Summary
Hjärt-kärlsjukdom är den vanligaste dödsorsaken i världen. Vaskulär förkalkning bidrar väsentligt till bördan av kardiovaskulär sjuklighet och dödlighet. Detta protokoll beskriver en enkel metod för att kvantifiera vaskulär glattmuskelcellmedierad kalciumutfällning in vitro genom fluorescerande avbildning.
Abstract
Vaskulär förkalkning involverar en serie degenerativa patologier, inklusive inflammation, förändringar i cellulär fenotyp, celldöd och frånvaron av förkalkningshämmare, som samtidigt leder till förlust av kärlelasticitet och funktion. Vaskulär förkalkning är en viktig bidragsgivare till sjuklighet och dödlighet i många patologier, inklusive kronisk njursjukdom, diabetes mellitus och åderförkalkning. Nuvarande forskningsmodeller för att studera vaskulär förkalkning är begränsade och är endast livskraftiga i de sena stadierna av förkalkningsutveckling in vivo. In vitro-verktyg för att studera vaskulär förkalkning använder slutpunktsmätningar, vilket ökar kraven på biologiskt material och riskerar att införa variabilitet i forskningsstudier. Vi demonstrerar tillämpningen av en ny fluorescerande märkt sond som binder till in vitro-förkalkningsutveckling på humana vaskulära glattmuskelceller och bestämmer realtidsutvecklingen av in vitro-förkalkning. I detta protokoll beskriver vi tillämpningen av vår nyutvecklade förkalkningsanalys, ett nytt verktyg inom sjukdomsmodellering som har potentiella translationella tillämpningar. Vi föreställer oss att denna analys är relevant i ett bredare spektrum av mineraldepositionsforskning, inklusive tillämpningar inom ben-, brosk- eller tandforskning.
Introduction
Vaskulär förkalkning (VC) är en oberoende riskfaktor för kardiovaskulär sjuklighet och dödlighet 1,2,3. Länge betraktad som en passiv kemisk process av ektopisk mineralavsättning, verkar det nu vara ett modifierbart vävnadsläkningssvar som involverar det aktiva bidraget från olika celler inklusive aktiverade vaskulära glattmuskelceller (hVSMC) som en drivkraft för sjukdomen 4,5. In vivo VC kan mätas med flerdelade CT-skanningar som en bedömning av aterosklerotisk börda 6,7,8. För närvarande pågår ett paradigmskifte, där VC-svårighetsgrad blir erkänd som en riskfaktor vid hjärt-kärlsjukdom, typ II-diabetes, kronisk njursjukdom och åldrande 9,10,11,12,13,14,15.
hVSMC är den vanligaste celltypen i hjärt-kärlsystemet och en huvudaktör i utvecklingen av VC. In vitro hVSMC-inducerad förkalkning är en allmänt använd sjukdomsmodell för att studera hjärt-kärlsjukdom16,17. De flesta protokoll för detektion av in vitro-förkalkning använder dock slutpunktsmätningar som kan begränsa datainsamling, kräver större användning av cellulärt material och kan sakta ner forskningen. Vanliga metoder för detektion av in vitro hVSMC-förkalkning inkluderar o-cresolphthalein-analysen, som mäter solubiliserad kalciumavsättning mot totalt protein och kräver celllys18. Dessutom används Alizarin Red färgning, som binder direkt till kalciumavlagringar på fasta celler eller vävnad19. För att studera hVSMC-förkalkning över tid med antingen o-kresolftalein eller Alizarin Red krävs satser av replikat per tidpunkt, vilket ökar efterfrågan på biologiskt material och i sin tur ökar risken för variabilitet.
I det här dokumentet beskriver vi metoden för tillämpning av en ny analys som använder hVSMC med en fluorescerande bildsond för att bestämma in vitro VC-progression samt fungera som en singulär förkalkningsanalys i slutstadiet. Vi har tidigare visat att denna analys är direkt jämförbar med metoderna o-cresolftalein och Alizarin Red och kan användas för att skilja mellan varierande odlingsförhållanden20. Förutom realtidsmätningar kan denna analys användas för att bestämma benägenheten hos serum- eller plasmaprover som en surrogatmarkör för klinisk VC-utveckling20. Detta kommer att hjälpa till vid tillämpningen av biologiska strategier för kardiovaskulär vetenskap och sjukdomsmodellering. En ytterligare tillämpning av analysen kan vara som ett translationellt BioHybrid-system för att bedöma VC-svårighetsgrad eller progression från blodbeståndsdelar såsom serum eller plasma.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cellsådd, underhåll och förkalkningsinduktion
- För odling av primära celler, använd ett laminärt luftflödesskåp, handskar och steril utrustning. Desinficera händer och arbetsyta före och efter utförandet av något arbete. Behandla alla primära celler och odlingsmedier som en potentiell biofara, om inte annat bevisas. Helst autoklav överskottsceller och media före bortskaffande. Inaktivera inte kemiskt och autoklav eftersom detta kommer att frigöra giftiga ångor.
- Odling hVSMC på obelagda cellodlingsplattor.
- Rutinmässigt bibehålla hVSMC i tillväxtmedium bestående av M199-medium kompletterat med 10%-20% FBS och 1% Pen/Strep och inkubera vid 37 °C och 5% CO2.
- Dela cellerna på 70% -90% sammanflöde.
- För att dela, tvätta hVSMCs 2x med PBS. Tillsätt trypsin och inkubera i 2–5 min vid 37 °C. Kontrollera om cellerna lossnar under mikroskopet.
- Hämma trypsinreaktionen genom att tillsätta seruminnehållande medium. Centrifugera cellerna vid 350 x g i 4 minuter och återsuspendera pelleten i underhållsmedium. hVSMCs följer ett 1: 2-delningsschema.
- För att starta förkalkningsexperimentet, förbered cellerna enligt instruktionerna för en delning (steg 1.4.1). Vid återsuspension, räkna cellerna och frö till en 48-brunnsplatta med en densitet 10-15 x 103 celler / cm2. Frö cellerna och undvik användning av de yttre brunnarna, som rekommenderas i kompletterande figur 1.
- Låt cellerna fästa och återhämta sig i 24 timmar (över natten) medan de inkuberas vid 37 °C och 5 %CO2.
- Tvätta försiktigt cellerna 2x med PBS, försiktigt aspirera alla återstående PBS efter 2: a tvätten.
- Tillsätt försiktigt förkalkningsmedium och inkubera ytterligare vid 37 °C och 5 %CO2. Förkalkningsmedium måste innehålla en förkalkningsstimulans, fluorescerande märkt fetuin-A (t.ex. med rött fluorescerande protein [RFP]) (1 μg / ml) och HOECHST 33342 (0,1 μg / ml) kärnfläck eller liknande levande fluorescerande kärnfläck. Använd inte DAPI, eftersom det inte är permeabelt.
- Kontrollera dagligen med ett ljusmikroskop tills förkalkning sker.
OBS: För anteckningar om cellodling och underhåll av hVMSC: er, se Kompletterande fil 1.
2. Förkalkningsdetektering via avbildning
OBS: Följande protokoll innehåller de allmänna stegen som ska vidtas vid förberedelse, avbildning och dataanalys. Skärmbilder som stöder instruktionerna för varje steg med hjälp av en automatiserad bildplattform och motsvarande bildanalysprogramvara (se materialförteckningen för mer information) finns i tilläggsfil 2 och tilläggsfil 3. Andra bildbehandlingsinstrument och bildbehandlingsverktyg kan användas för att tillämpa detta protokoll. Upprepad avbildning på samma plats i varje brunn är dock avgörande för meningsfull datainsamling. Att skapa ett protokoll för bildförkalkning och återanvändning vid varje bildsteg är nödvändigt för att få reproducerbara resultat. Första gången du använder metoden följer du stegen nedan för att förbereda dig före avbildningen.
- Inställning av protokoll
- Öppna programvaran och välj sedan Protokoll och Skapa ny.
- Välj Procedur och klicka på Ställ in temperatur. I popup-fönstret ställer du in temperaturen på 37 °C och lutningen på 1 °C och klickar på OK. Välj den typ av platta som valts i rullgardinsmenyn. Lägg till bildsteget genom att klicka på Bild. Markera den inverterade bilden och klicka på OK.
- Lägg till tre bildkanaler och ställ in dem på DAPI (377, 447 nm), RFP (531, 593 nm) och brightfield. Markera rutan Montage och ställ in önskat nummer och plats för bilderna. 2 x 2 för en 48-brunnsplatta är ett vanligt val. Ändra överlappningen för att representera en bättre täckning av varje brunn. Välj vilka brunnar som ska avbildas. Ett nytt fönster öppnas där brunnarna av intresse kan väljas.
- Klicka på Fokusalternativ för att ställa in fokusläget. Ett nytt fönster öppnas. Ställ in varje kanal individuellt. Vanligtvis är brunnar autofokuserade på "DAPI" -kanalen. Ställ in alla andra kanaler på Fast brännhöjd från första kanalen och ställ in genom att klicka på OK. Stäng fönstret.
- Starta stegen för förinställning av datareduktion genom att klicka på Datareduktion och välj Bildförbehandling. Om du ställer in det här steget minskar fluorescensbakgrunden. Acceptera standardinställningarna genom att välja OK. En ny uppsättning bilder skapas med prefixet "TSF". Originalbilderna kommer att bevaras.
- Ställ in ett steg för att räkna cellerna genom att välja Cellanalys. Välj TSF DAPI-bilder från rullgardinsmenyn Kanal . Ställ in ytterligare detaljer efter att avbildningen har utförts. Detta steg kan också betraktas som datareduktion; Se alltid till att behålla originalbilderna.
- Förbered analysen av RFP-signalen (förkalkning) genom att välja Statistik. I popup-fönstret märker du Steg och väljer TSF RFP som ingångskanal. Markera rutorna Övre värde och Lägre värde. Markera rutan för Total yta i den nedre listan. Välj Ingen i kolumnen Färgeffekt. I popup-fönstret klickar du på Anpassad och markerar bakgrundsrutan. Detta kommer att färgkoda resultaten från låg-hög för enkel bedömning. Tryck på OK.
- För en rättvis avläsning, normalisera RFP-signalen per cell. På så sätt delas en total yta per cell. För att ställa in det här steget, tryck på Ratio på vänster sida. I popup-fönstret väljer du för datainmatning 1 RFP-kvantifiering: Total yta från rullgardinsmenyn. Välj vidare Cellantal som datainmatning 2.
- Välj slutligen ett nytt datamängdsnamn och tryck på OK och OK igen. Välj Färgeffekt enligt beskrivningen ovan. I det övre vänstra hörnet väljer du Arkiv och sparar filen som protokoll (.prt-filtyp).
- Dagligen efter det att den första förkalkningen inträffar
- För varje tidpunkt, upprepa dessa steg. I startprogramvaran trycker du på Läs nu och befintligt protokoll .... Välj det protokoll som har skapats i föregående steg. Programmet kommer att be om att spara experimentet. Detta kan göras i detta steg men också i ett senare steg manuellt genom att klicka på Spara-knappen uppe till vänster.
- Ett popup-fönster kommer att be om att vänta på att systemet värms upp. Slå på CO 2-gasregulatorn och ställ in den på 5%.
- När systemet har nått den inställda temperaturen visas en uppmaning att sätta in en platta och läsa. Tryck på Avbryt. Detta beror på att exponeringen för varje fluorokrom måste justeras individuellt för varje tidpunkt.
- Transport plattan från inkubatorn till avbildaren i ett kassaskåp som motstår brott och spill och är i linje med lokala biosäkerhetsbestämmelser för transport av levande celler i händelse av en olycka. Placera plattan i plattläsaren.
- När du har avbrutit klickar du på Procedur. I popup-fönstret väljer du Förinställt bildsteg. Justera fokus och exponering på DAPI-kanalen först. Avmarkera rutan Automatisk exponering vid alla kanaler. Klicka sedan på mikroskopikonen bredvid DAPI-kanalen . Ett nytt fönster öppnas.
- Välj brunnen att fokusera på. Använd en brunn med medium till hög förkalkning för detta steg. Om en signal redan är synlig klickar du först på Autofokus och sedan på Autoexponering. Om inte, öka först exponeringen och upprepa autofokus och autoexponering. Om så önskas kan exponeringen justeras manuellt genom att välja rullgardinsmenyn för exponering. Kontrollera inställningarna på flera brunnar. När du är nöjd sparar du inställningarna.
- Justera exponeringen på samma sätt för alla kanaler.
VARNING: Fokusera inte på andra kanaler; justera endast exponeringen. Fokusslätten ska vara densamma för alla kanaler. - Stäng procedurfönstret. Välj den gröna Läs nu-knappen i det övre aktivitetsfältet. Spara experimentet enligt programvaran.
OBS: Programvaran läser nu automatiskt alla valda brunnar i de valda inställningarna.
3. Analys av data
OBS: För detaljerade skärmdumpar om hur man utför dataanalysen med hjälp av en automatiserad bildplattform och motsvarande bildanalysprogramvara (se materialförteckningen för detaljer), se Tilläggsfil 4. Om alternativa bildbehandlingsinstrument eller analysprogram används bör bilderna exporteras och bearbetas i tillverkningssatser för att säkerställa att exponeringen, fluorescenströskeln eller intensiteten justeras lika för alla bilder i en jämförande datauppsättning.
- Medan systemet läser plattan bearbetas alla bilder automatiskt i bakgrunden. Justera inställningarna för cellantal genom att välja TSF DAPI-bilder som ska visas. Välj den valda brunnen genom att dubbelklicka. Ett nytt fönster dyker upp. Välj en av bilderna.
- Välj fliken Analys . I popup-fönstret väljer du Mobilanalys: Antal celler. Klicka på OK. Avmarkera RFP- och brightfield-kanalerna. Markera rutan Markera objekt .
- Klicka på Alternativ för att öppna menyn. Justera storleks- och intensitetströskeln så att den inkluderar alla kärnor men utesluter skräp. Klicka på OK. Klicka på Tillämpa ändringar längst ned till vänster för att även överföra inställningarna till alla andra bilder.
- På liknande sätt som tidigare, välj en brunn och bild med en medelhög till hög mängd förkalkning för att bäst justera signal-brusförhållandet; klicka på fliken Analys på Aktivitetsmenyn.
- Den här gången väljer du Bildstatistik. Avmarkera DAPI- och brightfield-kanalen. Klicka på Alternativ för att öppna menyn. Markera rutan Tröskelavvikelser. Justera tröskelvärdets övre och nedre värden. Räkna bara signalen om den är ovanför bakgrunden och uteslut om det finns skräp / artefakter.
- Om du vill ange ett icke-subjektivt tröskelvärde för signalen ovanför bakgrunden väljer du linjeverktyget i aktivitetsfältet. Ett fönster dyker upp. Rita en linje genom en signallapp, men se till att även inkludera ett bakgrundsområde.
OBS: En graf visas i popup-fönstret som visar en topp som representerar signalen ovanför bakgrundslinjen. Topphöjdsvärdet på 25 % representerar det rekommenderade tröskelvärdet. Det rekommenderas också att mäta flera signalpatchar för att säkerställa valet av rätt tröskel. När du väljer signalfläckar kan val av regioner med mycket hög signalstyrka resultera i en tröskel som försummar medelstora och eller lägre signaler. Det rekommenderas därför att välja fläckar av medium till låg signal ovanför bakgrunden. Exempel på för höga, för låga och exakta tröskelvärden visas i tilläggsfil 4. - När du är nöjd klickar du på OK och tillämpar ändringar för att överföra inställningarna till alla andra brunnar. Kontrollera om tröskeln är korrekt vald i de andra brunnarna.
- När cellantalet och RFP-tröskelvärdena har angetts exporterar du data. Välj den platta som är av intresse. I rullgardinsmenyn kan flera parametrar väljas för export. Av relevans kan vara cellantal, RFP-område och "area/cell" som är det mått som används för jämförelse mellan grupper. Klicka på Excel-knappen bredvid rullgardinsmenyn för att exportera data direkt till ett kalkylblad.
OBS: I rullgardinsmenyn kan de beräknade värdena för cellantalet, den totala arean av RFP-signal (som återspeglar förkalkningsområdet) samt det normaliserade förhållandet mellan den totala ytan av RFP-signal per cell nu väljas individuellt och exporteras till ett kalkylblad. Visa resultaten som förhållandet mellan den totala arean av RFP-signal per cell och visualisera (t.ex. stapeldiagram). Använd ett oparat Students t-test för att jämföra två grupper eller ett oparat ANOVA för att jämföra olika grupper samtidigt. Att jämföra samma grupp vid olika tidpunkter kan kräva parad statistisk analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultatet inkluderar originalbilder av HOECHST-färgade kärnor, RFP-märkt förkalkning och ljusfältbilder. Olika stadier av förkalkning som sträcker sig från låg (figur 2) till hög (figur 3) kan detekteras och analyseras. Förkalkning kan vanligtvis upptäckas som svarta fläckar med hjälp av ljusmikroskopi (figur 2D och figur 3B, pilar indikerar förkalkning), som är användbara för primär bedömning och för att avgöra när avbildning ska börja. För förbättrat signal-brusförhållande bör de bearbetade RFP-bilderna analyseras för att kvantifiera förkalkning (figur 2F och figur 3D, pilar indikerar förkalkning). Slutligen kan data presenteras som ett stapeldiagram som jämför två eller flera villkor vid en tidpunkt, åtföljd av representativa bilder (figur 4A,B,C). Data ska visas normaliserade till cellantal (t.ex. som förkalkningsarea per cell). Data kan också visas som tidsseriedata som visar samma tillstånd vid olika tidpunkter (figur 4D).
Figur 1: Visuell abstrakt som sammanfattar stegen för halvautomatisk detektering och analys av förkalkning. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Exempel på förkalkning i tidigt skede . (A)Överläggsbilden kan visas och analyseras som (B) separata DAPI (kärnor), (C) RFP (förkalkning) och (D) ljusfältsbilder. (E) Kärnor identifieras av programvaran och kan markeras som gula cirklar för att justera inställningarna. (F) För analys av RFP-signalen förbehandlas bilder för att minska bakgrundssignalen och (G) därefter kan ett tröskelvärde ställas in för att mäta signalen. Pilar indikerar förkalkning i (D) ljusfältet och (F & G) transformerade RFP-bilder. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Exempel på förkalkning i senare skede . (A) Överläggsbilden kan visas och analyseras som separata (B) ljusfält, (C) RFP (förkalkning) och (E) DAPI (kärnor) bilder. (D) För analys av RFP-signalen förbehandlas bilder för att minska bakgrundssignalen. Pilar indikerar förkalkning i (B) ljusfält och (D) transformerade RFP-bilder. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Representativ jämförelse mellan låg och hög förkalkning av hVSMC efter 14 dagar i kultur med förkalkningsmedium. Vanligtvis kan data visas som ett stapeldiagram och analyseras med hjälp av det oparade Students t-test. Representativa bilder av (A) låg förkalkning och (B) hög förkalkning. Den röda signalen (RFP) återspeglar förkalkning och den blå signalen (HOECHST) visar kärnor. (C) Förkalkning presenterad som fetuin A-RFP-positiv signal (total yta) per cell. (D) Exempel på en förkalkningsanalys mätt över tid. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur 1: Exempel på en rad brunnar som används för ett förkalkningsexperiment med hVSMCs. Brunnarnas yttre ring används inte för förkalkningsexperimentet utan fylls med vätska. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande fil 1: Anteckningar om cellodling och underhåll av hVMSC. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande fil 2: Automatiserat bildprotokoll. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande fil 3: Bildanalysprotokoll. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Tilläggsfil 4: Dataanalysprotokoll. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I detta manuskript beskriver vi en halvautomatisk metod för in vitro-förkalkningsbestämning. För denna metod bör tre kritiska steg i hVSMC-förkalkning optimeras. För det första är cellulär densitet avgörande för hVSMC-förkalkningsutveckling. Låga densiteter av hVSMC kommer att resultera i långsam eller ingen förkalkning och celldöd på grund av bristen på cell-till-cell-kontakt och den stress som induceras under förkalkningsförhållanden21. Höga celltätheter resulterar i översammanflöde, varefter celler blir senescent22 och förkalkningsutvecklingen stannar. Det är viktigt att fröa ungefär 70% sammanflöde i brunnsplattan som kommer att användas för efterföljande förkalkningsutveckling, vilket säkerställer proliferativ kapacitet och cellulära anslutningar av hVSMCs.
För det andra kräver cellodlingsmediet som kommer att användas för förkalkningsinduktion optimering. Inom vaskulär förkalkningsforskning har en mängd olika tillstånd och mediekompositioner rapporterats förkalka hVSMCs23,24. Vi tror att metoden är lämplig för att upptäcka alla typer av in vitro-medierad förkalkning, och den har använts för att upptäcka kalcium-, fosfat- eller kalciumfosfatstimulerade avlagringar. Oavsett läge för förkalkningsinduktion är optimering av förkalkningsmediet avgörande. I det presenterade protokollet optimerade vi förkalkningsinduktionen genom att använda M199 med en total kalciumkoncentration på 4,5 mM Ca2+ med 2,5% FBS.
Slutligen har lokala skillnader i plattor under förkalkning observerats. Det är viktigt att tillämpa slumpmässig laddning av tekniska replikat för att förhindra provförspänning. Dessutom bör lastning av de yttre brunnsfilerna undvikas eftersom dessa brunnar alltid förkalkas snabbare i 48-brunnsinställningen. Detta orsakas potentiellt av dysreglering av intraplate fuktighet, där man inte använder de yttersta brunnarna och laddar dessa brunnar med stora volymer vätska hjälper till att kontrollera detta.
Medan förkalkningsanalysen i sig kan kräva flera optimeringssteg för att säkerställa reproducerbarhet med en viss installation, blir det enkelt när det väl är igång. Förkalkningsanalyser kan köras samtidigt och upprepade gånger under etablerade förhållanden utan behov av ytterligare optimering. hVSMC-medierad förkalkning kan vara utmanande och kräva experiment innan analysernas robusthet har uppnåtts. En forskare bör kunna bestämma den optimala tidpunkten innan man börjar regelbunden avbildning, vilket kan ta upp till 1 vecka. Ett fast bildschema kan upprättas från början av experimentet, även om detta kan producera många bilder utan differentiella avläsningar, använda en relativt stor mängd datalagring för bilder och vara tidskrävande i analysen.
Förfarandet som beskrivs i detta protokoll är ett sätt att utföra analysen av förkalkningsanalysen. För andra ändamål bör förfarandet anpassas i enlighet med detta. Vår analys med hjälp av den refererade automatiserade bildplattformen säkerställer reproducerbarhet, även om analys kan utföras med vilken levande cell och temperatur- och CO 2-styrd bildbehandlingsenhet som helst. Dessutom är motsvarande kommersiella programvarupaket optimerade för cellulär screening och analys med högt innehåll, idealiska för att mäta förkalkningsbenägenhet över tid. Andra programvarulösningar, till exempel freeware ImageJ, kan också tillhandahålla bildanalys och kvantifiera förkalkningsutveckling.
Avbildning av förkalkningsplattor i sent skede kan vara svårt på grund av problem med autofokusering om kulturen stöter på flytande skräp, vilket resulterar i ett minskat antal skarpa bilder och repliker. Bildanalys bör justeras i enlighet därmed, och vissa lösningar har utvecklats i programvaran som används i detta protokoll för att förbättra och förenkla analysen.
Cellulär heterogenitet spelar en avgörande roll vid kvantifiering av förkalkning in vitro. I denna plattform använder vi hVSMC som biosensorer för utveckling av förkalkning. Primära hVSMC härrör från olika givare med olika underliggande vaskulära patologier; Därför är denna analys fortfarande föremål för hög variabilitet på grund av heterogeniteten hos VSMCs-satser. En möjlig lösning är användningen av odödliga cellinjer eller användningen av hVSMC härledda från pluripotenta stamceller.
En annan begränsning är att kvantifieringsmetoden fortfarande är känslig för subjektivitet. Subjektivitet i förkalkningsanalyser uppstår på grund av slutpunktsanalyser, som endast var tillgängliga tills nyligen. Forskare måste bestämma när de ska stoppa experimentet och mäta förkalkning, vilket ökar analysens subjektivitet. Vi tror att metoden som introduceras i detta manuskript är överlägsen eftersom vi mäter över tid och kan jämföra förkalkningsutvecklingen under en viss period. Kopplat till detta måste belysningsinställningen justeras för varje tidpunkt separat på grund av minskningen av signalen över tiden. På grund av detta påverkas mängden signal som representeras i en bild fortfarande av en individs åsikt. Det är avgörande att belysningen utförs med de högsta signal-brusförhållandena så att analys efter bild kan utföras så objektivt som möjligt.
Även om vi ser subjektiviteten i denna analys som en begränsning, tror vi att den är överlägsen andra in vitro-förkalkningsmetoder. Till skillnad från de befintliga metoderna har vår halvautomatiska förkalkningsanalys fördelen att bilder kan analyseras anonymt, vilket ger en oberoende blindad åsikt. Dessutom kan bilderna analyseras i ett senare skede med samma definierade inställningar över en datauppsättning, vilket minskar subjektiviteten.
De nuvarande metoderna för förkalkningsbestämning är beroende av slutpunktsmätningar eller saknar kärlkomponenten25,26,27. Inom kliniken är verktyg som datortomografi, intravaskulär ultraljud och magnetisk resonanstomografi dyra och en börda för patienterna. Biomarkörforskning har visat sin användning men återspeglar inte patienternas förkalkningsbörda. Vi tror att denna halvautomatiska analys inte bara använder en enda biomarkör utan en samling cirkulerande komponenter, vilket återspeglar patientens kardiovaskulära status. Detta kan användas för att mäta ett förkalkningssvar som en biosensor. Potentiella ytterligare tillämpningar av den beskrivna metoden inkluderar patienters serumscreening för in vitro-förkalkningsutveckling som en surrogatmarkör för personlig utveckling av vaskulär förkalkning. Plattformen har visat sin känslighet för dialys och vitamin K-behandling, förutom både metabola och icke-metabola sjukdomar som är kopplade till patienter med dålig kardiovaskulär status och prognos20. Eftersom analysens princip bygger på detektion av kalciumkristaller, antar vi att det också kan vara relevant inom andra forskningsområden där mineralisering kan vara av relevans, såsom artros, osteoporos, benregenerativ medicin eller odontologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Leon Schurgers har fått institutionella anslag från Bayer, Boehringer Ingelheim, NattoPharma och IDS. Leon Schurgers äger aktier i Coagulation Profile. Willi Jahnen-Dechent är medgrundare och aktieägare i CALCISCON AG.
Acknowledgments
Denna forskning finansierades av Europeiska unionens forsknings- och innovationsprogram Horizon 2020 enligt Marie Sklodowska-Curie-bidragsavtalet nr 722609 och 764474, NWO ZonMw (MKMD 40-42600-98-13007). Denna forskning stöddes av BioSPX. WJ-D fick finansiering från Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, tyska forskningsstiftelsen) TRR219-project ID 322900939 och project ID 403041552
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Calcium chloride, 93%, anhydrous | Thermo Fisher Scientific | 349615000 | |
| Costar 6-well Clear TC-treated well plates | Corning | 3516 | |
| Cytation 3 System | BioTek, Abcoude, The Netherlands | ||
| Fetal Bovine Serum | Merck | F7524-100ML | |
| Fetuin-A-Alexa Fluor-546 | Prepared in-house | ||
| Gen5 Software v3.10 | BioTek | ||
| Gibco Medium 199 | Thermo Fisher Scientific | 11150059 | |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| PBS (10X), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300062 |
References
- Taylor, A. J., Bindeman, J., Feuerstein, I., Cao, F., Brazaitis, M., O'Malley, P. G. Coronary calcium independently predicts incident premature coronary heart disease over measured cardiovascular risk factors: mean three-year outcomes in the Prospective Army Coronary Calcium (PACC) project. Journal of the American College of Cardiology. 46 (5), 807-814 (2005).
- Arad, Y., Goodman, K. J., Roth, M., Newstein, D., Guerci, A. D. Coronary calcification, coronary disease risk factors, C-reactive protein, and atherosclerotic cardiovascular disease events the St. Francis Heart Study. Journal of the American College of Cardiology. 46 (1), 158-165 (2005).
- Detrano, R., et al. Coronary calcium as a predictor of coronary events in four racial or ethnic groups. New England Journal of Medicine. 358 (13), 1336-1345 (2008).
- Schurgers, L. J., Akbulut, A. C., Kaczor, D. M., Halder, M., Koenen, R. R., Kramann, R. Initiation and propagation of vascular calcification is regulated by a concert of platelet- and smooth muscle cell-derived extracellular vesicles. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 5, 36 (2018).
- Jaminon, A., Reesink, K., Kroon, A., Schurgers, L. The role of vascular smooth muscle cells in arterial remodeling: focus on calcification-related processes. International Journal of Molecular Sciences. 20 (22), 5694 (2019).
- Mollet, N., et al. Coronary plaque burden in patients with stable and unstable coronary artery disease using multislice CT coronary angiography. La Radiologia Medica. 116 (8), 1174-1187 (2011).
- Galal, H., Rashid, T., Alghonaimy, W., Kamal, D. Detection of positively remodeled coronary artery lesions by multislice CT and its impact on cardiovascular future events. The Egyptian Heart Journal. 71 (1), 26 (2019).
- Benedek, T., Gyöngyösi, M., Benedek, I. Multislice computed tomographic coronary angiography for quantitative assessment of culprit lesions in acute coronary syndromes. The Canadian Journal of Cardiology. 29 (3), 364-371 (2013).
- Raggi, P. Cardiovascular calcification in end stage renal disease. Cardiovascular Disorders in Hemodialysis. 149, 272-278 (2005).
- Raggi, P. Coronary artery calcification predicts risk of CVD in patients with CKD. Nature Reviews Nephrology. 13 (6), 324-326 (2017).
- Durham, A. L., Speer, M. Y., Scatena, M., Giachelli, C. M., Shanahan, C. M. Role of smooth muscle cells in vascular calcification: implications in atherosclerosis and arterial stiffness. Cardiovascular Research. 114 (4), 590-600 (2018).
- Yahagi, K., et al. Pathology of human coronary and carotid artery atherosclerosis and vascular calcification in diabetes mellitus. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (2), 191-204 (2017).
- Harper, E., Forde, H., Davenport, C., Rochfort, K. D., Smith, D., Cummins, P. M. Vascular calcification in type-2 diabetes and cardiovascular disease: Integrative roles for OPG, RANKL and TRAIL. Vascular Pharmacology. 82, 30-40 (2016).
- Lacolley, P., Regnault, V., Segers, P., Laurent, S. Vascular smooth muscle cells and arterial stiffening: relevance in development, aging, and disease. Physiological Reviews. 97 (4), 1555-1617 (2017).
- Pescatore, L. A., Gamarra, L. F., Liberman, M. Multifaceted mechanisms of vascular calcification in aging. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 39 (7), 1307-1316 (2019).
- Herrmann, J., Babic, M., Tölle, M., vander Giet, M., Schuchardt, M. Research models for studying vascular calcification. International Journal of Molecular Sciences. 21 (6), 2204 (2020).
- Bowler, M. A., Merryman, W. D. In vitro models of aortic valve calcification: solidifying a system. Cardiovascular Pathology: The Official Journal of the Society for Cardiovascular Pathology. 24 (1), 1-10 (2015).
- Gitelman, H. J. An improved automated procedure for the determination of calcium in biological specimens. Analytical Biochemistry. 18 (3), 521-531 (1967).
- Furmanik, M., et al. Endoplasmic reticulum stress mediates vascular smooth muscle cell calcification via increased release of Grp78 (glucose-regulated protein, 78 kDa)-loaded extracellular vesicles. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (2), 898-914 (2021).
- Jaminon, A. M. G., et al. Development of the BioHybrid assay: combining primary human vascular smooth muscle cells and blood to measure vascular calcification propensity. Cells. 10 (8), 2097 (2021).
- Reynolds, J. L., et al. Human vascular smooth muscle cells undergo vesicle-mediated calcification in response to changes in extracellular calcium and phosphate concentrations: a potential mechanism for accelerated vascular calcification in ESRD. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 15 (11), 2857-2867 (2004).
- Wang, X. -R., Zhang, J. -J., Xu, X. -X., Wu, Y. -G. Prevalence of coronary artery calcification and its association with mortality, cardiovascular events in patients with chronic kidney disease: a systematic review and meta-analysis. Renal Failure. 41 (1), 244-256 (2019).
- Willems, B. A., et al. Ucma/GRP inhibits phosphate-induced vascular smooth muscle cell calcification via SMAD-dependent BMP signalling. Scientific Reports. 8 (1), 4961 (2018).
- Furmanik, M., et al. Reactive oxygen-forming Nox5 links vascular smooth muscle cell phenotypic switching and extracellular vesicle-mediated vascular calcification. Circulation Research. 127 (7), 911-927 (2020).
- Virtanen, P., Isotupa, K. Staining properties of alizarin red S for growing bone in vitro. Acta Anatomica. 108 (2), 202-207 (1980).
- Yang, H., Curinga, G., Giachelli, C. M. Elevated extracellular calcium levels induce smooth muscle cell matrix mineralization in vitro. Kidney International. 66 (6), 2293-2299 (2004).
- Pasch, A., et al. Nanoparticle-based test measures overall propensity for calcification in serum. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 23 (10), 1744-1752 (2012).
