Summary
Hjerte- og karsykdommer er den ledende dødsårsaken over hele verden. Vaskulær forkalkning bidrar vesentlig til byrden av kardiovaskulær sykelighet og dødelighet. Denne protokollen beskriver en enkel metode for å kvantifisere vaskulær glatt muskelcellemediert kalsiumutfelling in vitro ved fluorescerende avbildning.
Abstract
Vaskulær forkalkning innebærer en rekke degenerative patologier, inkludert betennelse, endringer i cellulær fenotype, celledød og fravær av forkalkningshemmere, som samtidig fører til tap av fartøyets elastisitet og funksjon. Vaskulær forkalkning er en viktig bidragsyter til sykelighet og dødelighet i mange patologier, inkludert kronisk nyresykdom, diabetes mellitus og aterosklerose. Nåværende forskningsmodeller for å studere vaskulær forkalkning er begrenset og er bare levedyktige i de sene stadiene av forkalkningsutvikling in vivo. In vitro-verktøy for å studere vaskulær forkalkning bruker endepunktsmålinger, øker kravene til biologisk materiale og risikerer innføring av variabilitet i forskningsstudier. Vi demonstrerer anvendelsen av en ny fluorescerende merket sonde som binder seg til in vitro forkalkningsutvikling på humane vaskulære glatte muskelceller og bestemmer sanntidsutviklingen av in vitro forkalkning. I denne protokollen beskriver vi anvendelsen av vår nyutviklede forkalkningsanalyse, et nytt verktøy i sykdomsmodellering som har potensielle translasjonsapplikasjoner. Vi ser for oss at denne analysen er relevant i et bredere spekter av mineralavsetningsforskning, inkludert applikasjoner innen bein-, brusk- eller tannforskning.
Introduction
Vaskulær forkalkning (VC) er en uavhengig risikofaktor for kardiovaskulær sykelighet og dødelighet 1,2,3. Lenge betraktet som en passiv kjemisk prosess med ektopisk mineralavsetning, ser det nå ut til å være en modifiserbar vevshelingsrespons som involverer det aktive bidraget fra forskjellige celler, inkludert aktiverte vaskulære glatte muskelceller (hVSMC) som en driver av sykdommen 4,5. In vivo VC kan måles ved multislice CT-skanning som en vurdering av aterosklerotisk belastning 6,7,8. For tiden pågår et paradigmeskifte, hvor VC-alvorlighetsgrad blir anerkjent som en risikofaktor for kardiovaskulær sykdom, type II diabetes, kronisk nyresykdom og aldring 9,10,11,12,13,14,15.
hVSMCs er den mest tallrike celletypen i kardiovaskulærsystemet og en hovedaktør i utviklingen av VC. In vitro hVSMC-indusert forkalkning er en mye brukt sykdomsmodell for å studere kardiovaskulær sykdom16,17. Imidlertid bruker de fleste protokoller for påvisning av in vitro-forkalkning endepunktsmålinger som kan begrense datainnsamling, krever større bruk av cellulært materiale og kan bremse forskningen. Vanlige metoder for påvisning av in vitro hVSMC forkalkning inkluderer o-cresolphthalein analysen, som måler oppløselig kalsiumavsetning mot totalt protein og krever cellelyse18. Også Alizarin Red-farging brukes, som binder seg direkte til kalkavleiringer på faste celler eller vev19. For å studere hVSMC forkalkning over tid med enten o-cresolphthalein eller Alizarin Red krever batcher av replikasjoner per tidspunkt, øker etterspørselen på biologisk materiale, og i sin tur øker sjansen for variabilitet.
I dette papiret beskriver vi metoden for anvendelse av en ny analyse som bruker hVSMCs med en fluorescerende bildebehandlingssonde for å bestemme in vitro VC-progresjon, samt fungere som en enestående forkalkningsanalyse i sluttstadiet. Vi har tidligere vist at denne analysen er direkte sammenlignbar med o-cresolphthalein og Alizarin Red-metodene og kan brukes til å skille mellom varierende kulturforhold20. I tillegg til sanntidsmålinger kan denne analysen brukes til å bestemme tilbøyeligheten til serum- eller plasmaprøver som en surrogatmarkør for klinisk VC-utvikling20. Dette vil hjelpe til med anvendelsen av biologiske strategier for kardiovaskulær vitenskap og sykdomsmodellering. En ytterligere anvendelse av analysen kan være som et translasjonelt biohybridsystem for å vurdere VC-alvorlighetsgrad eller progresjon fra blodbestanddeler som serum eller plasma.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cellesåing, vedlikehold og forkalkningsinduksjon
- For dyrking av primære celler, bruk et laminært luftstrømskap, hansker og sterilt utstyr. Desinfiser hender og arbeidsområde før og etter å ha utført noe arbeid. Behandle alle primære celler og kulturmedier som en potensiell biohazard, med mindre det motsatte er bevist. Fortrinnsvis autoklavoverskuddsceller og medier før deponering. Ikke inaktiver og autoklav kjemisk, da dette vil frigjøre giftige røyk.
- Kultur hVSMC på ubelagte cellekulturplater.
- Rutinemessig opprettholde hVSMC i vekstmedium bestående av M199 medium supplert med 10% -20% FBS og 1% Penn / Strep og inkubere ved 37 ° C og 5% CO2.
- Del cellene etter 70% -90% samløp.
- For å dele, vask hVSMCs 2x med PBS. Tilsett trypsin og rug i 2-5 min ved 37 °C. Kontroller for løsrivelse av celler under mikroskopet.
- Hemmer trypsinreaksjonen ved å tilsette serumholdig medium. Sentrifuge cellene ved 350 x g i 4 minutter og resuspendere pelleten i vedlikeholdsmedium. hVSMCs følger en 1: 2 splitting ordningen.
- For å starte forkalkningseksperimentet, klargjør cellene etter instruksjoner for en splittelse (trinn 1.4.1). Ved resuspendering teller du cellene og frøet i en 48-brønns plate med en tetthet på 10-15 x 103 celler/cm2. Frø cellene unngå bruk av de ytre brønnene, som anbefalt i supplerende figur 1.
- La cellene feste seg og komme seg i 24 timer (over natten) mens de ruger ved 37 °C og 5 % CO2.
- Vask forsiktig cellene 2x med PBS, og aspirer forsiktig alle gjenværende PBSetter 2. vask.
- Tilsett forkalkningsmedium forsiktig og inkuber ytterligere ved 37 °C og 5 % CO2. Forkalkningsmedium må inneholde en forkalkningsstimulus, fluorescerende merket fetuin-A (f.eks. med rødt fluorescerende protein [RFP]) (1 μg / ml) og HOECHST 33342 (0,1 μg / ml) kjernefysisk flekk eller lignende levende fluorescerende atomflekk. Ikke bruk DAPI, da dette ikke er gjennomtrengelig.
- Sjekk daglig med et lett mikroskop til forkalkning oppstår.
MERK: For merknader om cellekultur og vedlikehold av hVMSC-er, se Tilleggsfil 1.
2. Forkalkningsdeteksjon via bildebehandling
MERK: Følgende protokoll gir de generelle trinnene som skal tas i forberedelse, bildebehandling og dataanalyse. Skjermbilder som støtter instruksjonene for hvert trinn ved hjelp av en automatisert bildebehandlingsplattform og tilhørende bildeanalyseprogramvare (se Materialfortegnelse for detaljer) er gitt i Tilleggsfil 2 og Tilleggsfil 3. Andre bildebehandlingsinstrumenter og bildebehandlingsverktøy kan brukes til å anvende denne protokollen. Gjentatt avbildning på samme sted i hver brønn er imidlertid avgjørende for meningsfull datainnsamling. Å lage en protokoll for bildeforkalkning og gjenbruk ved hvert bildebehandlingstrinn er nødvendig for å oppnå reproduserbare resultater. Første gang du bruker metoden, følg trinnene nedenfor for å forberede deg før avbildningen.
- Oppsett av protokoll
- Åpne programvaren, og velg deretter Protokoller og Opprett ny.
- Velg Prosedyre og klikk Still inn temperatur. I popup-vinduet setter du temperaturen til 37 °C og gradienten til 1 °C, og klikker på OK. Velg platetypen du ønsker fra rullegardinmenyen. Legg til bildetrinnet ved å klikke på Bilde. Velg det omvendte bildet, og klikk OK.
- Legg til tre bildekanaler og sett dem til DAPI (377, 447 nm), RFP (531, 593 nm) og brightfield. Merk av Montage-boksen og angi ønsket nummer og plassering av bildene. 2 x 2 for en 48-brønns plate er et vanlig valg. Endre overlappingen for å representere en bedre dekning av hver brønn. Velg hvilke brønner som skal avbildes. Et nytt vindu åpnes der brønnene av interesse kan velges.
- Klikk Fokusalternativer for å angi fokusmodus. Et nytt vindu åpnes. Angi hver kanal individuelt. Vanligvis er brønner autofokusert på "DAPI" -kanalen. Sett alle andre kanaler til Fast brennvidde fra første kanal , og angi ved å klikke OK . Lukk vinduet.
- Start trinnene for forhåndsinnstilling av datareduksjon ved å klikke Datareduksjon og velge Forhåndsbehandling av bilder. Hvis du konfigurerer dette trinnet, reduseres fluorescensbakgrunnen. Godta standardinnstillingene ved å velge OK. Et nytt sett med bilder vil bli opprettet med prefikset "TSF". De opprinnelige bildene vil bli bevart.
- Konfigurer et trinn for å telle cellene ved å velge Cellulær analyse. Velg TSF DAPI-bilder fra rullegardinmenyen Kanal . Angi ytterligere detaljer etter at bildebehandlingen er utført. Dette trinnet kan også betraktes som datareduksjon; Sørg alltid for å beholde originalbildene.
- Forbered analysen av RFP-signalet (forkalkning) ved å velge Statistikk. I popup-vinduet merker du Trinn og velger TSF RFP som inngangskanal. Merk av for Øvre verdi og Nedre verdi. Merk av i boksen for Totalt areal i den nedre listen. Velg Ingen i Fargeeffekt-kolonnen. I popup-vinduet klikker du på Egendefinert og merker av for Bakgrunn. Dette vil fargekode resultatene fra lav-høy for enkel vurdering. Trykk på OK.
- For en rettferdig avlesning, normaliser RFP-signalet per celle. Ved å gjøre dette deles et totalt areal per celle. Hvis du vil konfigurere dette trinnet, trykker du på Ratio på venstre side. I popup-vinduet velger du for datainngang 1 RFP-kvantifisering: Totalt areal fra rullegardinmenyen. Velg videre Celleantall som datainngang 2.
- Til slutt velger du et nytt datasettnavn og trykker OK og OK igjen. Velg Fargeeffekt som beskrevet tidligere. Velg Fil øverst til venstre, og lagre filen som protokoll (PRT-filtype).
- Daglig etter at den første forkalkningen oppstår
- Gjenta disse trinnene for hvert tidspunkt. I oppstartsprogramvaren trykker du på Les nå og Eksisterende protokoll .... Velg protokollen som ble opprettet i forrige trinn. Programmet vil be om å lagre eksperimentet. Dette kan gjøres på dette trinnet, men også på et senere trinn manuelt ved å klikke på Lagre-knappen øverst til venstre.
- Et popup-vindu vil be om å vente på at systemet skal varmes opp. Slå på CO2 gassregulatoren og sett den til 5%.
- Når systemet har nådd den innstilte temperaturen, vises en melding om å sette inn en plate og lese. Trykk på Avbryt. Dette skyldes at eksponeringen for hvert fluorokrom for hvert tidspunkt må justeres individuelt.
- Transport platen fra inkubatoren til bildebehandleren i en safe som motstår brudd og søl og er i tråd med lokale biosikkerhetsforskrifter for transport av levende celler, i tilfelle en ulykke. Plasser platen i plateleseren.
- Etter å ha kansellert, klikk på Prosedyre. I popup-vinduet velger du Forhåndsinnstilt bildetrinn. Juster fokus og eksponering på DAPI-kanalen først. Fjern merket for Automatisk eksponering i alle kanaler. Klikk deretter på mikroskopikonet ved siden av DAPI-kanalen . Et nytt vindu åpnes.
- Velg brønnen du vil fokusere på. Bruk en brønn med middels til høy forkalkning for dette trinnet. Hvis et signal allerede er synlig, klikker du først Autofokus og deretter Autoeksponering. Hvis ikke, øk først eksponeringen og gjenta autofokus og autoeksponering. Om ønskelig kan eksponeringen justeres manuelt ved å velge rullegardinmenyen eksponering. Sjekk innstillingene på flere brønner. Når du er fornøyd, lagrer du innstillingene.
- Juster eksponeringen på samme måte for alle kanaler.
FORSIKTIG: Ikke fokuser på andre kanaler; juster bare eksponeringen. Fokussletten skal være den samme for alle kanaler. - Lukk prosedyrevinduet. Velg den grønne Les nå-knappen på den øverste oppgavelinjen. Lagre eksperimentet som angitt av programvaren.
MERK: Programvaren vil nå automatisk lese alle de valgte brønnene i de valgte innstillingene.
3. Analyse av data
MERK: For detaljerte skjermbilder om hvordan du utfører dataanalysen ved hjelp av en automatisert bildebehandlingsplattform og tilhørende bildeanalyseprogramvare (se Materialfortegnelse for detaljer), se Tilleggsfil 4. Ved bruk av alternative bildebehandlingsinstrumenter eller analyseprogramvare skal bildene eksporteres og batchbehandles for å sikre at eksponeringen, fluorescensterskelen eller intensiteten justeres likt for alle bilder i et komparativt datasett.
- Mens systemet leser platen, blir alle bildene automatisk behandlet i bakgrunnen. Juster innstillingene for celleantall ved å velge TSF DAPI-bilder som skal vises. Velg ønsket brønn ved å dobbeltklikke. Et nytt vindu dukker opp. Velg ett av bildene.
- Velg kategorien Analyse . I popup-vinduet velger du Cellular Analysis: Cell Count. Klikk OK. Fjern merket for RFP- og brightfield-kanalene. Merk av for Uthev objekter .
- Klikk Alternativer for å åpne menyen. Juster terskelen for størrelse og intensitet for å inkludere alle kjerner, men unngå rusk. Klikk OK. Klikk på Bruk endringer nederst til venstre for også å overføre innstillingene til alle andre bilder.
- På samme måte som før, velg en brønn og et bilde med middels til høy mengde forkalkning for best å justere signal-til-støy-forholdet; Klikk kategorien Analyse på oppgavemenyen.
- Denne gangen velger du Bildestatistikk. Fjern merket for DAPI- og brightfield-kanalen. Klikk Alternativer for å åpne menyen. Merk av i boksen Terskelavvik. Juster terskelens øvre og nedre verdier. Tell bare signalet hvis det er over bakgrunnen og ekskluder hvis det er rusk / gjenstander.
- Hvis du vil angi en ikke-subjektiv terskelverdi for signalet over bakgrunnen, velger du linjeverktøyet fra oppgavelinjen. Et vindu vil dukke opp. Tegn en linje gjennom en signallapp, men sørg for å også inkludere et bakgrunnsområde.
MERK: En graf vises i popup-vinduet, som viser en topp som representerer signalet over bakgrunnslinjen. Topphøydeverdien på 25 % representerer den anbefalte terskelen. Det anbefales også å måle flere signalplaster for å sikre valg av riktig terskel. Når du velger signalflater, kan valg av regioner med svært høy signalstyrke resultere i en terskel som forsømmer middels og eller lavere signaler. Det anbefales derfor å velge flekker med middels til lavt signal over bakgrunnen. Eksempler på for høye, for lave og nøyaktige terskler vises i tilleggsfil 4. - Når du er fornøyd, klikker du OK og Bruk endringer for å overføre innstillingene til alle andre brønner. Sjekk om terskelen er nøyaktig valgt i de andre brønnene.
- Når tersklene for celletall og RFP er angitt, eksporterer du dataene. Velg platen av interesse. I rullegardinmenyen kan flere parametere velges for eksport. Av relevans kan være celletall, RFP-område og "område / celle" som er beregningen som brukes til sammenligning mellom grupper. Klikk på Excel-knappen ved siden av rullegardinmenyen for å eksportere dataene direkte til et regneark.
MERK: I rullegardinmenyen kan de beregnede verdiene for celletallet, det totale arealet av RFP-signal (som reflekterer forkalkningsområdet), samt det normaliserte forholdet mellom totalt areal av RFP-signal per celle nå velges individuelt og eksporteres til et regneark. Vis resultatene som forholdet mellom det totale arealet av RFP-signal per celle og visualiser (f.eks. søylediagrammer). Bruk en ikke-paret Student t-test for å sammenligne to grupper eller en ikke-paret ANOVA for å sammenligne forskjellige grupper samtidig. Sammenligning av samme gruppe på forskjellige tidspunkter kan kreve parvis statistisk analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultatet inkluderer originale bilder av HOECHST-fargede kjerner, RFP-merket forkalkning og brightfield-bilder. Ulike stadier av forkalkning fra lav (figur 2) til høy (figur 3) kan oppdages og analyseres. Forkalkning kan vanligvis oppdages som svarte flekker ved hjelp av lysmikroskopi (figur 2D og figur 3B, pilene indikerer forkalkning), som er nyttige for primær vurdering og for å bestemme når man skal starte avbildning. For forbedret signal-til-støy-forhold bør de behandlede RFP-bildene analyseres for å kvantifisere forkalkning (figur 2F og figur 3D, pilene indikerer forkalkning). Til slutt kan data presenteres som et søylediagram som sammenligner to eller flere forhold på et tidspunkt, ledsaget av representative bilder (figur 4A, B, C). Data skal vises normalisert til celletall (f.eks. som forkalkningsområde per celle). Data kan også vises som tidsseriedata som viser samme tilstand ved ulike tidspunkter (figur 4D).
Figur 1: Visuelt sammendrag som oppsummerer trinnene for semi-automatisert forkalkningsdeteksjon og analyse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Eksempel på forkalkning i tidlig fase . (A) Overleggsbildet kan vises og analyseres som (B) separate DAPI (kjerner), (C) RFP (forkalkning) og (D) brightfield-bilder. (E) Kjerner identifiseres av programvaren og kan utheves som gule sirkler for å justere innstillingene. (F) For analyse av RFP-signalet blir bilder forhåndsbehandlet for å redusere bakgrunnssignalet, og (G) kan deretter settes en terskel for å måle signalet. Pilene indikerer forkalkning i (D) brightfield og (F & G) transformerte RFP-bilder. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Eksempel på forkalkning i senere stadium . (A) Overleggsbildet kan vises og analyseres som separate (B) brightfield, (C) RFP (forkalkning) og (E) DAPI (kjerner) bilder. (D) For analyse av RFP-signalet blir bilder forhåndsbehandlet for å redusere bakgrunnssignalet. Pilene indikerer forkalkning i (B) brightfield og (D) transformerte RFP-bilder. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Representativ sammenligning mellom lav og høy forkalkning av hVSMC etter 14 dager i kultur med forkalkningsmedium. Vanligvis kan data vises som et stolpediagram og analyseres ved hjelp av den uparrede studentens t-test. Representative bilder av (A) lav forkalkning og (B) høy forkalkning. Det røde signalet (RFP) reflekterer forkalkning, og det blå signalet (HOECHST) viser kjerner. (C) Forkalkning presentert som fetuin A-RFP positivt signal (totalt areal) per celle. (D) Eksempel på en forkalkningsanalyse målt over tid. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Supplerende figur 1: Eksempel på en rekke brønner som brukes til et forkalkningseksperiment med hVSMCs. Den ytre ringen av brønnene brukes ikke til forkalkningseksperimentet, men fylles med væske. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 1: Merknader om cellekultur og vedlikehold av hVMSC. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 2: Automatisert bildeprotokoll. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 3: Protokoll for bildeanalyse. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 4: Dataanalyseprotokoll. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I dette manuskriptet beskriver vi en halvautomatisert metode for bestemmelse av forkalkning in vitro . For denne metoden bør tre kritiske trinn for hVSMC-forkalkning optimaliseres. For det første er cellulær tetthet kritisk for hVSMC forkalkningsutvikling. Lav tetthet av hVSMCs vil resultere i langsom eller ingen forkalkning og celledød på grunn av mangel på celle-til-celle-kontakt og stresset som induseres under kalsifiseringsforhold21. Høye cellulære tettheter resulterer i overflyt, hvoretter celler blir senescent22 og forkalkningsutviklingen stopper. Det er kritisk å frø omtrent 70% konfluens i brønnplaten som skal brukes til etterfølgende forkalkningsutvikling, noe som sikrer spredningskapasitet og cellulære forbindelser av hVSMCs.
For det andre krever cellekulturmediet som skal brukes til forkalkningsinduksjon optimalisering. Innen vaskulær forkalkningsforskning er det rapportert om en rekke tilstander og mediesammensetninger for å forkalke hVSMCs23,24. Vi mener metoden er egnet til å påvise alle typer in vitro-mediert forkalkning, og den har blitt brukt til å påvise kalsium-, fosfat- eller kalsiumfosfatstimulerte avleiringer. Uansett modus for forkalkningsinduksjon er optimalisering av kalsifiseringsmediet avgjørende. I den presenterte protokollen optimaliserte vi forkalkningsinduksjon ved å bruke M199 med en total kalsiumkonsentrasjon på 4,5 mM Ca2+ med 2,5% FBS.
Til slutt har lokale forskjeller i plater under forkalkning blitt observert. Det er viktig å bruke tilfeldig lasting av tekniske repliker for å forhindre utvalgsskjevhet. I tillegg bør lasting av de ytre brønnbanene unngås, da disse brønnene alltid forkalkes raskere i 48-brønnsinnstillingen. Dette er potensielt forårsaket av dysregulering av fuktighet på intraplaten, hvor det å ikke bruke de ytterste brønnene og laste disse brønnene med store mengder væske bidrar til å kontrollere for dette.
Mens forkalkningsanalysen i seg selv kan kreve flere optimaliseringstrinn for å sikre reproduserbarhet med et bestemt oppsett, blir dette enkelt når det er i gang. Forkalkningsanalyser kan kjøres samtidig og gjentatte ganger under etablerte forhold uten behov for ytterligere optimalisering. hVSMC-mediert forkalkning kan være utfordrende og kreve eksperimentering før robustheten til analysene er oppnådd. En forsker skal kunne bestemme den optimale timingen før du starter vanlig bildebehandling, noe som kan ta opptil 1 uke. En fast bildetidsplan kan etableres fra starten av eksperimentet, selv om dette kan gi mange bilder uten differensiell avlesning, bruke en relativt stor mengde datalagring for bilder og være tidkrevende i analyse.
Prosedyren beskrevet i denne protokollen er en måte å utføre analysen av forkalkningsanalysen på. For andre formål bør prosedyren justeres tilsvarende. Vår analyse ved hjelp av den refererte automatiserte bildebehandlingsplattformen sikrer reproduserbarhet, selv om analysen kan utføres ved hjelp av en hvilken som helst levende celle- og temperatur- og CO2-kontrollert bildebehandlingsenhet. I tillegg er de tilsvarende kommersielle programvarepakkene optimalisert for cellulær screening og analyse med høyt innhold, ideelt egnet til å måle forkalkningstilbøyelighet over tid. Andre programvareløsninger, for eksempel freeware ImageJ, kan gi bildeanalyse og kvantifisere forkalkningsutvikling også.
Avbildningen av forkalkningsplater i sen fase kan være vanskelig på grunn av problemer med autofokusering hvis kulturen møter flytende rusk, noe som resulterer i et redusert antall skarpe bilder og replikasjoner. Bildeanalyse bør justeres deretter, og noen løsninger er utviklet i programvaren som brukes i denne protokollen for å forbedre og forenkle analysen.
Cellulær heterogenitet spiller en avgjørende rolle i kvantifiseringen av forkalkning in vitro. I denne plattformen bruker vi hVSMCs som biosensorer for utvikling av forkalkning. Primære hVSMCs er avledet fra forskjellige givere med forskjellige underliggende vaskulære patologier; Derfor er denne analysen fortsatt gjenstand for høy variabilitet på grunn av heterogeniteten til VSMCs batcher. En mulig løsning er bruk av immortaliserte cellelinjer eller bruk av hVSMCs avledet fra pluripotente stamceller.
En annen begrensning er at kvantifiseringsmetoden fortsatt er følsom for subjektivitet. Subjektivitet i forkalkningsanalyser oppstår på grunn av sluttpunktanalyser, som bare var tilgjengelige inntil nylig. Forskere må bestemme når de skal stoppe eksperimentet og måle forkalkning, noe som øker subjektiviteten til analysen. Vi mener metoden som er innført i dette manuskriptet er overlegen da vi måler over tid og kan sammenligne forkalkningsutviklingen i en viss periode. I forbindelse med dette må belysningsinnstillingen justeres for hvert tidspunkt separat på grunn av reduksjonen i signalet over tid. På grunn av dette påvirkes mengden signal som er representert i et bilde fortsatt av individets mening. Det er avgjørende at belysning utføres med de høyeste signal-til-støy-forholdene, slik at post-bildeanalyse kan utføres så objektivt som mulig.
Selv om vi ser subjektiviteten til denne analysen som en begrensning, tror vi at den er bedre enn andre in vitro forkalkningsmetoder. I motsetning til de eksisterende metodene har vår halvautomatiske forkalkningsanalyse fordelen at bilder kan analyseres anonymt, og dermed gi en uavhengig blindet mening. I tillegg kan bildene analyseres på et senere tidspunkt med de samme definerte innstillingene på tvers av et datasett, og dermed redusere subjektiviteten.
De nåværende metodene for bestemmelse av forkalkning er avhengige av endepunktsmålinger eller mangler den vaskulære komponenten25,26,27. Innenfor klinikken er verktøy som computertomografi, intravaskulær ultralyd og magnetisk resonansavbildning dyre og en byrde for pasientene. Biomarkørforskning har bevist sin bruk, men gjenspeiler ikke forkalkningsbyrden til pasientene. Vi tror at denne halvautomatiske analysen ikke bare bruker en enkelt biomarkør, men en samling sirkulerende komponenter, som gjenspeiler pasientens kardiovaskulære status. Dette kan brukes til å måle en forkalkningsrespons som en biosensor. Potensielle videre anvendelser av den beskrevne metoden inkluderer pasientens serumscreening for in vitro forkalkningsutvikling som surrogatmarkør for personlig utvikling av vaskulær forkalkning. Plattformen har vist følsomhet for dialyse og vitamin K-behandling, i tillegg til både metabolske og ikke-metabolske sykdommer som er knyttet til pasienter med dårlig kardiovaskulær status og prognose20. Siden analysens prinsipp er basert på påvisning av kalsiumkrystaller, antar vi at det også kan være relevant i andre forskningsområder der mineralisering kan være relevant, for eksempel slitasjegikt, osteoporose, beinregenerativ medisin eller tannforskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Leon Schurgers har mottatt institusjonelle tilskudd fra Bayer, Boehringer Ingelheim, NattoPharma og IDS. Leon Schurgers eier aksjer i Coagulation Profile. Willi Jahnen-Dechent er medstifter og aksjonær i CALCISCON AG.
Acknowledgments
Denne forskningen ble finansiert av EUs Horizon 2020 forsknings- og innovasjonsprogrammer under Marie Sklodowska-Curie stipendavtale No 722609 og 764474, NWO ZonMw (MKMD 40-42600-98-13007). Denne forskningen ble støttet av BioSPX. WJ-D mottok finansiering fra Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, tysk forskningsstiftelse) TRR219-prosjekt ID 322900939 og prosjekt-ID 403041552
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Calcium chloride, 93%, anhydrous | Thermo Fisher Scientific | 349615000 | |
| Costar 6-well Clear TC-treated well plates | Corning | 3516 | |
| Cytation 3 System | BioTek, Abcoude, The Netherlands | ||
| Fetal Bovine Serum | Merck | F7524-100ML | |
| Fetuin-A-Alexa Fluor-546 | Prepared in-house | ||
| Gen5 Software v3.10 | BioTek | ||
| Gibco Medium 199 | Thermo Fisher Scientific | 11150059 | |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| PBS (10X), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300062 |
References
- Taylor, A. J., Bindeman, J., Feuerstein, I., Cao, F., Brazaitis, M., O'Malley, P. G. Coronary calcium independently predicts incident premature coronary heart disease over measured cardiovascular risk factors: mean three-year outcomes in the Prospective Army Coronary Calcium (PACC) project. Journal of the American College of Cardiology. 46 (5), 807-814 (2005).
- Arad, Y., Goodman, K. J., Roth, M., Newstein, D., Guerci, A. D. Coronary calcification, coronary disease risk factors, C-reactive protein, and atherosclerotic cardiovascular disease events the St. Francis Heart Study. Journal of the American College of Cardiology. 46 (1), 158-165 (2005).
- Detrano, R., et al. Coronary calcium as a predictor of coronary events in four racial or ethnic groups. New England Journal of Medicine. 358 (13), 1336-1345 (2008).
- Schurgers, L. J., Akbulut, A. C., Kaczor, D. M., Halder, M., Koenen, R. R., Kramann, R. Initiation and propagation of vascular calcification is regulated by a concert of platelet- and smooth muscle cell-derived extracellular vesicles. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 5, 36 (2018).
- Jaminon, A., Reesink, K., Kroon, A., Schurgers, L. The role of vascular smooth muscle cells in arterial remodeling: focus on calcification-related processes. International Journal of Molecular Sciences. 20 (22), 5694 (2019).
- Mollet, N., et al. Coronary plaque burden in patients with stable and unstable coronary artery disease using multislice CT coronary angiography. La Radiologia Medica. 116 (8), 1174-1187 (2011).
- Galal, H., Rashid, T., Alghonaimy, W., Kamal, D. Detection of positively remodeled coronary artery lesions by multislice CT and its impact on cardiovascular future events. The Egyptian Heart Journal. 71 (1), 26 (2019).
- Benedek, T., Gyöngyösi, M., Benedek, I. Multislice computed tomographic coronary angiography for quantitative assessment of culprit lesions in acute coronary syndromes. The Canadian Journal of Cardiology. 29 (3), 364-371 (2013).
- Raggi, P. Cardiovascular calcification in end stage renal disease. Cardiovascular Disorders in Hemodialysis. 149, 272-278 (2005).
- Raggi, P. Coronary artery calcification predicts risk of CVD in patients with CKD. Nature Reviews Nephrology. 13 (6), 324-326 (2017).
- Durham, A. L., Speer, M. Y., Scatena, M., Giachelli, C. M., Shanahan, C. M. Role of smooth muscle cells in vascular calcification: implications in atherosclerosis and arterial stiffness. Cardiovascular Research. 114 (4), 590-600 (2018).
- Yahagi, K., et al. Pathology of human coronary and carotid artery atherosclerosis and vascular calcification in diabetes mellitus. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (2), 191-204 (2017).
- Harper, E., Forde, H., Davenport, C., Rochfort, K. D., Smith, D., Cummins, P. M. Vascular calcification in type-2 diabetes and cardiovascular disease: Integrative roles for OPG, RANKL and TRAIL. Vascular Pharmacology. 82, 30-40 (2016).
- Lacolley, P., Regnault, V., Segers, P., Laurent, S. Vascular smooth muscle cells and arterial stiffening: relevance in development, aging, and disease. Physiological Reviews. 97 (4), 1555-1617 (2017).
- Pescatore, L. A., Gamarra, L. F., Liberman, M. Multifaceted mechanisms of vascular calcification in aging. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 39 (7), 1307-1316 (2019).
- Herrmann, J., Babic, M., Tölle, M., vander Giet, M., Schuchardt, M. Research models for studying vascular calcification. International Journal of Molecular Sciences. 21 (6), 2204 (2020).
- Bowler, M. A., Merryman, W. D. In vitro models of aortic valve calcification: solidifying a system. Cardiovascular Pathology: The Official Journal of the Society for Cardiovascular Pathology. 24 (1), 1-10 (2015).
- Gitelman, H. J. An improved automated procedure for the determination of calcium in biological specimens. Analytical Biochemistry. 18 (3), 521-531 (1967).
- Furmanik, M., et al. Endoplasmic reticulum stress mediates vascular smooth muscle cell calcification via increased release of Grp78 (glucose-regulated protein, 78 kDa)-loaded extracellular vesicles. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (2), 898-914 (2021).
- Jaminon, A. M. G., et al. Development of the BioHybrid assay: combining primary human vascular smooth muscle cells and blood to measure vascular calcification propensity. Cells. 10 (8), 2097 (2021).
- Reynolds, J. L., et al. Human vascular smooth muscle cells undergo vesicle-mediated calcification in response to changes in extracellular calcium and phosphate concentrations: a potential mechanism for accelerated vascular calcification in ESRD. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 15 (11), 2857-2867 (2004).
- Wang, X. -R., Zhang, J. -J., Xu, X. -X., Wu, Y. -G. Prevalence of coronary artery calcification and its association with mortality, cardiovascular events in patients with chronic kidney disease: a systematic review and meta-analysis. Renal Failure. 41 (1), 244-256 (2019).
- Willems, B. A., et al. Ucma/GRP inhibits phosphate-induced vascular smooth muscle cell calcification via SMAD-dependent BMP signalling. Scientific Reports. 8 (1), 4961 (2018).
- Furmanik, M., et al. Reactive oxygen-forming Nox5 links vascular smooth muscle cell phenotypic switching and extracellular vesicle-mediated vascular calcification. Circulation Research. 127 (7), 911-927 (2020).
- Virtanen, P., Isotupa, K. Staining properties of alizarin red S for growing bone in vitro. Acta Anatomica. 108 (2), 202-207 (1980).
- Yang, H., Curinga, G., Giachelli, C. M. Elevated extracellular calcium levels induce smooth muscle cell matrix mineralization in vitro. Kidney International. 66 (6), 2293-2299 (2004).
- Pasch, A., et al. Nanoparticle-based test measures overall propensity for calcification in serum. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 23 (10), 1744-1752 (2012).
