Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Полуавтоматизированный и воспроизводимый биологический метод количественной оценки осаждения кальция in vitro

Published: June 2, 2022 doi: 10.3791/64029
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 1, 2, 1,3
1Department of Biochemistry, Cardiovascular Research Institute Maastricht (CARIM), Maastricht University, 2Helmholtz Institute for Biomedical Engineering, Biointerface Group, RWTH Aachen University, 3Institute of Experimental Medicine and Systems Biology, RWTH Aachen University
* These authors contributed equally

Summary

Сердечно-сосудистые заболевания являются основной причиной смерти во всем мире. Кальцификация сосудов вносит существенный вклад в бремя сердечно-сосудистой заболеваемости и смертности. Этот протокол описывает простой метод количественной оценки осаждения кальция in vitro с помощью флуоресцентной визуализации.

Abstract

Кальцификация сосудов включает в себя ряд дегенеративных патологий, включая воспаление, изменения клеточного фенотипа, гибель клеток и отсутствие ингибиторов кальцификации, которые одновременно приводят к потере эластичности и функции сосудов. Кальцификация сосудов является важным фактором заболеваемости и смертности при многих патологиях, включая хроническое заболевание почек, сахарный диабет и атеросклероз. Современные исследовательские модели для изучения кальцификации сосудов ограничены и жизнеспособны только на поздних стадиях развития кальцификации in vivo. Инструменты in vitro для изучения кальцификации сосудов используют измерения конечных точек, повышая требования к биологическому материалу и рискуя введением изменчивости в научные исследования. Мы демонстрируем применение нового флуоресцентно меченого зонда, который связывается с развитием кальцификации in vitro на клетках гладкой мускулатуры сосудов человека и определяет развитие кальцификации in vitro в реальном времени. В этом протоколе мы описываем применение нашего недавно разработанного анализа кальцификации, нового инструмента в моделировании заболеваний, который имеет потенциальное трансляционное применение. Мы предполагаем, что этот анализ будет актуален в более широком спектре исследований минерального осаждения, включая применение в исследованиях костей, хрящей или зубов.

Introduction

Кальцификация сосудов (ВК) является самостоятельным фактором риска сердечно-сосудистой заболеваемости и смертности 1,2,3. Долгое время считавшийся пассивным химическим процессом внематочного минерального отложения, теперь он представляет собой модифицируемую реакцию заживления тканей, включающую активный вклад различных клеток, включая активированные клетки гладкой мускулатуры сосудов (hVSMC) в качестве драйвера заболевания 4,5. In vivo ВК может быть измерен с помощью многоспиральной компьютерной томографии как оценка атеросклеротическойнагрузки 6,7,8. В настоящее время происходит смена парадигмы, в которой тяжесть ВК становится признанным фактором риска сердечно-сосудистых заболеваний, диабета II типа, хронического заболевания почек и старения 9,10,11,12,13,14,15.

hVSMC являются наиболее распространенным типом клеток в сердечно-сосудистой системе и основным участником в развитии VC. Кальцификация in vitro hVSMC является широко используемой моделью заболевания для изучения сердечно-сосудистых заболеваний16,17. Тем не менее, большинство протоколов для обнаружения кальцификации in vitro используют измерения конечных точек, которые могут ограничить сбор данных, требуют более широкого использования клеточного материала и могут замедлить исследования. Общие методы обнаружения кальцификации hVSMC in vitro включают анализ o-кресольфталеина, который измеряет солюбилизированное отложение кальция против общего белка и требует лизиса клеток18. Также используется окрашивание Alizarin Red, которое связывается непосредственно с отложениями кальция на фиксированных клетках или ткани19. Для изучения кальцификации hVSMC с течением времени с помощью o-кресольфталеина или Alizarin Red требуются партии реплик в каждый момент времени, увеличивая спрос на биологический материал и, в свою очередь, увеличивая вероятность изменчивости.

В этой статье мы подробно описываем метод применения нового анализа, который использует hVSMC с флуоресцентным зондом визуализации для определения прогрессирования VC in vitro , а также функционирует как сингулярный анализ кальцификации на конечной стадии. Ранее мы продемонстрировали, что этот анализ непосредственно сопоставим с методами o-cresolphthalein и Alizarin Red и может быть использован для различения различных условий культуры20. В дополнение к измерениям в режиме реального времени этот анализ может быть использован для определения склонности образцов сыворотки или плазмы в качестве суррогатного маркера для клинической разработки VC20. Это поможет в применении биологических стратегий сердечно-сосудистых наук и моделировании заболеваний. Дальнейшее применение анализа может осуществляться в виде трансляционной системы BioHybrid для оценки тяжести или прогрессирования VC из компонентов крови, таких как сыворотка или плазма.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Посев, поддержание и индукция кальцификации клеток

  1. Для культивирования первичных клеток используйте ламинарный шкаф воздушного потока, перчатки и стерильное оборудование. Дезинфицируйте руки и рабочее пространство до и после проведения любой работы. Рассматривайте все первичные клетки и питательные среды как потенциальную биологическую опасность, если не доказано обратное. Предпочтительно автоклав избыточных ячеек и сред перед утилизацией. Не следует химически инактивировать и автоклавировать, так как это будет выделять токсичные пары.
  2. Культивирование hVSMC на пластинах для культивирования клеток без покрытия.
  3. Обычно поддерживать hVSMC в питательной среде, состоящей из среды M199, дополненной 10% -20% FBS и 1% Pen/Strep, и инкубировать при 37 °C и 5% CO2.
  4. Разделите ячейки на 70%-90% сливание.
    1. Для разделения промывайте hVSMC 2x с помощью PBS. Добавить трипсин и инкубировать в течение 2-5 мин при 37 °C. Проверьте отслоение клеток под микроскопом.
    2. Ингибируют трипсиновую реакцию путем добавления сывороточносодержащей среды. Центрифугируйте ячейки при 350 х г в течение 4 мин и повторно суспендируйте гранулу в поддерживающей среде. hVSMC следуют схеме разделения 1:2.
  5. Чтобы начать эксперимент по кальцификации, подготовьте клетки, следуя инструкциям по расщеплению (шаг 1.4.1). При повторном суспензии пересчитайте клетки и семена в 48-луночную пластину с плотностью 10-15 х 103 ячейки/см2. Засейте клетки, избегая использования наружных колодцев, как рекомендовано на дополнительном рисунке 1.
  6. Дайте клеткам прилипнуть и восстановиться в течение 24 ч (ночью) во время инкубации при 37 °C и 5% CO2.
  7. Аккуратно промыть ячейки 2x PBS, тщательно аспирируя все оставшиеся PBS после2-й промывки.
  8. Осторожно добавляют кальцификационную среду и далее инкубируют при 37 °C и 5% CO2. Кальцифицирующая среда должна содержать стимул кальцификации, флуоресцентно меченый фетуин-А (например, с красным флуоресцентным белком [RFP]) (1 мкг/мл) и ядерное пятно HOECHST 33342 (0,1 мкг/мл) или аналогичное живое флуоресцентное ядерное пятно. Не используйте DAPI, так как он непроницаем.
  9. Проверяйте ежедневно со световым микроскопом, пока не произойдет кальцификация.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Примечания по культуре клеток и поддержанию hVMSC см. в Дополнительном файле 1.

2. Обнаружение кальцификации с помощью визуализации

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий протокол содержит общие шаги, которые необходимо предпринять при подготовке, визуализации и анализе данных. Снимки экрана, поддерживающие инструкции для каждого шага с использованием автоматизированной платформы обработки изображений и соответствующего программного обеспечения для анализа изображений (см. Таблицу материалов для получения подробной информации ), приведены в Дополнительном файле 2 и Дополнительном файле 3. Для применения этого протокола могут использоваться другие инструменты визуализации и инструменты обработки изображений. Однако повторная визуализация в одном и том же месте в каждой скважине имеет решающее значение для значимого сбора данных. Создание протокола для кальцификации и повторного использования изображений на каждом этапе визуализации необходимо для получения воспроизводимых результатов. При первом применении метода выполните следующие действия, чтобы подготовиться к визуализации.

