Summary
Protokol, moyamoya dışı akut iskemik inmenin tedavisi için ensefalomiyosinanjiyozis-iskemik beyin dokusunun pial yüzeyine vasküler temporalis kas flebinin greftlenmesi için yöntemler sağlamayı amaçlamaktadır. Yaklaşımın anjiyogenezi arttırmadaki etkinliği, farelerde geçici bir orta serebral arter tıkanıklığı modeli kullanılarak değerlendirilir.
Abstract
İskemik inme geçiren hastaların çoğu için etkili bir tedavi mevcut değildir, bu da yeni terapötiklerin geliştirilmesini zorunlu kılmaktadır. Beynin iskemik inme sonrası kendi kendini iyileştirme yeteneği, etkilenen bölgedeki yetersiz kan akımı ile sınırlıdır. Ensefalomiyosinanjiyoz (EMS), moyamoya hastalığı olan hastalarda anjiyogenezi sağlayan nöroşirürjik bir prosedürdür. İskemik beyin yüzeyine vasküler temporalis kas greftinin yerleştirilmesi ile kraniyotomi içerir. EMS, farelerde akut iskemik inme ortamında hiç çalışılmamıştır. Bu çalışmayı yönlendiren hipotez, EMS'nin kas greftini çevreleyen kortikal yüzeyde serebral anjiyogenezi arttırmasıdır. Burada gösterilen protokol prosedürü açıklar ve EMS yaklaşımının fizibilitesini ve etkinliğini destekleyen ilk verileri sağlar. Bu protokolde, 60 dakikalık geçici orta serebral arter tıkanıklığından (MCAo) sonra, fareler MCAo veya MCAo + EMS tedavisine randomize edildi. EMS oklüzyondan 3-4 saat sonra yapıldı. Fareler, MCAo veya MCAo + EMS tedavisinden 7 veya 21 gün sonra kurban edildi. Temporalis greft canlılığı nikotinamid adenin dinükleotid indirgenmiş-tetrazolyum redüktaz testi kullanılarak ölçüldü. Bir fare anjiyogenez dizisi, anjiyojenik ve nöromodülatör protein ekspresyonunu ölçtü. İmmünohistokimya, beyin korteksi ile greft bağını ve damar yoğunluğundaki değişimi görselleştirmek için kullanıldı. Buradaki ön veriler, aşılanmış kasın EMS'den 21 gün sonra canlı kaldığını göstermektedir. İmmün boyama, başarılı greft implantasyonu ve kas greftinin yakınındaki damar yoğunluğunda artış gösterdi ve bu da anjiyogenezin arttığını gösterdi. Veriler, EMS'nin fibroblast büyüme faktörünü (FGF) arttırdığını ve inme sonrası osteopontin seviyelerini azalttığını göstermektedir. Ek olarak, inme sonrası EMS, protokolün güvenli ve güvenilir olduğunu düşündüren mortaliteyi arttırmamıştır. Bu yeni prosedür etkili ve iyi tolere edilir ve akut iskemik inme sonrası gelişmiş anjiyogenez için yeni müdahaleler hakkında bilgi sağlama potansiyeline sahiptir.
Introduction
İskemik inme, yıkıcı kronik sekelleri olan akut nörovasküler bir yaralanmadır. ABD'de inme mağdurlarının çoğu, yılda 650.000, kalıcı fonksiyonel sakatlıktan muzdariptir1. Mevcut tedavilerin hiçbiri, iskemik inmenin akut fazından sonra nöroproteksiyon ve fonksiyonel iyileşme sağlamaz. Akut iskemik inmeden sonra, hem doğrudan hem de kollateral kan kaynakları azalır, bu da beyin hücrelerinin ve ağlarının işlev bozukluğuna yol açar ve ani nörolojik defisitlere neden olur 2,3. İskemik bölgeye kan akışının restorasyonu, inme tedavisinin en önemli hedefi olmaya devam etmektedir. Bu nedenle, iskemik bölgede kan akışını teşvik etmek için anjiyogenezi arttırmak umut verici bir terapötik yaklaşımdır; Bununla birlikte, eritropoietin, statinler ve büyüme faktörleri de dahil olmak üzere inme sonrası anjiyogenezi teşvik etmek için daha önce çalışılan yöntemler, kabul edilemez toksisite veya çevrilebilirlik seviyeleri ile sınırlandırılmıştır4.
Ensefalomiyosinanjiyoz (EMS), sıklıkla inmeye yol açan daralmış kraniyal arterlerin bir durumu olan moyamoya hastalığı olan insanlarda serebral anjiyogenezi artıran cerrahi bir prosedürdür. EMS, hastanın temporalis kasının vasküler bir bölümünün kafatasından kısmen ayrılmasını, ardından kraniyotomi ve kasın etkilenen kortekse aşılanmasını içerir. Bu prosedür iyi tolere edilir ve serebral anjiyogenezi indükleyerek moyamoya hastalığı olan hastalarda iskemik inme riskini azaltır 5,6. Bu nedenle, prosedür bu hastalarda büyük ölçüde önleyici bir rol oynamaktadır. Bu işlemin getirdiği anjiyogenez, iskemik inme ortamında nörovasküler koruma ve iyileşmeyi teşvik etmede de rol oynayabilir. Bu rapor, EMS tarafından ortaya çıkarılan anjiyogenezin, serebral iskemi için anlayış ve terapötik seçenekleri genişletme potansiyeline sahip olduğu hipotezini desteklemektedir.
EMS'nin yanı sıra, anjiyogenezi iyileştirmek için çeşitli farmakolojik ve cerrahi yaklaşımlar vardır, ancak bunların birkaç sınırlaması vardır. Vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF) uygulaması gibi farmakolojik yaklaşımların, tümör dokularında bulunanlara benzeyen kaotik, düzensiz, sızıntılı ve ilkel vasküler pleksusların oluşumu da dahil olmak üzere çeşitli sınırlamalar nedeniyle yetersiz veya hatta zararlı olduğu bulunmuştur 7,8 ve klinik çalışmalarda yararlı etkileri yoktur9.
Cerrahi yaklaşımlar arasında yüzeyel temporal arter-orta serebral arter anastomozu gibi direkt anastomozlar, ensefalo-duro arterio-sinanjiyoz (EDAS), ensefalomiyosinanjiyoz (EMS) gibi indirekt anastomozlar ve direkt ve indirekt anastomoz kombinasyonları10 yer almaktadır. Tüm bu prosedürler, EMS hariç, küçük hayvanlarda teknik olarak çok zorlu ve talepkardır. Diğer prosedürler kompleks vasküler anastomoz gerektirirken, EMS nispeten basit bir kas grefti gerektirir. Dahası, temporalis kasının kortekse yakınlığı, aşılama için doğal bir seçim olmasını sağlar, çünkü aşılama için daha uzak bir kas kullanıldığında gerekli olacağı gibi, kan kaynağından tamamen eksize edilmesi veya ayrılması gerekmez.
EMS, sıçanlarda kronik serebral hipoperfüzyon modellerinde incelenmiştir 7,11. Bununla birlikte, temporalis kas grefti kullanan EMS, kemirgenlerde akut iskemik inmede hiç çalışılmamıştır. Burada, orta serebral arter tıkanıklığı modeli (MCAo) ile iskemik inme sonrası farelerde EMS'nin yeni bir protokolünü tanımladık. Bu makale, MCAo'dan sonra farelerde EMS'nin bu yeni yaklaşımı için yöntemlerin ve erken verilerin bir açıklaması olarak hizmet vermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm deneyler UConn Health Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmış ve ABD yönergelerine uygun olarak yürütülmüştür. Aşağıdaki protokol herhangi bir kemirgen türünde veya türünde çalışmalıdır. Burada, 8 ila 12 haftalık, yaş ve kilo uyumlu C57BL / 6 vahşi tip erkek fareler kullanıldı. Fareler standart chow diyeti ve su ad libitum ile beslendi. Standart muhafaza koşulları, 12 saatlik bir aydınlık / karanlık döngüsü ile% 72.3 ° F ve% 30 -% 70 bağıl nemde tutuldu.
1. Ameliyat öncesi hazırlık
- Ameliyattan önce otoklavlama yaparak tüm aletleri sterilize edin. Çalışma yüzeyini %70 etanol ile sterilize edin ve elektrikli ısıtma yastığı ile çalışma yüzeyini 37 °C'ye ısıtın.
- Fareyi indüksiyon için% 4-5% izofluran ile uyuşturmak için bir indüksiyon odası kullanın. Ameliyat sonuna kadar bakım için burun konisi yoluyla % 1.5 -% 2.0 izofluran verin. Ameliyattan önce, sert bir arka ayak sıkışmasına yanıt eksikliğini ve postüral reaksiyonun ve sağ refleksin kaybını değerlendirerek farenin uygun şekilde uyuşturulduğundan emin olun.
- Fareyi çalışma yüzeyindeki sol tarafına yerleştirin ve her iki gözü de korumak için göz merhemi uygulayın.
- Cerrahi alan üzerindeki saçları (yani, göz ve kulak arasındaki sağ lateral kafatası) elektrikli makaslarla tıraş edin. Cerrahi alanı, cerrahi bölgenin ortasından dışarıya doğru konsantrik daireler halinde,% 70 etanol ve ardından povidon çözeltisi ile temizleyin ve bu adımları 2 kat tekrarlayın.
NOT: Ameliyat bölgesinin göze yakın olması nedeniyle, cerrahi bölgeyi çevreleyen alanın% 150'sinin çıkarılması, tahrişi veya gözün kazara yaralanmasını önlemek için mümkün olmayabilir. - Ameliyat yerinde ameliyat öncesi analjezi olarak deri altı enjeksiyonu ile% 0.25 bupivakain (8 mg / kg vücut ağırlığına kadar) tek doz bupivakain uygulayın.
- 4x büyütmede cerrahi bir mikroskop kurun. Mikroskop tüm cerrahi adımlar için kullanılır.
2. Ameliyat prosedürü
NOT: Ameliyat adımları Şekil 1'de sunulmuştur. Bu protokol için, sahte gruba üç fare, yalnızca EMS için üç fare, MCAo için 12 fare ve MCAo + EMS grubu için 23 fare tahsis edildi.
- MCAo ameliyatı
NOT: MCAo, bizim tarafımızdan ve diğerleri tarafından tanımlandığı gibi kemirgenlerde iyi karakterize edilmiş bir iskemik inme modelidir12,13,14. Ameliyat adımları burada kısaca açıklanmıştır. Fokal geçici serebral iskemi, izofluran anestezisi altında 60 dakikalık sağ MCAo ile indüklendi ve ardından 7 veya 21 gün boyunca reperfüzyon yapıldı.- İç karotis arter bifurkasyonundan eksternal karotis arter kütüğü yoluyla 10-11 mm uzunluğunda 6.0 silikon kauçuk kaplı monofilament ilerleterek orta hat ventral boyun insizyonu ve ardından tek taraflı sağ MCAo yapın. Sahte farelerde, dikişin internal karotis artere ilerlemesi dışında aynı ameliyatları gerçekleştirin.
- Otomatik bir ısıtma yastığı ile ameliyat sırasında sıcaklığı ~ 37 ° C'de tutarak bir sıcaklık kontrol sistemi kullanarak rektal sıcaklıkları ölçün.
- Doppler probunu lateral kafatasına (MCA bölgesine karşılık gelen) yerleştirerek ve8 değerini kaydederek sütür yerleştirmeden önce serebral kan akışını ölçmek için lazer Doppler flowmetry kullanın. Tıkanıklığın başlangıç çizgisindeki serebral kan akışının% 15'ine indirgenmesini doğrulamak için, dikiş ilerletildikten sonra aynı prosedürü kullanın. Reperfüzyonu doğrulamak için, dikiş alındıktan sonra aynı prosedürü kullanın.
- Kronik son noktalar için yeterli beslenmeyi sağlamak için kurban edilene kadar ve / veya ameliyattan 1 hafta sonra tüm hayvanları ıslak püre ile besleyin, çünkü hayvanlar inme sonrası yetiştirme eksikliklerine sahiptir.
- EMS ameliyatı
- 60 dakikalık MCAo'dan sonra, fareleri yalnızca MCAo veya MCAo + EMS gruplarına randomize edin. MCAo'dan (MCAo + EMS grubu) veya belirli deneyler için sahte ameliyattan (yalnızca EMS grubu) 4 saat sonra EMS gerçekleştirin. Ameliyattan önce yeni bir çift steril cerrahi eldivene geçin.
NOT: Fareler 60 dakikalık MCAo'dan sonra anesteziden kurtuldu ve EMS ameliyatından önce yeniden anestezi altına alındı. - EMS alan gruplar için (MCAo + EMS veya yalnızca EMS grupları), 1-2 mm rostralden sağ kulağa ve 1-2 mm kaudalden sağ göze kadar uzanan makasla 10-15 mm'lik bir cilt kesisi yapın.
NOT: Steril makaslar, altındaki temporalis kaslarının kazara zarar görmesini önlemek için kullanıldı. - Kelepçeleri kullanarak cilt kapaklarını geri çekin ve temporalis kasını ve kafatasını görsel olarak tanımlayın.
- Temporalis kasını bir yayma tekniği ile makas kullanarak kafatasından açıkça ayırın. Ventral yansımayı kolaylaştırmak için kasın kaudal sınırı boyunca ventralal olarak yönlendirilmiş 2-3 mm'lik bir miyotomi uygulayın.
- Bir mikro matkap kullanarak yansıyan temporalis kasının altındaki kafatasında ~ 5 mm çapında bir kraniyotomi uygulayın.
- Beynin pial yüzeyini ortaya çıkarmak için dura materini cımbızla çıkarın. Beyinde kazara yaralanmayı önlemek için çok dikkatli olun.
- Temporalis kasının dorsal sınırını dorsal deri flebinin deri altı dokusuna 6-0 monokril filamentlerle dikerek maruz kalan serebral kortekse hizalayın.
- Cilt kesisini 6-0 monofilament dikişle kapatın. Fareyi tekrar kafesine yerleştirin ve anesteziden iyileşene kadar izleyin. Fareyi barınma tesisine geri getirin.
- 60 dakikalık MCAo'dan sonra, fareleri yalnızca MCAo veya MCAo + EMS gruplarına randomize edin. MCAo'dan (MCAo + EMS grubu) veya belirli deneyler için sahte ameliyattan (yalnızca EMS grubu) 4 saat sonra EMS gerçekleştirin. Ameliyattan önce yeni bir çift steril cerrahi eldivene geçin.
3. Ameliyat sonrası dikkat edilmesi gerekenler
- Fareleri hastalık için ve cerrahi bölgeyi günlük enfeksiyon için izleyin. Hidrasyonu desteklemek için günlük deri altı normal salin (vücut ağırlığına göre% 1 hacim) verin.
- Ameliyattan 7 gün sonrasına kadar şiddetli dehidrasyon (vücut ağırlığı kaybı >% 20) için izleyin. % >20 kilo kaybı durumunda vücut ağırlığına göre deri altı normal salin% 1 hacim ek bir bolusu uygulayın.
- Özel hususlar olmadan enjeksiyonlara, fizyolojik izlemeye ve diğer testlere devam edin.
NOT: Bu prosedürde, ameliyat sonrası tedavi için opioidlerin veya steroidal olmayan anti-enflamatuar ilaçların (NSAID'ler) kullanımından, bu ajanların inme sonucu veya enfarktüs boyutu üzerindeki bilinen etkileri nedeniyle, kurum içi kurumsal hayvan bakımı ve kullanım komitesi15,16,17,18 ile istişare halinde kaçınılmıştır. Bununla birlikte, postoperatif analjezi kullanımı, diğer modellerle birlikte EMS cerrahisi için oldukça teşvik edilmektedir. Bunun için lütfen Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi'ne (IACUC) danışın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu çalışma için toplam 41 fare kullanılmıştır. MCAo'da bir ve MCAo + EMS'de iki olmak üzere üç mortaliteden sonra, gösterilen sonuçları elde etmek için toplam 38 fare kullanıldı.
İstatistik
Her deneyden elde edilen veriler, standart sapma (S.D.) ± ortalama olarak sunulur. Anlamlılık, iki grubu karşılaştırmak için eşleşmemiş öğrencinin t-testi veya ikiden fazla grup için tek yönlü ANOVA kullanılarak belirlendi ve çoklu karşılaştırmaları düzeltmek için Newman-Keuls post-hoc testi yapıldı.
Nikotinamid adenin dinükleotid (indirgenmiş)-tetrazolium redüktaz (NADH-TR) boyama
Bu boyama, Turoczi ve ark.19'da olduğu gibi aşılanmış kasın uzun süreli yaşayabilirliğini değerlendirmek için yapıldı. Kısaca, kurban sırasında, aşılanmış kas flebi dikkatlice eksize edildi, 30 dakika boyunca% 4 paraformaldehit ile sabitlendi ve -80 ° C'de optimum kesme sıcaklığı (OCT) ortamında kriyokorundu. Temporalis kas dokusunun birkaç 12 μm kalınlığındaki kriyoseksiyonu NADH-TR enzim-histokimyasal reaksiyonu için boyandı. Slaytlar, 0.05 M Tris tamponunda (pH 7.6) nitromavi tetrazolium (1.8 mg / dL) ve NADH (15 mg / dL) çözeltisinde 37 ° C'de 30 dakika boyunca inkübe edildi. Kullanılmayan tetrazolium reaktifi, aseton konsantrasyonlarının artması ve ardından azaltılması kullanılarak uzaklaştırıldı. NADH-tetrazolium boyalı kasın kantitatif değerlendirmesi, 40x büyütmede alınan kas görüntüleri üzerinde yapıldı.
İmmünoboyama çalışmaları
İmmün boyama, kas greftinin korteks ve kan damarı yoğunluğu ile kas ve korteks kavşağında bağlanmasını görselleştirmek için kullanıldı20,21. Beyin dokusu ile kas bağının görselleştirilmesi için, EMS ameliyatı geçirmiş fareler burada kullanılmıştır. Her bir zaman noktasının sonunda, fareler bir avertin enjeksiyonu (50 mg / kg vücut ağırlığı) ile uyuşturuldu, ardından 5 mM Etilendiamintetraasetik asit (EDTA) içeren 1x PBS ile perfüzyon ve% 4 paraformaldehit ile fiksasyon. Kafatası, temporalis kas (TM) greftinin beyin korteksinden kazara ayrılmasını önlemek için dikkatlice kesildi. Beyin korteksinin üzerindeki TM grefti daha sonra kalan temporalis kasından ayrıldı. Beyin dikkatlice çıkarıldı ve bir gecede% 4 paraformaldehit içinde sabitlendi. Sabit beyin daha sonra beyin şişenin dibine batana kadar (yaklaşık 1-3 gün) 1x PBS'de% 30 sakkaroz ile susuz bırakıldı. 30 μm boyutundaki doku kesitleri dondurucu mikrotomla kesilerek slaytlara monte edildi.
İpsilateral beyin korteksindeki kan damarlarının immünoboyaması için, MCAo ve MCAo + EMS fareleri feda edildi, perfüze edildi, sabitlendi ve yukarıdaki gibi işlendi. 30 μm boyutundaki beyin dilimleri dondurucu bir mikrotom üzerine bölündü ve bir cam tarafa monte edildi. Antijen geri kazanımı sitrat tamponu (pH 6.0) kullanılarak yapıldı ve kesitler bloke edici tampon ile inkübe edildi, ardından primer antikorlar, anti-alfa iskelet kası aktin 1:200 ve Lectin-Dy59421,22 ile gece boyunca inkübasyon yapıldı. Fare başına üç koronal beyin kesiti (n = 5 fare / grup; toplam = 15 bölüm) bregmadan 0.45 mm ile 0.98 mm arasında alındı, boyandı ve iskemik çekirdek ve penumbra bölgelerinin birleşme noktasında 20x büyütmede nicelleştirme için görselleştirildi. Kör bir gözlemci, ImageJ yazılımını kullanarak beyin parankimindeki lektin pozitif damar yoğunluğunu ölçtü.
Kas grefti EMS'den 21 gün sonra canlı kalır
Bu ameliyatın başarısı için ön koşul, aşılanmış temporalis kasının uzun süreli yaşayabilirliğidir. TM greftinde ameliyattan 7 gün sonra aşılanmış kas ve kontrol kasında kas hücrelerinin geçici hasarı görüldü (%71.32 kas hücresi sağkalımı ± %16.64'e karşılık %97.19 ± %3.81). Bununla birlikte, aşılanmış ve kontrol kası arasındaki bu fark ortadan kalkmış ve kaslar ameliyattan 21 gün sonra tamamen iyileşmiştir (%98.22 ± 3.965'e karşılık %96.87 ± %2.27; Şekil 2A).
Kas greftleri beyin dokusu ile gevşek bağlar kurar
Temporalis kasının beyin korteks yüzeyine başarılı bir şekilde aşılanması, bu modelin başarısı için en önemli gerekliliktir. Hem EMS + MCAo hem de EMS'ye özel modelde, temporalis kas greftleri EMS'den 21 gün sonra kortikal yüzeye yapıştı ve bu da başarılı cerrahi, greft implantasyonu ve bağlanmayı düşündürdü (Şekil 1B ve Şekil 2B).
EMS sonrası perilezyonel kortekste kan damarı yoğunluğu artar
Akut inme, serebral kan akımında akut azalmaya, kollateral damarların alımının engellenmesine, anormal vasküler filizlenmeye ve kötü inme sonuçlarına katkıda bulunan disfonksiyonel anjiyogeneze yol açar23. EMS, inme sonrası perilezyonel kortekste kan damarı yüzey alanını ve entegre yoğunluğu önemli ölçüde arttırır (p < 0.05'e karşı MCAo-only; Şekil 3).
Anjiyojenik ve nöromodülatör proteinlerin analizi
Üreticinin talimatlarına göre MCAo-only ve MCAo + EMS farelerinde MCAo'dan 7 gün ve 21 gün sonra anjiyojenik ve nöromodülatör proteinlerin ekspresyonunu karşılaştırmak için bir fare anjiyogenez dizisi kullanıldı24. ImageJ yazılımı, protein nokta lekesinin her veri noktası için piksel yoğunluğunu ölçmek için kullanıldı. Veriler, analiz edilen her proteinin yoğunluğunun, her bir leke için standartların ortalama yoğunluğuna oranı olarak kaydedildi.
Fibroblast büyüme faktörü (FGF)-asidik EMS'den sonra yukarı regüle edilir ve osteopontin aşağı regüle edilir
Protein dizisi sonuçları, inmeden 21 gün sonra MCAo + EMS grubunda FGF-asidik (0.677 ± 0.007 vs. 0.085 ± 0.014, p = 0.045), protein düzeylerinde anlamlı bir artış ve inflamatuar koşullarda eksprese edilen çok fonksiyonlu bir molekül olan osteopontin seviyelerinde azalma (0.692 ± 0.007 vs. 0.758 ± 0.014, p = 0.048) göstermiştir (Şekil 4A).
İnme sonrası EMS için mortalite sonuçları
Hem MCAo hem de EMS, farelerde bazı mortaliteye neden olabilecek invaziv cerrahi tekniklerdir. Bu deneyde, MCAo ameliyatından 21 gün sonra farelerde% 10-11 arasında mortalite vardı, bu da 60 dakikalık MCAo14'e maruz kalan fareler için kabul edilen bir ölüm oranıdır. MCAo'dan sonra farelerde EMS yapılması mortaliteyi arttırmadı (Şekil 4B), MCAo'dan sonra bile EMS cerrahisinin toleransını düşündürmektedir.
Şekil 1. Orta serebral arter tıkanıklığı (MCAo) sonrası kademeli EMS prosedürü: (A) Adım 1. Sağ orta serebral arter bölgesi üzerinde bir cilt kesisi yapılır. Deri ve deri altı dokular yansır, kafatası ve temporalis kasını açığa çıkarır. 2. Adım. Temporalis kası kafatasından uzağa diseke edilir ve ventralal olarak yansıtılır. 3. Adım. Bir kraniyotomi yapılır (4-5 mm) ve dura nazikçe çıkarılır. 4. Adım. Temporalis kası, maruz kalan korteksi örtmek için doğrudan beyin yüzeyine yerleştirilir. 5. Adım. Temporalis kasının dorsal kenarı, beyin yüzeyi ile aynı hizada olan dorsal cilt flebinin deri altı dokusuna dikilir. 6. Adım. Kesi kapatılır ve fare anesteziden çıkarılır ve kafesine geri döndürülür. Şeklin bu kısmı25'ten değiştirilmiştir. (B) MCAo kaynaklı inmenin ensefalomiyosinanjiyoz (EMS) tedavisi için kavramsal şema. Kısaltmalar: FGF = Fibroblast büyüme faktörü. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2. İmmün boyama çalışmaları. (A) Temporalis kas greftleri canlılığını korur. İskemik korteks dokusundaki temporalis kas greftleri (EMS) yüksek canlılık sağlar. (Solda) Orta serebral arter tıkanıklığı (MCAo) + ensefalomiyosinanjiyoz (EMS) cerrahisinden 7 gün sonra nikotinamid adenin dinükleotid (indirgenmiş)-tetrazolium redüktaz-boyalı kas dokusu hücrelerinin kontrolden (kontralateral taraftan naif kas) ve aşılanmış kasın temsili görüntüsü. Siyah ok () hasarlı hücreleri gösterir. (Sağda) Canlı / ölü kas hücrelerinin miktarı. EMS'den 7 gün sonra kas hücreleri, 21 günde tamamen iyileşen hafif bir hasar (p < 0.1; t-testi) gösterir. (n = 5 fare / zaman noktası = bu gruptaki toplam 10 fare) Veriler ortalama ± S.D. Ölçek çubuğu = 20 μm. (B) EMS ameliyatından 21 gün sonra aşılanmış temporalis kasının beyin korteksi ile bağlanması. Anti-alfa iskelet kası aktinin (yeşil) ve Lectin-Dy594 (kırmızı; kan damarı belirteci) antikoru (n = 3 fare) ile boyanmış EMS dokuları. Ölçek çubuğu = 100 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Ensefalomiyosinanjiyoz (EMS) cerrahisi, inmeden 21 gün sonra iskemik lezyonlarda kan damarı yoğunluğunu arttırır . (A) (Sol) orta serebral arter tıkanıklığına (MCAo) veya (Sağda) MCAo + EMS'ye maruz kalan ve endotel hücrelerinin bazal zarındaki glikoproteinlere bağlanan L. esculentum (Domates) Lectin-Dy594 ile boyanmış farelerden alınan koronal beyin bölümlerinin temsili görüntüleri. Grafikler niceliklendirilmiş alanlardır. MCAo + EMS fareleri, vasküler fraksiyon alanı (B ) ve entegre yoğunluk (C) parametreleri kullanarak daha yüksek endotel ağı gösterdi. **p 0.01 < (eşlenmemiş t-testi), MCAo'ya özgü fareler ise iskemik lezyona (kesikli çizgi) yakın hasar gösterdi. N = 5 fare / grup = toplam 10 fare. Veriler ortalama ± S.D. Ölçek çubuğu = 100 μm. Kısaltmalar: Kontra = karşıt taraf; Ipsi = ipsilateral taraf. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Ensefalomiyosinanjiyozis, inme sonrası anjiyojenik proteinleri modüle eder . (A) Orta serebral arter tıkanıklığı (MCAo) sonrası 53 fare anjiyogenezi ile ilişkili proteinin ve perilezyonel korteksten lizatlarda MCAo + EMS'nin (MCAo'dan sonraki 21. gün) göreceli seviyelerini eşzamanlı olarak değerlendirmek için bir fare anjiyogenez dizisi (ARY015) kullanıldı. Kantitatif analiz, EMS cerrahisinin osteopontini önemli ölçüde azalttığını ve inme sonrası fibroblast büyüme faktörünü (FGF) arttırdığını göstermektedir - inme sonrası asidik protein (* p < 0.05 veya **p < 0.01) ve ipsilateral MCAo. Veriler S.D.± ortalamadır; n = 3 fare/grup/zaman noktası = toplam 15 fare. (B) EMS inme sonrası mortaliteyi arttırmadı (MCAo). Kaplan Meier sağkalım eğrisi, EMS + MCAO'nun tek başına MCAO'ya kıyasla inme sonrası mortaliteyi değiştirmediğini göstermektedir (p = 0.54). EMS n = 3 için; MCAo n = 11 için; ve MCAo + EMS n = 21 için. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol, MCAo kaynaklı inmenin fare modelinde başarılı bir EMS prosedürünü açıklar. Veriler, aşılanmış dokunun canlı kaldığını ve EMS ameliyatından çok sonra beyin korteksi ile bağlar oluşturabileceğini göstermektedir. Bu bulgular, inme bölgesinde yavaş yavaş zengin vasküler trofik bir ortam geliştirmek için serebral kas grefti kullanmanın mantığını desteklemektedir. EMS, aynı ortamda enfarktüslü serebral dokuyu potansiyel olarak onarmak için umut verici bir terapidir.
Protokolün kritik adımları adım 2.2.4'ü içerir: bu adım TM'ye kaçınılmaz travmaya neden olur, bu da korteks ile bağlanma ve trofik faktörleri serbest bırakma yeteneğini azaltabilir. TM travmasını mümkün olduğunca sınırlamaya özen gösterin. Doku travmasını azaltmak için alternatif bir strateji, TM'yi kafatasından sadece dorsal sınırında açıkça incelemek ve miyotomiden vazgeçmektir. Bu durumda, TM kafatasından uzaklaştırılır (tamamen yansıtılmak yerine) ve kraniyotomi, kasın altındaki kraniyotomi matkabı ile gerçekleştirilir. Bu, bu adımı gerçekleştirmek için mevcut alan miktarını azaltır, ancak yine TM travmasını azaltabilir. Ayrıca, kraniyotomi ve duranın manipülasyonu sırasında altta yatan beyin korteksinin yaralanmasını önlemek için 2.2.5 ve 2.2.6 numaralı adımlarda aşırı özen ve uygulama gereklidir.
Bu EMS modeli, köklü MCAo modeline doğal bir ektir. MCAo modeli, insan hastalarda yaygın olan iskemi ve vasküler ağ hasarının patofizyolojisini yakından simüle ettiğinden, MCAo + EMS modelinin insanlara yüksek düzeyde çevrilebilirliğe sahip olması muhtemeldir. Burada sunulan EMS modeli, sadece otolog dokuya dayanan preklinik ortamda iskemik inme için çalışılan ilk terapötik müdahaledir. Ayrıca, TM grefti organik ve otolog olduğu için, trofik faktörlerin çeşitli zaman noktalarında optimum seviyelere salınımını düzenlemeye yarayan bitişik yaralı beyin ile parakrin sinyal etkileşimleri gösterebilir.
İnme proanjiyojenik bir ortam yaratırken ve anjiyogenezin kendisini uyarırken26, inme sonrası içsel yanıt, anjiyojenik faktörlerin eşik altı seviyeleri nedeniyle hasarlı bölgedeki vasküler arzı iyileştirmek için yeterli değildir. Burada, EMS, sadece inme geçiren hayvanlara kıyasla FGF-asidik protein ekspresyonunu daha da geliştirdi. Bu protein, diğer büyüme faktörleriyle birlikte neovaskülarizasyonu dolaylı olarak kontrol eder. FGF-asidik ayrıca nörotrofik bir faktör olarak da çalışır ve nöroproteksiyonu ve nörogenezi teşvik eder27,28. FGF-asidiklerin nöroprotektif etkilerinin bazılarına AKT ve MAPK/EPK yolaklarının aktivasyonu aracılık eder29. FGF'ye ek olarak, protein osteopontininin ekspresyonu da azaldı. Osteopontin, diğer fonksiyonların yanı sıra çoklu nöropatolojilerde ve doku yeniden şekillenme süreçlerinde oynadığı rol nedeniyle giderek daha fazla tanınan pro-enflamatuar, pleotropik bir sitokindir. Osteopontinin inmedeki rolü hala belirsizdir30. Bununla birlikte, insanlarda yapılan son çalışmalar, osteopontin'in inme sonrası zayıf bir prognostik faktör olduğuna işaret etmektedir. İnme sonrası serum osteopontin düzeylerinde bir azalma, inme31'li insan hastalarda olumlu sonuçları (modifiye Rankin ölçek skoru 90 günde 2 <) tahmin etmek için bir çalışmada gösterilmiştir. Başka bir çalışma, daha yüksek plazma osteopontin seviyeleri ile inme sonrası insan hastalarda ölüm ve sakatlık sonuçları arasında doza bağımlı bir ilişki olduğunu göstermiştir32. Bu klinik çalışmalara paralel olarak, buradaki veriler, EMS'den sonra osteopontinin azalmasının, neo-damar oluşumunu arttırmak için anti-enflamatuar bir ortamı teşvik edebileceğini düşündürmektedir. Genel olarak, FGF-asidik ve osteopontinin diferansiyel ekspresyonu, bu fare modelinde EMS'yi takip eden anjiyogenezi yöneten mekanizmalara işaret eder ve anjiyogeneze ek olarak nöroproteksiyon ve nöro-rejenerasyonu da beraberinde getirebilecek prosedürün olasılığını arttırır.
Bu yordamın bazı olası sınırlamaları vardır. Artmış kan damarı yoğunluğuna bağlı serebral akışın ölçülmesi bu prosedürde zordur, çünkü lazer Doppler veya lazer benek debimetresinin yaygın olarak kullanılan prosedürleri, korteksin tepesinde kortikal yüzeyde gerçek kan ölçümünü önleyen temporalis kasının varlığından etkilenir. Bu nedenle, gerçek zamanlı akış ölçümü gerekiyorsa, bu prosedür daha sofistike, ancak nadiren bulunan, küçük kemirgen MRI taramasına ihtiyaç duyabilir. Bununla birlikte, kan damarı yoğunluğu ölçümünün kullanılması, EMS prosedürünün verilerimizin önerdiği gibi anjiyogenezi iyileştirmedeki başarısını dolaylı olarak desteklemektedir. Diğer bir sınırlama, kendisi invaziv bir prosedür olan MCAo'nun üstündeki EMS müdahalelerinin invaziv doğasıdır. Bu çalışmada EMS ile sadece MCAo'ya kıyasla artmış mortalite olmamasına rağmen, hemikraniektomi gereksinimi gelecekteki tüm inme tipleri için çevrilebilirliğini sınırlayabilir. Bununla birlikte, klinik pratikte, büyük iskemik inmeli hastaların% >10'u, artmış kafa içi basıncı23'ü yönetmek için hemikraniektomiye ihtiyaç duymaktadır ve bu EMS modeli, özellikle inme hastalarının bu alt grubu için translasyonel değere sahip olabilir. Son olarak, EMS'nin performansı için MCAo sonrası 4 saatlik zaman noktası, çoğu insan hasta için rT-PA'nın standart tedavi penceresine girmek üzere seçilmiştir, ancak gelecekteki çalışmalar EMS için terapötik pencereyi değerlendirmek için daha sonraki zaman noktalarını kullanacaktır.
Genel olarak, EMS modeli, iskemik inme sonrası anjiyogenezi indüklemek için iyi tolere edilen bir seçenek sunar ve potansiyel klinik translasyonuna ek olarak, inme ve anjiyogenezin patofizyolojisini inceleyen gelecekteki çalışmalarda kullanılabilir.
Burada açıklanan EMS modeli, klinik öncesi çalışma için serebral anjiyogenezi elde etmek için güvenli bir yöntem sunarak, genellikle istenmeyen yan etkilere veya kontrolsüz anjiyogeneze yol açan farmakolojik müdahalelere olan ihtiyacı ortadan kaldırır. Büyük iskemik inme geçiren birçok hasta, artan kafa içi basıncını yönetmek için klinik seyri sırasında hemikraniektomiye ihtiyaç duyar. Kas aşılaması için farelerde hemikraniektomiyi de içeren bu EMS prosedürü, iskemik inmede EMS'nin translasyonel uygulaması için klinik öncesi kavram kanıtı sağlayabilir. Bu nedenle, bu model iskemik inme sonrası nörovasküler iyileşme bilgisini genişletme ve inme mağdurları için terapötiklerde saatin ihtiyacı olan yeniliklerin geliştirilmesini kolaylaştırma potansiyeline sahiptir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma, Araştırma Mükemmellik Programı-UConn Health (Ketan R Bulsara ve Rajkumar Verma'ya) ve UConn Health start-up'ı (Rajkumar Verma'ya) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-0 monocryl suture | Ethilon | 697G | |
| 70% ethanol to sanitize operating surface | Walgreens | ||
| Bupivacaine 0.25% solution | Midwest Vet | ||
| Clamps for tissue retraction | Roboz | ||
| Doccal suture with silicone coating | Doccal Corporation | 602145PK10Re | |
| Electric heating pad for operating surface | |||
| Isoflurane anesthesia | Piramal Critical Care Inc | ||
| Isoflurane delivery apparatus | B6Surgivet (Isotech 4) | ||
| Micro drill | Harvard Apparatus | ||
| Microdissecting tweezers, curved x2 | Piramal Critical Care Inc | ||
| mouse angiogenesis panel arrat | R& D biotech | ARY015 | |
| Needle driver | Ethilon | ||
| Ointment for eye protection | Walgreens | ||
| Operating microscope | Olympus | ||
| Operating surface | Olympus | ||
| Povidone iodine solution | Walgreens | ||
| Rectal thermometer | world precison instrument | ||
| Saline or 70% ethanol for irrigation | Walgreens | ||
| Small electric razor to shave operative site | Generic | ||
| Surgical scissors | Roboz |
References
- Stroke,
- Cipolla, M. J., McCall, A. L., Lessov, N., Porter, J. M. Reperfusion decreases myogenic reactivity and alters middle cerebral artery function after focal cerebral ischemia in rats. Stroke. 28 (1), 176-180 (1997).
- Arai, K., et al. Cellular mechanisms of neurovascular damage and repair after stroke. Journal of Child Neurology. 26 (9), 1193-1198 (2011).
- Ergul, A., Alhusban, A., Fagan, S. C. Angiogenesis: a harmonized target for recovery after stroke. Stroke. 43 (8), 2270-2274 (2012).
- Imai, H., et al. The importance of encephalo-myo-synangiosis in surgical revascularization strategies for moyamoya disease in children and adults. World Neurosurgery. 83 (5), 691-699 (2015).
- Ravindran, K., Wellons, J. C., Dewan, M. C. Surgical outcomes for pediatric moyamoya: a systematic review and meta-analysis. Journal of Neurosurgery: Pediatrics. 24 (6), 663-672 (2019).
- Kim, H. S., et al. The neovascularization effect of bone marrow stromal cells in temporal muscle after encephalomyosynangiosis in chronic cerebral ischemic rats. Journal of Korean Neurosurgical Society. 44 (4), 249-255 (2008).
- Srivastava, P., et al. Neuroprotective and neuro-rehabilitative effects of acute purinergic receptor P2X4 (P2X4R) blockade after ischemic stroke. Experimental Neurology. , 329 (2020).
- Cao, R., et al. VEGFR1-mediated pericyte ablation links VEGF and PlGF to cancer-associated retinopathy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (2), 856-861 (2010).
- Hedlund, E., Hosaka, K., Zhong, Z., Cao, R., Cao, Y. Malignant cell-derived PlGF promotes normalization and remodeling of the tumor vasculature. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (41), 17505-17510 (2009).
- Cao, Y. Therapeutic angiogenesis for ischemic disorders: what is missing for clinical benefits. Discovery Medicine. 9 (46), 179-184 (2010).
- Verma, R., et al. Inhibition of miR-141-3p ameliorates the negative effects of poststroke social isolation in aged mice. Stroke. 49 (7), 1701-1707 (2018).
- Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
- Engel, O., Kolodziej, S., Dirnagl, U., Prinz, V. Modeling stroke in mice-middle cerebral artery occlusion with the filament model. Journal of Visualized Experiments. 47 (47), 2423 (2011).
- Pétrault, M., et al. Neither nefopam nor acetaminophen can be used as postoperative analgesics in a rat model of ischemic stroke. Fundam Clin Pharmacol. (2), 194-200 (2017).
- Khansari PS,, Halliwell RF, Mechanisms Underlying Neuroprotection by the NSAID Mefenamic Acid in an Experimental Model of Stroke. (64), (2019).
- Mishra, V., Verma, R., Raghubir, R. Neuroprotective effect of flurbiprofen in focal cerebral ischemia: the possible role of ASIC1a. Neuropharmacology. 59 (7-8), 582-588 (2010).
- Chen, T. Y., Goyagi, T., Toung, T. J., Kirsch, J. R., Hurn, P. D., Koehler, R. C., Bhardwaj, A. Prolonged opportunity for ischemic neuroprotection with selective kappa-opioid receptor agonist in rats. Stroke. 35 (5), 1180-1185 (2004).
- Turóczi, Z., et al. Muscle fiber viability, a novel method for the fast detection of ischemic muscle injury in rats. PLoS ONE. 9 (1), e84783 (2014).
- Im, K., Mareninov, S., Diaz, M. F. P., Yong, W. H. An introduction to performing immunofluorescence staining. Methods in Molecular Biology. , Clifton, N.J. 299-311 (2019).
- Zheng, J., et al. Protective roles of adenosine A1, A2A, and A3 receptors in skeletal muscle ischemia and reperfusion injury. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 293 (6), H3685-H3691 (2007).
- Jiao, C., et al. Visualization of mouse choroidal and retinal vasculature using fluorescent tomato lectin perfusion. Translational Vision Science and Technology. 9 (1), (2020).
- Simard, J. M., Sahuquillo, J., Sheth, K. N., Kahle, K. T., Walcott, B. P.
- Liu, X., et al. Osteoclasts protect bone blood vessels against senescence through the angiogenin/plexin-B2 axis. Nature Communications. 12 (1), 1832 (2021).
- Paro, M., Gamiotea-Turro, D., Blumenfeld, L., Bulsara KR,, Verma, R. A Novel Model for Encephalomyosynangiosis Surgery after Middle Cerebral Artery Occlusion-Induced Stroke in Mice. BioXriv. 10, (2021).
- Venkat, P., et al. Treatment with an Angiopoietin-1 mimetic peptide promotes neurological recovery after stroke in diabetic rats. CNS Neuroscience & Therapeutics. 27 (1), 48-59 (2021).
- Cheng, X., et al. Acidic fibroblast growth factor delivered intranasally induces neurogenesis and angiogenesis in rats after ischemic stroke. Neurological Research. 33 (7), 675-680 (2011).
- Xu, H. Protective effects of mutant of acidic fibroblast growth factor against cerebral ischaemia-reperfusion injury in rats. Injury. 40 (9), 963-967 (2009).
- Tsai, M. J., et al. Acidic FGF promotes neurite outgrowth of cortical neurons and improves neuroprotective effect in a cerebral ischemic rat model. Neuroscience. 305, 238-247 (2015).
- Meller, R., et al.
- Meseguer, E., et al. Osteopontin predicts three-month outcome in stroke patients treated by reperfusion therapies. Journal of Clinical Medicine. 9 (12), 4028 (2020).
- Zhu, Z., et al. Plasma osteopontin levels and adverse clinical outcomes after ischemic stroke. Atherosclerosis. 332, 33-40 (2021).
