Summary
Il protocollo presenta un modello murino di colonizzazione vaginale con batteri vaginali umani coltivati anaerobicamente. Ci concentriamo su Gardnerella vaginalis, includendo suggerimenti per Prevotella bivia e Fusobacterium nucleatum. Questo protocollo può anche essere utilizzato come guida per le inoculazioni vaginali e il recupero vitale di altri batteri cresciuti anaerobicamente.
Abstract
La vagina dei mammiferi può essere colonizzata da molti taxa batterici. Il microbioma vaginale umano è spesso dominato da specie di Lactobacillus , ma una donna su quattro sperimenta vaginosi batterica, in cui un basso livello di lattobacilli è accompagnato da una crescita eccessiva di diversi batteri anaerobici. Questa condizione è stata associata a molte complicazioni di salute, compresi i rischi per la salute riproduttiva e sessuale. Mentre vi è una crescente evidenza che mostra la natura complessa delle interazioni microbiche nella salute vaginale umana, i ruoli individuali di questi diversi batteri anaerobici non sono completamente compresi. Ciò è complicato dalla mancanza di modelli adeguati per studiare i batteri vaginali cresciuti anaerobicamente. I modelli murini ci permettono di studiare la biologia e la virulenza di questi organismi in vivo. Altri modelli murini di inoculazione batterica vaginale sono stati precedentemente descritti. Qui, descriviamo i metodi per l'inoculazione di batteri cresciuti anaerobicamente e il loro recupero praticabile in topi C57Bl / 6 allevati convenzionalmente. Viene anche descritto un nuovo metodo procedurale meno stressante per l'inoculazione vaginale e il lavaggio. L'inoculazione e il recupero praticabile di Gardnerella sono delineati in dettaglio e vengono discusse le strategie per ulteriori anaerobi come Prevotella bivia e Fusobacterium nucleatum .
Introduction
Nei mammiferi, la vagina ospita un consorzio di specie batteriche. Il microbioma vaginale umano è unico tra i mammiferi nella sua abbondanza di membri del genere Lactobacillus e corrispondente basso pH vaginale (3.8-4.5) 1,2,3,4. L'interruzione di questa dominanza del Lactobacillus è associata a una varietà di esiti negativi sulla salute.
Nella vaginosi batterica (BV) ci sono meno lattobacilli e una maggiore abbondanza di diversi batteri anaerobici, come Gardnerella vaginalis e Prevotella bivia 5,6. Le donne con BV sono ad aumentato rischio di infezioni sessualmente trasmissibili 7,8,9, infertilità 10, perdite di gravidanza 11, parto pretermine 12,13,14, infezioni intrauterine 15, infezioni cervicali 16 e cancro16,17,18 . La BV è anche associata a una maggiore probabilità di colonizzazione vaginale da parte di batteri potenzialmente patogeni, come il Fusobacterium nucleatum 1,19,20, un isolato comune dalle infezioni da liquido amniotico 21.
A causa dell'importanza dei batteri anaerobici nella salute vaginale umana, vi è la necessità di modelli animali che possano essere utilizzati per studiare la biologia e la patogenesi di questi organismi. Qui, descriviamo i metodi per l'inoculazione vaginale e il recupero vitale di Gardnerella vaginalis nei topi estrogenizzati e suggeriamo ulteriori strategie per Prevotella bivia e Fusobacterium nucleatum. Altri modelli di colonizzazione vaginale murina sono stati precedentemente descritti, ma questi si sono concentrati sull'inoculazione e il recupero di batteri anaerobici facoltativi come il gruppo B Streptococcus22 e Neisseria gonorrhoeae23 che sono stati coltivati aerobicamente. L'inoculazione e il recupero di anaerobi obbligati possono essere realizzati con successo con appropriate strategie sperimentali. Discutiamo gli approcci per il recupero praticabile di diversi taxa batterici e suggeriamo una valutazione empirica delle condizioni per la vitalità di ulteriori specie / ceppi di interesse.
Il metodo classico per stimare la colonizzazione da parte di batteri vivi è il recupero delle unità formanti colonie (CFU). Nei topi allevati convenzionalmente con il proprio microbiota endogeno, ciò richiede il recupero su agar media che seleziona contro i membri del microbiota vaginale endogeno pur consentendo al ceppo inoculato di batteri di crescere. Qui, usiamo un isolato resistente alla streptomicina di G. vaginalis24 che può essere recuperato selettivamente su un mezzo di agar contenente streptomicina. Per garantire che il terreno sia sufficientemente selettivo e, al contrario, che i batteri resistenti alla streptomicina non siano presenti nel microbioma endogeno, le lavaggi vaginali raccolti appena prima dell'inoculazione devono essere placcati su agar selettivo (contenente streptomicina).
Il metodo migliore per la preparazione dell'inoculo può variare tra specie e ceppi di batteri. Prima dell'inizio degli esperimenti sui topi, deve essere eseguito un lavoro preliminare per determinare le condizioni preferibili per il terreno di coltura, l'endpoint di crescita e la preparazione dell'inoculo, nonché la suscettibilità all'ossigeno e la vitalità nella PBS. Nel caso di batteri più sensibili all'ossigeno, possono essere prese in considerazione preparazioni alternative dell'inoculo (ad esempio, in un terreno di coltura anaerobico con un gruppo di controllo del veicolo appropriato)25,26.
Protocol
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati e condotti in conformità con le linee guida istituzionali e la Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio dell'Università della California di San Diego (UCSD, numero di protocollo: S20057, 2020-in poi) e prima ancora presso la Washington University, St. Louis (protocollo 20110149, fino al 2020).
NOTA: Il protocollo seguente utilizza topi C57Bl / femmina allevati convenzionalmente, di età compresa tra 6 e 11 settimane al momento dell'inoculazione. Si prega di notare le informazioni sul fornitore e le fasce di età specifiche utilizzate in precedenza nel lavoro citato pertinente.
1. Preparazione e somministrazione di β-estradiolo 17-valerato
NOTA: β-estradiolo 17-valerato è un cancerogeno e una tossina riproduttiva che può essere assorbita attraverso la pelle27,28. Indossare DPI adeguati durante la manipolazione della polvere e della soluzione liquida. È anche una tossina acquatica29; Smaltirlo correttamente in un contenitore opportunamente sigillato ed etichettato.
- Filtrare fino a 50 ml di olio di sesamo attraverso un filtro da 0,22 μm utilizzando un sistema di filtraggio sottovuoto a tubo conico da 50 ml. Aprire solo in un armadio di biosicurezza per mantenere la sterilità.
- Calcolare il volume della soluzione di valerato di β-estradiolo necessaria per l'esperimento: 200 μL per topo più 2-3 ml in più per tenere conto della perdita di campione durante il riempimento della siringa (ad esempio, un esperimento su 10 topi richiede 4 ml in totale). Calcolare la quantità di β-estradiolo valerato necessaria per produrre una soluzione da 5 mg/ml e pesarla direttamente in un tubo a fondo tondo da 14 ml.
- Tappare saldamente il tubo da 14 ml e il vortice per rompere i grumi nella polvere (questo permetterà al valerato di β-estradiolo di dissolversi più rapidamente). Aggiungere olio di sesamo filtrato sterile al tubo da 14 ml in modo che la concentrazione finale di valerato di β-estradiolo sia di 5 mg / ml.
- Posizionare il tubo da 14 mL ben chiuso su un rotatore a 37 °C per 30-40 minuti, fino a quando la polvere solida non si dissolve completamente. Confermare visivamente l'omogeneità della soluzione prima dell'iniezione nei topi. L'incubazione a 37 °C diminuisce la viscosità dell'olio di sesamo, facilitandone l'iniezione.
- Aspirare la soluzione di valerato di β-estradiolo in una siringa da 1 mL (senza ago). Per fare questo senza introdurre bolle, in primo luogo, disegnare un po 'della soluzione, quindi espellere delicatamente mantenendo la punta della siringa nell'olio di sesamo. Aspirare nuovamente la soluzione lentamente, superando leggermente il segno di 100 μL.
- Inserire un ago da 25 G x 5/8 sulla siringa. Quindi, innescare l'ago espellendo lentamente la soluzione di olio di sesamo fino a quando non inizia a uscire dalla punta dell'ago. Espellere la soluzione fino a quando la siringa è al segno di 100 μL. Preparare una siringa per mouse.
- Somministrare il β-estradiolo 17-valerato mediante iniezione intraperitoneale a 48 ore o 72 ore prima dell'inoculazione. Iniettare in ciascun topo 100 μL della soluzione di 5 mg/mL di β-estradiolo valerato (0,5 mg di β-estradiolo valerato/topo), come descritto in precedenza22,30. Conservare la soluzione rimanente a 4 °C per 72 ore fino alla successiva iniezione.
- Somministrare nuovamente la soluzione di valerato di β-estradiolo il giorno dell'inoculazione, immediatamente prima dell'inoculazione vaginale dei topi. Rimuovere la soluzione da 4 °C e metterla su un rotatore a 37 °C per 30 minuti prima dell'iniezione per consentire all'olio di sesamo di riscaldarsi e diventare meno viscoso. Procedere con le iniezioni come descritto al punto 1.7.
2. Preparazione dell'inoculo
NOTA: Questa sezione contiene i passaggi generali per la preparazione di inoculi da Gardnerella vaginalis JCP8151B-SmR 24,25,31,32 resistente alla streptomicina coltivata anaerobicamente. Tutti i passaggi in questa sezione devono essere eseguiti in una camera anaerobica.
- Ciclo di tutti i reagenti, compreso il brodo NYC III preparato, l'agar e il PBS, in una camera anaerobica per equilibrare almeno 24 ore prima dell'uso.
NOTA: Qui, è stata utilizzata una camera anaerobica in vinile equilibrata con miscela di gas idrogeno al 5%. La concentrazione interna di ossigeno si trova tipicamente a 0 ppm, anche se ci possono essere aumenti transitori di basso livello (10-25 ppm) quando si riciclano materiali nella camera. - Due giorni prima dell'inoculazione vaginale, striare fuori Gardnerella da uno stock di glicerolo congelato su una piastra di agar NYC III nella camera anaerobica. Utilizzare un piccolo contenitore (come una scatola vuota per pipette) pieno di ghiaccio secco per mantenere congelato il brodo di glicerolo durante il trasporto dentro e fuori dalla camera.
- 1 giorno prima dell'inoculazione vaginale, utilizzare 5-10 singole colonie di Gardnerella dalla piastra per inoculare 10 ml di brodo NYC III. Lasciare crescere la coltura liquida per una notte per 16 ore a 37 °C. Includere una seconda aliquota da 1 mL del terreno di coltura lasciato non inoculata e incubarla insieme alla coltura inoculata per confermare che il terreno non è contaminato.
- Preparare l'inoculo da coltura liquida come descritto di seguito. Eseguire il più possibile la preparazione dell'inoculo nella camera anaerobica.
- Determinare la densità ottica della coltura (OD) aggiungendo 200 μL di coltura a 800 μL di terreno fresco in una cuvetta da 1,5 mL (diluizione 1:5). Utilizzare uno spettrofotometro per misurare la densità (OD) della coltura diluita a una lunghezza d'onda di 600 nm (utilizzare una cuvetta separata con solo mezzi freschi come bianco). Moltiplicare la lettura OD per 5 per ottenere l'OD600 effettivo della cultura 16 h.
- Calcola il volume di inoculo necessario per l'esperimento. Ad esempio, per infettare 15 topi con un inoculo di 20 μL per topo, sono necessari 15 x 20 μL = 300 μL di inoculo. Preparare circa il 25% in più di inoculo del necessario, quindi per 15 topi, preparare 300 μL + (0,25 x 300 μL) = 375 μL di inoculo.
- Utilizzando l'OD 600 determinato al punto 2.4.1., calcolare il volume della coltura di 16 ore che deve essere abbassato e risospeso per ottenere un inoculo OD600 = 5,0 nel volume calcolato al punto 2.4.2. Ad esempio, se l'OD600 della coltura è 1,5 e il volume dell'inoculo necessario è 375 μL, allora il volume di coltura da far girare verso il basso è (375 μL x 5)/1,5 = 1250 μL.
- Pipettare il volume di coltura calcolato al punto 2.4.3. in una provetta sterile per microcentrifuga. Pellet i batteri centrifugando a 16.000 x g per 1-3 minuti.
- Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in PBS anaerobico al volume calcolato al punto 2.4.2. L'inoculo sarà ora a un OD600 calcolato di 5.0. Se applicabile, preparare anche un tubo di PBS per fungere da controllo del veicolo per i topi nel gruppo di controllo non infetto.
- Prima di rimuovere il tubo di inoculo dalla camera anaerobica, preparare una serie di diluizioni seriali da 1:10 a 1:10 x 106 in PBS. La piastra spot 5 replica ogni diluizione su una piastra di agar utilizzando un pipet multicanale per determinare la CFU dell'inoculo. Questa è la CFU pre-inoculazione.
3. Pre-lavaggio vaginale e inoculazione con Gardnerella
- Preparare i tubi di lavaggio vaginale nella camera anaerobica (questo può essere fatto contemporaneamente alla preparazione dell'inoculo nella fase 2.4.). Pipettare 70 μL di PBS sterile anaerobico in provette da microcentrifuga da 1,5 mL etichettate con numeri di topo. Preparare un tubo di lavaggio per mouse. Chiudere saldamente i tubi e farli uscire dalla camera anaerobica.
- Eseguire una lavanda vaginale su ciascun topo con 50 μL di PBS anaerobico dalle singole provette preparate al punto 3.1. Questi lavaggi vaginali sono i lavaggi pre-inoculazione e possono essere utilizzati per misurazioni e saggi a valle.
- Dopo la somministrazione della seconda iniezione di valerato di β-estradiolo (fase 1.8), posizionare ciascun topo sopra una gabbia o una superficie dura pulita che possa afferrare con le zampe anteriori. Afferrare delicatamente la parte centrale della coda e sollevare in modo che i quarti posteriori siano leggermente sollevati e l'apertura vaginale sia esposta.
- Utilizzando una pipetta e la punta del filtro p-200, aspirare 50 μL di PBS dal tubo di lavaggio corrispondente al mouse appropriato. Inserire delicatamente la punta della pipetta nel lume vaginale ~2-3 mm e pipettare delicatamente il volume di 50 μL, 3x-4x.
- Trasferire il materiale di lavaggio raccolto (~50 μL) nello stesso tubo di lavaggio da cui proviene, pipettando su e giù nel tubo di lavaggio che contiene ancora i restanti 20 μL di PBS. Se c'è muco eccessivo e la punta si ostruisce, utilizzare una punta p-200 pulita per raccogliere il materiale rimanente e posizionarlo nello stesso tubo di lavaggio.
- Somministrare vaginalmente 20 μL della sospensione batterica concentrata o del controllo del veicolo nella vagina di ciascun topo. Inoculare ogni topo immediatamente dopo il lavaggio vaginale per quel topo (cioè, eseguire il lavaggio e l'inoculazione in sequenza per ciascun topo prima di passare al successivo). Per semplificare questo processo, utilizzare due pipette p200, una impostata a 50 μL per i lavaggi e l'altra a 20 μL per le inoculazioni.
- Trattenere il mouse come descritto al punto 3.2.1. Utilizzando una punta p-200, pipettare 20 μL di sospensione batterica nella vagina. Per gli esperimenti di co-inoculazione utilizzando due diverse specie/ceppi batterici, utilizzare 10 μL di ciascuna sospensione batterica ed evitare di mescolare i due ceppi prima dell'inoculazione.
NOTA: Il volume totale di inoculazione non deve superare i 20 μL per evitare fuoriuscite dalla vagina. - Continuare a tenere l'estremità posteriore di ciascun topo per 10-20 secondi per evitare che il volume somministrato si accumuli immediatamente nell'introito vaginale. Quindi, posizionare il topo in una nuova gabbia / recipiente o con compagni di gabbia che sono già stati inoculati.
- Ripetere il passaggio 3.2. e Passo 3.3. per ogni mouse. Non rimettere mai i topi in una gabbia con animali che non sono ancora stati inoculati. Ciò impedisce l'esposizione involontaria dei topi a batteri resistenti alla streptomicina prima dell'inoculazione.
- Trattenere il mouse come descritto al punto 3.2.1. Utilizzando una punta p-200, pipettare 20 μL di sospensione batterica nella vagina. Per gli esperimenti di co-inoculazione utilizzando due diverse specie/ceppi batterici, utilizzare 10 μL di ciascuna sospensione batterica ed evitare di mescolare i due ceppi prima dell'inoculazione.
- Dopo che tutti i topi sono stati inoculati, riportare il tubo dell'inoculo nella camera anaerobica. Preparare e placcare un'altra diluizione seriale come descritto al punto 2.5. Questa è la CFU post-inoculazione. Confrontare i CFU delle piastre post-inoculazione e pre-inoculazione per determinare se la vitalità dell'inoculo è diminuita mentre si trovava al di fuori della camera anaerobica durante l'inoculazione degli animali.
- Placcare le lavaggi vaginali raccolte nel punto 3.2. su agar selettivo (in questo caso, 1 mg/ml di streptomicina). Incubare le piastre per 1-2 giorni in camera anaerobica a 37 °C ed esaminarne la crescita.
NOTA: La crescita indica che i membri endogeni del microbioma sono resistenti al marcatore di selezione e possono, quindi, oscurare l'enumerazione CFU dell'organismo bersaglio.
4. Raccolta di lavaggi vaginali per determinare la colonizzazione vitale di Gardnerella
- Raccogli i lavaggi vaginali in determinati punti temporali per analizzare la colonizzazione vaginale. Raccogliere come descritto nel passaggio 3.2.
- Immediatamente dopo la raccolta, ciclo le lavaggi vaginali in una camera anaerobica. Utilizzare 10 μL di ciascun lavaggio per eseguire la diluizione seriale e la placcatura su agar selettivo come descritto al punto 2.5. Utilizzare i conteggi CFU come misura della colonizzazione vaginale da parte di Gardnerella (o un altro anaerobo di interesse).
5. Sacrificio, dissezione e omogeneizzazione dei tessuti
- Preparare un tubo da 5 ml per ogni organo raccolto da ciascun topo (ad esempio, se la vagina, la cervice e l'utero vengono raccolti, preparare tre tubi per topo). Riempire ogni tubo con 1x PBS anaerobico sterile (o altri mezzi di omogeneizzazione) nella camera anaerobica. Utilizzare 1 ml di PBS per i tubi utilizzati per raccogliere vagine e cervici e 750 μL per i tubi utilizzati per raccogliere le corna uterine.
- Una volta aggiunto il PBS, pesare ogni singola provetta (questo è il peso pre-raccolta e verrà utilizzato per determinare il peso totale di ogni tessuto raccolto). Se una bilancia non è disponibile nella camera anaerobica, tappare ermeticamente i tubi e farli uscire dalla camera per essere pesati, quindi rimetterli in bicicletta.
NOTA: La preparazione del tubo e la raccolta del peso possono essere eseguite 1 giorno prima del sacrificio, ma i tubi devono essere tenuti nella camera anaerobica con tappi ermeticamente sigillati per evitare l'evaporazione. - Preparare una serie di tubi di lavaggio vaginale come descritto al punto 3.1. per raccogliere il lavaggio finale al sacrificio. Inoltre, preparare un becher da 50 ml di acqua deionizzata (DI) e un secondo becher da 50 ml di etanolo al 70% -90% da utilizzare per il risciacquo e la sterilizzazione degli strumenti standard di dissezione dell'acciaio durante il sacrificio.
- Estrarre i tubi di raccolta degli organi riempiti di PBS dalla camera anaerobica. Tenere i tubi ben chiusi fino a quando i tessuti sono pronti per essere aggiunti.
- Sacrificare ogni mouse utilizzando metodi approvati IACUC. Eseguire il lavaggio finale come descritto nei punti 3.2.2. e 3.2.3. o immediatamente prima del sacrificio o subito dopo.
- Iniziare la dissezione e la raccolta dei tessuti. Spruzzare lungo l'addome e la parte posteriore di ciascun topo con etanolo al 70%. Sterilizzare le forbici in un becher di etanolo, lasciarle asciugare e quindi tagliare un singolo taglio verticale della cavità addominopelvica del topo.
- Utilizzare una pinza sterile per tirare indietro la pelle e spingere delicatamente l'intestino fuori dalla cavità del corpo e sul lato del campo aperto, che esporrà il tratto riproduttivo.
NOTA: Fare attenzione a non perforare o perforare l'intestino in quanto potrebbero ospitare batteri resistenti alla streptomicina che possono confondere i risultati sperimentali. - Per raccogliere il massimo tessuto vaginale, rompere l'osso pubico durante l'autopsia. Usando le forbici sterili, tagliare il centro dell'osso pubico (la sinfisi pubica) facendo attenzione a non tagliare nella vagina. Utilizzando due serie di pinze sterili, afferrare ciascun lato del bacino e aprire il bacino lateralmente, esponendo la parte inferiore della vagina sottostante.
- Utilizzare una pinza per afferrare delicatamente la cervice (una struttura più dura rispetto al tessuto circostante). Tirare delicatamente sulla cervice per esporre il colon, nascosto dietro e strettamente collegato alla vagina.
- Utilizzare piccole forbici per liberare la vagina dai tessuti connettivi esterni. Separare con cura la vagina dal colon ed evitare di perforare il tratto intestinale. Quando completamente rilasciato, fiancheggia la vagina all'introito con le forbici e taglia per rilasciare dal corpo del topo.
- Mantenere una presa delicata sulla cervice mentre si tira leggermente verso l'alto per rendere le corna uterine più visibili. Con l'altra mano, tagliare direttamente sotto le ovaie sui lati destro e sinistro per liberare le corna uterine. Rimuovere il tratto riproduttivo ormai scollegato dalla cavità corporea e posizionarlo in una piastra di Petri sterile.
- Usando un rasoio, separare le corna uterine, la cervice e la vagina. Posizionare ogni fazzoletto nella rispettiva provetta di raccolta etichettata. Se le citochine devono essere raccolte, posizionare i tubi sul ghiaccio dopo l'aggiunta di tessuto.
- Pesare nuovamente ogni tubo dopo che il tessuto è stato aggiunto. Questo è il peso post-raccolta. Sottrarre il peso pre-raccolta dal peso post-raccolta per ottenere il peso totale del tessuto.
- Utilizzare un omogeneizzatore portatile per omogeneizzare gli organi nelle loro provette di raccolta. Per Gardnerella JCP8151B, eseguire questo passaggio nell'armadio di biosicurezza (aerobicamente) o nella camera anaerobica.
- Preparare diversi set di tubi per il lavaggio e il trattamento asettico dell'omogeneizzatore portatile tra i campioni. Assicurarsi che ogni set abbia tre tubi conici da 50 ml: uno riempito con acqua DI, uno con etanolo al 70% e il terzo con 1x PBS. Preparare un set separato di tubi di lavaggio per ciascun gruppo di trattamento del topo.
- Per pulire l'omogeneizzatore, abbassare le lame nel liquido in ogni tubo di lavaggio e ruotare lo strumento alla massima velocità. Tenere l'omogeneizzatore in ciascuno dei tre tubi per circa 3 s. L'ordine di lavaggio è acqua DI (per rimuovere i detriti fisici), quindi etanolo (per disinfettare) e infine 1x PBS (per neutralizzare). Agitare la sonda su un tovagliolo di carta o un tappetino monouso per rimuovere il liquido in eccesso tra ogni risciacquo.
- Dopo il risciacquo iniziale, omogeneizzare i tessuti abbassando la sonda omogeneizzatore sul fondo del tubo di raccolta, intrappolando il tessuto sottostante. Accendere l'omogeneizzatore per macinare il tessuto, muovendo delicatamente la sonda su e giù di circa 5 volte rimanendo sommersa. Omogeneizzare ogni organo per circa 15-30 s.
- Dopo aver spento e rimosso l'omogeneizzatore dal tubo, ispezionare visivamente il contenuto per garantire la completa interruzione del tessuto. Questo è particolarmente importante per la cervice e la vagina, che a volte non riescono a essere catturate dalla sonda.
NOTA: Va bene se un po 'di grasso in eccesso sulle corna uterine non si omogeneizza completamente. - Ripetere i passaggi 5.14.1.-5.14.4., lavando e sterilizzando la sonda tra ciascun campione. Passare a un nuovo set di tubi di lavaggio per ogni gruppo sperimentale.
- Spostare le provette con campioni omogeneizzati nella camera anaerobica. Per determinare la carica batterica di ciascun tessuto, eseguire un breve vortice delicato del campione da miscelare, quindi rimuovere 100 μL di omogenato tissutale per la diluizione seriale e la placcatura su agar selettivo per la determinazione della CFU (la prima diluizione è 1 x 100). Se è richiesto un limite inferiore di rilevazione, eseguire la placcatura di 200-250 μL di omogenato non diluito.
Representative Results
Una rappresentazione schematica di un esperimento di esempio mostra alcuni dei modi in cui si potrebbe eseguire il protocollo descritto (Figura 1).
Alcuni animali porteranno microbi endogeni nei loro microbiomi vaginali che cresceranno su supporti non selettivi. I metodi qui descritti si basano su isolati resistenti alla streptomicina dei ceppi batterici studiati, insieme a terreni selettivi contenenti streptomicina, per selezionare contro i batteri endogeni (Figura 2A,B). È possibile che la resistenza alla streptomicina si sviluppi spontaneamente, quindi controllare i topi prima dell'infezione (lavaggi del giorno 0) può aiutare a stabilire se questo può essere un problema.
Il recupero dei batteri vitali dai lavaggi vaginali viene effettuato mediante diluizione seriale e placcatura su supporti di agar. Una capsula di Petri standard può contenere fino a una matrice 6 x 6 di macchie da 5 μL, consentendo l'enumerazione dei titoli batterici da sei punti di replica su sei ordini di grandezza per ciascun campione se si utilizzano diluizioni seriali 10 volte (Figura 3A). Questo metodo può essere utilizzato per enumerare titoli di batteri che vanno da Gardnerella a Prevotella e Fusobacterium (Figura 3B-D).
Insieme, questi metodi consentono di testare ipotesi e fare interpretazioni sulla colonizzazione batterica / infezione del tratto riproduttivo femminile. Ad esempio, un confronto tra i titoli di Gardnerella nei lavaggi vaginali e gli omogenati del tessuto vaginale ha dimostrato la concordanza tra questi metodi (Figura 4A). Allo stesso modo, in un modello di co-inoculazione vaginale, i titoli di Prevotella nel tessuto uterino erano significativamente più alti (circa 20 volte) durante la co-infezione da Gardnerella rispetto alla mono-infezione di Prevotella (Figura 4B). Infine, i ceppi batterici wild-type rispetto a quelli mutanti possono essere confrontati in questi modelli per stabilire i ruoli svolti da geni specifici e dai loro prodotti nei processi di colonizzazione/infezione del tratto riproduttivo. Ad esempio, un ceppo mutante di Fusobacterium privo della capacità di trasportare e consumare l'acido sialico carboidrato ha portato a livelli più bassi di colonizzazione entro 3 giorni dopo l'inoculazione (Figura 4C).
Figura 1: Schema di un esperimento di esempio33. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Crescita di microbi vaginali murini endogeni su agar selettivo rispetto a quello non selettivo. I lavaggi vaginali di cinque topi femmina C57Bl / 6 (1-5) sono stati striati su due diverse piastre di agar NYC III e incubati anaerobicamente. (A) La piastra a sinistra non contiene antibiotici e consente la crescita di batteri anaerobici endogeni dal tratto vaginale murino. (B) La piastra a destra contiene 1 mg/ml di streptomicina e seleziona contro la crescita di batteri endogeni. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Recupero di G. vaginalis, P. bivia e F. nucleatum CFU vitali da lavaggi vaginali. (A) CFU di inoculo G. vaginalis JCP8151B-SmR, replica-placcato come serie di diluizione su agar NYC III. (B-D) Recupero di (B) G. vaginalis 24, (C) P. bivia25 e (D) F. nucleatum26 vitali dalle lavaggi vaginali di animali monoinfetti. Per ogni grafico (B-D), i dati sono combinati da due esperimenti indipendenti, con 10-15 topi per esperimento24,25,26. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Ulteriore analisi della colonizzazione batterica anaerobica in un modello di inoculazione vaginale murina. (A) I titoli di G. vaginalis nei lavaggi vaginali sono correlati con i titoli di G. vaginalis recuperati da omogenati di tessuto vaginale a 24 ore e 72 ore dopo l'inoculazione (combinazione di due esperimenti indipendenti, n = 10 ciascuno. Significato determinato dal test di correlazione di rango di Spearman)24. (B) La co-infezione con G. vaginalis porta ad un aumento dei titoli di P. bivia nel tessuto del corno uterino rispetto agli animali mono-infetti da P. bivia a 48 ore dopo l'inoculazione (combinazione di due esperimenti indipendenti, ciascuno con 6-10 topi per gruppo. Significato determinato dal test U di Mann-Whitney, **p = 0,0017)25. (C) Il mutante di F. nucleatum con trasportatore di acido sialico interrotto (Ω SiaT) ha titoli ridotti nelle lavaggi vaginali di topi mono-infetti rispetto a F. nucleatum wild-type a 72 ore dopo l'inoculazione (combinazione di due esperimenti indipendenti, ciascuno con 10 topi per gruppo. Significato determinato dal test U di Mann-Whitney, **p < 0.01)26. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
File supplementare 1: Esempi di metodi utilizzati per diversi batteri vaginali cresciuti in condizioni anaerobiche. Clicca qui per scaricare questo file.
Discussion
Il modo più significativo in cui il modello qui descritto differisce dai modelli di inoculazione vaginale precedentemente pubblicati è l'uso di batteri coltivati anaerobicamente, che richiedono considerazioni speciali per la preparazione di inoculo vitale e il recupero di batteri dai topi. I passaggi specifici del protocollo di cui sopra possono variare leggermente a seconda della specie/ceppo di batteri utilizzati, come suggerito nel file supplementare 1. Inoltre, questo manoscritto descrive un nuovo metodo procedurale per la somministrazione di batteri e lavaggi vaginali che richiede meno esperienza da parte dello sperimentatore e meno moderazione per i topi. Se lo sperimentatore non è a suo agio con la forma di contenzione descritta al punto 3.2. e step 3.3., i topi possono invece essere scruffati come precedentemente descritto34 con o senza anestesia secondo il disegno sperimentale e le linee guida istituzionali IACUC.
Un avvertimento importante per l'uso di batteri coltivati anaerobicamente nei modelli murini è che alcuni passaggi (come quelli che coinvolgono animali vivi) devono essere eseguiti al di fuori della camera anaerobica. Pertanto, i passaggi più critici in questo protocollo sono quelli in cui i batteri di interesse saranno esposti a un ambiente aerobico, come durante l'inoculazione dei topi. L'uso di qualsiasi nuovo anaerobo in questo modello richiederà un'indagine preliminare sulla sua capacità di mantenere la vitalità dopo l'esposizione all'ossigeno (come il confronto delle CFU pre- e post-inoculazione come descritto nella fase 2.5. e nella fase 3.4.). A seconda del grado di sensibilità all'ossigeno e alla PBS dell'organismo, devono essere presi in considerazione diversi metodi di preparazione dell'inoculo (scheda supplementare 1, fase 2.4.5.). Per le inoculazioni con G. vaginalis JCP8151B, abbiamo scoperto che un singolo tubo di inoculo può essere preparato in PBS e utilizzato per infettare tutti i topi. Se viene utilizzato un batterio anaerobico diverso che è più sensibile all'ossigeno, l'inoculo può invece essere preparato in tubi separati per ciascun topo in modo che non sia necessaria un'apertura / chiusura ripetuta del tubo. Allo stesso modo, se la specie batterica di interesse è più meticolosa / meno capace di sopravvivere in PBS rispetto a G. vaginalis, l'inoculazione può invece essere preparata in terreni di coltura. Se il mezzo utilizzato contiene agenti riducenti, come il mezzo anaerobo CDC utilizzato per la coltura Prevotella bivia (file supplementare 1, fase 2.1. e fase 2.2.), allora i batteri avranno anche una maggiore protezione dall'esposizione all'ossigeno.
Possono essere presi in considerazione anche metodi alternativi per l'omogeneizzazione, come il battito del tallone22,35, che viene eseguito con il tappo del tubo chiuso e può, quindi, introdurre meno ossigeno rispetto all'omogeneizzatore portatile. Inoltre, gli organismi più sensibili all'ossigeno possono richiedere un tempo di equilibrio più lungo per i mezzi. Un indicatore di ossigeno come la resazurina può essere utilizzato per verificare che siano state raggiunte le condizioni anaerobiche (fase 2.1.). Metodi alternativi come i vasi anaerobici possono influenzare i risultati e dovrebbero essere controllati per la vitalità batterica prima dell'uso.
La sensibilità all'ossigeno e la fastidiosità dell'organismo sperimentale possono anche svolgere un ruolo nel recupero di successo di batteri vitali dal topo durante il lavaggio / omogeneizzazione (file supplementare 1, passo 3.2. e passo 5.1.). Per gli organismi altamente sensibili, il tempo tra il lavaggio prelevato e placcato può portare a una perdita di vitalità e causare una stima artificialmente bassa della colonizzazione vaginale batterica. Per mitigare questo effetto, i lavaggi raccolti possono essere immediatamente diluiti in terreni di coltura anaerobici freschi (con agente riducente). Allo stesso modo, l'omogeneizzazione degli organi può essere eseguita in terreni di coltura freschi piuttosto che PBS per aumentare la vitalità batterica e può anche essere eseguita nella camera anaerobica stessa per ridurre al minimo l'esposizione all'ossigeno.
A seconda dello scopo di un determinato esperimento, lo sperimentatore deve prestare attenzione ai gruppi di controllo. Per testare le ipotesi, le misure di base dei topi di controllo non infetti che sono trattati con il solo veicolo aiuteranno a stabilire se c'è induzione di chemochine / citochine o altri esiti specifici di infezione. Il veicolo di controllo utilizzato deve essere lo stesso del veicolo utilizzato per l'inoculazione, quindi se i batteri sono inoculati in terreni di coltura, allora i terreni di coltura non inoculati devono essere utilizzati come controllo (fascicolo supplementare 1, fase 2.4.5.).
I metodi descritti in questo protocollo potrebbero essere applicati anche a batteri facoltativi in grado di crescere anaerobicamente ma che sono tradizionalmente studiati utilizzando condizioni di coltura aerobica (come Escherichia coli o Streptococco di gruppo B). Ciò potrebbe essere particolarmente rilevante per le infezioni da questi organismi nei siti del corpo che si ritiene contengano bassi livelli di ossigeno, come la cervice. Può darsi che un organismo facoltativo infetti con maggiore successo i siti con meno ossigeno quando l'inoculo viene preparato anaerobicamente rispetto a aerobicamente. In tale esperimento, il recupero di batteri vitali per il censimento dei CFU potrebbe non richiedere condizioni anaerobiche.
Disclosures
Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.
Acknowledgments
Ringraziamo Lynne Foster per l'assistenza tecnica durante lo sviluppo di questi modelli. Apprezziamo i fondi di avvio del Dipartimento di Microbiologia Molecolare e del Centro per la ricerca sulle malattie infettive delle donne (ad AL), e la March of Dimes (premio Basil O'Connor ad AL) che ha contribuito a sostenere gli esperimenti in fase iniziale. Anche il National Institute of Allergy and Infectious Diseases (R01 AI114635) ha sostenuto lo sviluppo di questi modelli.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| β-estradiol 17-valerate | Sigma | E1631 | estrogenization of mice |
| 0.22 µm, 50 mL Steriflip vacuum filter | Fisher | SCGP00525 | sterile filtering sesame oil |
| 14 mL tube | Falcon | 352059 | estrogenization of mice |
| 190-proof ethanol | Koptec | V1105M | dissection, tissue homogenization, CDC and Columbia media |
| 1x PBS | Fisher | MT21040CM | vaginal lavage, G. vaginlalis inoculum prep, tissue collection and homogenization |
| 25 G × 5/8 -in needle | BD | 305122 | estrogenization of mice |
| 5 mL tube | Falcon | 352063 | Tissue collection and homogenization |
| Anaerobic chamber | Coy | 7200000 | Growth of anaerobic bacteria |
| Bacto agar | Fisher | DF0140074 | G. vaginalis, F. nucleatum, and P. bivia agar plates |
| Bacto peptone | Fisher | DF0118170 | CDC anaerobic media for P. bivia growth |
| Columbia broth | Fisher | DF0944170 | Columbia media for F. nucleatum growth |
| Defibrinated sheep blood | Hemostat | DSB500 | CDC anaerobic media for P. bivia growth |
| Forceps | Fine Science Tools | 11008-13 | mouse/tissue dissection |
| Glucose | Sigma | G7528 | NYCIII media for G. vaginalis growth |
| Handheld homogenizer | ISC Bio | 3305500 | Tissue homogenization |
| Hemin | Sigma | 51280 | CDC anaerobic media for P. bivia growth, Columbia media for F. nucleatum growth |
| HEPES | Cellgro | 25-060-Cl | NYCIII media for G. vaginalis growth |
| Horse serum | Hemostat | SHS500 | NYCIII media for G. vaginalis growth |
| Hydrogen gas mix (5% hydrogen, 10% CO2, 85% nitrogen) | Matheson | Gas for anaerobic chamber | |
| Isofluorane | VetOne | 502017 | mouse anaethesia at sacrifice |
| L-cysteine | Sigma | C1276 | CDC anaerobic media for P. bivia growth |
| L-glutamate | Sigma | G1626 | CDC anaerobic media for P. bivia growth |
| Milli-Q Water Purifier | Millipore | IQ-7000 | for making media and homogenization |
| NaCl | Sigma | S3014 | NYCIII media for G. vaginalis growth |
| NaOH tablets | Sigma | S5881 | CDC anaerobic media for P. bivia growth |
| Nitrogen gas | Airgas | Gas for anaerobic chamber | |
| p-200 filter tips | ISC Bio | P-1237-200 | vaginal lavages and bacterial inoculations |
| pancreatic digest of casein | Sigma | 70169 | CDC anaerobic media for P. bivia growth |
| Proteose peptone #3 | Fisher | DF-122-17-4 | NYCIII media for G. vaginalis growth |
| Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | mouse/tissue dissection |
| Sesame oil | Fisher | ICN15662191 | estrogenization of mice |
| Single edge surgical carbon steel razor blades | VWR | 55411-050 | tissue dissection |
| Sodium chloride | Sigma | S3014 | CDC anaerobic media for P. bivia growth |
| Spectrophotometer | BioChrom | 80-3000-45 | measuring bacterial OD600 |
| Streptomycin | Gibco | 11860038 | add to agar media to make selective plates |
| Tuberculin slip tip 1ml syringe | BD | 309659 | estrogenization of mice |
| Vitaim K3 | Sigma | M5625 | Columbia media for F. nucleatum growth |
| Vitamin K1 | Sigma | 95271 | CDC anaerobic media for P. bivia growth |
| Yeast extract | Fisher | DF0127-17-9 | NYCIII media for G. vaginalis growth |
References
- Hillier, S. L., Krohn, M. A., Rabe, L. K., Klebanoff, S. J., Eschenbach, D. A. The normal vaginal flora, H2O2-producing lactobacilli, and bacterial vaginosis in pregnant women. Clinical Infectious Diseases. 16, Suppl 4 273-281 (1993).
- Ravel, J., et al.
- Hill, G. B., Eschenbach, D. A., Holmes, K. K.
- van de Wijgert, J. The vaginal microbiome and sexually transmitted infections are interlinked: Consequences for treatment and prevention. PLoS Medicine. 14 (12), 1002478 (2017).
- Srinivasan, S., et al. Bacterial communities in women with bacterial vaginosis: high resolution phylogenetic analyses reveal relationships of microbiota to clinical criteria. PLoS One. 7 (6), 37818 (2012).
- Shipitsyna, E., et al. Composition of the vaginal microbiota in women of reproductive age-sensitive and specific molecular diagnosis of bacterial vaginosis is possible. PLoS One. 8 (4), 60670 (2013).
- Brotman, R. M., et al. Bacterial vaginosis assessed by gram stain and diminished colonization resistance to incident gonococcal, chlamydial, and trichomonal genital infection. The Journal of Infectious Diseases. 202 (12), 1907-1915 (2010).
- Peipert, J. F., et al. Bacterial vaginosis, race, and sexually transmitted infections: does race modify the association. Sexually Transmitted Diseases. 35 (4), 363-367 (2008).
- Wiesenfeld, H. C., Hillier, S. L., Krohn, M. A., Landers, D. V., Sweet, R. L. Bacterial vaginosis is a strong predictor of Neisseria gonorrhoeae and Chlamydia trachomatis infection. Clinical Infectious Diseases. 36 (5), 663-668 (2003).
- Spandorfer, S. D., Neuer, A., Giraldo, P. C., Rosenwaks, Z., Witkin, S. S. Relationship of abnormal vaginal flora, proinflammatory cytokines and idiopathic infertility in women undergoing IVF. The Journal of Reproductive Medicine. 46 (9), 806-810 (2001).
- Ralph, S. G., Rutherford, A. J., Wilson, J. D. Influence of bacterial vaginosis on conception and miscarriage in the first trimester: cohort study. BMJ. 319 (7204), 220-223 (1999).
- Holst, E., Goffeng, A. R., Andersch, B. Bacterial vaginosis and vaginal microorganisms in idiopathic premature labor and association with pregnancy outcome. Journal of Clinical Microbiology. 32 (1), 176-186 (1994).
- DiGiulio, D. B., et al. Microbial prevalence, diversity and abundance in amniotic fluid during preterm labor: a molecular and culture-based investigation. PLoS One. 3 (8), 3056 (2008).
- Svare, J. A., Schmidt, H., Hansen, B. B., Lose, G. Bacterial vaginosis in a cohort of Danish pregnant women: Prevalence and relationship with preterm delivery, low birthweight and perinatal infections. British Journal of Obstetrics and Gynaecology. 113 (12), 1419-1425 (2006).
- Ádám, A., et al. Culture- and PCR-based detection of BV associated microbiological profile of the removed IUDs and correlation with the time period of IUD in place and the presence of the symptoms of genital tract infection. Annals of Clinical Microbiology and Antimicrobials. 17 (1), 40 (2018).
- Di Paola, M., et al. Characterization of cervico-vaginal microbiota in women developing persistent high-risk Human Papillomavirus infection. Scientific Reports. 7 (1), 10200 (2017).
- Bullman, S., et al. Analysis of Fusobacterium persistence and antibiotic response in colorectal cancer. Science. 358 (6369), 1443-1448 (2017).
- Brennan, C. A., Garrett, W. S. Gut microbiota, inflammation, and colorectal cancer. Annual Review of Microbiology. 70, 395-411 (2016).
- Hill, G. B. Preterm birth: associations with genital and possibly oral microflora. Annals of Periodontology. 3 (1), 222-232 (1998).
- Hitti, J., et al. Vaginal indicators of amniotic fluid infection in preterm labor. Obstetrics & Gynecology. 97 (2), 211-219 (2001).
- DiGiulio, D. B.
- Patras, K. A., Doran, K. S. A murine model of Group B Streptococcus vaginal colonization. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (117), e54708 (2016).
- Jerse, A. E., et al. Estradiol-treated female mice as surrogate hosts for Neisseria gonorrhoeae genital tract infections. Frontiers in Microbiology. 2, 107 (2011).
- Gilbert, N. M., Lewis, W. G., Lewis, A. L. Clinical features of bacterial vaginosis in a murine model of vaginal infection with Gardnerella vaginalis. PLoS One. 8 (3), 59539 (2013).
- Gilbert, N. M., et al. Gardnerella vaginalis and Prevotella bivia trigger distinct and overlapping phenotypes in a mouse model of bacterial vaginosis. The Journal of Infectious Diseases. 220 (7), 1099-1108 (2019).
- Agarwal, K., et al. Glycan cross-feeding supports mutualism between Fusobacterium and the vaginal microbiota. PLOS Biology. 18 (8), 3000788 (2020).
- Liehr, J. G. Is estradiol a genotoxic mutagenic carcinogen. Endocrine Reviews. 21 (1), 40-54 (2000).
- Yager, J. D., Davidson, N. E.
- Adeel, M., Song, X., Wang, Y., Francis, D., Yang, Y. Environmental impact of estrogens on human, animal and plant life: A critical review. Environment International. 99, 107-119 (2017).
- Miner, N. A., Koehler, J., Greenaway, L.
- Lewis, W. G., Robinson, L. S., Gilbert, N. M., Perry, J. C., Lewis, A. L. Degradation, foraging, and depletion of mucus sialoglycans by the vagina-adapted Actinobacterium Gardnerella vaginalis. Journal of Biological Chemistry. 288 (17), 12067-12079 (2013).
- Robinson, L. S., et al. Genome sequences of 15 Gardnerella vaginalis strains isolated from the vaginas of women with and without bacterial vaginosis. Genome Announcements. 4 (5), 00879 (2016).
- Adapted from "mouse posterior turn" by BioRender.com. BioRender.com. , Available from: https://app.biorender.com/biorender-templates (2022).
- Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (67), e2771 (2012).
- Verollet, R. A major step towards efficient sample preparation with bead-beating. Biotechniques. 44 (6), 832-833 (2008).
