procedimento. Medir o fluxo cerebral devido ao aumento da densidade dos vasos sanguíneos é um desafio neste procedimento, pois os procedimentos comumente usados de Doppler a laser ou medidor de vazão de salpicos a laser são afetados pela presença de músculo temporal no topo do córtex, que impedem a verdadeira medição do sangue na superfície cortical. Assim, este procedimento pode precisar de uma ressonância magnética de roedores pequenos mais sofisticada, mas raramente disponível, se a medição de fluxo em tempo real for necessária. No entanto, o uso da medição da densidade dos vasos sanguíneos apoia indiretamente o sucesso do procedimento EMS na melhoria da angiogênese, conforme sugerido por nossos dados. Outra limitação é a natureza invasiva das intervenções EMS no topo do MCAo, que em si é um procedimento invasivo. Embora não tenha havido aumento da mortalidade com EMS neste estudo em comparação com apenas MCAo, a necessidade de hemicraniectomia pode limitar sua futura traduzibilidade para todos os tipos de acidente vascular cerebral. No entanto, na prática clínica, >10% dos pacientes com acidente vascular cerebral isquêmico grande necessitam de hemicraniectomia para controlar o aumento da pressão intracraniana23, e esse modelo de EMS pode ter valor translacional para esse subgrupo de pacientes com AVC em particular. Finalmente, o ponto de tempo de 4 h pós-MCAo para a realização do EMS foi escolhido para se enquadrar na janela de tratamento padrão da rT-PA para a maioria dos pacientes humanos, embora estudos futuros usem pontos de tempo posteriores para avaliar a janela terapêutica para EMS.

No geral, o modelo EMS fornece uma opção bem tolerada para induzir angiogênese após acidente vascular cerebral isquêmico e, além de sua potencial tradução clínica, pode ser usado em estudos futuros que examinem a fisiopatologia do acidente vascular cerebral e da angiogênese.

O modelo EMS descrito aqui oferece um método seguro de obtenção de angiogênese cerebral para estudo pré-clínico, evitando a necessidade de intervenções farmacológicas, que muitas vezes levam a efeitos colaterais indesejados ou angiogênese descontrolada. Muitos pacientes com grandes acidentes vasculares cerebrais isquêmicos necessitam de uma hemicraniectomia durante o curso clínico para controlar o aumento da pressão intracraniana. Este procedimento EMS, que também inclui hemicraniectomia em camundongos para enxerto muscular, pode fornecer prova pré-clínica de conceito para aplicação translacional de EMS em acidente vascular cerebral isquêmico. Portanto, esse modelo tem o potencial de ampliar o conhecimento da recuperação neurovascular após um acidente vascular cerebral isquêmico e facilitar o desenvolvimento de inovações, que são a necessidade da hora, na terapêutica para sobreviventes de AVC.

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Disclosures

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado pelo Research Excellence Program-UConn Health (para Ketan R Bulsara e Rajkumar Verma) e UConn Health start-up (para Rajkumar Verma).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6-0 monocryl suture Ethilon 697G
70% ethanol to sanitize operating surface Walgreens
Bupivacaine 0.25% solution Midwest Vet
Clamps for tissue retraction Roboz
Doccal suture with silicone coating Doccal Corporation 602145PK10Re
Electric heating pad for operating surface
Isoflurane anesthesia Piramal Critical Care Inc
Isoflurane delivery apparatus B6Surgivet (Isotech 4)
Micro drill Harvard Apparatus
Microdissecting tweezers, curved x2 Piramal Critical Care Inc
mouse angiogenesis panel arrat R& D biotech ARY015
Needle driver Ethilon
Ointment for eye protection Walgreens
Operating microscope Olympus
Operating surface Olympus
Povidone iodine solution Walgreens
Rectal thermometer world precison instrument
Saline or 70% ethanol for irrigation Walgreens
Small electric razor to shave operative site Generic
Surgical scissors Roboz

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Neurociência Edição 184
Um modelo para o tratamento da encefalomiossinangiose após acidente vascular cerebral induzido pela oclusão da artéria cerebral média em camundongos
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