  1. Настройка протокола
    1. Откройте программное обеспечение, а затем выберите Протоколы и Создать новый.
    2. Выберите Процедура и нажмите Установить температуру. Во всплывающем окне установите температуру на 37 °C и градиент на 1 °C и нажмите кнопку OK. Выберите тип пластины в раскрывающемся меню. Добавьте шаг создания образа, щелкнув Изображение. Выберите перевернутый тепловизор и нажмите кнопку «ОК».
    3. Добавьте три канала обработки изображений и установите для них DAPI (377, 447 нм), RFP (531, 593 нм) и brightfield. Установите флажок Монтаж и задайте нужное количество и расположение изображений. 2 x 2 для плиты с 48 скважинами является распространенным выбором. Измените перекрытие, чтобы представить лучший охват каждой скважины. Выберите, какие скважины должны быть изображены. Откроется новое окно, в котором можно выбрать интересующие скважины.
    4. Нажмите кнопку Параметры фокусировки , чтобы задать режим фокусировки. Откроется новое окно. Установите каждый канал индивидуально. Как правило, скважины автофокусируются на канале «DAPI». Установите для всех остальных каналов фиксированную высоту фокусировки с первого канала и нажмите кнопку ОК. Закройте окно.
    5. Начните шаги по предварительной настройке сокращения данных, щелкнув Сокращение данных и выбрав Предварительная обработка изображений. Настройка этого шага уменьшает фон флуоресценции. Примите параметры по умолчанию, нажав кнопку ОК. Будет создан новый набор изображений с префиксом "TSF". Исходные изображения будут сохранены.
    6. Настройте шаг для подсчета клеток, выбрав Клеточный анализ. Выберите изображения TSF DAPI в раскрывающемся меню Канал . Установите дополнительные сведения после выполнения визуализации. Этот шаг также можно рассматривать как сокращение объема данных; всегда следите за тем, чтобы сохранить исходные изображения.
    7. Подготовьте анализ сигнала RFP (кальцификации), выбрав Статистика. Во всплывающем окне пометьте Step и выберите TSF RFP в качестве входного канала. Установите флажки Верхнее значение и Нижнее значение . Установите флажок Общая площадь в нижнем списке. Выберите «Нет » в столбце «Цветовой эффект ». Во всплывающем окне нажмите кнопку Пользовательский и установите флажок Фон . Это приведет к цветовой кодировке результатов от low-high для легкой оценки. Нажмите OK.
    8. Для справедливого считывания нормализуйте сигнал RFP на ячейку. При этом общая площадь делится на ячейку. Чтобы настроить этот шаг, нажмите Ratio с левой стороны. Во всплывающем окне выберите для ввода данных 1 RFP Quantification: Total Area из раскрывающегося меню. Далее выберите Количество ячеек в качестве входных данных 2.
    9. Наконец, выберите Новое имя набора данных и нажмите OK и OK еще раз. Выберите Цветовой эффект , как описано выше. В левом верхнем углу выберите Файл и сохраните файл по протоколу (тип файла .prt).
  2. Ежедневно после первого обызвествления происходит
    1. Для каждой точки времени повторите эти шаги. В запускаемом программном обеспечении нажмите Читать сейчас и Существующий протокол.... Выберите протокол, созданный на предыдущем шаге. Программа попросит сохранить эксперимент. Это можно сделать на этом шаге, а также на любом более позднем шаге вручную, нажав кнопку «Сохранить » в левом верхнем углу.
    2. Всплывающее окно попросит подождать, пока система нагреется. Включите газовый контроллерCO2 и установите его на 5%.
    3. Как только система достигнет заданной температуры, появится подсказка вставить пластину и прочитать. Нажмите кнопку Отмена. Это связано с тем, что для каждой точки времени экспозиция каждого фторхрома должна регулироваться индивидуально.
    4. Транспортируйте пластину из инкубатора в тепловизор в сейфе, который устойчив к разрушению и разливу и соответствует местным правилам биобезопасности для транспортировки живых клеток в случае аварии. Поместите пластину в устройство считывания пластин.
    5. После отмены нажмите « Процедура». Во всплывающем окне выберите Предустановленный шаг создания образа. Сначала настройте фокус и экспозицию на канале DAPI . Снимите флажок Автоматическая экспозиция на всех каналах. Затем щелкните значок Микроскоп рядом с каналом DAPI . Откроется новое окно.
    6. Выберите колодец, на котором нужно сосредоточиться. Используйте колодец со средним и высоким кальцификацией для этого шага. Если сигнал уже виден, сначала нажмите кнопку Автофокус , а затем Автоэкспозиция. Если нет, сначала увеличьте экспозицию и повторите автофокус и автоэкспозицию. При желании экспозицию можно настроить вручную, выбрав раскрывающееся меню экспозиции. Проверьте настройки на нескольких скважинах. После этого сохраните настройки.
    7. Отрегулируйте экспозицию одинаково для всех каналов.
      ВНИМАНИЕ: Не сосредотачивайтесь на других каналах; только регулируйте экспозицию. Фокус должен быть одинаковым для всех каналов.
    8. Закройте окно процедуры. Нажмите зеленую кнопку «Прочитать сейчас» на верхней панели задач. Сохраните эксперимент, как указано программным обеспечением.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Теперь программное обеспечение будет автоматически считывать все выбранные скважины в выбранных настройках.

3. Анализ данных

ПРИМЕЧАНИЕ: Подробные снимки экрана о том, как выполнять анализ данных с помощью автоматизированной платформы визуализации и соответствующего программного обеспечения для анализа изображений (см. Таблицу материалов для получения подробной информации ), см. в Дополнительном файле 4. При использовании альтернативных инструментов визуализации или аналитического программного обеспечения изображения должны быть экспортированы и обработаны пакетно, гарантируя, что экспозиция, порог флуоресценции или интенсивность корректируются одинаково для всех изображений в сравнительном наборе данных.

  1. Пока система считывает пластину, все изображения автоматически обрабатываются в фоновом режиме. Настройте параметры количества ячеек, выбрав изображения TSF DAPI для отображения. Выберите нужный колодец двойным щелчком мыши. Появится новое окно. Выберите одно из изображений.
  2. Выберите вкладку Анализ . Во всплывающем окне выберите Клеточный анализ: количество ячеек. Нажмите кнопку ОК. Отмените выбор rfP и каналов brightfield. Установите флажок Выделить объекты .
  3. Нажмите кнопку Параметры , чтобы открыть меню. Отрегулируйте размер и порог интенсивности, чтобы включить все ядра, но исключить мусор. Нажмите кнопку ОК. Нажмите Применить изменения в левом нижнем углу, чтобы также перенести настройки на все остальные изображения.
  4. Точно так же, как и раньше, выберите скважину и изображение со средним и высоким уровнем кальцификации, чтобы наилучшим образом отрегулировать отношение сигнал/шум; перейдите на вкладку Анализ в меню задач.
    1. На этот раз выберите Статистика изображений. Снимите флажок DAPI и канала brightfield. Нажмите кнопку Параметры , чтобы открыть меню. Установите флажок Пороговые выбросы. Отрегулируйте верхнее и нижнее значения порогового значения. Подсчитывайте сигнал только в том случае, если он находится над фоном, и исключайте, если есть обломки /артефакты.
    2. Чтобы задать несубъективное пороговое значение для сигнала над фоном, выберите инструмент «Линия» на панели задач. Появится окно. Проведите линию через участок сигнала, но не забудьте также включить область фона.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Во всплывающем окне появится график, показывающий пик, представляющий сигнал над фоновой линией. Значение пиковой высоты 25% представляет собой рекомендуемое пороговое значение. Также рекомендуется измерять несколько сигнальных патчей, чтобы обеспечить выбор правильного порога. При выборе участков сигнала выбор областей с очень высокой силой сигнала может привести к порогу, который пренебрегает средними и или более низкими сигналами. Поэтому рекомендуется выбирать участки среднего и низкого сигнала выше фона. Примеры слишком высоких, слишком низких и точных пороговых значений приведены в дополнительном файле 4.
    3. После выполнения нажмите кнопку ОК и Применить изменения , чтобы перенести настройки на все остальные скважины. Проверьте, точно ли выбран порог в других скважинах.
  5. После установки пороговых значений количества ячеек и RFP экспортируйте данные. Выберите интересующую вас тарелку. В раскрывающемся меню для экспорта можно выбрать несколько параметров. Релевантным может быть количество ячеек, область RFP и «область / ячейка», которая является метрикой, используемой для сравнения между группами. Нажмите кнопку Excel рядом с раскрывающимся меню, чтобы экспортировать данные непосредственно в электронную таблицу.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В выпадающем меню вычисляемые значения количества ячеек, общей площади RFP-сигнала (отражающей площадь кальцификации), а также нормализованного соотношения общей площади RFP-сигнала на ячейку теперь можно выбрать индивидуально и экспортировать в электронную таблицу. Отображение результатов в виде соотношения общей площади RFP-сигнала на ячейку и визуализация (например, гистограммы). Примените непарный T-тест студента для сравнения двух групп или непарный ANOVA для сравнения разных групп в один и тот же момент времени. Сравнение одной и той же группы в разные моменты времени может потребовать парного статистического анализа.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Результат включает в себя оригинальные изображения ядер, окрашенных HOECHST, кальцификацию, помеченную RFP, и изображения яркого поля. Могут быть обнаружены и проанализированы различные стадии кальцификации от низкой (рисунок 2) до высокой (рисунок 3). Кальцификация обычно может быть замечена в виде черных пятен с помощью световой микроскопии (рисунок 2D и рисунок 3B, стрелки указывают на кальцификацию), которые полезны для первичной оценки и определения того, когда начинать визуализацию. Для улучшения отношения сигнал/шум обработанные изображения RFP должны быть проанализированы для количественной оценки кальцификации (рисунок 2F и рисунок 3D, стрелки указывают на кальцификацию). Наконец, данные могут быть представлены в виде гистограммы, сравнивающей два или более условий в одной точке времени, сопровождаемую репрезентативными изображениями (фиг.4A,B,C). Данные должны отображаться в соответствии с количеством ячеек (например, в виде области кальцификации на ячейку). Данные также могут отображаться в виде данных временных рядов, показывающих одно и то же состояние в различных точках времени (рисунок 4D).

Figure 1
Рисунок 1: Визуальная аннотация, обобщающая шаги для полуавтоматического обнаружения и анализа кальцификации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Пример кальцификации на ранней стадии. (A)Наложенное изображение может быть отображено и проанализировано в виде (B) отдельных изображений DAPI (ядра), (C) RFP (кальцификация) и (D) изображений яркого поля. (E) Ядра идентифицируются программным обеспечением и могут быть выделены в виде желтых кругов для настройки настроек. (F) Для анализа сигнала RFP изображения предварительно обрабатываются для уменьшения фонового сигнала, и (G) впоследствии может быть установлен порог для измерения сигнала. Стрелки указывают на кальцификацию в (D) ярком поле и (F & G) преобразованных изображениях RFP. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Пример кальцификации на более поздней стадии. (A) Наложенное изображение может быть отображено и проанализировано в виде отдельных (B) brightfield, (C) RFP (кальцификация) и (E) DAPI (ядра) изображений. (D) Для анализа сигнала RFP изображения предварительно обрабатываются для уменьшения фонового сигнала. Стрелки указывают на кальцификацию в (B) ярком поле и (D) преобразованных изображениях RFP. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Репрезентативное сравнение низкой и высокой кальцификации hVSMC через 14 дней в культуре со средой кальцификации. Как правило, данные могут отображаться в виде гистограммы и анализироваться с использованием непарного t-теста Студента. Репрезентативные изображения (А) низкой кальцификации и (В) высокой кальцификации. Красный сигнал (RFP) отражает кальцификацию, а синий сигнал (HOECHST) отображает ядра. (C) Кальцификация представлена в виде положительного сигнала фетуина A-RFP (общая площадь) на клетку. D) Пример анализа кальцификации, измеренного с течением времени. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительный рисунок 1: Пример ряда скважин, используемых для эксперимента по кальцификации с hVSMC. Наружное кольцо скважин не используется для эксперимента по кальцификации, а заполнено жидкостью. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 1: Примечания по клеточной культуре и поддержанию hVMSC. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 2: Протокол автоматической обработки изображений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 3: Протокол анализа изображений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 4: Протокол анализа данных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В этой рукописи мы описываем полуавтоматический метод определения кальцификации in vitro . Для этого метода необходимо оптимизировать три критических этапа кальцификации hVSMC. Во-первых, клеточная плотность имеет решающее значение для развития кальцификации hVSMC. Низкая плотность hVSMC приведет к медленному или нулевому кальцификации и гибели клеток из-за отсутствия межклеточного контакта и стресса, который индуцируется в условиях кальцификации21. Высокая клеточная плотность приводит к чрезмерному слиянию, после чего клетки стареют22 и развитие кальцификации прекращается. Крайне важно засеять примерно 70% слияние в плите скважины, которая будет использоваться для последующего развития кальцификации, обеспечивая пролиферативную емкость и клеточные соединения hVSMC.

Во-вторых, среда клеточной культуры, которая будет использоваться для индукции кальцификации, требует оптимизации. В рамках исследований кальцификации сосудов сообщалось, что различные состояния и композиции сред кальцифицируют hVSMCs23,24. Мы считаем, что этот метод подходит для обнаружения всех видов кальцификации, опосредованной in vitro, и он был использован для обнаружения кальциевых, фосфатных или кальциево-фосфатных стимулированных отложений. Независимо от режима индукции кальцификации, оптимизация кальцифицирующей среды имеет решающее значение. В представленном протоколе мы оптимизировали индукцию кальцификации с помощью M199 с общей концентрацией кальция 4,5 мМ Ca2+ с 2,5% FBS.

Наконец, наблюдались локальные различия в пластинах во время кальцификации. Крайне важно применять случайную загрузку технических реплик для предотвращения смещения выборки. Кроме того, следует избегать загрузки наружных полос скважин, так как эти скважины всегда кальцинируются быстрее в условиях 48 скважин. Это потенциально вызвано дисрегуляцией влажности внутри плиты, при этом контроль за этим помогает не использовать самые внешние скважины и загружать эти скважины большими объемами жидкости.

Хотя сам анализ кальцификации может потребовать нескольких шагов оптимизации для обеспечения воспроизводимости с конкретной установкой, после запуска это становится простым. Анализы на кальцификацию могут проводиться одновременно и многократно в установленных условиях без необходимости дальнейшей оптимизации. Кальцификация, опосредованная hVSMC, может быть сложной задачей и требует экспериментов до того, как будет достигнута надежность анализов. Исследователь должен быть в состоянии определить оптимальные сроки до начала регулярной визуализации, которая может занять до 1 недели. Фиксированное расписание обработки изображений может быть установлено с самого начала эксперимента, хотя это может привести к получению многих изображений без дифференциального считывания, использовать относительно большой объем хранилища данных для изображений и занимать много времени при анализе.

Процедура, описанная в этом протоколе, является одним из способов выполнения анализа анализа кальцификации. Для других целей процедура должна быть соответствующим образом скорректирована. Наш анализ с использованием упомянутой автоматизированной платформы визуализации обеспечивает воспроизводимость, хотя анализ может быть выполнен с использованием любой живой клетки и устройства визуализации, контролируемого температурой иCO2. Кроме того, соответствующие коммерческие пакеты программного обеспечения оптимизированы для скрининга и анализа клеток с высоким содержанием, идеально подходящих для измерения склонности к кальцификации с течением времени. Другие программные решения, такие как бесплатное программное обеспечение ImageJ, также могут обеспечить анализ изображений и количественную оценку развития кальцификации.

Визуализация пластин кальцификации на поздней стадии может быть затруднена из-за проблем с автофокусировкой, если культура сталкивается с плавающим мусором, что приводит к уменьшению количества четких изображений и реплик. Анализ изображений должен быть соответствующим образом скорректирован, и некоторые решения были разработаны в программном обеспечении, используемом в этом протоколе, для улучшения и упрощения анализа.

Клеточная гетерогенность играет решающую роль в количественной оценке кальцификации in vitro. В этой платформе мы используем hVSMC в качестве биосенсоров для развития кальцификации. Первичные hVSMCs получены от различных доноров с различными основными сосудистыми патологиями; поэтому этот анализ по-прежнему подвержен высокой изменчивости из-за неоднородности партий VSMC. Возможным решением является использование увековеченных клеточных линий или использование hVSMC, полученных из плюрипотентных стволовых клеток.

Другим ограничением является то, что метод количественной оценки по-прежнему чувствителен к субъективности. Субъективность в анализах кальцификации возникает из-за анализов конечных точек, которые были доступны только до недавнего времени. Исследователи должны решить, когда прекратить эксперимент и измерить кальцификацию, увеличивая субъективность анализа. Мы считаем, что метод, представленный в этой рукописи, превосходит, поскольку мы измеряем с течением времени и можем сравнивать развитие кальцификации в определенный период. В связи с этим настройка освещения должна быть отрегулирована для каждой точки времени отдельно из-за уменьшения сигнала с течением времени. Из-за этого количество сигнала, представленного на картинке, по-прежнему зависит от мнения человека. Крайне важно, чтобы освещение осуществлялось с самым высоким отношением сигнал/шум, чтобы пост-имиджевый анализ можно было выполнить как можно более объективно.

Хотя мы рассматриваем субъективность этого анализа как ограничение, мы считаем, что он превосходит другие методы кальцификации in vitro . В отличие от существующих методов, наш полуавтоматический анализ кальцификации имеет то преимущество, что изображения могут быть проанализированы анонимно, тем самым обеспечивая независимое слепое мнение. Кроме того, изображения могут быть проанализированы на более позднем этапе с теми же определенными настройками по всему набору данных, тем самым уменьшая субъективность.

Современные методы определения кальцификации основаны на измерениях конечной точки или отсутствуют сосудистыекомпоненты 25,26,27. В клинике такие инструменты, как компьютерная томография, внутрисосудистое ультразвуковое исследование и магнитно-резонансная томография, являются дорогостоящими и тяжелыми для пациентов. Исследования биомаркеров доказали его использование, но не отражают бремя кальцификации пациентов. Мы считаем, что этот полуавтоматический анализ использует не только один биомаркер, но и набор циркулирующих компонентов, отражающих сердечно-сосудистый статус пациента. Это может быть использовано для измерения реакции кальцификации в качестве биосенсора. Потенциальные дальнейшие применения описанного метода включают скрининг сыворотки пациентов на развитие кальцификации in vitro в качестве суррогатного маркера для персонализированного развития кальцификации сосудов. Платформа продемонстрировала свою чувствительность к диализу и лечению витамином К, в дополнение к метаболическим и неметаболическим заболеваниям, которые связаны с пациентами с плохим сердечно-сосудистым статусом и прогнозом20. Поскольку принцип анализа основан на обнаружении кристаллов кальция, мы предполагаем, что он также может быть актуален в других областях исследований, где минерализация может иметь значение, таких как остеоартрит, остеопороз, регенеративная медицина костей или стоматологические исследования.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Леон Шургерс получил институциональные гранты от Bayer, Boehringer Ingelheim, NattoPharma и IDS. Леон Шургерс владеет акциями Coagulation Profile. Вилли Янен-Дехент является соучредителем и акционером CALCISCON AG.

Acknowledgments

Это исследование финансировалось исследовательскими и инновационными программами Европейского Союза Horizon 2020 в рамках грантового соглашения Марии Склодовской-Кюри No 722609 и 764474, NWO ZonMw (MKMD 40-42600-98-13007). Это исследование было поддержано BioSPX. WJ-D получил финансирование от Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Немецкий исследовательский фонд) TRR219 -проект ID 322900939 и проект ID 403041552

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Calcium chloride, 93%, anhydrous Thermo Fisher Scientific 349615000
Costar 6-well Clear TC-treated well plates Corning 3516
Cytation 3 System BioTek, Abcoude, The Netherlands
Fetal Bovine Serum Merck F7524-100ML
Fetuin-A-Alexa Fluor-546 Prepared in-house
Gen5 Software v3.10 BioTek
Gibco Medium 199 Thermo Fisher Scientific 11150059
Hoechst 33342, Trihydrochloride Thermo Fisher Scientific H3570
PBS (10X), pH 7.4 Thermo Fisher Scientific 70011044
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red Thermo Fisher Scientific 25300062

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Taylor, A. J., Bindeman, J., Feuerstein, I., Cao, F., Brazaitis, M., O'Malley, P. G. Coronary calcium independently predicts incident premature coronary heart disease over measured cardiovascular risk factors: mean three-year outcomes in the Prospective Army Coronary Calcium (PACC) project. Journal of the American College of Cardiology. 46 (5), 807-814 (2005).
  2. Arad, Y., Goodman, K. J., Roth, M., Newstein, D., Guerci, A. D. Coronary calcification, coronary disease risk factors, C-reactive protein, and atherosclerotic cardiovascular disease events the St. Francis Heart Study. Journal of the American College of Cardiology. 46 (1), 158-165 (2005).
  3. Detrano, R., et al. Coronary calcium as a predictor of coronary events in four racial or ethnic groups. New England Journal of Medicine. 358 (13), 1336-1345 (2008).
  4. Schurgers, L. J., Akbulut, A. C., Kaczor, D. M., Halder, M., Koenen, R. R., Kramann, R. Initiation and propagation of vascular calcification is regulated by a concert of platelet- and smooth muscle cell-derived extracellular vesicles. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 5, 36 (2018).
  5. Jaminon, A., Reesink, K., Kroon, A., Schurgers, L. The role of vascular smooth muscle cells in arterial remodeling: focus on calcification-related processes. International Journal of Molecular Sciences. 20 (22), 5694 (2019).
  6. Mollet, N., et al. Coronary plaque burden in patients with stable and unstable coronary artery disease using multislice CT coronary angiography. La Radiologia Medica. 116 (8), 1174-1187 (2011).
  7. Galal, H., Rashid, T., Alghonaimy, W., Kamal, D. Detection of positively remodeled coronary artery lesions by multislice CT and its impact on cardiovascular future events. The Egyptian Heart Journal. 71 (1), 26 (2019).
  8. Benedek, T., Gyöngyösi, M., Benedek, I. Multislice computed tomographic coronary angiography for quantitative assessment of culprit lesions in acute coronary syndromes. The Canadian Journal of Cardiology. 29 (3), 364-371 (2013).
  9. Raggi, P. Cardiovascular calcification in end stage renal disease. Cardiovascular Disorders in Hemodialysis. 149, 272-278 (2005).
  10. Raggi, P. Coronary artery calcification predicts risk of CVD in patients with CKD. Nature Reviews Nephrology. 13 (6), 324-326 (2017).
  11. Durham, A. L., Speer, M. Y., Scatena, M., Giachelli, C. M., Shanahan, C. M. Role of smooth muscle cells in vascular calcification: implications in atherosclerosis and arterial stiffness. Cardiovascular Research. 114 (4), 590-600 (2018).
  12. Yahagi, K., et al. Pathology of human coronary and carotid artery atherosclerosis and vascular calcification in diabetes mellitus. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (2), 191-204 (2017).
  13. Harper, E., Forde, H., Davenport, C., Rochfort, K. D., Smith, D., Cummins, P. M. Vascular calcification in type-2 diabetes and cardiovascular disease: Integrative roles for OPG, RANKL and TRAIL. Vascular Pharmacology. 82, 30-40 (2016).
  14. Lacolley, P., Regnault, V., Segers, P., Laurent, S. Vascular smooth muscle cells and arterial stiffening: relevance in development, aging, and disease. Physiological Reviews. 97 (4), 1555-1617 (2017).
  15. Pescatore, L. A., Gamarra, L. F., Liberman, M. Multifaceted mechanisms of vascular calcification in aging. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 39 (7), 1307-1316 (2019).
  16. Herrmann, J., Babic, M., Tölle, M., vander Giet, M., Schuchardt, M. Research models for studying vascular calcification. International Journal of Molecular Sciences. 21 (6), 2204 (2020).
  17. Bowler, M. A., Merryman, W. D. In vitro models of aortic valve calcification: solidifying a system. Cardiovascular Pathology: The Official Journal of the Society for Cardiovascular Pathology. 24 (1), 1-10 (2015).
  18. Gitelman, H. J. An improved automated procedure for the determination of calcium in biological specimens. Analytical Biochemistry. 18 (3), 521-531 (1967).
  19. Furmanik, M., et al. Endoplasmic reticulum stress mediates vascular smooth muscle cell calcification via increased release of Grp78 (glucose-regulated protein, 78 kDa)-loaded extracellular vesicles. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (2), 898-914 (2021).
  20. Jaminon, A. M. G., et al. Development of the BioHybrid assay: combining primary human vascular smooth muscle cells and blood to measure vascular calcification propensity. Cells. 10 (8), 2097 (2021).
  21. Reynolds, J. L., et al. Human vascular smooth muscle cells undergo vesicle-mediated calcification in response to changes in extracellular calcium and phosphate concentrations: a potential mechanism for accelerated vascular calcification in ESRD. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 15 (11), 2857-2867 (2004).
  22. Wang, X. -R., Zhang, J. -J., Xu, X. -X., Wu, Y. -G. Prevalence of coronary artery calcification and its association with mortality, cardiovascular events in patients with chronic kidney disease: a systematic review and meta-analysis. Renal Failure. 41 (1), 244-256 (2019).
  23. Willems, B. A., et al. Ucma/GRP inhibits phosphate-induced vascular smooth muscle cell calcification via SMAD-dependent BMP signalling. Scientific Reports. 8 (1), 4961 (2018).
  24. Furmanik, M., et al. Reactive oxygen-forming Nox5 links vascular smooth muscle cell phenotypic switching and extracellular vesicle-mediated vascular calcification. Circulation Research. 127 (7), 911-927 (2020).
  25. Virtanen, P., Isotupa, K. Staining properties of alizarin red S for growing bone in vitro. Acta Anatomica. 108 (2), 202-207 (1980).
  26. Yang, H., Curinga, G., Giachelli, C. M. Elevated extracellular calcium levels induce smooth muscle cell matrix mineralization in vitro. Kidney International. 66 (6), 2293-2299 (2004).
  27. Pasch, A., et al. Nanoparticle-based test measures overall propensity for calcification in serum. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 23 (10), 1744-1752 (2012).

Tags

Биохимия выпуск 184
Полуавтоматизированный и воспроизводимый биологический метод количественной оценки осаждения кальция <em>in vitro</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jaminon, A. M. G., Rapp, N.,… More

Jaminon, A. M. G., Rapp, N., Akbulut, A. C., Dzhanaev, R., Reutelingsperger, C. P., Jahnen-Dechent, W., Schurgers, L. J. A Semi-Automated and Reproducible Biological-Based Method to Quantify Calcium Deposition In Vitro. J. Vis. Exp. (184), e64029, doi:10.3791/64029 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter