Summary
이 프로토콜은 야누스 염기 나노 튜브 (JBNts), 마트린 -3 및 형질 전환 성장 인자 베타 -1 (TGF-β1)을 순차적으로 추가하여 층별 야누스 염기 나노 매트릭스 (JBNm) 스캐 폴드의 조립을 설명합니다. JBNm은 제작되고 특성화되었습니다. 또한 우수한 생리활성을 나타내어 부착, 증식 및 분화와 같은 세포 기능을 촉진했습니다.
Abstract
다양한 생체 재료 스캐폴드는 시험관내 및 생체 내 사용을 위한 특정 기능을 촉진하기 위해 세포 부착 및 증식을 안내하기 위해 개발되었습니다. 이러한 생체 재료 스캐폴드 내로의 성장 인자의 첨가는 일반적으로 최적의 세포 배양 환경을 제공하고, 세포 분화 및 그 후속 기능을 매개하기 위해 수행된다. 그러나, 종래의 생체 재료 스캐폴드 내의 성장 인자는 전형적으로 이식시 방출되도록 설계되어, 주변 조직 또는 세포에 의도하지 않은 부작용을 초래할 수 있다. 여기에서 DNA에서 영감을 받은 야누스 염기 나노매트릭스(JBNm)는 자체 지속 가능한 연골 조직 구조를 위한 층별 구조로 고도로 국소화된 미세 환경을 성공적으로 달성했습니다. JBNms는 야누스 염기 나노 튜브 (JBNts), 마트린 -3 및 생체 친화도를 통해 성장 인자 베타 -1 (TGF-β1)에서 자체 조립됩니다. JBNm은 TGF-β1:matrilin-3:JBNt 비율이 1:4:10으로 조립되었는데, 이는 층별 구조로의 적절한 조립이 발생할 수 있는 결정된 비율이기 때문입니다. 먼저, TGF-β1 용액을 마트릴린-3 용액에 첨가하였다. 이어서, 이 혼합물을 JBNt 용액의 첨가 전에 충분한 균질성을 보장하기 위해 수회 피펫팅하였다. 이것은 여러 번 다시 피펫팅한 후 층별 JBNm을 형성했습니다. 층별 JBNm 구조, JBNt 단독, 마트릴린-3 단독, 및 TGF-β1 단독을 특성화하기 위해 다양한 실험을 수행하였다. JBNm의 형성은 UV-Vis 흡수 스펙트럼으로 연구되었고, JBNm의 구조는 투과 전자 현미경 (TEM)으로 관찰되었습니다. 혁신적인 층별 JBNm 스캐폴드가 분자 규모로 형성됨에 따라 형광 염료 표지 JBNm을 관찰할 수 있었습니다. TGF-β1은 주사 가능한 JBNm의 내부 층 내에 국한되어 주변 부위로의 성장 인자 방출을 방지하고 국소 연골 생성을 촉진하며 항 비대 미세 환경을 촉진 할 수 있습니다.
Introduction
조직 공학의 스캐폴드는 세포 부착 및 후속조직 발달을 위한 구조적 지지를 제공하는 데 중요한 역할을 합니다1. 전형적으로, 어떠한 스캐폴딩도 없는 종래의 조직 구축물은 세포 배양 환경에 의존하고 세포 분화를 매개하기 위해 추가된 성장 인자에 의존한다. 또한, 스캐폴드에 생리활성 분자를 추가하는 것은 종종 세포 분화 및 기능 2,3을 안내하는 데 선호되는 접근 방식입니다. 일부 스캐폴드는 네이티브 조직의 생화학적 미세 환경을 독립적으로 모방할 수 있는 반면, 다른 스캐폴드는 성장 인자를 통해 세포 기능에 직접 영향을 미칠 수 있습니다. 그러나 연구자들은 종종 세포 부착, 성장 및 분화에 긍정적인 영향을 미칠 수 있는 스캐폴드를 선택하는 데 어려움을 겪는 동시에장기간에 걸쳐 최적의 구조적 지지와 안정성을 제공합니다4,5. 생리 활성 분자는 종종 스캐폴드에 느슨하게 결합되어 이식시 이러한 단백질이 빠르게 방출되어 원치 않는 위치에서 방출됩니다. 이것은 의도적으로 표적화되지 않은 조직이나 세포에 대한 부작용으로 절정에 달합니다 6,7.
비계는 일반적으로 고분자 재료로 만들어집니다. 야누스 베이스 나노-매트릭스(JBNm)는 자가 지속 가능한 연골 조직 구축물8을 위한 새로운 층별 방법으로 만들어진 생체모방 스캐폴드 플랫폼이다. 이 새로운 DNA에서 영감을 받은 나노튜브는 세포외 기질(ECM)에서 발견되는 콜라겐의 구조와 표면 화학을 적절하게 모방하기 때문에 야누스 베이스 나노튜브(JBNts)로 명명되었습니다. JBNm은 matrilin-3 및 형질 전환 성장 인자 베타 -1 (TGF-β1)과 같은 생리 활성 분자를 첨가하여 원하는 세포 및 조직 기능을 자극 할 수있는 최적의 미세 환경을 만들 수 있습니다9.
JBNts는 핵염기 아데닌과 티민의 합성 버전에서 파생 된 새로운 나노 튜브입니다. JBNts는 자체 조립(10)을 통해 형성됩니다. 6 개의 합성 핵염기가 결합하여 고리를 형성하고,이 고리는 π-π 스태킹 상호 작용을 거쳐 길이 200-300 μm의 나노 튜브를 만듭니다11. 이 나노 튜브는 구조적으로 콜라겐 단백질과 유사합니다. 천연 연골 미세 환경의 한 측면을 모방함으로써 JBNts는 연골 세포 및 인간 중간엽 줄기 세포(hMSC)에 유리한 부착 부위를 제공하는 것으로 나타났습니다11,12,13,14. 나노 튜브는 자체 조립을 거치고 어떤 종류의 개시제 (예 : 자외선)도 필요로하지 않기 때문에 도달하기 어려운 결함 영역15에 대한 주사 가능한 스캐 폴드로서의 흥미로운 잠재력을 보여줍니다.
Matrilin-3는 연골에서 발견되는 구조적 세포 외 기질 단백질입니다. 이 단백질은 연골 형성과 적절한 연골 기능에 중요한 역할을합니다16,17. 최근에는 생체 재료 스캐폴드에 포함되어 비대 9,18,19 없이 연골 생성을 촉진합니다. 이 단백질을 JBNm에 포함시킴으로써 연골 세포는 천연 미세 환경과 유사한 구성 요소를 포함하는 스캐 폴드에 끌립니다. 또한, 마트리린-3은 연골세포20 내에서 적절한 TGF-β1 신호전달을 위해 필요한 것으로 나타났다. 성장 인자는 신호 분자로 기능하여 특정 세포 또는 조직의 특정 성장을 유발합니다. 따라서 최적의 연골 재생을 달성하기 위해 매트릴린-3 및 TGF-β1은 JBNm 내의 필수 구성 요소입니다. 층별 스캐폴드 내로 TGF-β1을 첨가하면 조직 구축물에서 연골 재생을 더욱 촉진할 수 있다. TGF-β1은 연골 결손의 치유 과정을 촉진하고 연골 세포 및 hMSC 증식 및 분화를 촉진하는 데 사용되는 성장 인자입니다21,22. 따라서 TGF-β1은 연골 재생 JBNm (J / T / M JBNm) 23에서 중요한 역할을하며, 특히 JBNm 층 내에 국한 될 때 적절한 성장을 촉진합니다.
앞서 언급했듯이 성장 인자는 일반적으로 특정 혼입 방법 없이 스캐폴드 외부에 조립됩니다. 여기에서 생체 재료의 정밀하게 설계된 나노 아키텍처를 통해 JBNm은 의도된 세포와 조직의 특정 표적화를 위해 개발되었습니다. JBNm은 내층의 JBNt 표면에 부착된 TGF-β1과 외층(24,25)의 JBNt 표면에 부착된 마트릴린-3으로 구성된다. 층별 구조의 내부 층에 TGF-β1을 혼입하면 JBNm 섬유를 따라 고도로 국소화된 미세 환경을 허용하여 단백질12의 훨씬 느린 방출을 갖는 항상성 조직 구축물을 생성합니다. JBNm의 주입성은 다양한 미래의 생체 재료 응용 분야에 이상적인 연골 조직 구조물입니다26.
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Protocol
1. JBNts의 합성
- 다양한 화합물12의 합성을 수반하는 이전에 공개된 방법을 활용하여 JBNt 단량체를 제조한다.
- 조 JBNt 단량체가 합성된 후 역상 컬럼을 사용하여 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)로 정제합니다. 용매 A : 100 % 물, 용매 B : 100 % 아세토 니트릴 및 용매 C : pH = 1의 HCl 수용액을 사용하십시오. 3mL/분의 유속을 사용하십시오. HPLC에서 얻은 가장 큰 피크를 7.2분에 수집한다.
2. JBNt / Matn1 / TGF-β1 제작 (비디오 1)
알림: 비디오 1 은 JBNm이 생리적 환경(수용액, 자외선 없음, 화학 첨가물 없음 및 가열 없음)에서 형성된 주사 가능한 고체임을 보여주며, 이는 생물학적으로도 영감을 받았습니다.
- H2O에 현탁 된 1 mg / mL TGF-β1 8 μL를 H2O에 현탁 된 1 mg / mL matrilin-3 3 32 μL에 첨가하여 이러한 단백질의 적절한 혼합을 보장합니다.
- H2O에 현탁된 1mg/mL JBNts 80μL를 TGF-β1/마트리린-3 용액에 첨가합니다. 적절한 혼합을 위해 반복적으로 피펫팅하십시오. 백색 응집의 존재는 JBNt의 첨가 직후에 관찰 될 수 있으며, 이는 JBNm의 형성을 나타냅니다 (비디오 1).
3. 자외선 가시광선(UV-Vis) 흡수가 있는 검체 관찰
참고: UV-Vis 흡수 스펙트럼은 JBNm의 어셈블리를 특성화하기 위해 연구되었습니다. 이 측정은 JBNt 단독, 마트릴린-3 단독, TGF-β1 단독, 및 세 부분으로 구성된 전체 층별 JBNm의 네 가지 범주에 대해 분석되었습니다. 모든 초기 농도는H2O에 현탁된다.
- JBNt 그룹의 경우 5μL의H2O에 1mg/mL JBNt 50μL를 추가하여 90.9μg/mL 용액을 만듭니다.
- matrilin-3 그룹의 경우 40μL의 10μg/mL matrilin-3을 15μL의H2O에 추가하여 7.3μg/mL 용액을 만듭니다.
- TGF-β1 그룹의 경우 10μL의 10μg/mL TGF-β1을 45μL의H2O에 추가하여 1.8μg/mL 용액을 만듭니다.
- JBNm 그룹의 경우 10μg/mL 마트릴린-3 40μL를 10μg/mL TGF-β1 10μL에 추가합니다. 적절한 혼합을 보장하기 위해 교반한 다음 5μL의 1mg/mL JBNts를 용액에 첨가하고 반복적으로 피펫팅하여 샘플을 혼합합니다.
- 분광 광도계를 사용하여 각 그룹의 흡수 스펙트럼을 측정합니다.
4. 시편의 제타 전위 측정
참고: JBNm이 생체 내 조직과 어떻게 상호 작용하는지 더 잘 예측하기 위해 제타 전위를 분석했습니다. 세 그룹이 측정되었다: 마트릴린-3 단독, TGF-β1을 사용한 매트릴린-3, 및 전체 층별 JBNm.
- matrilin-3 그룹의 경우 160μL의 10mg/mL matrilin-3을 640μL의H2O에 추가하여 800μL 용액을 만듭니다.
- 매트릴린-3/TGF-β1 화합물의 경우 10μg/mL 매트린-3 160μL를 10μg/mL TGF-β1 40μL에 추가합니다. 적절한 균질성을 보장하기 위해 반복적으로 피펫팅하십시오. 이어서, 이를 600 μL의H2O에 첨가하여 800 μL 용액을 생성한다.
- JBNm 그룹의 경우 10μg/mL 매트린-3 160μL를 10μg/mL TGF-β1 40μL에 추가합니다. 단백질을 혼합하기 위해 여러 번 피펫팅하십시오. 그런 다음 균질성을 보장하기 위해 용액과 피펫에 1mg/mL JBNts 20μL를 추가합니다. 마지막으로, JBNm 용액을 580 μL의H2O에 첨가하여 800 μL 용액을 생성한다.
- 세 그룹에 대한 제타 전위 값을 측정합니다.
5. 투과전자현미경(TEM)을 위한 JBNt/마트릴린-3 나노매트릭스의 제조
참고 : TEM 특성화는 JBNts 및 JBNm의 형태를 특성화하기 위해 수행됩니다.
- 두 개의 그리드를 플라즈마 클리너에 삽입하여 게시된 프로토콜 및 제조업체의 프로토콜12에 따라 JBNts 및 JBNm의 음성 염색 전에 그리드를 적절하게 청소합니다.
- 10μL의 1mg/mL JBNt와 40μL의 증류수를 혼합하여 200μg/mL JBNt 용액을 만듭니다.
- 30μL의 100μg/mL 매트릴린-3을 20μL의 100μg/mL TGF-β1 및 피펫과 여러 번 혼합합니다. 10 μL의 1 mg / mL JBNts를 matrilin-3 / TGF-β1 혼합물에 첨가하여 JBNm 샘플을 준비합니다. 다시, 반복적으로 피펫.
- 3μL의 JBNt 용액(200μg/mL)과 3μL의 JBNm 용액을 별도의 그리드에 추가하고 2분 동안 그대로 두십시오.
- 각 그리드를 100 μL의 우라닐 아세테이트 용액 (0.5 %)으로 헹굽니다. 여과지를 사용하여 여분의 용액을 제거하고 그리드를 자연 건조시킵니다.
- 투과 전자 현미경을 작동하여 이전에 발표 된11,12와 같이 샘플을 적절하게 관찰하고 특성화합니다.
6. 형광표지 단백질의 흡수 스펙트럼 측정
참고 : JBNm의 구조는 흡수 스펙트럼 분석을 통해 JBNm의 구조를 관찰하여 검증됩니다.
- 제조업체의 지침에 따라 단백질 라벨링 키트를 사용하여 TGF-β1에 라벨을 붙입니다. 20 μL의 20 μg/mL 표지된 TGF-β1을 25 μL의 H2O에 첨가하여 8.9 μg/mL 시험 용액을 만듭니다.
- 별도의 라벨링 키트를 사용하여 matrilin-3에 라벨을 붙입니다. 20 μL의 80 μg/mL 표지된 매트린-3을 25 μL의H2O에 첨가하여 36 μg/mL 시험 용액을 만듭니다.
참고 : TGF-β1의 형광 염료 라벨링은 최종 농도가 20 μg / mL 인 반면, matrilin-3의 라벨링은 최종 농도가 80 μg / mL입니다. - 20 μL의 80 μg/mL 표지된 매트린-3을 20 μL의 20 μg/mL 표지된 TGF-β1 및 5 μL의 H2O와 혼합하면 표지된 TGF-β1/matrilin-3 화합물이 생성됩니다. 혼합물을 여러 번 피펫팅하여 혼합하십시오.
- 40 μL의 H2O에 5 μL의 1 mg / mL JBNts를 첨가하여 111 μg / mL 용액을 만듭니다.
- 20μL의 20μg/mL 표지된 TGF-β1을 80μg/mL로 표지된 매트린-3 및 피펫 20μL에 여러 번 추가합니다. 표지된 TGF-β1/매트린-3 용액에 5μL의 1mg/mL JBNts를 추가하고 화합물을 적절하게 혼합하기 위해 반복적으로 피펫팅합니다.
참고 : JBNt, 표지 된 TGF-β1 및 표지 된 matrilin-3 샘플의 최종 농도는 각각 111 μg / mL, 8.9 μg / mL 및 36 μg / mL였습니다. - 각 샘플 그룹 (즉, 표지 된 TGF-β1 (단계 6.1), 표지 된 매트린 -3 (단계 6.2), 표지 된 TGF-β1 / 마트릴린 -3 (단계 6.3), JBNts (단계 6.4), JBNm (단계 6.5))을 검은 색 384 웰 플레이트의 자신의 웰로 옮깁니다.
- 검은색 384웰 플레이트를 다중 모드 마이크로플레이트 리더에 로드하고 제조업체의 프로토콜에 따라 488nm 및 555nm의 여기 파장에서 측정합니다.
7. 시험관 내 생물학적 기능 분석
- 사전 코팅된 커버 유리 챔버의 세포 접착력 테스트
- 각 셀 유형에 하나의 커버 글라스가 사용되므로 5 개의 샘플 그룹으로 2 개의 챔버 커버 글라스를 준비하십시오.
- 198.75μL의 증류수에 1.25μL의 1mg/mL JBNts를 첨가하여 6.25μg/mL 용액을 생성합니다.
- 190μL의 증류수에 10μL의 10μg/mL 매트린-3을 추가하여 0.5μg/mL 용액을 만듭니다.
- 197.5 μg/mL의 증류수에 10 μg/mL TGF-β1 2.5 μL를 첨가하여 0.125 μg/mL 용액을 만듭니다.
- JBNm 그룹의 경우 10μg/mL 매트린-3 10μL를 10μg/mLTGF-β1 및 피펫 2.5μL에 추가합니다. 1 mg/mL 농도의 JBNts 1.25 μL를 혼합물 용액과 피펫에 추가합니다. 마지막으로 186.25μL의 증류수를 추가하여 200μL JBNm 용액을 만듭니다.
- 대조군의 경우 200μL의 증류수를 사용하십시오.
- 각 샘플 그룹을 No. 1.5 챔버 커버 글라스의 자체 웰에 추가하십시오. 커버 글라스를 -80 °C 냉동고에 1 시간 동안 넣은 다음 동결 건조기 기기로 동결 건조시킵니다.
- 준비된 챔버 커버 글라스의 각 웰에 인간 중간엽 줄기세포(hMSC)와 인간 연골세포 세포(웰당 10,000개 세포)를 시드합니다.
- 두 개의 커버 글라스를 37°C 인큐베이터에서 4시간 동안 배양합니다. 이어서, 세포 배양 배지를 흡인하고 PBS로 2회 헹굽니다.
- 세포를 4% 파라포름알데히드로 5분 동안 고정한 다음 PBS로 샘플을 제거하고 헹굽니다. 샘플을 두 번째로 헹구어 4% 파라포름알데히드를 완전히 제거합니다.
- 세포를 100 μL의 0.1% 트리톤-X로 10분 동안 배양하고 PBS로 세척한다. 각 웰에 0.165μM 로다민-팔로이딘 100μL를 추가합니다. 30분 동안 기다렸다가 PBS로 다시 씻습니다.
- 각 웰에 0.1μg/mL DAPI를 추가하여 핵을 염색합니다. 5 분 동안 기다렸다가 PBS로 웰을 두 번 헹굽니다.
- 스펙트럼 컨포칼 현미경을 사용하여 세포 형태를 관찰하고 형광 이미지를 캡처합니다.
- 또한 이미지 처리 소프트웨어를 사용하여 세포 수와 형태를 분석합니다. 소프트웨어를 열고 이미지를로드하십시오. 스케일 바를 추가하고 소프트웨어를 보정합니다. 각 샘플에 대해 주어진 영역의 셀 수를 계산합니다. 그런 다음 측정 도구를 사용하여 각 샘플의 세포 형태에 대한 데이터를 수집합니다.
- 세포 증식
- 3개의 처리되지 않은 96웰 플레이트를 준비하고 각각에 5개의 샘플 그룹을 추가합니다.
- JBNt 그룹의 경우 증류수 596.25μL에 1mg/mL JBNts 3.75μL를 추가하면 농도가 6.25μg/mL인 600μL JBNt 용액이 생성됩니다.
- TGF-β1 그룹의 경우 592.5μL의 증류수에 10μg/mL TGF-β1 7.5μL를 추가하여 0.125μg/mL의 테스트 용액을 만듭니다.
- matrilin-3 그룹의 경우 30μL의 10μg/mL matrilin-3을 증류수 570μL에 추가하여 0.5μg/mL 테스트 용액을 만듭니다.
- JBNm 그룹의 경우 7.5μL의 10μg/mL TGF-β1과 30μL의 10μg/mL 매트릴린-3 및 피펫을 여러 번 혼합한 다음 3.75μL의 1mg/mL JBNts를 용액에 추가합니다.
- JBNt 용액 558.75μL를 증류수로 희석하여 JBNt, TGF-β1 및 matrilin-3 샘플에 대해 각각 6.25μg/mL, 0.125μg/mL 및 0.5μg/mL의 최종 농도를 얻습니다.
- 대조군의 경우 600μL의 증류수를 사용하십시오.
- 각 샘플 그룹을 6개의 웰(웰당 샘플 100μL)로 나눕니다.
- 모든 샘플이 들어 있는 3개의 플레이트를 -80°C 냉동고에 1시간 동안 넣은 다음 동결건조 기기로 동결건조합니다.
- 이 플레이트에 hMSC를 시드하고, 각각 5,000개의 세포를 포함하는 100μL 세포 현탁액(웰당)을 받습니다. 3개의 플레이트를 5%CO2에서 1일, 3일, 또는 5일 동안 37°C에서 인큐베이션한다.
- 10 μL의 CCK-8 용액을 세포와 함께 각 웰에 첨가하고 37 °C에서 2 시간 더 배양한다.
- 450nm에서 다중 모드 마이크로플레이트 리더로 각 웰의 흡수 값을 측정합니다.
- hMSC의 알려진 기울기를 96웰 플레이트에 시드하고 4시간 동안 배양합니다. CCK-8 분석을 사용하여 알려진 세포 수의 흡수 값을 측정하고 표준 곡선을 생성합니다.
- 흡수 표준 곡선을 사용하여 세포 증식을 계산합니다.
- 3개의 처리되지 않은 96웰 플레이트를 준비하고 각각에 5개의 샘플 그룹을 추가합니다.
- 안정성 테스트
참고: 인간 TGF-β1 표적 ELISA 키트를 사용하여 아가로스 히드로겔에서 JBNm으로부터 TGF-β1의 백분율 방출을 측정하였다.- PBS 20mL에 아가로스 분말 400mg을 첨가하고 100°C까지 가열하여 2% 아가로스를 제조하여 아가로스 분말을 완전히 용해시킨다.
- 냉각된 2% 아가로스 하이드로겔 내부에 JBNm을 준비한다.
- 10 μL의 10 μg/mL TGF-β1, 40 μL의 10 μg/mL 마트리린-3, 5 μL의 1 mg/mL JBNts 및 195 μL의 PBS를 결합합니다. 이 용액을 2 % 아가 로스 250 μL와 혼합하여 JBNm 하이드로 겔을 만듭니다.
- 500μL의 PBS를 방출 용액으로 사용하여 추가하고 3일마다 교체하십시오. 방출 된 모든 용액을 보관하고 샘플을 15 일 동안 그대로 두십시오.
- ELISA 키트를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 캡처된 각 릴리스 솔루션을 테스트합니다.
참고 : 이론적 로딩 값 100 %에서 PBS에서 방출되는 TGF-β1의 양을 빼면 TGF-β1의 잔량을 결정할 수 있습니다.
- PCR26을 이용한 세포 분화 분석.
- 20 μL의 세포 현탁액 (4 x 104 세포), 30 μL의 특정 용액 (또는 샘플 그룹에 따라 PBS), 및 50 μL의 2 wt% 아가로스를 함유하는 각각의 샘플로 7개의 샘플 그룹을 준비한다.
- TGF-β1 그룹의 경우 10μg/mL TGF-β1 5μL를 PBS 25μL에 추가하여 1.6μg/mL 용액을 만듭니다.
- matrilin-3 그룹의 경우 10μg/mL matrilin-3 20μL를 PBS 10μL에 추가하여 6.7μg/mL 용액을 만듭니다.
- JBNt 그룹의 경우 27.5μL의 PBS에 2.5μL의 1mg/mL JBNt를 추가하면 83.3μg/mL 용액이 생성됩니다.
- J/T/M JBNm 그룹의 경우 10μL의 10μg/mL 매트린-3에 5μL의 10μg/mL TGF-β1과 피펫을 위아래로 추가하여 용액을 혼합합니다. 그런 다음 2.5μL의 1mg/mL JBNt와 피펫을 다시 추가합니다. 마지막으로 2.5μL의 PBS로 희석합니다.
- 각 대조군에 대해 30μL의 PBS를 샘플로 사용합니다.
- 각 웰에 0.5mL의 세포 배양 배지를 추가하고 3일마다 교체해야 합니다.
- 양성대조군의 경우, TGF-β1이 첨가된 시판되는 hMSC 연골성 배지를 사용한다. 이 추가 TGF-β1은 TGF-β1 및 J/T/M JBNm 그룹 모두의 양과 동일하다.
- 음성 대조군 중 하나의 경우, TGF-β1을 포함하지 않는 상업용 hMSC 연골 배지를 사용하십시오. 다른 음성 대조군의 경우, 10% 소 태아 혈청(FBS)을 함유하는 DMEM 세포 배양 배지를 사용한다.
- 다른 모든 그룹의 경우 TGF-β1이 없는 상업용 hMSC 연골성 세포 배양 배지를 사용하십시오.
- 샘플을 15일 동안 배양한다.
- 샘플의 RNA를 추출하고 PCR을 수행하여 앞서 설명한 대로 샘플의 분화를 연구합니다26.
- 20 μL의 세포 현탁액 (4 x 104 세포), 30 μL의 특정 용액 (또는 샘플 그룹에 따라 PBS), 및 50 μL의 2 wt% 아가로스를 함유하는 각각의 샘플로 7개의 샘플 그룹을 준비한다.
- X형 콜라겐 발현 분석을 위한 면역염색
- 상기와 동일한 방법으로 분화된 7개의 아가로오스계 시료를 PCR 방법으로 PCR 방법으로 준비한다(단계 7.4).
- 샘플을 15일 동안 배양한다.
- 샘플을 4% 포름알데히드로 1일 동안 고정하고 30% 자당 용액에 밤새 담근 다음 액체 질소로 -80°C에서 밤새 동결합니다. 수용성 글리콜과 수지의 혼합물인 최적의 절단 온도 복합 시약(OCT)을 사용하여 -10°C에서 샘플을 고정합니다.
- 저온 유지 장치 마이크로톰을 작동하여 각 샘플의 20μm 두께의 냉동 섹션을 얻습니다.
- 제조업체의 프로토콜에 따라 1:800 희석된 항콜라겐 X 항체와 PBS로 희석된 형광 표지 2차 항체로 각 섹션을 염색합니다.
- 접안렌즈에서 488nm의 여기와 40x의 배율을 사용하여 컨포칼 현미경으로 각 섹션을 관찰합니다.
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Representative Results
프로토콜에 따라 JBNts는 UV-Vis 흡수 및 TEM으로 성공적으로 합성되고 특성화되었습니다. JBNm은 빠른 생체 모방 과정을 거치는 주사 가능한 고체 스캐폴드입니다. 생리학적 환경에서 TGF-β1/matrilin-3 용액의 혼합물에 JBNts를 첨가한 후, 그림 1에서 볼 수 있듯이 JBNm의 성공적인 조립을 나타내는 단단한 흰색 메쉬 스캐폴드가 형성되었습니다. 이것은 특성화 방법에서 입증되었습니다.
생리 학적 조건 하에서, matrilin-3은 등전점27 (그림 2A)로 인해 음전하를 띤다. TGF-β1 용액을 매트린-3 용액에 첨가한 후, TGF-β1/매트릴린-3 화합물의 제타-전위는 거의 중성 값으로 증가하여 두 단백질이 전하 상호작용을 통해 결합되었음을 나타냅니다. 그림 2A에서 볼 수 있듯이 JBNm의 제타 전위는 생리적 환경에서 라이신 측쇄의 등전점이 약 9.74이기 때문에 JBNts로 인해 세 그룹 중에서 가장 높습니다. JBNm의 제타 전위 값의 증가는 레이어 별 구조의 성공적인 조립을 나타냅니다.
UV-Vis 흡수 스펙트럼(그림 2B)은 JBNm의 계층적 층별 내부 구조의 형성을 명확히 합니다. 라이신 측쇄와 JBNts의 방향족 고리는 각각 220nm 및 280nm에서 두 개의 흡수 피크에 기여했습니다. TGF-β1의 첨가 후에 흡수 값의 감소가 관찰되었으며, 이는 TGF-β1과 JBNts 사이에 결합이 일어난다는 것을 나타낸다. JBNts를 matrilin-3에 첨가 한 후, 피크의 흡수 강도의보다 명백한 감소가 관찰되었으며, 이는 다시 한번 matrilin-3과 JBNts 사이의 성공적인 결합을 나타냅니다. 유사하게, TGF-β1 / matrilin-3의 혼합물에 JBNts를 첨가 한 후, JBNm이 형성되었고, 흡수 피크는 강도가 감소했다. JBNm의 흡수 피크는 TGF-β1/JBNts 라인보다 매트린-3/JBNts 라인에 더 가깝고, 이는 JBNts가 매트린-3에 결합하는 것을 선호하여 TGF-β1이 내부 층에 존재하는 동안 매트릴린-3과 층별 외부 구조를 형성한다는 것을 나타냅니다. TEM은 JBNts 및 JBNm의 형태를 특성화하는 데 사용됩니다(그림 2C). 단백질과 결합한 후, JBNm의 두꺼운 다발이 스캐폴드 구조를 형성하는 것으로 관찰되었다.
형광 현미경은 층별 구조의 존재를 확인하고 (그림 3A) JBNm의 단면을 입증했습니다. TGF-β1 및 matrilin-3을 표지 한 후, 적색 형광 matrilin-3이 JBNt 번들을 감싸고 JBNm의 외부 층을 형성하는 것으로 관찰되었다. 그림 3B에서 녹색 형광 TGF-β1은 내부 층을 형성하여 성장 인자를 저장하고 TGF-β1의 국소화를 허용하는 능력에 기여했습니다. 도 3C 는 형광 스펙트럼에 의해 특성화되는 바와 같이, 형광 염료-표지된 단백질 사이의 형광 공명 에너지 전달 (FRET) 과정을 표시하며, 표지된 TGF-β1 및 마트리린-3 그룹에 대해 각각 520nm 및 570nm에서 방출 피크를 갖는다(28). 프로토콜에 따라 JBNts를 첨가 한 후, 레이어 별 구조가 형성되고; 피크는 JBNm 그룹에 대해 520nm 및 570nm 모두에서 관찰되었으며, 이는 단백질과 JBNt의 성공적인 결합 및 조립을 나타냅니다.
또한 hMSCs 접착 및 세포 증식에 대한 JBNm의 효과가 조사되었습니다. 도 4에 나타난 바와 같이, 챔버형 커버글라스의 표면에 코팅된 JBNm의 세포 부착 밀도가 결정되었다. JBNm은 hMSC가 자체적으로 클러스터링된 반면(그림 4A), JBNt에 부착된 세포는 더 적었습니다. 그러나 다른 그룹의 경우 hMSC는 JBNm 그룹에 비해 정렬없이 고르게 분포되었습니다. JBNm의 세포 크기뿐만 아니라 세포의 정렬은 JBNts가 세포 접착에 중요한 역할을하는 반면 JBNm의 단백질은 세포 접착의 친화력을 증가 시킨다는 것을 보여주었습니다 (그림 4B, C).
JBNm, JBNts, 마트릴린-3 단독, TGF-β1 단독, 및 음성 대조군을 사용한 세포 배양 1일째 후, JBNm 및 TGF-β1 그룹은 다른 군과 비교하였을 때 유의한 세포 증식을 보였다. 세포 배양 기간이 3일 및 5일로 증가하였을 때, JBNm 및 TGF-β1 그룹은 도 5에서 볼 수 있듯이 훨씬 더 증가된 세포 증식을 나타냈다. JBNm과 JBNm(음성 대조군)이 없는 hMSC의 분화를 결정하기 위해 장기 기능 연구가 수행되었습니다. 15일 후, 강화된 알시안 블루 얼룩이 관찰되었으며, 이는 JBNm26과 함께 성장하는 hMSC의 연골 형성을 나타냅니다. 따라서, 세포들은 JBNm의 JBNts를 선호하였다. 이것은 DNA 모방 구조와 소분자 단위로 분해되는 능력 때문일 수 있으며, 후자는 낮은 pH 또는 충분한 효소 활성(예: 세포에 의한 흡수)에 의해 유발될 수 있습니다14,29.
비디오 1 : JBNm 어셈블리의 비디오 녹화. 이 기록은 JBNt, matrilin-3 및 TGF-β1이 JBNm으로 형성되는 것을 보여줍니다. 이 수치는 Zhou et al. (2021)26. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
그림 1: JBNts의 화학 구조, J/T/M JBNm 및 J/T/M JBNm의 연골 생성 능력에 대한 개략도. (A) JBNt의 화학 구조, 단량체에서 로제트 링, JBNt로의 형성을 강조합니다. (B) J/T/M JBNm을 구성하는 구성 요소 및 JBNm으로 조립되는 방법. (C ) J/T/M JBNm에서 인간 중간엽 줄기세포를 배양하는 도식. 이 수치는 Zhou et al. (2021)26. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: J/T/M JBNm의 물질 특성. (A) 매트릴린-3 단독, TGF-β1/매트릴린-3 화합물 및 J/T/M JBNm의 제타 전위 스펙트럼. (B) JBNts 단독, 마트릴린-3 단독, TGF-β1 단독, 마트릴린-3/JBNts 화합물, TGF-β1/JBNts 화합물 및 J/T/M JBNm의 UV-Vis 흡수 스펙트럼. (C ) 투과전자현미경(TEM)으로부터 얻은 JBNt 단독 및 J/T/M JBNm의 이미지. 이 수치는 Zhou et al. (2021)26. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: J/T/M JBNm의 형광 컨포칼 이미징 및 형광 스펙트럼. (A) 적색 형광 표지 매트릴린-3 및 녹색 형광 표지 TGF-β1이 있는 J/T/M JBNm의 3D 공초점 이미지. (B) 적색 형광 표지 매트린-3, 녹색 형광 표지 TGF-β1 및 병합 버전이 있는 J/T/M JBNm의 2D 컨포칼 이미지. (c) 표지된 단백질 간의 FRET 과정을 특성화하기 위한 다양한 화합물의 형광 스펙트럼. 이 수치는 Zhou et al. (2021)26. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 인간 중간엽 줄기세포(hMSC ) 배양 분석. (A) 아가로스 겔에서 배양된 TGF-β1, 마트릴린-3 및 JBNts를 사용한 hMSC의 광학 현미경 이미지. (B) 다양한 JBNm 성분으로 코팅 된 챔버 커버 유리에서 배양 된 hMSC의 컨 포칼 현미경 이미지. (C) 각 그룹에 대해 평방 밀리미터당 부착된 세포 수의 그래프. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. (D) 그룹당 μm 단위의 세포 장축 길이의 그래프. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 참고: N ≥ 3, *P< 0.05, **P< 0.01, ***P< 0.001, ****P< 0.0001(음성 대조군과 비교, NC). 이 수치는 Zhou et al. (2021)26. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 1일, 3일, 5일 사이의 다양한 그룹에 대한 세포 수 비교. 1, 3, 5일에 다른 물질로 배양한 후 hMSC의 세포 수 통계. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 참고: N = 6, *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001. 이 수치는 Zhou et al. (2021)26. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 연구의 목표는 세포 분화를 매개하기 위해 세포 배양 환경에 의존하는 기존 조직 구축물의 한계를 극복하기 위해 생체 모방 스캐폴드 플랫폼인 JBNm을 개발하는 것입니다. JBNm은 자체 지속 가능한 연골 조직 구조를 위한 층별 구조 스캐폴드입니다. 혁신적인 디자인은 새로운 DNA에서 영감을 받은 나노 물질인 JBNts를 기반으로 합니다. JBNts30, TGF-β1 및 matrilin-3으로 구성된 JBNm은 스캐폴드의 자체 조립이 분자 수준에서 제어되는 새로운 층별 기술을 통해 조립됩니다. JBNm의 조립을 관찰하고 제타 전위 측정, UV-Vis 흡수, TEM 및 형광 스펙트럼 분석으로 특성화했습니다.
그림 2B(3단계)의 UV-Vis 스펙트럼은 JBNm의 계층적 층별 내부 형성을 입증했습니다. 흡광도 피크의 차이는 결합 친화도의 차이로 인해 관찰될 수 있습니다. JBNts와 TGF-β1 사이보다 JBNts와 matrilin-3 사이에 더 많은 주요 상호 작용이 발생하며, 이는 JBNts가 섬유질 형태 및 라이신 표면 화학 측면에서 콜라겐 단백질을 모방한다는 것을 나타냅니다. 이 기술은 TGF-β1이 아닌 매트린 -3에 대한 JBNts의 결합을 관찰하는 데 필요하며, TGF-β1의 캡슐화를 허용하여 TGF-β1을 주변 조직으로 느리게 방출합니다. JBNm의 개발에서 가장 중요한 단계는 단백질과 JBNts의 결합입니다. 표지된 마트리린-3과 TGF-β1 사이의 FRET 현상의 완전한 효과를 관찰하려면 JBNts를 추가하기 전에 TGF-β1과 마트릴린-3을 추가해야 합니다. 이 기술의 한계는 단백질과 나노 튜브의 잘못된 추가 시퀀스에서 비롯되어 다양한 측정을 초래합니다. 이것은 향후 연구를 위한 JBNm의 형성을 위한 중요한 단계이며, 따라서 향후 JBNm 제작 및 연구에 적용될 것입니다.
Matrilin-3는 매우 음성 단백질인 반면 TGF-β1은 그림 2A에서 볼 수 있듯이 약간 중성인 단백질입니다. 이들 단백질의 결합을 결정하기 위해 전하 차이를 관찰하였다. matrilin-3의 음전하 상태에서, 제타 전위는 TGF-β1의 첨가 후 거의 중성 값으로 증가했다 (그림 2A). 이 단계는 생체모방 스캐폴드의 제1 내부 층을 결정하고, 두 단백질의 결합이 전하 상호작용을 통해 이루어진다는 것을 나타내는데 중요하다. JBNm 제조의 두 번째 단계인 JBNts를 첨가한 후 JBNm의 제타 전위는 ~10 ± 5mV에서 측정되었습니다(그림 2A). JBNts는 매우 긍정적이기 때문에 JBNm의 전하가 예상대로 증가하는 것으로 관찰되었습니다. 따라서 제타 전위를 가진 전하의 측정은 전하 상호 작용을 통해 JBNm의 형성을 단계별로 관찰하는 데 중요합니다. UV-Vis 분광법과 유사하게 이 단계에서는 첨가 순서가 중요하며 잘못된 첨가 순서로 인해 다양한 측정이 발생할 수 있습니다. 마찬가지로, 측정 전에 혼합물을 위아래로 피펫팅하는 것이 중요합니다.
다음으로, TGF-β1 및 matrilin-3은 다중 모드 마이크로 플레이트 리더를 사용한 컨 포칼 현미경 및 형광 스펙트럼 분석으로 JBNm의 발달을 관찰 할 수 있도록 표지됩니다. 샘플은 488nm 레이저로 여기되었고 520nm 및 570nm에서 방출 피크를 보여주었습니다(그림 3). JBNt는 라벨링되지 않았기 때문에 JBNt만의 방출 피크는 관찰되지 않았습니다. FRET는 TGF-β1 공여체로부터 마트릴린-3 수용체로 발생하여 520nm에서 방출 피크를 감소시키고 570nm에서 방출 피크를 증가시킨다. 두 구성 요소는 거리가 10nm 떨어져 있어 FRET 현상이 발생할 수 있습니다. 따라서 JBNm의 조립은 전하 상호 작용과 함께 공간적(즉, 물리적 거리) 프로세스를 기반으로 합니다. JBNm 개발에서 가장 중요한 단계는 추가 시퀀스입니다. FRET 현상의 완전한 효과를 관찰하려면 JBNts를 추가하기 전에 TGF-β1 및 matrilin-3을 추가해야 합니다. 형광 JBNm을 관찰하려면 접안 렌즈에서 최소 40 배의 배율이 필요합니다. 이 기술의 한계는 JBNt가 표지되지 않았기 때문에 컨포칼 현미경으로 관찰할 수 없다는 것입니다. 그러나, 단백질 표지 기술은 향후 적용을 위해 약간의 수정을 통해 JBNt 표지에 적용될 수 있다.
JBNm은 세포 부착 및 세포 증식과 같은 세포 기능을 도울 수 있습니다. 이 연구에서는 hMSC를 다양한 물질 (JBNm, JBNts, TGF-β1, matrilin-3 및 첨가제가없는 음성 대조군)에서 배양 (5,000 세포로 시작)하여 CCK-8 용액을 사용하여 1, 3 및 5 일 동안 배양 한 후 세포 증식을 결정하기위한 정확한 제조업체의 프로토콜에 따라 세포 수를 비교했습니다. JBNm, 특히 TGF-β1 및 TGF-β1의 존재 하에 다른 3개의 군에 비해 현저한 세포 증식을 보였다. JBNts는 ECM의 콜라겐을 형태학적으로 모방하는 반면 matrilin-3는 연골 특이적 단백질이므로 37°C에서 3일 및 5일 동안 배양한 후 세포 증식 활성이 증가합니다(그림 5). JBNm은 생체 재료29,31로서 다양한 미래 응용을위한 전통적인 세포 구조의 한계를 극복하기 위해 주사 가능한 생체 모방 조직 공학 스캐 폴드 역할을 할 수있는 큰 잠재력을 보여주었습니다. JBNm은 연골 ECM을 형태 학적으로 모방하여 접착 부위를 제공하고 TGF-β132,33과 같은 미세 환경으로의 친 연골 생성 분화 인자의 방출을 허용합니다. 스캐폴드의 내부 층에 TGF-β1을 통합하는 JBNm의 기능은 원하지 않는 영역으로 누출되는 것을 방지하여 스캐폴드의 효율성을 향상시킵니다(그림 4 및 그림 5). 많은 hMSC가 JBNm 스캐폴드를 따라 군집하는 것으로 보이는 반면, 세포는 matrilin-3, TGF-β1 및 음성 대조군에 드물게 분포되어 있습니다(그림 4). 세포의 형태도 관찰되어 JBNm 표면과의 우수한 친화력을 나타냅니다. 이러한 정밀하게 설계된 생체재료들은 혼입된 생체활성 분자가 세포 배양 환경으로 빠르게 방출되는 것을 방지하고, 매트릭스(34) 내의 조직 구축물의 자가-지속가능성을 개선시킨다. 이 기술의 한계는 출발 세포 수가 세포의 증식을 결정하는 데 중요하다는 것입니다. 5,000의 시작 세포 수가이 연구에 가장 최적으로 발견되었습니다. 알려진 세포 수를 플로팅하고 다중 모드 마이크로플레이트 리더에서 측정하여 세포 수를 결정하기 위해 표준 곡선도 필요합니다. 이 기술은 JBNm 스캐폴드와 관련된 모든 연구에서 세포 증식을 결정하기 위한 표준화된 방법으로 미래에 적용될 수 있습니다.
hMSC는 15일 동안 장기 기능 연구를 확인하기 위해 JBNm이 있거나 없는 3D 아가로스 펠렛에서 배양되었습니다. 15일 후, 양성 대조군(배지가 변경될 때마다 펠릿에 신선한 TGF-β1이 공급됨), JBNm, JBNts, matrilin-3, TGF-β1 및 첨가제가 없는 아가로스 펠렛의 hMSC에서 총 RNA를 추출했습니다. 실시간 qPCR은 유전자 분석을 위해 수행되었으며, 연골 분화 마커인 아그레칸(ACAN) 및 비대 마커 유형 X 콜라겐(COL X)에 대해 테스트되었습니다. JBNm 그룹의 ACAN 발현은 다른 그룹에 비해 유의하게 증가하여 JBNm이 COL X를 억제하면서 줄기 세포 연골 분화를 유의하게 촉진한다는 것을 입증했습니다. 한편, 양성 대조군은 ACAN의 증가, 및 분화된 세포26의 비대에 언급된 바와 같이 향상된 연골 형성을 가졌다. 이 연구의 또 다른 한계는 RNA 추출이 하이드로젤에 내장된 세포에서 이루어진다는 것입니다. 따라서이 프로토콜에서 얻은 총 RNA는 농도와 순도가 낮았습니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 더 많은 샘플을 배양하고 추출하여 다음 단계인 real-time qPCR을 위한 최적의 농도와 순도를 얻었습니다. qPCR은 연구에 중요하지만 많은 수의 샘플을 희생하지 않고 효율적인 샘플 추출을 보장하기 위해 향후 연구를 위해 이 기술을 약간 수정해야 합니다.
JBNm 하이드로젤로부터 단백질의 방출을 시험하기 위해 인간 TGF-β1 ELISA 키트로 안정성 시험을 수행하였다. 이 연구에서 TGF-β1은 J/T/M JBNm에 캡슐화될 것으로 예상되므로 TGF-β1 방출이 관찰되지 않아야 합니다(즉, 이론적 부하 값은 100%). 이 단계의 한계는 모든 TGF-β1이 JBNm의 층별 스캐폴드로 캡슐화되는 것으로 가정한다는 것이다. 15 일 후, 하이드로 겔에서 방출 된 용액을 수집하여 제조업체의 프로토콜에 따라 키트로 테스트합니다. 이어서, TGF-β1의 양은 이론 로딩 값으로부터 PBS에서 방출된 TGF-β1의 양을 뺀 것에 의해 계산하였다. TGF-β1은 JBNm의 내부 층에 캡슐화되어 있기 때문에 단백질의 느린 방출이 예상되었습니다. 본 연구는 TGF-β1이 JBNm 스캐폴드 내에 국한되어 있고 주변 영역(26)으로 빠르게 방출되지 않는다는 것을 입증하였다.
이 혁신적인 층별 JBNm 연골 조직 구조는 분자 수준에서 고도로 조직화되고 제어된 자가 조립에 의해 실현되었습니다. TGF-β1은 매트릭스 섬유의 내부 층에 국한되어 원치 않는 위치로의 누출을 방지하고 동시에 국부적 인 연골 생성을 촉진합니다. 또한, matrilin-3는 매트릭스 섬유의 외부 층에 국한되어, 항 비대 미세 환경(35)을 생성한다. JBNts는 구조적 스캐폴드 백본으로서 작용할 뿐만 아니라 매트릭스 섬유(30,36)를 따라 세포를 국소화하기 위한 줄기 세포 앵커리지 및 접착력을 향상시키는 것으로 나타났다. 미래의 작업에 관해서는, JBNt 기반 스캐폴드의 층별 설계는 다양한 조직(37,38,39)에서의 적용을 위해 맞춤화될 것이다.
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Disclosures
Yupeng Chen 박사는 Eascra Biotech, Inc. 및 NanoDe Therapeutics, Inc.의 공동 설립자입니다.
Acknowledgments
이 작업은 NIH 보조금 7R01AR072027 및 7R03AR069383, NSF 경력 상 1905785, NSF 2025362 및 코네티컷 대학교의 지원을 받습니다. 이 작업은 NIH 보조금 S10OD016435에 의해 부분적으로 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 % Normal Goat Serum | Thermo Fisher | 50062Z | Agent used to block nonspecific antibody binding actions during staining. |
| 24-well plate | Corning | 07-200-740 | 24-well plate used for comparative cell culture. |
| 384-Well Black Untreated Plate | Thermo Fisher | 262260 | 384-well plate used for absorption measurements. |
| 8-well chambered coverglass | Thermo Fisher | 155409PK | 8-well coverglass used for comparative cell culture. |
| 96-well flat bottom | Corning | 07-200-91 | 96-well plate used for comparative cell culture. |
| 96-Well Plate non- treated | Thermo Fisher | 260895 | 96-well plate used for comparative cell culture and analysis. |
| Agarose Gel | Sigma-Aldrich | A9539 | Hydrogel used for cell culture. |
| Agarose Gel | Sigma Aldrich | A9539 | Hydrogel used as an environment for cell culture. |
| Alexa Fluor Microscale Protein Labeling Kit | Thermo Fisher | A30006 (488) and A30007 (555) | Fluorescent dye used to label proteins. |
| Anti-Collagen X Antibody | Thermo Fisher | 41-9771-82 | Antibody used to stain collagen-X. |
| Bio-Rad PCR Machine | Bio-Rad | Equipment used to perform PCR on samples. | |
| C28/I2 Chondrocyte Cell Line | Cells used to analyze proliferative abilities of various samples. | ||
| Cell Counting Kit 8 | Milipore Sigma | 96992 | Cell proliferation assay. |
| Cell Profiler | Broad Institute | Software used to analyze cell images. | |
| Cryostat Microtome | Equipment used to produce thin segments of samples for use in staining and microscopy. | ||
| DAPI | Invitrogen | D1306 | Blue fluorescent stain that binds to adenine-thymine DNA regions. |
| Disposable cuvettes | FISHER Scientific | 14-955-128 | Container used for spectrophotometry. |
| DMEM Cell Culture Medium | Thermo Fisher | 10566032 | Media used to support cellular growth. |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | A4766801 | Serum used in cell culture medium to support cell growth. |
| Fluoromount-G Mounting Medium | Thermo Fisher | 00-4958-02 | Solution used to mount slides for immunostaining. |
| Formaldehyde | Compound used to fix samples prior to microtoming. | ||
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody | Thermo Fisher | A16110 | Antibody used for protein staining. |
| Human Mesenchymal Stem Cells | LONZA | PT-2501 | Cells used to analyze differentiative abilities of various samples. |
| Human Mesenchymal Stem Chondrogenic Medium | LONZA | PT-3003 | Cell medium used to promote chondrogenic differentiation. |
| ImageJ | National Institutes of Health | Image analysis software used in conjunction with microscopy. | |
| itaq Universal SYBR Green One-Step Kit | BioRad | 1725150 | Kit used for PCR. |
| Janus-base nanotubes (JBNts) | Nanotube made from synthetic nucleobases to act as cell scaffolding tool. | ||
| LaB6 20-120 kV Transmission Electronic Microscope | Tecnai | Equipment used to perform transmission electron microscopy on a sample. | |
| MATLAB | MathWorks | Statistical software used for modeling and data analysis. | |
| Matrilin-3 | Fisher Scientific | 3017MN050 | Structural protein used as adhesion sites for chondrocytes. |
| NanoDrop Spectrophotometer | Thermo Fisher | Equipment used to measure absorption values of a sample. | |
| Nikon A1R Spectral Confocal Microscope | Nikon | A1R HD25 | Confocal microscope used to analyze samples. |
| Number 1.5 Chamber Coverglass | Thermo Fisher | 152250 | Environment for sterile cell culture and imaging. |
| Optimal Cutting Temperature Compound Reagent | Compound used to embed cells prior to microtoming. | ||
| Paraformaldehyde | Thermo Scientific | AAJ19943K2 | Compound used to fix cells. |
| PDC-32G Plasma Cleaner | Harrick Plasma | Cleaner used to prepare grids prior to transmission electron microscopy. | |
| penicillin-streptomycin | GIBCO | 15-140-148 | Antibiotic agent used to discourage bacterial growth during cell culture. |
| Phosphate Buffered Saline | Thermo Fisher | 10010023 | Solution used to wash cell medium and act as a buffer during experimentation. |
| Rhodamine-phalloidin | Invitrogen | R415 | F-Actin red fluorescent dye. |
| Rneasy Plant Mini Kit | QIAGEN | 74904 | Kit used to filter and homogenize samples during RNA extraction. |
| Sucrose Solution | Solution used to process samples prior to microtoming. | ||
| TGF beta-1 Human ELISA Kit | Invitrogen | BMS249-4 | Assay kit used to determine the presence of TGF-β1 in a sample. |
| TGF-β1 | PEPROTECH | 100-21C | Growth factor used for the stimulation of chondrogenic differentiation and proliferation. |
| Triton-X | Invitrogen | HFH10 | Compound used to lyse cells not fixed during staining process. |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher | 15596026 | Reagent used to isolate RNA. |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern Panalytical | Equipment used to measure zeta-potential values of a sample. |
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