Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Un modelo para el tratamiento de la encefalomiosinangiosis después del accidente cerebrovascular inducido por la oclusión de la arteria cerebral media en ratones

Published: June 22, 2022 doi: 10.3791/63951
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 1
1Department of Neuroscience, UConn School of Medicine, 2Division of Neurosurgery, UConn School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

El protocolo tiene como objetivo proporcionar métodos para la encefalomiosinangiosis (injerto de un colgajo de músculo vascular temporal en la superficie pial del tejido cerebral isquémico) para el tratamiento del accidente cerebrovascular isquémico agudo no moyamoya. La eficacia del enfoque en el aumento de la angiogénesis se evalúa utilizando un modelo transitorio de oclusión de la arteria cerebral media en ratones.

Abstract

No existe un tratamiento efectivo disponible para la mayoría de los pacientes que sufren de accidente cerebrovascular isquémico, lo que hace que el desarrollo de nuevas terapias sea imperativo. La capacidad del cerebro para autocurarse después de un accidente cerebrovascular isquémico está limitada por el suministro inadecuado de sangre en el área afectada. La encefalomiosinangiosis (EMS) es un procedimiento neuroquirúrgico que logra la angiogénesis en pacientes con enfermedad de moyamoya. Implica craneotomía con la colocación de un injerto de músculo vascular temporal en la superficie isquémica del cerebro. EMS nunca se ha estudiado en el contexto de accidente cerebrovascular isquémico agudo en ratones. La hipótesis que impulsa este estudio es que la EMS mejora la angiogénesis cerebral en la superficie cortical que rodea el injerto muscular. El protocolo que se muestra aquí describe el procedimiento y proporciona datos iniciales que respaldan la viabilidad y eficacia del enfoque EMS. En este protocolo, después de 60 minutos de oclusión transitoria de la arteria cerebral media (MCAo), los ratones fueron aleatorizados a MCAo o MCAo + EMS. El EMS se realizó 3-4 h después de la oclusión. Los ratones fueron sacrificados 7 o 21 días después del tratamiento MCAo o MCAo + EMS. La viabilidad del injerto temporalis se midió mediante el ensayo de nicotinamida adenina dinucleótido reducido en tetrazolio reductasa. Una matriz de angiogénesis de ratón cuantificó la expresión de proteínas angiogénicas y neuromoduladoras. La inmunohistoquímica se utilizó para visualizar la unión del injerto con la corteza cerebral y el cambio en la densidad de los vasos. Los datos preliminares aquí sugieren que el músculo injertado permaneció viable 21 días después de EMS. La inmunotinción mostró una implantación exitosa del injerto y un aumento en la densidad de los vasos cerca del injerto muscular, lo que indica un aumento de la angiogénesis. Los datos muestran que EMS aumenta el factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) y disminuye los niveles de osteopontina después del accidente cerebrovascular. Además, la EMS después del accidente cerebrovascular no aumentó la mortalidad, lo que sugiere que el protocolo es seguro y confiable. Este nuevo procedimiento es efectivo y bien tolerado y tiene el potencial de proporcionar información de nuevas intervenciones para mejorar la angiogénesis después del accidente cerebrovascular isquémico agudo.

Introduction

El accidente cerebrovascular isquémico es una lesión neurovascular aguda con secuelas crónicas devastadoras. La mayoría de los sobrevivientes de accidentes cerebrovasculares, 650,000 por año, en los Estados Unidos sufren de discapacidad funcional permanente1. Ninguno de los tratamientos disponibles confiere neuroprotección y recuperación funcional tras la fase aguda del ictus isquémico. Después de un accidente cerebrovascular isquémico agudo, los suministros de sangre directos y colaterales disminuyen, lo que conduce a la disfunción de las células y redes cerebrales, lo que resulta en déficits neurológicos repentinos 2,3. La restauración del suministro de sangre a la región isquémica sigue siendo el objetivo principal de la terapia del accidente cerebrovascular. Por lo tanto, mejorar la angiogénesis para promover el suministro de sangre en el territorio isquémico es un enfoque terapéutico prometedor; Sin embargo, los métodos previamente estudiados para promover la angiogénesis posterior al accidente cerebrovascular, incluyendo eritropoyetina, estatinas y factores de crecimiento, han sido limitados por niveles inaceptables de toxicidad o traducibilidad4.

La encefalomiosinangiosis (EMS) es un procedimiento quirúrgico que mejora la angiogénesis cerebral en humanos con enfermedad de moyamoya, una afección de arterias craneales estrechadas que a menudo conduce a un accidente cerebrovascular. EMS implica el desprendimiento parcial de una sección vascular del músculo temporal del paciente del cráneo, seguido de craneotomía e injerto del músculo en la corteza afectada. Este procedimiento es bien tolerado e induce angiogénesis cerebral, reduciendo el riesgo de accidente cerebrovascular isquémico en pacientes con enfermedad de moyamoya 5,6. Por lo tanto, el procedimiento cumple en gran medida un papel preventivo en estos pacientes. La angiogénesis provocada por este procedimiento también puede tener un papel en la promoción de la protección neurovascular y la recuperación en el contexto del accidente cerebrovascular isquémico. Este informe apoya la hipótesis de que la angiogénesis provocada por EMS tiene el potencial de ampliar la comprensión y las opciones terapéuticas para la isquemia cerebral.

Además de EMS, existen varios enfoques farmacológicos y quirúrgicos para mejorar la angiogénesis, pero tienen varias limitaciones. Se ha encontrado que los enfoques farmacológicos, como la administración del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), son insuficientes o incluso perjudiciales debido a varias limitaciones, incluida la formación de plexos vasculares caóticos, desorganizados, permeables y primitivos, que se asemejan a los encontrados en los tejidos tumorales 7,8 y no tienen efectos beneficiosos en los ensayos clínicos9.

Los abordajes quirúrgicos incluyen anastomosis directa como anastomosis superficial de arteria temporal temporal-arteria cerebral media, anastomosis indirecta como arterio-sinangiosis encefalo-duro (EDAS), encefalomiosinangiosis (EMS) y combinaciones de anastomosis directa e indirecta10. Todos estos procedimientos son muy desafiantes técnicamente y exigentes en animales pequeños, excepto en EMS. Mientras que los otros procedimientos requieren anastomosis vascular compleja, EMS requiere un injerto muscular relativamente simple. Además, la proximidad del músculo temporal a la corteza lo convierte en una opción natural para el injerto, ya que no necesita ser completamente extirpado o desconectado de su suministro de sangre, como sería necesario si se usara un músculo más distante para el injerto.

EMS ha sido estudiado en modelos de hipoperfusión cerebral crónica en ratas 7,11. Sin embargo, la EMS que utiliza un injerto de músculo temporal nunca se ha estudiado en el accidente cerebrovascular isquémico agudo en roedores. Aquí, describimos un nuevo protocolo de EMS en ratones después de un accidente cerebrovascular isquémico a través del modelo de oclusión de la arteria cerebral media (MCAo). Este manuscrito sirve como una descripción de los métodos y datos tempranos para este nuevo enfoque de EMS en ratones después de MCAo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Todos los experimentos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de UConn Health y se llevaron a cabo de acuerdo con las pautas de los Estados Unidos. El siguiente protocolo debe funcionar en cualquier especie o cepa de roedor. Aquí, se utilizaron ratones machos de tipo salvaje C57BL / 6 de 8 a 12 semanas de edad, de la misma edad y peso. Los ratones fueron alimentados con dieta estándar de comida y agua ad libitum. Las condiciones estándar de la vivienda se mantuvieron a 72.3 ° F y 30% -70% de humedad relativa con un ciclo de luz / oscuridad de 12 h.

1. Preparación previa a la cirugía

  1. Esterilice todos los instrumentos en autoclave antes de la cirugía. Desinfecte la superficie de operación con etanol al 70% y caliente la superficie de operación a 37 °C con una almohadilla térmica eléctrica.
  2. Utilice una cámara de inducción para anestesiar al ratón con 4% -5% de isoflurano para la inducción. Administrar isoflurano al 1,5% -2,0% a través del cono nasal para el mantenimiento hasta el final de la cirugía. Asegúrese antes de la cirugía de que el ratón esté adecuadamente anestesiado evaluando la falta de respuesta a un pellizco firme de la pata trasera y la pérdida de la reacción postural y el reflejo de enderezamiento.
  3. Coloque el mouse en su lado izquierdo en la superficie operativa y aplique ungüento para los ojos para proteger ambos ojos.
  4. Afeitar el vello sobre el campo quirúrgico (es decir, el cráneo lateral derecho entre el ojo y la oreja) con cortapelos eléctricos. Limpie el campo quirúrgico en círculos concéntricos hacia afuera desde el centro del sitio quirúrgico, con etanol al 70% seguido de solución de povidona, y repita estos pasos 2x.
    NOTA: Debido a que el sitio de la cirugía está cerca del ojo, la eliminación del 150% del área que rodea un sitio quirúrgico puede no ser posible para evitar irritación o lesiones accidentales en el ojo.
  5. Administrar una dosis única de bupivacaína al 0,25% (hasta 8 mg/kg de peso corporal) mediante inyección subcutánea como analgesia preoperatoria en el lugar de la cirugía.
  6. Coloque un microscopio quirúrgico con un aumento de 4x. El microscopio se utiliza para todos los pasos quirúrgicos.

2. Procedimiento quirúrgico

NOTA: Los pasos de la cirugía se presentan en la Figura 1. Para este protocolo, se asignaron tres ratones al grupo simulado, tres ratones para EMS solo, 12 ratones para MCAo y 23 ratones para el grupo MCAo + EMS.

  1. Cirugía MCAo
    NOTA: MCAo es un modelo bien caracterizado de accidente cerebrovascular isquémico en roedores, según lo descrito por nosotros y otros12,13,14. Los pasos de la cirugía se describen brevemente aquí. La isquemia cerebral focal transitoria fue inducida por un MCAo derecho de 60 min bajo anestesia con isoflurano seguido de reperfusión durante 7 o 21 días.
    1. Haga una incisión en el cuello ventral en la línea media seguida de MCAo derecho unilateral avanzando un monofilamento recubierto de caucho de silicona 6.0 de 10-11 mm de largo desde la bifurcación de la arteria carótida interna a través de un muñón de la arteria carótida externa. En ratones simulados, realice cirugías idénticas, excepto por el avance de la sutura en la arteria carótida interna.
    2. Mida la temperatura rectal utilizando un sistema de control de temperatura, manteniendo la temperatura a ~ 37 ° C durante la cirugía con una almohadilla térmica automática.
    3. Utilice la flujometría Doppler láser para medir el flujo sanguíneo cerebral antes de la inserción de la sutura colocando la sonda Doppler contra el cráneo lateral (correspondiente al territorio MCA) y registrando el valor8. Para confirmar la reducción de la oclusión al 15% del flujo sanguíneo cerebral basal, use el mismo procedimiento después de avanzar en la sutura. Para confirmar la reperfusión, use el mismo procedimiento después de retirar la sutura.
    4. Alimente a todos los animales con puré húmedo hasta el sacrificio y / o 1 semana después de la cirugía para garantizar una nutrición adecuada para los puntos finales crónicos, ya que los animales tienen déficits de cría después del accidente cerebrovascular.
  2. Cirugía EMS
    1. Después de 60 minutos de MCAo, aleatorice a los ratones en grupos MCAo solo o MCAo + EMS. Realice EMS 4 h después de MCAo (grupo MCAo + EMS) o cirugía simulada para experimentos seleccionados (grupo solo EMS). Cámbiese a un nuevo par de guantes quirúrgicos estériles antes de la cirugía.
      NOTA: Los ratones se recuperaron de la anestesia después de 60 minutos de MCAo y fueron reanestesiados antes de la cirugía EMS.
    2. Para los grupos que reciben EMS (MCAo + EMS o grupos solo EMS), haga una incisión cutánea de 10-15 mm con tijeras, que se extiende desde 1-2 mm rostral hasta la oreja derecha hasta 1-2 mm caudal hasta el ojo derecho.
      NOTA: Se utilizaron tijeras estériles para evitar daños accidentales en los músculos temporales debajo.
    3. Retraiga los colgajos de piel con pinzas e identifique visualmente el músculo temporal y el cráneo.
    4. Disecciona sin rodeos el músculo temporal lejos del cráneo usando tijeras con una técnica de extensión. Realizar una miotomía de 2-3 mm dirigida ventralmente a lo largo del borde caudal del músculo para facilitar la reflexión ventral.
    5. Realice una craneotomía de ~ 5 mm de diámetro en el cráneo debajo del músculo temporal reflejado usando un micro taladro.
    6. Retire la duramadre con pinzas para exponer la superficie pial del cerebro. Tenga mucho cuidado para evitar lesiones accidentales en el cerebro.
    7. Suturar el borde dorsal del músculo temporal al tejido subcutáneo del colgajo dorsal de piel con filamentos monocrilos 6-0, haciéndolo al ras de la corteza cerebral expuesta.
    8. Cierre la incisión cutánea con sutura de monofilamento 6-0. Coloque el ratón de nuevo en su jaula y monitoree hasta que se recupere de la anestesia. Devuelva el ratón a sus instalaciones de alojamiento.

3. Consideraciones postoperatorias

  1. Controle a los ratones para detectar enfermedades y el sitio quirúrgico para detectar infecciones diariamente. Administre solución salina normal subcutánea (1% de volumen por peso corporal) diariamente para apoyar la hidratación.
  2. Controle la deshidratación severa (pérdida de peso corporal >20%) hasta 7 días después de la cirugía. Administrar un bolo adicional de solución salina normal subcutánea 1% volumen por peso corporal si >20% pérdida de peso.
  3. Proceda con inyecciones, monitoreo fisiológico y otras pruebas sin consideraciones especiales.
    NOTA: En este procedimiento, se evitó el uso de opioides o antiinflamatorios no esteroideos (AINE) para tratar después de la cirugía debido a los efectos conocidos de estos agentes sobre el resultado del accidente cerebrovascular o el tamaño del infarto en consulta con el comité institucional interno de cuidado y uso de animales15,16,17,18. Sin embargo, el uso de analgesia postoperatoria es muy recomendable para la cirugía EMS con otros modelos. Consulte al Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) para esto.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Un total de 41 ratones fueron utilizados para este estudio. Después de tres mortalidades, una en MCAo y dos en MCAo + EMS, se utilizaron un total de 38 ratones para obtener los resultados mostrados.

Estadística
Los datos de cada experimento se presentan como media ± desviación estándar (DE). La significancia se determinó utilizando la prueba t de un estudiante no pareado para comparar dos grupos o ANOVA unidireccional para más de dos grupos, con una prueba post-hoc de Newman-Keuls para corregir las comparaciones múltiples.

Tinción de nicotinamida adenina dinucleótido (reducida)-tetrazolio reductasa (NADH-TR)
Esta tinción se realizó para evaluar la viabilidad a largo plazo del músculo injertado como en Turoczi et al.19. Brevemente, en el momento del sacrificio, el colgajo muscular injertado se extirpó cuidadosamente, se fijó con paraformaldehído al 4% durante 30 min y se criopreservó en un medio de temperatura óptima de corte (OCT) a -80 °C. Se tiñeron varias criosecciones de tejido muscular temporal de 12 μm de espesor para la reacción enzimática-histoquímica NADH-TR. Los portaobjetos se incubaron durante 30 min a 37 °C en una solución de nitroazul tetrazolio (1,8 mg/dL) y NADH (15 mg/dL) en tampón Tris 0,05 M (pH 7,6). El reactivo de tetrazolio no utilizado se eliminó mediante aumento seguido de disminución de las concentraciones de acetona. La evaluación cuantitativa del músculo teñido con NADH-tetrazolio se realizó en imágenes musculares tomadas con un aumento de 40x.

Estudios de inmunotinción
La inmunotinción se utilizó para visualizar la unión del injerto muscular con la corteza y la densidad de los vasos sanguíneos en la unión del músculo y la corteza20,21. Para la visualización de la unión muscular con el tejido cerebral, se utilizaron ratones que se habían sometido a cirugía EMS. Al final de cada punto de tiempo respectivo, los ratones fueron anestesiados con una inyección de avertin (50 mg / kg de peso corporal), seguida de perfusión con 1x PBS que contenía 5 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) y fijación con paraformaldehído al 4%. El cráneo se cortó cuidadosamente para evitar el desprendimiento accidental del injerto de músculo temporal (MT) de la corteza cerebral. El injerto de MT sobre la corteza cerebral se separó del músculo temporal restante. El cerebro se extrajo cuidadosamente y se fijó en paraformaldehído al 4% durante la noche. El cerebro fijo se deshidrató con sacarosa al 30% en 1x PBS hasta que el cerebro se hundió hasta el fondo del vial (aproximadamente 1-3 días). Las secciones de tejido de 30 μm de tamaño se cortaron con micrótomo de congelación y se montaron en portaobjetos.

Para la inmunotinción de los vasos sanguíneos en la corteza cerebral ipsilateral, los ratones MCAo y MCAo + EMS fueron sacrificados, perfundidos, fijados y procesados como se mencionó anteriormente. Las rebanadas de cerebro de 30 μm de tamaño se seccionaron en un micrótomo de congelación y se montaron en un lado de vidrio. La recuperación del antígeno se realizó mediante tampón citrato (pH 6,0) y las secciones se incubaron con tampón de bloqueo seguido de incubación durante la noche con anticuerpos primarios, actina 1:200 del músculo esquelético antialfa y lectina-Dy59421,22. Se tomaron tres secciones cerebrales coronales por ratón (n = 5 ratones/grupo; total = 15 secciones) entre 0,45 mm y 0,98 mm de bregma, se tiñeron y se visualizaron para su cuantificación con un aumento de 20x en la unión del núcleo isquémico y las regiones de penumbra. Un observador ciego cuantificó la densidad de vasos positivos de lectina en el parénquima cerebral utilizando el software ImageJ.

El injerto muscular sigue siendo viable a los 21 días después de la EMS
Un requisito previo para el éxito de esta cirugía es la viabilidad a largo plazo del músculo temporal injertado. El injerto de MT mostró daño transitorio de las células musculares a los 7 días después de la cirugía en músculo injertado vs. músculo control (71,32% de supervivencia de células musculares ± 16,64% vs. 97,19% ± 3,81%). Sin embargo, esta diferencia entre el músculo injertado y el músculo control desapareció, y los músculos se recuperaron completamente 21 días después de la cirugía (98,22% ± 3,965 vs. 96,87% ± 2,27%; Figura 2A).

Los injertos musculares hacen enlaces sueltos con el tejido cerebral
El injerto exitoso del músculo temporal en la superficie de la corteza cerebral es un requisito primordial para el éxito de este modelo. Tanto en el modelo EMS + MCAo como en el modelo solo EMS, los injertos musculares temporales se adhirieron a la superficie cortical 21 días después del EMS, lo que sugiere una cirugía exitosa, implantación del injerto y unión (Figura 1B y Figura 2B).

La densidad de los vasos sanguíneos aumenta en la corteza perilesional después de EMS
El accidente cerebrovascular agudo conduce a una reducción aguda del flujo sanguíneo cerebral, al reclutamiento impedido de vasos colaterales, a la germinación vascular anormal y a la angiogénesis disfuncional, lo que contribuye a los malos resultados del accidente cerebrovascular23. La EMS aumenta significativamente el área de superficie de los vasos sanguíneos y la densidad integrada en la corteza perilesional después del accidente cerebrovascular (p < 0,05 frente a MCAo sola; Figura 3).

Análisis de proteínas angiogénicas y neuromoduladoras
Se utilizó una matriz de angiogénesis de ratón para comparar la expresión de proteínas angiogénicas y neuromoduladoras 7 días y 21 días después de MCAo en ratones MCAo solo vs. MCAo + EMS según las instrucciones del fabricante24. El software ImageJ se utilizó para cuantificar la densidad de píxeles para cada punto de datos de la mancha de puntos de proteína. Los datos se registraron como la relación entre la densidad de cada proteína analizada y la densidad promedio de los patrones para cada blot.

El factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) ácido está regulado al alza y la osteopontina se regula a la baja después de EMS
Los resultados de la matriz de proteínas mostraron un aumento significativo en los niveles de proteína de FGF-ácido (0,677 ± 0,007 vs. 0,585 ± 0,014, p = 0,045), un potente factor angiogénico, y una disminución en los niveles de osteopontina, una molécula multifuncional expresada en condiciones inflamatorias (0,692 ± 0,007 vs. 0,758 ± 0,014, p = 0,048) en el grupo MCAo + EMS 21 días después del accidente cerebrovascular, lo que sugiere una mejor angiogénesis y neuroprotección (Figura 4A).

Resultados de mortalidad para EMS después de un accidente cerebrovascular
Tanto MCAo como EMS son técnicas quirúrgicas invasivas que pueden causar cierta mortalidad en ratones. En este experimento, hubo entre 10% y 11% de mortalidad en ratones 21 días después de la cirugía MCAo, que es una tasa de mortalidad aceptada para ratones sometidos a 60 min de MCAo14. La realización de EMS en ratones después de MCAo no aumentó la mortalidad (Figura 4B) lo que sugiere tolerancia a la cirugía de EMS incluso después de MCAo.

Figure 1
Figura 1. Procedimiento EMS paso a paso después de la oclusión de la arteria cerebral media (MCAo): (A) Paso 1. Se hace una incisión en la piel sobre el territorio de la arteria cerebral media derecha. La piel y los tejidos subcutáneos se reflejan, exponiendo el cráneo y el músculo temporal. Paso 2. El músculo temporal se disecciona lejos del cráneo y se refleja ventralmente. Paso 3. Se realiza una craneotomía (4-5 mm) y se retira suavemente la duramadre. Paso 4. El músculo temporal se coloca directamente sobre la superficie del cerebro para cubrir la corteza expuesta. Paso 5. El borde dorsal del músculo temporal se sutura al tejido subcutáneo del colgajo de piel dorsal, al ras de la superficie del cerebro. Paso 6. La incisión se cierra y el ratón se retira de la anestesia y se devuelve a su jaula. Esta parte de la cifra ha sido modificada de25. (B) Esquema conceptual para el tratamiento de la encefalomiosinangiosis (EMS) del accidente cerebrovascular inducido por MCAo. Abreviaturas: FGF = Factor de crecimiento de fibroblastos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2. Estudios de inmunotinción. (A) Los injertos musculares temporales mantienen la viabilidad. Los injertos musculares temporales (EMS) en el tejido de la corteza isquémica mantienen una alta viabilidad. (Izquierda) Imagen representativa de células del tejido muscular teñidas con nicotinamida adenina dinucleótido (reducido)-tetrazolio reductasa del control (músculo naïve del lado contralateral) y músculo injertado a los 7 días después de la oclusión de la arteria cerebral media (MCAo) + cirugía de encefalomiosinangiosis (EMS). La flecha negra () muestra las celdas dañadas. (Derecha) Cuantificación de células musculares vivas/muertas. Las células musculares a los 7 días después de la EMS muestran algún daño leve (p < 0.1; prueba t) que se recuperó completamente a los 21 días. (n = 5 ratones/puntos de tiempo = total 10 ratones en este grupo) Los datos son medias ± S.D. Barra de escala = 20 μm. (B) Unión del músculo temporal injertado con la corteza cerebral 21 días después de la cirugía EMS. Tejidos EMS teñidos con actina anti-alfa del músculo esquelético (verde) y anticuerpos Lectin-Dy594 (rojo; marcador de vasos sanguíneos) (n = 3 ratones). Barra de escala = 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: La cirugía de encefalomiosinangiosis (EMS) aumenta la densidad de los vasos sanguíneos en lesiones isquémicas 21 días después del accidente cerebrovascular . (A) Imágenes representativas de secciones cerebrales coronales de ratones sometidos a oclusión de la arteria cerebral media (izquierda) (MCAo) o MCAo + EMS (derecha) y teñidas con L. esculentum (Tomate) Lectin-Dy594, que se une a glicoproteínas en la membrana basal de las células endoteliales. Los gráficos son áreas cuantificadas. Los ratones MCAo + EMS mostraron una mayor red endotelio utilizando parámetros a saber, área de fracción vascular ( B) y densidad integrada (C). **p < 0,01 (prueba t no pareada), mientras que los ratones MCAo solo mostraron daño cerca de la lesión isquémica (línea discontinua). N = 5 ratones/grupo= 10 ratones en total. Los datos son medias ± S.D. Barra de escala = 100 μm. Abreviaturas: Contra = lado contralateral; Ipsi = lado ipsilateral. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: La encefalomiosinangiosis modula las proteínas angiogénicas después del accidente cerebrovascular . (A) Se utilizó una matriz de angiogénesis de ratón (ARY015) para evaluar simultáneamente los niveles relativos de 53 proteínas relacionadas con la angiogénesis del ratón después de la oclusión de la arteria cerebral media (MCAo) y MCAo + EMS (día 21 después de MCAo) en lisados de tejido cerebral de la corteza perilesional. El análisis cuantitativo muestra que la cirugía EMS redujo significativamente la osteopontina y aumentó la proteína ácida del factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) después del accidente cerebrovascular (* p < 0.05 o **p < 0.01) frente a MCAo ipsilateral. Los datos son medios ± S.D.; n = 3 ratones/grupo/punto de tiempo = total 15 ratones. (B) EMS no aumentó la mortalidad después del accidente cerebrovascular (MCAo). La curva de supervivencia de Kaplan Meier muestra que EMS + MCAO no cambió la mortalidad posterior al accidente cerebrovascular frente a MCAO solo (p = 0,54). Para EMS n = 3; para MCAo n = 11; y para MCAo + EMS n = 21. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Este protocolo describe un procedimiento EMS exitoso en un modelo de ratón de accidente cerebrovascular inducido por MCAo. Los datos muestran que el tejido injertado sigue siendo viable y puede formar vínculos con la corteza cerebral mucho después de la cirugía EMS. Estos hallazgos apoyan la justificación para usar un injerto muscular cerebral para desarrollar gradualmente un ambiente trófico rico en vascular en el sitio del accidente cerebrovascular. EMS es una terapia prometedora para reparar potencialmente el tejido cerebral infartado en el mismo entorno.

Los pasos críticos del protocolo incluyen el paso 2.2.4: este paso causa un trauma inevitable a la MT, lo que puede reducir su capacidad para vincularse con la corteza y liberar factores tróficos. Tenga cuidado de limitar el trauma de MT en la medida de lo posible. Una estrategia alternativa para reducir el trauma tisular es diseccionar sin rodeos la MT del cráneo solo en su borde dorsal y renunciar a la miotomía. En este caso, la MT se levantaría lejos del cráneo (en lugar de reflejarse completamente), y la craneotomía se realizaría con el taladro de craneotomía debajo del músculo. Esto reduce la cantidad de espacio disponible para realizar este paso, pero nuevamente puede reducir el trauma de MT. Además, el cuidado extremo y la práctica son necesarios en los pasos 2.2.5 y 2.2.6, para prevenir lesiones en la corteza cerebral subyacente durante la craneotomía y la manipulación de la duramadre.

Este modelo EMS es un complemento natural del modelo MCAo bien establecido. Debido a que el modelo MCAo simula de cerca la fisiopatología de la isquemia y el daño de la red vascular, que es común en pacientes humanos, es probable que el modelo MCAo + EMS tenga un alto nivel de traducibilidad a los humanos. El modelo EMS presentado aquí es la primera intervención terapéutica que se ha estudiado para el accidente cerebrovascular isquémico en el entorno preclínico que se basa solo en tejido autólogo. Además, debido a que el injerto de MT es orgánico y autólogo, puede demostrar interacciones de señalización paracrina con el cerebro lesionado adyacente que sirven para regular la liberación de factores tróficos a niveles óptimos en varios puntos de tiempo.

Mientras que el accidente cerebrovascular crea un ambiente proangiogénico y estimula la angiogénesis en sí misma26, la respuesta intrínseca posterior al accidente cerebrovascular no es suficiente para mejorar el suministro vascular en la región dañada debido a los niveles subumbrales de factores angiogénicos. Aquí, EMS mejoró aún más la expresión de la proteína ácida FGF en comparación con los animales que solo recibieron un accidente cerebrovascular. Esta proteína controla indirectamente la neovascularización en concierto con otros factores de crecimiento. FGF-ácido también actúa como factor neurotrófico, promoviendo la neuroprotección y la neurogénesis27,28. Algunos de los efectos neuroprotectores del FGF-ácido están mediados por la activación de las vías AKT y MAPK/EPK29. Además de FGF, también hubo una expresión reducida de la proteína osteopontina. La osteopontina es una citoquina proinflamatoria y pleotrópica que está siendo cada vez más reconocida por su papel en múltiples neuropatologías y procesos de remodelación tisular, entre otras funciones. El papel de la osteopontina en el accidente cerebrovascular aún es incierto30. Sin embargo, estudios recientes en humanos apuntan a la osteopontina como un factor de mal pronóstico después del accidente cerebrovascular. En un estudio se demostró una disminución en los niveles séricos de osteopontina después del accidente cerebrovascular para predecir resultados favorables (puntuación modificada de la escala de Rankin < 2 a los 90 días) en pacientes humanos con accidente cerebrovascular31. Otro estudio mostró una relación dosis-dependiente entre los niveles más altos de osteopontina plasmática y los resultados de muerte y discapacidad en pacientes humanos después del accidente cerebrovascular32. En línea con estos estudios clínicos, los datos aquí sugieren que la osteopontina reducida después de EMS puede promover un ambiente antiinflamatorio para aumentar la formación de neovasos. En general, la expresión diferencial de FGF-ácido y osteopontina apunta hacia los mecanismos que gobiernan la angiogénesis después de EMS en este modelo de ratón y aumenta la probabilidad de que el procedimiento que también puede provocar neuroprotección y neuro-regeneración además de la angiogénesis.

Existen algunas limitaciones potenciales de este procedimiento. La medición del flujo cerebral debido al aumento de la densidad de los vasos sanguíneos es un desafío en este procedimiento, ya que los procedimientos comúnmente utilizados de láser Doppler o medidor de flujo de moteado láser se ven afectados por la presencia de músculo temporal en la parte superior de la corteza que impiden la medición verdadera de la sangre en la superficie cortical. Por lo tanto, este procedimiento puede necesitar una resonancia magnética de roedores pequeños más sofisticada, pero rara vez disponible, si se requiere una medición de flujo en tiempo real. Sin embargo, el uso de la medición de la densidad de los vasos sanguíneos apoya indirectamente el éxito del procedimiento EMS para mejorar la angiogénesis según lo sugerido por nuestros datos. Otra limitación es la naturaleza invasiva de las intervenciones de EMS en la parte superior de MCAo, que en sí mismo es un procedimiento invasivo. Si bien no hubo un aumento de la mortalidad con EMS en este estudio en comparación con MCAo solamente, el requisito de hemicraniectomía puede limitar su traducibilidad futura para todos los tipos de accidente cerebrovascular. Sin embargo, en la práctica clínica, el >10% de los pacientes con accidente cerebrovascular isquémico grande requieren hemicraniectomía para manejar el aumento de la presión intracraneal23, y este modelo EMS puede tener valor traslacional para este subgrupo de pacientes con accidente cerebrovascular en particular. Finalmente, el punto de tiempo de 4 h post-MCAo para el rendimiento de EMS se eligió para caer dentro de la ventana de tratamiento estándar de rT-PA para la mayoría de los pacientes humanos, aunque los estudios futuros utilizarán puntos de tiempo posteriores para evaluar la ventana terapéutica para EMS.

En general, el modelo EMS proporciona una opción bien tolerada para inducir la angiogénesis después del accidente cerebrovascular isquémico y, además de su posible traducción clínica, puede usarse en estudios futuros que examinen la fisiopatología del accidente cerebrovascular y la angiogénesis.

El modelo EMS descrito aquí ofrece un método seguro para lograr la angiogénesis cerebral para el estudio preclínico, evitando la necesidad de intervenciones farmacológicas, que a menudo conducen a efectos secundarios no deseados o angiogénesis incontrolada. Muchos pacientes con accidentes cerebrovasculares isquémicos grandes requieren una hemicraniectomía durante su curso clínico para controlar el aumento de la presión intracraneal. Este procedimiento EMS, que también incluye hemicraniectomía en ratones para injerto muscular, puede proporcionar una prueba de concepto preclínica para la aplicación traslacional de EMS en el accidente cerebrovascular isquémico. Por lo tanto, este modelo tiene el potencial de ampliar el conocimiento de la recuperación neurovascular después de un accidente cerebrovascular isquémico y facilitar el desarrollo de la innovación, que son la necesidad del momento, en la terapéutica para los sobrevivientes de accidentes cerebrovasculares.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por Research Excellence Program-UConn Health (a Ketan R Bulsara y Rajkumar Verma) y UConn Health start-up (a Rajkumar Verma).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6-0 monocryl suture Ethilon 697G
70% ethanol to sanitize operating surface Walgreens
Bupivacaine 0.25% solution Midwest Vet
Clamps for tissue retraction Roboz
Doccal suture with silicone coating Doccal Corporation 602145PK10Re
Electric heating pad for operating surface
Isoflurane anesthesia Piramal Critical Care Inc
Isoflurane delivery apparatus B6Surgivet (Isotech 4)
Micro drill Harvard Apparatus
Microdissecting tweezers, curved x2 Piramal Critical Care Inc
mouse angiogenesis panel arrat R& D biotech ARY015
Needle driver Ethilon
Ointment for eye protection Walgreens
Operating microscope Olympus
Operating surface Olympus
Povidone iodine solution Walgreens
Rectal thermometer world precison instrument
Saline or 70% ethanol for irrigation Walgreens
Small electric razor to shave operative site Generic
Surgical scissors Roboz

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stroke, Last updated 10/22/20. , Accessed 11/12/20. https://www.cdc.gov/stroke/index.htm (2020).
  2. Cipolla, M. J., McCall, A. L., Lessov, N., Porter, J. M. Reperfusion decreases myogenic reactivity and alters middle cerebral artery function after focal cerebral ischemia in rats. Stroke. 28 (1), 176-180 (1997).
  3. Arai, K., et al. Cellular mechanisms of neurovascular damage and repair after stroke. Journal of Child Neurology. 26 (9), 1193-1198 (2011).
  4. Ergul, A., Alhusban, A., Fagan, S. C. Angiogenesis: a harmonized target for recovery after stroke. Stroke. 43 (8), 2270-2274 (2012).
  5. Imai, H., et al. The importance of encephalo-myo-synangiosis in surgical revascularization strategies for moyamoya disease in children and adults. World Neurosurgery. 83 (5), 691-699 (2015).
  6. Ravindran, K., Wellons, J. C., Dewan, M. C. Surgical outcomes for pediatric moyamoya: a systematic review and meta-analysis. Journal of Neurosurgery: Pediatrics. 24 (6), 663-672 (2019).
  7. Kim, H. S., et al. The neovascularization effect of bone marrow stromal cells in temporal muscle after encephalomyosynangiosis in chronic cerebral ischemic rats. Journal of Korean Neurosurgical Society. 44 (4), 249-255 (2008).
  8. Srivastava, P., et al. Neuroprotective and neuro-rehabilitative effects of acute purinergic receptor P2X4 (P2X4R) blockade after ischemic stroke. Experimental Neurology. , 329 (2020).
  9. Cao, R., et al. VEGFR1-mediated pericyte ablation links VEGF and PlGF to cancer-associated retinopathy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (2), 856-861 (2010).
  10. Hedlund, E., Hosaka, K., Zhong, Z., Cao, R., Cao, Y. Malignant cell-derived PlGF promotes normalization and remodeling of the tumor vasculature. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (41), 17505-17510 (2009).
  11. Cao, Y. Therapeutic angiogenesis for ischemic disorders: what is missing for clinical benefits. Discovery Medicine. 9 (46), 179-184 (2010).
  12. Verma, R., et al. Inhibition of miR-141-3p ameliorates the negative effects of poststroke social isolation in aged mice. Stroke. 49 (7), 1701-1707 (2018).
  13. Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
  14. Engel, O., Kolodziej, S., Dirnagl, U., Prinz, V. Modeling stroke in mice-middle cerebral artery occlusion with the filament model. Journal of Visualized Experiments. 47 (47), 2423 (2011).
  15. Pétrault, M., et al. Neither nefopam nor acetaminophen can be used as postoperative analgesics in a rat model of ischemic stroke. Fundam Clin Pharmacol. (2), 194-200 (2017).
  16. Khansari PS,, Halliwell RF, Mechanisms Underlying Neuroprotection by the NSAID Mefenamic Acid in an Experimental Model of Stroke. (64), (2019).
  17. Mishra, V., Verma, R., Raghubir, R. Neuroprotective effect of flurbiprofen in focal cerebral ischemia: the possible role of ASIC1a. Neuropharmacology. 59 (7-8), 582-588 (2010).
  18. Chen, T. Y., Goyagi, T., Toung, T. J., Kirsch, J. R., Hurn, P. D., Koehler, R. C., Bhardwaj, A. Prolonged opportunity for ischemic neuroprotection with selective kappa-opioid receptor agonist in rats. Stroke. 35 (5), 1180-1185 (2004).
  19. Turóczi, Z., et al. Muscle fiber viability, a novel method for the fast detection of ischemic muscle injury in rats. PLoS ONE. 9 (1), e84783 (2014).
  20. Im, K., Mareninov, S., Diaz, M. F. P., Yong, W. H. An introduction to performing immunofluorescence staining. Methods in Molecular Biology. , Clifton, N.J. 299-311 (2019).
  21. Zheng, J., et al. Protective roles of adenosine A1, A2A, and A3 receptors in skeletal muscle ischemia and reperfusion injury. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 293 (6), H3685-H3691 (2007).
  22. Jiao, C., et al. Visualization of mouse choroidal and retinal vasculature using fluorescent tomato lectin perfusion. Translational Vision Science and Technology. 9 (1), (2020).
  23. Simard, J. M., Sahuquillo, J., Sheth, K. N., Kahle, K. T., Walcott, B. P. Managing malignant cerebral infarction. Current Treatment Options in Neurology. 13 (2), 217-229 (2011).
  24. Liu, X., et al. Osteoclasts protect bone blood vessels against senescence through the angiogenin/plexin-B2 axis. Nature Communications. 12 (1), 1832 (2021).
  25. Paro, M., Gamiotea-Turro, D., Blumenfeld, L., Bulsara KR,, Verma, R. A Novel Model for Encephalomyosynangiosis Surgery after Middle Cerebral Artery Occlusion-Induced Stroke in Mice. BioXriv. 10, (2021).
  26. Venkat, P., et al. Treatment with an Angiopoietin-1 mimetic peptide promotes neurological recovery after stroke in diabetic rats. CNS Neuroscience & Therapeutics. 27 (1), 48-59 (2021).
  27. Cheng, X., et al. Acidic fibroblast growth factor delivered intranasally induces neurogenesis and angiogenesis in rats after ischemic stroke. Neurological Research. 33 (7), 675-680 (2011).
  28. Xu, H. Protective effects of mutant of acidic fibroblast growth factor against cerebral ischaemia-reperfusion injury in rats. Injury. 40 (9), 963-967 (2009).
  29. Tsai, M. J., et al. Acidic FGF promotes neurite outgrowth of cortical neurons and improves neuroprotective effect in a cerebral ischemic rat model. Neuroscience. 305, 238-247 (2015).
  30. Meller, R., et al. Neuroprotection by osteopontin in stroke. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 25 (2), 217-225 (2005).
  31. Meseguer, E., et al. Osteopontin predicts three-month outcome in stroke patients treated by reperfusion therapies. Journal of Clinical Medicine. 9 (12), 4028 (2020).
  32. Zhu, Z., et al. Plasma osteopontin levels and adverse clinical outcomes after ischemic stroke. Atherosclerosis. 332, 33-40 (2021).

Tags

Neurociencia Número 184
Un modelo para el tratamiento de la encefalomiosinangiosis después del accidente cerebrovascular inducido por la oclusión de la arteria cerebral media en ratones
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Paro, M. R., Gamiotea Turro, D.,… More

Paro, M. R., Gamiotea Turro, D., Mcgonnigle, M., Bulsara, K. R., Verma, R. A Model for Encephalomyosynangiosis Treatment after Middle Cerebral Artery Occlusion-Induced Stroke in Mice. J. Vis. Exp. (184), e63951, doi:10.3791/63951 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter