Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Tillverkning och karakterisering av lager-för-lager Janus Base Nano-Matrix för att främja broskregenerering

Published: July 6, 2022 doi: 10.3791/63984
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Biomedical Engineering, University of Connecticut
* These authors contributed equally

Summary

Detta protokoll beskriver sammansättningen av en lager-för-lager Janus-bas nano-matris (JBNm) ställning genom att lägga till Janus basnanorör (JBNts), matrilin-3 och transformerande tillväxtfaktor Beta-1 (TGF-β1) sekventiellt. JBNm tillverkades och karakteriserades; Dessutom visade den utmärkt bioaktivitet, uppmuntrande cellfunktioner som vidhäftning, proliferation och differentiering.

Abstract

Olika biomaterialställningar har utvecklats för att styra celladhesion och proliferation i hopp om att främja specifika funktioner för in vitro - och in vivo-användning . Tillsatsen av tillväxtfaktorer i dessa biomaterialställningar görs i allmänhet för att ge en optimal cellodlingsmiljö, förmedla celldifferentiering och dess efterföljande funktioner. Tillväxtfaktorerna i en konventionell biomaterialställning är dock vanligtvis utformade för att frigöras vid implantation, vilket kan leda till oavsiktliga biverkningar på omgivande vävnad eller celler. Här har den DNA-inspirerade Janus-basnanomatrisen (JBNm) framgångsrikt uppnått en mycket lokaliserad mikromiljö med en lager-för-lager-struktur för självhållbara broskvävnadskonstruktioner. JBNms är självmonterade från Janus basnanorör (JBNts), matrilin-3 och transformerande tillväxtfaktor beta-1 (TGF-β1) via bioaffinitet. JBNm monterades med ett TGF-β1: matrilin-3: JBNt-förhållande på 1: 4: 10, eftersom detta har varit det bestämda förhållandet vid vilket korrekt montering i lager-för-lager-strukturen kunde inträffa. Först tillsattes TGF-β1-lösningen till matrilin-3-lösningen. Därefter pipetterades denna blandning flera gånger för att säkerställa tillräcklig homogenitet före tillsatsen av JBNt-lösningen. Detta bildade lager-för-lager JBNm, efter pipettering flera gånger igen. En mängd olika experiment utfördes för att karakterisera skikt-för-lager JBNm-strukturen, JBNts ensam, matrilin-3 ensam och TGF-β1 ensam. Bildandet av JBNm studerades med UV-Vis-absorptionsspektra, och strukturen hos JBNm observerades med transmissionselektronmikroskopi (TEM). Eftersom den innovativa lager-för-lager JBNm-ställningen bildas i molekylär skala kunde den fluorescerande färgämnesmärkta JBNm observeras. TGF-β1 är begränsad i det inre skiktet av den injicerbara JBNm, som kan förhindra frisättning av tillväxtfaktorer till omgivande områden, främja lokaliserad kondrogenes och främja en antihypertrofisk mikromiljö.

Introduction

Ställningar inom vävnadsteknik spelar en viktig roll för att ge strukturellt stöd för cellfästning och efterföljande vävnadsutveckling1. Vanligtvis förlitar sig konventionella vävnadskonstruktioner utan byggnadsställningar på cellodlingsmiljön och tillsatte tillväxtfaktorer för att förmedla celldifferentiering. Dessutom är denna tillsats av bioaktiva molekyler i byggnadsställningar ofta det föredragna tillvägagångssättet för att styra celldifferentiering och funktion 2,3. Vissa byggnadsställningar kan efterlikna den biokemiska mikromiljön hos inhemska vävnader oberoende, medan andra direkt kan påverka cellfunktioner via tillväxtfaktorer. Forskare stöter dock ofta på utmaningar när de väljer ställningar som kan påverka celladhesion, tillväxt och differentiering positivt, samtidigt som de ger optimalt strukturellt stöd och stabilitet under en lång period 4,5. De bioaktiva molekylerna är ofta löst bundna till ställningen vilket leder till snabb frisättning av dessa proteiner vid implantation, vilket resulterar i att de frigörs på oönskade platser. Detta kulminerar i biverkningar på vävnader eller celler som inte avsiktligt riktades mot 6,7.

Byggnadsställningar är vanligtvis gjorda av polymera material. Janus basnanomatris (JBNm) är en biomimetisk ställningsplattform skapad med en ny lager-för-lager-metod för självhållbar broskvävnadskonstruktion8. Dessa nya DNA-inspirerade nanorör har fått namnet Janus base nanotubes (JBNts), eftersom de korrekt efterliknar strukturen och ytkemin hos kollagen som finns i den extracellulära matrisen (ECM). Med tillsats av bioaktiva molekyler, såsom matrilin-3 och Transforming Growth Factor Beta-1 (TGF-β1), kan JBNm skapa en optimal mikromiljö som sedan kan stimulera önskad cell- och vävnadsfunktionalitet9.

JBNts är nya nanorör härledda från syntetiska versioner av nukleobasadenin och tymin. JBNts bildas genom självmontering10; Sex syntetiska nukleobaser binder för att bilda en ring, och dessa ringar genomgår π-π staplingsinteraktioner för att skapa ett nanorör 200-300 μm i längd11. Dessa nanorör liknar strukturellt kollagenproteiner; genom att efterlikna en aspekt av den inhemska broskmikromiljön har JBNts visat sig ge ett gynnsamt fästställe för kondrocyter och humana mesenkymala stamceller (hMSC)11,12,13,14. Eftersom nanorören genomgår självmontering och inte kräver någon form av initiator (t.ex. UV-ljus) visar de spännande potential som en injicerbar byggnadsställning för svåråtkomliga defekta områden15.

Matrilin-3 är ett strukturellt extracellulärt matrisprotein som finns i brosk. Detta protein spelar en viktig roll i kondrogenes och korrekt broskfunktion16,17. Nyligen har det inkluderats i biomaterialställningar, vilket uppmuntrar kondrogenes utan hypertrofi 9,18,19. Genom att inkludera detta protein i JBNm lockas broskceller till en byggnadsställning som innehåller liknande komponenter som den i dess ursprungliga mikromiljö. Dessutom har det visat sig att matrilin-3 behövs för korrekt TGF-β1-signalering inom kondrocyter20. Tillväxtfaktorer fungerar som signalmolekyler, vilket orsakar specifik tillväxt av en viss cell eller vävnad. För att uppnå optimal broskregenerering är matrilin-3 och TGF-β1 väsentliga komponenter inom JBNm. Tillsatsen av TGF-β1 i lager-för-lager-ställningen kan ytterligare främja broskregenerering i en vävnadskonstruktion. TGF-β1 är en tillväxtfaktor som används för att uppmuntra läkningsprocessen av osteokondrala defekter, vilket uppmuntrar kondrocyt- och hMSC-proliferation och differentiering21,22. Således spelar TGF-β1 en nyckelroll i broskregenereringen JBNm (J / T / M JBNm)23, vilket uppmuntrar till korrekt tillväxt, särskilt när den är lokaliserad inom JBNm-lagren.

Som tidigare nämnts monteras tillväxtfaktorer vanligtvis på utsidan av byggnadsställningar utan specifika metoder för införlivande. Här, med den exakt utformade nanoarkitekturen av biomaterialen, utvecklades JBNm för specifik inriktning av avsedda celler och vävnader. JBNm består av TGF-β1 vidhäftad på JBNt-ytor i det inre skiktet och matrilin-3 vidhäftad på JBNt-ytor i det yttre skiktet24,25. Införlivandet av TGF-β1 i det inre skiktet i lager-för-lager-strukturen möjliggör en mycket lokaliserad mikromiljö längs JBNm-fibrerna, vilket skapar en homeostatisk vävnadskonstruktion med en mycket långsammare frisättning av proteinet12. Injicerbarheten hos JBNm gör den till en idealisk broskvävnadskonstruktion för olika framtida biomaterialapplikationer26.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Syntes av JBNts

  1. Förbered JBNt-monomeren med hjälp av tidigare publicerade metoder, som involverar syntesen av en mängd olika föreningar12.
  2. Rena rå JBNt-monomer efter att den har syntetiserats med högpresterande vätskekromatografi (HPLC) med hjälp av en omvänd faskolonn. Använd lösningsmedel A: 100% vatten, lösningsmedel B: 100% acetonitril och lösningsmedel C: HCl vattenlösning med pH = 1. Använd en flödeshastighet på 3 ml/min. Samla den största toppen som erhållits i HPLC vid 7,2 min.

2. Tillverkning för JBNt/Matn1/TGF-β1 (Video 1)

OBS: Video 1 visar att JBNm är ett injicerbart fast ämne som bildas i en fysiologisk miljö (vattenlösning, inget UV-ljus, inga kemiska tillsatser och ingen uppvärmning), som också är biologiskt inspirerad.

  1. Tillsätt 8 μl 1 mg/ml TGF-β1 suspenderat i H2O-32 μl 1 mg/ml matrilin-3 suspenderat iH2O. Pipett för att säkerställa korrekt blandning avdessa proteiner.
  2. Tillsätt 80 μl 1 mg/ml JBNts suspenderat iH2Otill TGF-β1/matrilin-3-lösningen. Pipettera upprepade gånger för att säkerställa korrekt blandning. Närvaron av vita flockar kan observeras omedelbart efter tillsatsen av JBNts, vilket indikerar bildandet av JBNm (Video 1).

3. Observation av prover med ultraviolett synlig (UV-Vis) absorption

OBS: UV-Vis-absorptionsspektra studerades för att karakterisera sammansättningen av JBNm. Denna mätning analyserades för fyra kategorier: JBNts ensam, matrilin-3 ensam, TGF-β1 ensam och hela lager-för-lager JBNm, bestående av alla tre delarna. Alla initiala koncentrationer suspenderas iH2O.

  1. För JBNt-gruppen, tillsätt 5 μl 1 mg/ml JBNts till 50 μlH2Oför att göra en 90,9 μg/ml lösning.
  2. För matrilin-3-gruppen, tillsätt 40 μl 10 μg/ml matrilin-3 till 15 μlH2O-lösningför att göra en 7,3 μg/ml lösning.
  3. För TGF-β1-gruppen, tillsätt 10 μL av 10 μg/ml TGF-β1 till 45 μL avH2Oför att göra en lösning på 1,8 μg/ml.
  4. För JBNm-gruppen, tillsätt 40 μL av 10 μg/ml matrilin-3 till 10 μl av 10 μg/mL TGF-β1. Agitera för att säkerställa korrekt blandning och tillsätt sedan 5 μl 1 mg/ml JBNts till lösningen, pipettera upprepade gånger för att blanda provet.
  5. Använd en spektrofotometer för att mäta absorptionsspektrumet för varje grupp.

4. Zeta-potentialmätning av prover

OBS: Zeta-potentialen analyserades för att bättre förutsäga hur JBNm skulle interagera med in vivo-vävnad . Tre grupper mättes: matrilin-3 ensam, matrilin-3 med TGF-β1 och hela lager-för-lager JBNm.

  1. För matrilin-3-gruppen, tillsätt 160 μl 10 mg/ml matrilin-3 till 640 μlH2O-lösningför att göra en 800 μl-lösning.
  2. För matrilin-3/TGF-β1-föreningen, tillsätt 160 μl 10 μg/ml matrilin-3 till 40 μl 10 μg/ml TGF-β1. Pipettera upprepade gånger för att säkerställa korrekt homogenitet. Tillsätt den sedan till 600 μLH2O, vilket resulterar i en 800 μL-lösning.
  3. För JBNm-gruppen, tillsätt 160 μL av 10 μg/ml matrilin-3 till 40 μL av 10 μg/ml TGF-β1. Pipettera flera gånger för att blanda proteinerna. Tillsätt sedan 20 μl 1 mg/ml JBNts till lösningen och pipetten för att säkerställa homogenitet. Slutligen tillsätt JBNm-lösningen till 580 μLH2Oför att producera en 800 μL-lösning.
  4. Mät zetapotentialvärdena för de tre grupperna.

5. Beredning av JBNt/matrilin-3 nanomatris för transmissionselektronmikroskopi (TEM)

OBS: TEM-karakterisering utförs för att karakterisera morfologin hos JBNts och JBNm.

  1. Sätt i två galler i en plasmarengörare för att rengöra gallren ordentligt före den negativa färgningen av JBNts och JBNm enligt de publicerade protokollen och tillverkarens protokoll12.
  2. Skapa en JBNt-lösning på 200 μg/ml genom att blanda 10 μl 1 mg/ml JBNts med 40 μl destillerat vatten.
  3. Blanda 30 μl 100 μg/ml matrilin-3 med 20 μl 100 μg/ml TGF-β1 och pipettera flera gånger. Tillsätt 10 μl 1 mg/ml JBNts till blandningen matrilin-3/TGF-β1 för att bereda JBNm-provet. Återigen, pipett upprepade gånger.
  4. Tillsätt 3 μl av JBNt-lösningen (200 μg/ml) och 3 μl av JBNm-lösningen på separata rutnät och låt dem stå i 2 minuter.
  5. Skölj varje galler med 100 μl uranylacetatlösning (0,5 %). Använd filterpapper för att ta bort överskottslösningen och låt gallren lufttorka.
  6. Använd ett transmissionselektronmikroskop för att korrekt observera och karakterisera proverna, som publicerats tidigare11,12.

6. Absorptionsspektramätning av fluorescerande märkta proteiner

OBS: Strukturen hos JBNm verifieras genom att observera strukturerna i JBNm med absorptionsspektralanalys.

  1. Märk TGF-β1 med hjälp av ett proteinmärkningssats enligt tillverkarens instruktioner. Tillsätt 20 μl 20 μg/ml märkt TGF-β1 till 25 μlH2O-lösningför att göra en 8,9 μg/ml testlösning.
  2. Märk matrilin-3 med hjälp av ett separat märkningssats. Tillsätt 20 μl 80 μg/ml märkt matrilin-3 till 25 μlH2O-testför att göra en 36 μg/ml testlösning.
    OBS: Den fluorescerande färgämnesmärkningen av TGF-β1 resulterade i en slutlig koncentration på 20 μg / ml, medan märkningen av matrilin-3 resulterade i en slutlig koncentration på 80 μg / ml.
  3. Blanda 20 μL 80 μg/ml märkt matrilin-3 med 20 μL 20 μg/ml märkt TGF-β1 och 5 μLH2O, vilket resulterar i en märkt TGF-β1/matrilin-3-förening. Pipettera blandningen flera gånger för att blanda.
  4. Tillsätt 5 μl 1 mg/ml JBNts till 40 μlH2O, vilket resulterar i en lösning på 111 μg/ml.
  5. Tillsätt 20 μl 20 μg / ml märkt TGF-β1 till 20 μL 80 μg / ml märkt matrilin-3 och pipettera flera gånger. Tillsätt 5 μL 1 mg / ml JBNts till den märkta TGF-β1 / matrilin-3-lösningen och pipettera upprepade gånger för att blanda föreningen ordentligt.
    OBS: De slutliga koncentrationerna av JBNt, märkta TGF-β1 och märkta matrilin-3-prover var 111 μg / ml, 8,9 μg / ml respektive 36 μg / ml.
  6. Överför varje provgrupp (dvs. märkt TGF-β1 (steg 6.1), märkt matrilin-3 (steg 6.2), märkt TGF-β1/matrilin-3 (steg 6.3), JBNts (steg 6.4), JBNm (steg 6.5)) till sin egen brunn på en svart 384-brunnsplatta.
  7. Ladda den svarta 384-brunnsplattan i en mikroplattläsare med flera lägen och gör mätningar vid excitationsvåglängder på 488 nm och 555 nm enligt tillverkarens protokoll.

7. Analys av biologiska in vitro-funktioner

  1. Celladhesionstest på förbelagda täckglaskammare
    1. Förbered två kammare täckglasögon med fem grupper av prover, eftersom ett täckglas används för varje celltyp.
    2. Tillsätt 1,25 μl 1 mg/ml JBNts till 198,75 μl destillerat vatten, vilket resulterar i en lösning på 6,25 μg/ml.
    3. Tillsätt 10 μl 10 μg/ml matrilin-3 till 190 μl destillerat vatten, vilket resulterar i en lösning på 0,5 μg/ml.
    4. Tillsätt 2,5 μl 10 μg/ml TGF-β1 till 197,5 μg/ml destillerat vatten, vilket resulterar i en 0,125 μg/ml-lösning.
    5. För JBNm-gruppen, tillsätt 10 μL av 10 μg/ml matrilin-3 till 2,5 μL av 10 μg/mLTGF-β1 och pipettera upprepade gånger. Tillsätt 1,25 μl JBNts med en koncentration av 1 mg/ml till blandningslösningen och pipetten. Tillsätt slutligen 186,25 μl destillerat vatten för att resultera i en 200 μL JBNm-lösning.
      1. För kontrollgruppen, använd 200 μl destillerat vatten.
    6. Lägg till varje provgrupp i sin egen brunn av ett kammarglas nr 1,5. Placera täckglaset i en frys på -80 °C i 1 timme och frystorka det sedan med ett lyofiliseringsinstrument.
    7. Frö humana mesenkymala stamceller (hMSC) och humana kondrocytceller (10 000 celler per brunn) i varje brunn i de beredda kammarhöljena.
    8. Inkubera de två täckglasen i 4 timmar i en 37 °C inkubator. Aspirera sedan cellodlingsmediet och skölj två gånger med PBS.
    9. Fixa celler med 4% paraformaldehyd i 5 minuter och ta sedan bort och skölj prover med PBS. Skölj provet en andra gång för att helt ta bort 4% paraformaldehyd.
    10. Inkubera celler med 100 μl 0,1% Triton-X i 10 min och tvätta med PBS. Tillsätt 100 μL 0,165 μM rhodamin-falloidin till varje brunn. Vänta i 30 min och tvätta sedan med PBS igen.
    11. Tillsätt 0,1 μg / ml DAPI till varje brunn för att färga kärnorna. Vänta i 5 min och skölj brunnarna med PBS två gånger.
    12. Använd ett spektralt konfokalmikroskop för att observera cellmorfologi och fånga fluorescerande bilder.
    13. Vidare analysera cellnummer och morfologi med hjälp av bildbehandlingsprogramvara. Öppna programvaran och ladda bilderna. Lägg till en skalstreck och kalibrera programvaran. Räkna antalet celler i ett visst område för varje prov. Använd sedan mätverktyget för att samla in data om cellmorfologi för varje prov.
  2. Cellproliferation
    1. Förbered tre obehandlade 96-brunnsplattor och tillsätt fem grupper av prover till varje.
      1. För JBNt-gruppen, tillsätt 3,75 μL 1 mg/ml JBNts till 596,25 μL destillerat vatten, vilket resulterar i en 600 μL JBNt-lösning med en koncentration av 6,25 μg/ml.
      2. För TGF-β1-gruppen, tillsätt 7,5 μl 10 μg/ml TGF-β1 till 592,5 μl destillerat vatten, vilket resulterar i en testlösning på 0,125 μg/ml.
      3. För matrilin-3-gruppen, tillsätt 30 μl 10 μg/ml matrilin-3 till 570 μl destillerat vatten, vilket resulterar i en 0,5 μg/ml testlösning.
      4. För JBNm-gruppen, blanda 7,5 μl 10 μg/ml TGF-β1 med 30 μl 10 μg/ml matrilin-3 och pipettera flera gånger, följt av tillsats av 3,75 μl 1 mg/ml JBNts till lösningen.
      5. Späd JBNm-lösning med 558,75 μl destillerat vatten för att erhålla de slutliga koncentrationerna av 6,25 μg/ml, 0,125 μg/ml respektive 0,5 μg/ml för JBNt-, TGF-β1- och matrilin-3-prover.
      6. För kontrollgruppen, använd 600 μl destillerat vatten.
    2. Dela upp varje provgrupp i sex brunnar (100 μl prov per brunn).
    3. Placera de tre plattorna som innehåller alla prover i en frys på -80 °C i 1 timme och frystorka sedan med ett frysmedel.
    4. Frö hMSC på dessa plattor, var och en får en 100 μL cellsuspension (per brunn) innehållande 5,000 celler. Inkubera de tre plattorna vid 37 °C i 1 dag, 3 dagar eller 5 dagar vid 5 %CO2.
    5. Tillsätt 10 μl CCK-8-lösning till varje brunn med cellerna och inkubera vid 37 °C i ytterligare 2 timmar.
    6. Mät absorptionsvärdena för varje brunn med mikroplattläsare med flera lägen vid 450 nm.
    7. Frö en känd gradient av hMSC på en 96-brunnsplatta och inkubera i 4 timmar. Använd CCK-8-analysen för att mäta absorptionsvärdena för det kända antalet celler och generera en standardkurva.
    8. Beräkna cellproliferation med hjälp av absorptionsstandardkurvan.
  3. Stabilitetstest
    OBS: Ett humant TGF-β1-riktat ELISA-kit användes för att bestämma den procentuella frisättningen av TGF-β1 från JBNm i en agaroshydrogel.
    1. Förbered 2% agaros genom att tillsätta 400 mg agarospulver till 20 ml PBS och värma det upp till 100 ° C för att helt lösa upp agarospulvret.
    2. Förbered JBNm inuti den kylda 2% agaroshydrogelen.
      1. Kombinera 10 μL av 10 μg / ml TGF-β1, 40 μL av 10 μg / ml matrilin-3, 5 μL av 1 mg / ml JBNts och 195 μL PBS. Blanda denna lösning med 250 μL 2% agaros, vilket skapar JBNm-hydrogelen.
    3. Tillsätt 500 μL PBS, använd den som en frigöringslösning och se till att ändra den var 3: e dag. Behåll varje släppt lösning och låt provet sitta i 15 dagar.
    4. Använd ett ELISA-kit för att testa var och en av de fångade frigöringslösningarna genom att följa tillverkarens instruktioner.
      OBS: Genom att subtrahera mängden TGF-β1 som frigörs i PBS från det teoretiska belastningsvärdet på 100% kan den återstående mängden TGF-β1 bestämmas.
  4. Celldifferentieringsanalys med PCR26.
    1. Bered sju grupper av prover med varje prov som innehåller 20 μl cellsuspension (4 x 104 celler), 30 μl av den specifika lösningen (eller PBS, beroende på provgrupp) och 50 μl 2 viktprocent agaros.
      1. För TGF-β1-gruppen, tillsätt 5 μL av 10 μg/ml TGF-β1 till 25 μL PBS, vilket resulterar i en lösning på 1,6 μg/ml.
      2. För matrilin-3-gruppen, tillsätt 20 μl 10 μg/ml matrilin-3 till 10 μl PBS, vilket resulterar i en 6,7 μg/ml lösning.
      3. För JBNt-gruppen, tillsätt 2,5 μL 1 mg/ml JBNts till 27,5 μL PBS, vilket resulterar i en 83,3 μg/ml lösning.
      4. För J/T/M JBNm-gruppen, tillsätt 10 μl 10 μg/ml matrilin-3 till 5 μl 10 μg/ml TGF-β1 och pipettera upp och ner för att blanda lösningen. Tillsätt sedan 2,5 μl 1 mg/ml JBNts och pipettera igen. Slutligen späd med 2,5 μL PBS.
      5. Använd 30 μl PBS som prov för varje kontrollgrupp.
    2. Tillsätt 0,5 ml cellodlingsmedium till varje brunn, se till att byta ut det var 3: e dag.
      1. För den positiva kontrollgruppen, använd ett kommersiellt tillgängligt hMSC-kondrogent medium som innehåller tillsatt TGF-β1. Denna ytterligare TGF-β1 är lika med mängden i både TGF-β1- och J/T/M JBNm-grupperna.
      2. För en av de negativa kontrollgrupperna, använd ett kommersiellt hMSC-kondrogent medium som inte innehåller TGF-β1. För den andra negativa kontrollgruppen, använd ett DMEM-cellodlingsmedium som innehåller 10% fetalt bovint serum (FBS).
      3. För varannan grupp, använd ett kommersiellt hMSC kondrogent cellodlingsmedium utan TGF-β1.
    3. Odla proverna i 15 dagar.
    4. Extrahera provernas RNA och utför PCR för att studera differentieringen av proverna som beskrivits tidigare26.
  5. Immunfärgning för typ X-kollagenuttrycksanalys
    1. Bered sju agarosbaserade prover på samma sätt som celldifferentieringen med PCR-metodavsnittet (steg 7.4).
    2. Odla proverna i 15 dagar.
    3. Fixera proverna med 4% formaldehyd i 1 dag, blötlägg i 30% sackaroslösning över natten och frys sedan över natten vid -80 ° C med flytande kväve. Fixera proverna med hjälp av det optimala skärtemperaturföreningsreagenset (OCT), en blandning av vattenlösliga glykoler och hartser, vid -10 °C.
    4. Använd en kryostatmikrotom för att få 20 μm tjocka frysta sektioner av varje prov.
    5. Färga varje sektion med en antikollagen X-antikropp med 1: 800 utspädning och en fluorescerande märkning sekundär antikropp utspädd med PBS, enligt tillverkarens protokoll.
    6. Observera varje sektion med ett konfokalmikroskop, med en excitation på 488 nm och en förstoring på 40x på okularet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Efter protokoll syntetiserades JBNts framgångsrikt och karakteriserades med UV-Vis-absorption och TEM. JBNm är en injicerbar fast ställning som genomgår en snabb biomimetisk process. Efter att JBNts tillsatts till en blandning av TGF-β1/matrilin-3-lösning i en fysiologisk miljö bildades en solid vitmaskig byggnadsställning som indikerar framgångsrik montering av JBNm, vilket framgår av figur 1. Detta demonstrerades i karakteriseringsmetoderna.

Under fysiologiska förhållanden är matrilin-3 negativt laddad på grund av dess isoelektriska punkt27 (Figur 2A). Efter tillsats av TGF-β1-lösningen till matrilin-3-lösningen ökade zeta-potentialen hos TGF-β1/matrilin-3-föreningen till ett nästan neutralt värde, vilket indikerar att de två proteinerna var bundna via laddningsinteraktioner. Som framgår av figur 2A är zetapotentialen för JBNm den högsta bland de tre grupperna på grund av JBNts, eftersom den isoelektriska punkten för lysinsidans kedja är cirka 9,74 i en fysiologisk miljö. Ökningen av zeta-potentialvärden för JBNm indikerar den framgångsrika monteringen av dess lager-för-lager-struktur.

UV-Vis-absorptionsspektra (figur 2B) klargör bildandet av JBNm: s hierarkiska lager-för-lager-inre struktur. De aromatiska ringarna i lysinsidans kedjor och JBNts bidrog till de två absorptionstopparna vid 220 nm respektive 280 nm. Minskningen av absorptionsvärdet observerades efter tillsatsen av TGF-β1, vilket indikerar att bindning sker mellan TGF-β1 och JBNts. Efter tillsatsen av JBNts till matrilin-3 observerades en mer uppenbar minskning av absorptionsintensiteten hos topparna, vilket återigen indikerar framgångsrik bindning mellan matrilin-3 och JBNts. På samma sätt, efter tillsats av JBNts till en blandning av TGF-β1 / matrilin-3, bildades JBNm och absorptionstopparna minskade i intensitet. Absorptionstoppen för JBNm är närmare matrilin-3 / JBNts-linjen än TGF-β1 / JBNts-linjen, vilket indikerar att JBNts föredrar att binda till matrilin-3 och bildar en lager-för-lager yttre struktur med matrilin-3 medan TGF-β1 ligger i det inre skiktet. TEM används för att karakterisera morfologin hos JBNts och JBNm (Figur 2C). Efter att ha kombinerats med proteiner observerades tjocka buntar av JBNm som bildade en ställningsstruktur.

Fluorescensmikroskopi har bekräftat närvaron av lager-för-lager-strukturen (figur 3A) och visat tvärsnittet av JBNm. Efter märkning av TGF-β1 och matrilin-3 observerades att den röda fluorescerande matrilin-3 omsluter JBNt-buntarna och bildar det yttre skiktet av JBNm. I figur 3B bildade den grönfluorescerande TGF-β1 ett inre skikt, vilket bidrog till förmågan att lagra tillväxtfaktorer och möjliggöra lokalisering av TGF-β1. Figur 3C visar fluorescensresonansenergiöverföringsprocessen (FRET) mellan de fluorescerande färgämnesmärkta proteinerna som kännetecknas av fluorescensspektra, med emissionstoppar vid 520 nm och 570 nm för märkta TGF-β1- respektive matrilin-3-grupper28. Efter tillsats av JBNts enligt protokollet bildas skikt-för-lager-strukturen; toppar observerades vid både 520 nm och 570 nm för JBNm-gruppen, vilket indikerar en framgångsrik bindning och sammansättning av proteinerna och JBNts.

Dessutom undersöktes effekten av JBNm på hMSCs vidhäftning och cellproliferation. Som visas i figur 4 bestämdes celladhesionstätheten hos JBNm belagd på ytan av kammaröverdragsglasögonen. JBNm visade hMSC grupperade längs sig själv (figur 4A), medan färre celler följde JBNts. För de andra grupperna fördelades dock hMSC: erna jämnt utan anpassning jämfört med JBNm-gruppen. Inriktningen av celler, liksom storleken på cellerna på JBNm, visade att JBNts spelade en roll i celladhesion, medan proteinerna i JBNm ökade affiniteten för celladhesion (Figur 4B, C).

Efter dag 1 av cellodling med JBNm, JBNts, matrilin-3 ensam, TGF-β1 ensam och negativ kontroll visade JBNm- och TGF-β1-grupperna signifikant cellproliferation jämfört med de andra grupperna. När cellodlingstiden ökades till 3 och 5 dagar visade JBNm- och TGF-β1-grupperna ännu mer ökad cellproliferation, vilket ses i figur 5. En långsiktig funktionsstudie utfördes för att bestämma differentieringen av hMSC med JBNm och utan JBNm (negativ kontroll). Efter 15 dagar observerades en förbättrad alciansk blå fläck, vilket indikerar kondrogenes av hMSC som växer tillsammans med JBNm26. Således föredrog cellerna JBNts i JBNm. Detta berodde sannolikt på dess DNA-härmande struktur och förmåga att demonteras i småmolekylära enheter, varav den senare kan utlösas av ett lågt pH eller tillräcklig enzymatisk aktivitet (såsom upptag av celler)14,29.

Video 1: Videoinspelning av JBNm-montering. Denna inspelning visar bildandet av JBNts, matrilin-3 och TGF-β1 i JBNm. Denna siffra har modifierats från Zhou m.fl. (2021)26. Klicka här för att ladda ner den här videon.

Figure 1
Figur 1: Schematisk illustration av den kemiska strukturen hos JBNts, J / T / M JBNm och J / T / M JBNm: s kondrogena förmåga. (A) JBNts kemiska struktur, vilket belyser deras bildning från monomer till rosettring till JBNt. (B) De komponenter som utgör J/T/M JBNm, samt hur de monteras i JBNm. (C ) Schematisk för odling av mänskliga mesenkymala stamceller på J/T/M JBNm. Denna siffra har modifierats från Zhou m.fl. (2021)26. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Materialkarakterisering av J/T/M JBNm. (A) Zeta-potentialspektra av enbart matrilin-3, TGF-β1/matrilin-3-föreningen och J/T/M JBNm. (B) UV-Vis-absorptionsspektra av enbart JBNts, enbart matrilin-3, enbart TGF-β1, matrilin-3/JBNts-föreningen, TGF-β1/JBNts-föreningen och J/T/M JBNm. (C ) Bilder av enbart JBNts och J/T/M JBNm erhållna från transmissionselektronmikroskopi (TEM). Denna siffra har modifierats från Zhou m.fl. (2021)26. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Fluorescerande konfokalavbildning och fluorescensspektra av J / T / M JBNm. (A) 3D-konfokalbild av J / T / M JBNm, med röd-fluorescerande märkt matrilin-3 och grön-fluorescerande-märkt TGF-β1. (B) 2D-konfokala bilder av J/T/M JBNm, med röd-fluorescerande-märkt matrilin-3, grön-fluorescerande-märkt TGF-β1, och en sammanslagen version. (C) Fluorescensspektra av olika föreningar för att karakterisera FRET-processen mellan de märkta proteinerna. Denna siffra har modifierats från Zhou m.fl. (2021)26. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Analys av human odling av mesenkymala stamceller (hMSC). (A) Optiska mikroskopibilder av hMSC med TGF-β1, matrilin-3 och JBNts, odlade på en agarosgel. (B) Konfokalmikroskopibilder av hMSC odlade på det kammarförsedda täckglaset belagda med en mängd olika JBNm-komponenter. (C) Diagram över antalet celler som följs per kvadratmillimeter för varje grupp. Felstaplar anger standardavvikelser. (D) Diagram över cellens huvudaxellängd i μm per grupp. Felstaplar anger standardavvikelser. Anmärkning: N ≥ 3, *P< 0,05, **P< 0,01, ***P< 0,001, ****P< 0,0001 (jämfört med negativa kontroller, NC). Denna siffra har modifierats från Zhou m.fl. (2021)26. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: Jämförelse av cellnummer för olika grupper mellan dag 1, 3 och 5. Cellnummerstatistik för hMSC efter att ha odlats med olika material på dag 1, 3 och 5. Felstaplar anger standardavvikelser. Obs: N = 6, *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001. Denna siffra har modifierats från Zhou m.fl. (2021)26. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Målet med denna studie är att utveckla en biomimetisk ställningsplattform, JBNm, för att övervinna begränsningarna hos konventionella vävnadskonstruktioner som förlitar sig på cellodlingsmiljöer för att förmedla celldifferentiering. JBNm är en lager-för-lager-strukturställning för en självförsörjande broskvävnadskonstruktion. Den innovativa designen är baserad på nya DNA-inspirerade nanomaterial, JBNts. JBNm, som består av JBNts30, TGF-β1 och matrilin-3, monteras genom en ny lager-för-lager-teknik där ställningens självmontering styrdes på molekylär nivå. Sammansättningen av JBNm observerades och karakteriserades med zeta-potentialmätning, UV-Vis-absorption, TEM och fluorescensspektralanalys.

UV-Vis-spektra i figur 2B (steg 3) har visat bildandet av JBNm: s hierarkiska lager-för-lager-inre. En skillnad i absorbanstoppar kan observeras på grund av en skillnad i bindningsaffinitet. Fler större interaktioner förekommer mellan JBNts och matrilin-3 än mellan JBNts och TGF-β1 vilket indikerar att JBNts efterliknar kollagenproteiner när det gäller deras fibrösa morfologi och lysinytkemi. Denna teknik är nödvändig för att observera bindningen av JBNts till matrilin-3 snarare än TGF-β1, vilket möjliggör inkapsling av TGF-β1 och därför ger en långsam frisättning av TGF-β1 i den omgivande vävnaden. Det mest kritiska steget i utvecklingen av JBNm är kombinationen av proteiner med JBNts. TGF-β1 och matrilin-3 måste tillsättas före tillsatsen av JBNts för att observera den fulla effekten av FRET-fenomenet mellan den märkta matrilin-3 och TGF-β1. Begränsningen av denna teknik härrör från den felaktiga tillsatssekvensen av proteiner och nanorör, vilket resulterar i varierande mätningar. Detta är ett viktigt steg för bildandet av JBNm för framtida studier, och kommer därför att tillämpas på framtida JBNm-fabrikationer och studier.

Matrilin-3 är ett mycket negativt protein, medan TGF-β1 är ett något neutralt protein, vilket ses i figur 2A. Laddningsskillnaden observerades för att bestämma bindningen av dessa proteiner. Från det negativt laddade tillståndet för matrilin-3 ökade zeta-potentialen till ett nästan neutralt värde efter tillsatsen av TGF-β1 (Figur 2A). Detta steg är viktigt för att bestämma det första inre skiktet i den biomimetiska ställningen och för att indikera att kombinationen av båda proteinerna är genom laddningsinteraktion. Efter tillsatsen av JBNts, som är det andra steget i JBNm-tillverkningen, mättes zeta-potentialen för JBNm vid ~ 10 ± 5 mV (figur 2A). Eftersom JBNts är mycket positiva observerades laddningen av JBNm öka som förväntat. Bestämning av laddningar med zeta-potential är därför viktigt för att observera bildandet av JBNm steg för steg via laddningsinteraktioner. I likhet med UV-Vis-spektroskopi är tillsatssekvensen viktig i detta steg, och felaktig additionsordning kan resultera i olika mätningar. På samma sätt är det viktigt att pipettera blandningen upp och ner före mätning.

Därefter märks TGF-β1 och matrilin-3 så att utvecklingen av JBNm kan observeras med konfokalmikroskopi och fluorescensspektralanalys med multimode mikroplattläsare. Proverna exciterades med en 488 nm laser och visade emissionstoppar vid 520 nm och 570 nm (figur 3). Ingen utsläppstopp observerades enbart för JBNts eftersom de inte är märkta. FRET inträffade från TGF-β1-givaren till matrilin-3-acceptorn, vilket minskade utsläppstoppen vid 520 nm och ökade utsläppstoppen vid 570 nm; de två komponenterna är 10 nm från varandra i avstånd, vilket gör att FRET-fenomenet kan inträffa. Därför är sammansättningen av JBNm baserad på rumsliga (dvs fysiskt avstånd) processer tillsammans med laddningsinteraktioner. Det mest kritiska steget i utvecklingen av JBNm är additionssekvensen; TGF-β1 och matrilin-3 måste tillsättas före tillsatsen av JBNts för att observera den fulla effekten av FRET-fenomenet. Förstoring av minst 40x på okularet krävs för att observera den fluorescerande JBNm. Begränsningen av denna teknik är att JBNts inte är märkta och därför inte kunde observeras med konfokalmikroskopi. Proteinmärkningstekniken kan dock tillämpas för att märka JBNt med vissa modifieringar för framtida applikationer.

JBNm kan hjälpa cellfunktioner, såsom celladhesion och cellproliferation. I denna studie odlades hMSC (börjar med 5 000 celler) på olika material (JBNm, JBNts, TGF-β1, matrilin-3 och negativa kontroller utan tillsatser) för att jämföra cellnumren efter inkubation i 1, 3 och 5 dagar med CCK-8-lösning, enligt den exakta tillverkarens protokoll för att bestämma cellproliferation. JBNm, särskilt i närvaro av TGF-β1, och TGF-β1 ensam visade signifikant cellproliferation jämfört med de andra tre grupperna. JBNter efterliknar kollagen i ECM morfologiskt medan matrilin-3 är ett broskspecifikt protein, vilket resulterar i ökad cellproliferationsaktivitet efter inkubation vid 37 °C i 3 och 5 dagar (figur 5). JBNm har visat stor potential att fungera som en injicerbar och biomimetisk vävnadsteknisk ställning för att övervinna begränsningarna hos traditionella cellkonstruktioner för olika framtida applikationer som biomaterial29,31. JBNm efterliknar brosket ECM morfologiskt, ger vidhäftningsställen och möjliggör frisättning av pro-kondrogena differentierande faktorer i mikromiljön, såsom TGF-β132,33. JBNm:s förmåga att införliva TGF-β1 i ställningens inre skikt förhindrar att den läcker ut till oönskade områden, vilket förbättrar ställningens effektivitet (figur 4 och figur 5). Många hMSC ses klustra längs JBNm-ställningen, medan cellerna är glest fördelade i matrilin-3, TGF-β1 och negativa kontrollgrupper (figur 4). Cellernas morfologi observerades också, vilket indikerar utmärkt affinitet med JBNm-ytor. Dessa exakt utformade biomaterial förhindrar snabb frisättning av införlivade bioaktiva molekyler i cellodlingsmiljön och förbättrar självhållbarheten hos vävnadskonstruktionerna i matrisen34. En begränsning med denna teknik är att startcellnumren är avgörande för att bestämma proliferationen av celler. Ett startcellsnummer på 5 000 visade sig vara mest optimalt för denna studie. En standardkurva behövs också för att bestämma cellnumret genom att plotta ett känt antal celler och mäta dem i multimode mikroplattläsaren. Denna teknik kan tillämpas i framtiden som en standardiserad metod för att bestämma cellproliferation i alla studier relaterade till JBNm-byggnadsställningar.

hMSC odlades i 3D-agarospellets med och utan JBNm för att bestämma den långsiktiga funktionsstudien i 15 dagar. Efter 15 dagar extraherades totalt RNA från hMSC: erna i agarospellets, innehållande positiv kontroll (pellets levererades med färsk TGF-β1 varje gång medium ändrades), JBNm, JBNts, matrilin-3, TGF-β1 och inga tillsatser. QPCR i realtid utfördes för genanalys, testning för kondrogena differentieringsmarkörer, Aggrecan (ACAN) och hypertrofimarkör typ X kollagen (COL X). ACAN-uttryck i JBNm-gruppen ökade signifikant jämfört med andra grupper, vilket visar att JBNm främjar stamcellskondrogen differentiering signifikant samtidigt som COL X hämmas. Under tiden har den positiva kontrollen förbättrat kondrogenesen, vilket noteras i ökningen av ACAN, och även hypertrofi hos den differentierade cellen26. En ytterligare begränsning av denna studie är att RNA-extraktionen är från cellerna inbäddade i en hydrogel. Det totala RNA som erhölls i detta protokoll var därför lågt i koncentration och renhet. För att övervinna denna begränsning odlades och extraherades fler prover för att erhålla optimal koncentration och renhet för nästa steg, qPCR i realtid. Även om qPCR är viktigt för studien, är mindre modifiering av denna teknik nödvändig för framtida studier för att säkerställa effektiv provutvinning utan att offra ett stort antal prover.

Ett stabilitetstest utfördes med ett humant TGF-β1 ELISA-kit för att testa frisättningen av protein från JBNm-hydrogelen. I denna studie förväntas TGF-β1 kapslas in i J/T/M JBNm, och därför bör ingen TGF-β1-frisättning observeras (dvs. det teoretiska belastningsvärdet är 100%). En begränsning med detta steg är att all TGF-β1 antas vara inkapslad i JBNm lager-för-lager-ställningen. Efter 15 dagar samlas lösningar som frigörs från hydrogelen och testas med satsen enligt tillverkarens protokoll. Därefter beräknades mängden TGF-β1 genom att subtrahera mängden av den frigjorda TGF-β1 i PBS från det teoretiska belastningsvärdet. Eftersom TGF-β1 var inkapslad i det inre skiktet av JBNm, förväntades den långsamma frisättningen av proteinet. Studien visade att TGF-β1 är lokaliserad inom JBNm-ställningen och inte släpper ut snabbt i de omgivande områdena26.

Denna innovativa skikt-för-lager JBNm-broskvävnadskonstruktion realiserades genom mycket organiserad och kontrollerad självmontering på molekylär nivå. TGF-β1 är innesluten i det inre skiktet av matrisfibrerna, vilket förhindrar läckage till oönskade platser och främjar lokaliserad kondrogenes samtidigt. Dessutom är matrilin-3 lokaliserad i det yttre skiktet av matrisfibrerna, vilket skapar en antihypertrofisk mikromiljö35. JBNts har visat sig inte bara fungera som en strukturell ställningsstamnät utan också förbättra stamcellsförankring och vidhäftning för att lokalisera celler längs matrisfibrerna30,36. När det gäller framtida arbete kommer den lager-för-lager-designen av den JBNt-baserade ställningen att anpassas för applikationer i olika vävnader37,38,39.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Dr. Yupeng Chen är en av grundarna av Eascra Biotech, Inc.

Acknowledgments

Detta arbete stöds av NIH-bidrag 7R01AR072027 och 7R03AR069383, NSF Career Award 1905785, NSF 2025362 och University of Connecticut. Detta arbete stöds också delvis av NIH-bidrag S10OD016435.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 % Normal Goat Serum Thermo Fisher 50062Z Agent used to block nonspecific antibody binding actions during staining.
24-well plate Corning 07-200-740 24-well plate used for comparative cell culture.
384-Well Black Untreated Plate Thermo Fisher 262260 384-well plate used for absorption measurements.
8-well chambered coverglass Thermo Fisher 155409PK 8-well coverglass used for comparative cell culture.
96-well flat bottom Corning 07-200-91 96-well plate used for comparative cell culture.
96-Well Plate non- treated Thermo Fisher 260895 96-well plate used for comparative cell culture and analysis.
Agarose Gel Sigma-Aldrich A9539 Hydrogel used for cell culture.
Agarose Gel Sigma Aldrich A9539 Hydrogel used as an environment for cell culture.
Alexa Fluor Microscale Protein Labeling Kit Thermo Fisher A30006 (488) and A30007 (555) Fluorescent dye used to label proteins.
Anti-Collagen X Antibody Thermo Fisher 41-9771-82 Antibody used to stain collagen-X.
Bio-Rad PCR Machine Bio-Rad Equipment used to perform PCR on samples.
C28/I2 Chondrocyte Cell Line Cells used to analyze proliferative abilities of various samples.
Cell Counting Kit 8 Milipore Sigma 96992 Cell proliferation assay.
Cell Profiler Broad Institute Software used to analyze cell images.
Cryostat Microtome Equipment used to produce thin segments of samples for use in staining and microscopy.
DAPI Invitrogen D1306 Blue fluorescent stain that binds to adenine-thymine DNA regions.
Disposable cuvettes FISHER Scientific 14-955-128 Container used for spectrophotometry.
DMEM Cell Culture Medium Thermo Fisher 10566032 Media used to support cellular growth.
Fetal Bovine Serum GIBCO A4766801 Serum used in cell culture medium to support cell growth.
Fluoromount-G Mounting Medium Thermo Fisher 00-4958-02 Solution used to mount slides for immunostaining.
Formaldehyde Compound used to fix samples prior to microtoming.
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody Thermo Fisher A16110 Antibody used for protein staining.
Human Mesenchymal Stem Cells LONZA PT-2501 Cells used to analyze differentiative abilities of various samples.
Human Mesenchymal Stem Chondrogenic Medium LONZA PT-3003 Cell medium used to promote chondrogenic differentiation.
ImageJ National Institutes of Health Image analysis software used in conjunction with microscopy.
itaq Universal SYBR Green One-Step Kit BioRad 1725150 Kit used for PCR.
Janus-base nanotubes (JBNts) Nanotube made from synthetic nucleobases to act as cell scaffolding tool.
LaB6 20-120 kV Transmission Electronic Microscope Tecnai Equipment used to perform transmission electron microscopy on a sample.
MATLAB MathWorks Statistical software used for modeling and data analysis.
Matrilin-3 Fisher Scientific 3017MN050 Structural protein used as adhesion sites for chondrocytes.
NanoDrop Spectrophotometer Thermo Fisher Equipment used to measure absorption values of a sample.
Nikon A1R Spectral Confocal Microscope Nikon A1R HD25 Confocal microscope used to analyze samples.
Number 1.5 Chamber Coverglass Thermo Fisher 152250 Environment for sterile cell culture and imaging.
Optimal Cutting Temperature Compound Reagent Compound used to embed cells prior to microtoming.
Paraformaldehyde Thermo Scientific AAJ19943K2 Compound used to fix cells.
PDC-32G Plasma Cleaner Harrick Plasma Cleaner used to prepare grids prior to transmission electron microscopy.
penicillin-streptomycin GIBCO 15-140-148 Antibiotic agent used to discourage bacterial growth during cell culture.
Phosphate Buffered Saline Thermo Fisher 10010023 Solution used to wash cell medium and act as a buffer during experimentation.
Rhodamine-phalloidin Invitrogen R415 F-Actin red fluorescent dye.
Rneasy Plant Mini Kit QIAGEN 74904 Kit used to filter and homogenize samples during RNA extraction.
Sucrose Solution Solution used to process samples prior to microtoming.
TGF beta-1 Human ELISA Kit Invitrogen BMS249-4 Assay kit used to determine the presence of TGF-β1 in a sample.
TGF-β1 PEPROTECH 100-21C Growth factor used for the stimulation of chondrogenic differentiation and proliferation.
Triton-X Invitrogen HFH10 Compound used to lyse cells not fixed during staining process.
TRIzol Reagent Thermo Fisher 15596026 Reagent used to isolate RNA.
Zetasizer Nano ZS Malvern Panalytical Equipment used to measure zeta-potential values of a sample.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chan, B. P., Leong, K. W. Scaffolding in tissue engineering: general approaches and tissue-specific considerations. European Spine Journal. 17, Suppl 4 467-479 (2008).
  2. Heo, D. N., et al. 3D bioprinting of carbohydrazide-modified gelatin into microparticle-suspended oxidized alginate for the fabrication of complex-shaped tissue constructs. ACS Applied Material Interfaces. 12 (18), 20295-20306 (2020).
  3. Almeida, H. V., et al. Anisotropic shape-memory alginate scaffolds functionalized with either type i or type ii collagen for cartilage tissue engineering. Tissue Engineering. Part A. 23 (1-2), 55-68 (2017).
  4. Vinatier, C., Guicheux, J. Cartilage tissue engineering: From biomaterials and stem cells to osteoarthritis treatments. Annals of Physical and Rehabilitation Medicine. 59 (3), 139-144 (2016).
  5. Filardo, G., Kon, E., Roffi, A., Di Martino, A., Marcacci, M. Scaffold-based repair for cartilage healing: a systematic review and technical note. Arthroscopy. 29 (1), 174-186 (2013).
  6. James, A. W., et al. A review of the clinical side effects of bone morphogenetic protein-2. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 22 (4), 284-297 (2016).
  7. Blaney Davidson, E. N., vander Kraan, P. M., vanden Berg, W. B. TGF-beta and osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 15 (6), 597-604 (2007).
  8. Chen, Y., Yang, K. Intra-articular drug delivery systems for arthritis treatment. Rheumatology Current Research. 2, 106 (2012).
  9. Liu, Q., et al. Suppressing mesenchymal stem cell hypertrophy and endochondral ossification in 3D cartilage regeneration with nanofibrous poly(l-lactic acid) scaffold and matrilin-3. Acta Biomaterialia. 76, 29-38 (2018).
  10. Song, S., Chen, Y., Yan, Z., Fenniri, H., Webster, T. J. Self-assembled rosette nanotubes for incorporating hydrophobic drugs in physiological environments. International Journal of Nanomedicine. 6, 101-107 (2011).
  11. Zhou, L., et al. Self-assembled biomimetic Nano-Matrix for stem cell anchorage. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 108 (4), 984-991 (2020).
  12. Zhou, L., Yau, A., Zhang, W., Chen, Y. Fabrication of a biomimetic nano-matrix with janus base nanotubes and fibronectin for stem cell adhesion. Journal of Visualized Experiments. (159), e61317 (2020).
  13. Chen, Y., Song, S., Yan, Z., Fenniri, H., Webster, T. J. Self-assembled rosette nanotubes encapsulate and slowly release dexamethasone. International Journal of Nanomedicine. 6, 1035-1044 (2011).
  14. Chen, Y., et al. Self-assembled rosette nanotube/hydrogel composites for cartilage tissue engineering. Tissue Engineering. Part C, Methods. 16 (6), 1233-1243 (2010).
  15. Yu, H., Chen, Y. Advanced biomedical techniques for gene delivery. Recent Patents on Biomedical Engineering (Discontinued). 5 (1), 23-28 (2012).
  16. Muttigi, M. S., Han, I., Park, H. K., Park, H., Lee, S. H. Matrilin-3 role in cartilage development and osteoarthritis). International Journal of Molecular Sciences. 17 (4), 590 (2016).
  17. Pei, M., Luo, J., Chen, Q. Enhancing and maintaining chondrogenesis of synovial fibroblasts by cartilage extracellular matrix protein matrilins. Osteoarthritis Cartilage. 16 (9), 1110-1117 (2008).
  18. Bello, A. B., et al. Matrilin3/TGFbeta3 gelatin microparticles promote chondrogenesis, prevent hypertrophy, and induce paracrine release in MSC spheroid for disc regeneration. NPJ Regenerative Medicine. 6 (1), 50 (2021).
  19. Muttigi, M. S., et al. Matrilin-3 codelivery with adipose-derived mesenchymal stem cells promotes articular cartilage regeneration in a rat osteochondral defect model. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (3), 667-675 (2018).
  20. Jayasuriya, C. T., et al. Matrilin-3 chondrodysplasia mutations cause attenuated chondrogenesis, premature hypertrophy and aberrant response to TGF-beta in chondroprogenitor cells. International Journal of Molecular Sciences. 15 (8), 14555-14573 (2014).
  21. Poniatowski, L. A., Wojdasiewicz, P., Gasik, R., Szukiewicz, D. Transforming growth factor Beta family: insight into the role of growth factors in regulation of fracture healing biology and potential clinical applications. Mediators of Inflammation. 2015, 137823 (2015).
  22. Sun, Y., Lu, Y., Hu, Y., Ma, F., Chen, W. Induction of osteogenesis by bovine platelet transforming growth factor-beta (TGF-beta) in adult mouse femur. Chinese Medical Journal (English). 108 (12), 914-918 (1995).
  23. Sun, X., et al. Anti-miRNA oligonucleotide therapy for chondrosarcoma). Molecular Cancer Therapeutics. 18 (11), 2021-2029 (2019).
  24. Jayasuriya, C. T., Chen, Y., Liu, W., Chen, Q. The influence of tissue microenvironment on stem cell-based cartilage repair. Annals of the New York Academy of Sciences. 1383 (1), 21-33 (2016).
  25. Chen, Y., et al. Deficient mechanical activation of anabolic transcripts and post-traumatic cartilage degeneration in matrilin-1 knockout mice. PLoS One. 11 (6), 0156676 (2016).
  26. Zhou, L., Zhang, W., Lee, J., Kuhn, L., Chen, Y. Controlled self-assembly of DNA-mimicking nanotubes to form a layer-by-layer scaffold for homeostatic tissue constructs. ACS Applied Material Interfaces. 13 (43), 51321-51332 (2021).
  27. Belluoccio, D., Schenker, T., Baici, A., Trueb, B. Characterization of human matrilin-3 (MATN3). Genomics. 53 (3), 391-394 (1998).
  28. Yau, A., Yu, H., Chen, Y. mRNA detection with fluorescence-base imaging techniques for arthritis diagnosis. Journal of Rheumatology Research. 1 (2), 39-46 (2019).
  29. Lee, J., Sands, I., Zhang, W., Zhou, L., Chen, Y. DNA-inspired nanomaterials for enhanced endosomal escape. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (19), (2021).
  30. Zhang, W., Chen, Y. Molecular engineering of DNA-inspired Janus base nanomaterials. Juniper Online Journal Material Science. 5 (4), 555670 (2019).
  31. Yau, A., Sands, I., Chen, Y. Nano-scale surface modifications to advance current treatment options for cervical degenerative disc disease (CDDD). Journal of Orthopedic Research and Therapy. 4 (9), 1147 (2019).
  32. Mello, M. A., Tuan, R. S. Effects of TGF-beta1 and triiodothyronine on cartilage maturation: in vitro analysis using long-term high-density micromass cultures of chick embryonic limb mesenchymal cells. Journal of Orthopaedic Research. 24 (11), 2095-2105 (2006).
  33. Shi, Y., Massague, J. Mechanisms of TGF-beta signaling from cell membrane to the nucleus. Cell. 113 (6), 685-700 (2003).
  34. Sands, I., Lee, J., Zhang, W., Chen, Y. RNA delivery via DNA-inspired janus base nanotubes for extracellular matrix penetration. MRS Advances. 5 (16), 815-823 (2020).
  35. Zhou, L., Rubin, L. E., Liu, C., Chen, Y. Short interfering RNA (siRNA)-based therapeutics for cartilage diseases. Regenerative Engineering and Translational Medicine. 7 (3), 283-290 (2020).
  36. Bi, H., et al. Deposition of PEG onto PMMA microchannel surface to minimize nonspecific adsorption. Lab on a Chip. 6 (6), 769-775 (2006).
  37. Chen, Y., Webster, T. J. Increased osteoblast functions in the presence of BMP-7 short peptides for nanostructured biomaterial applications. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 91 (1), 296-304 (2009).
  38. Sun, M., Lee, J., Chen, Y., Hoshino, K. Studies of nanoparticle delivery with in vitro bio-engineered microtissues. Bioactive Materials. 5 (4), 924-937 (2020).
  39. Yau, A., Lee, J., Chen, Y. Nanomaterials for protein delivery in anticancer applications. Pharmaceutics. 13 (2), 155 (2021).

Tags

Bioengineering utgåva 185
Tillverkning och karakterisering av lager-för-lager Janus Base Nano-Matrix för att främja broskregenerering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Landolina, M., Yau, A., Chen, Y.… More

Landolina, M., Yau, A., Chen, Y. Fabrication and Characterization of Layer-By-Layer Janus Base Nano-Matrix to Promote Cartilage Regeneration. J. Vis. Exp. (185), e63984, doi:10.3791/63984 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter