Etablering af 3-dimensionelle sfæroider fra patientafledte tumorprøver og evaluering af deres følsomhed over for lægemidler

Summary

Denne protokol beskriver generering af 3D-tumorkulturmodeller fra primære kræftceller og evaluering af deres følsomhed over for lægemidler ved hjælp af cellelevedygtighedsassays og mikroskopiske undersøgelser.

Abstract

På trods af bemærkelsesværdige fremskridt i forståelsen af tumorbiologi mislykkes langt de fleste onkologiske lægemiddelkandidater, der går ind i kliniske forsøg, ofte på grund af manglende klinisk effekt. Denne høje fejlrate belyser de nuværende prækliniske modellers manglende evne til at forudsige klinisk effekt, hovedsageligt på grund af deres utilstrækkelighed i at afspejle tumorheterogenitet og tumormikromiljøet. Disse begrænsninger kan løses med 3-dimensionelle (3D) kulturmodeller (sfæroider) etableret fra humane tumorprøver afledt af individuelle patienter. Disse 3D-kulturer repræsenterer biologi i den virkelige verden bedre end etablerede cellelinjer, der ikke afspejler tumorheterogenitet. Desuden er 3D-kulturer bedre end 2-dimensionelle (2D) kulturmodeller (monolagsstrukturer), da de replikerer elementer i tumormiljøet, såsom hypoxi, nekrose og celleadhæsion, og bevarer den naturlige celleform og vækst. I denne undersøgelse blev der udviklet en metode til fremstilling af primære kulturer af kræftceller fra individuelle patienter, der er 3D og vokser i flercellede sfæroider. Cellerne kan udledes direkte fra patienttumorer eller patientafledte xenotransplantater. Metoden er bredt anvendelig til solide tumorer (fx tyktarm, bryst og lunge) og er også omkostningseffektiv, da den kan udføres i sin helhed i et typisk kræftforsknings- / cellebiologilaboratorium uden at stole på specialudstyr. Heri præsenteres en protokol til generering af 3D-tumorkulturmodeller (multicellulære sfæroider) fra primære kræftceller og evaluering af deres følsomhed over for lægemidler ved hjælp af to komplementære tilgange: et cellelevedygtighedsassay (MTT) og mikroskopiske undersøgelser. Disse multicellulære sfæroider kan bruges til at vurdere potentielle lægemiddelkandidater, identificere potentielle biomarkører eller terapeutiske mål og undersøge mekanismerne for respons og resistens.

Introduction

In vitro- og in vivo-undersøgelser repræsenterer komplementære tilgange til udvikling af kræftbehandlinger. In vitro-modeller giver mulighed for kontrol af de fleste eksperimentelle variabler og letter kvantitative analyser. De fungerer ofte som billige screeningsplatforme og kan også bruges til mekanistiske undersøgelser¹. Imidlertid er deres biologiske relevans i sagens natur begrænset, da sådanne modeller kun delvist afspejler tumormikromiljøet¹. I modsætning hertil fanger in vivo-modeller, såsom patientafledte xenotransplantater (PDX), kompleksiteten af tumormikromiljøet og er mere egnede til translationelle undersøgelser og individualisering af behandling hos patienter (dvs. undersøgelse af respons på lægemidler i en model afledt af en individuel patient)¹. In vivo-modeller er imidlertid ikke befordrende for high-throughput-tilgange til lægemiddelscreening, da de eksperimentelle parametre ikke kan kontrolleres så tæt som in vitro-modeller, og fordi deres udvikling er tidskrævende, arbejdskrævende og dyr ^1,2.

In vitro-modeller har været tilgængelige i over 100 år, og cellelinjer har været tilgængelige i over 70 år³. I løbet af de sidste årtier er kompleksiteten af de tilgængelige in vitro-modeller af solide tumorer imidlertid steget dramatisk. Denne kompleksitet spænder fra 2-dimensionelle (2D) kulturmodeller (monolagsstrukturer), der enten er tumorafledte etablerede cellelinjer eller primære cellelinjer til de nyere tilgange, der involverer 3-dimensionelle (3D) modeller¹. Inden for 2D-modellerne er en nøgleforskel mellem de etablerede og primære cellelinjer⁴. Etablerede cellelinjer er udødeliggjort; Derfor kan den samme cellelinje bruges globalt over mange år, hvilket fra et historisk perspektiv letter samarbejde, akkumulering af data og udvikling af mange behandlingsstrategier. Imidlertid akkumuleres genetiske aberrationer i disse cellelinjer med hver passage, hvilket kompromitterer deres biologiske relevans. Desuden afspejler det begrænsede antal tilgængelige cellelinjer ikke heterogeniteten af tumorer hos patienter ^4,5. Primære kræftcellelinjer stammer direkte fra resekterede tumorprøver opnået via biopsier, pleurale effusioner eller resektioner. Derfor er primære kræftcellelinjer mere biologisk relevante, da de bevarer elementer i tumormikromiljøet og tumoregenskaber, såsom intercellulær adfærd (fx krydstale mellem sunde og kræftceller) og de stammelignende fænotyper af kræftceller. Imidlertid er den replikative kapacitet af primære cellelinjer begrænset, hvilket fører til en smal dyrkningstid og begrænser antallet af tumorceller, der kan bruges til analyser ^4,5.

Modeller, der bruger 3D-kulturer, er mere biologisk relevante end 2D-kulturmodeller, da in vivo-betingelserne bevares. Således bevarer 3D-kulturmodeller den naturlige celleform og vækst og replikerer elementer i tumormiljøet, såsom hypoxi, nekrose og celleadhæsion. De mest almindeligt anvendte 3D-modeller inden for kræftforskning omfatter multicellulære sfæroider, stilladsbaserede strukturer og matrixindlejrede kulturer ^4,6,7.

Denne protokol genererer 3D-tumorkulturmodeller (multicellulære sfæroider) fra primære kræftceller og evaluerer deres følsomhed over for lægemidler ved hjælp af to komplementære tilgange: et cellelevedygtighedsassay (MTT) og mikroskopiske undersøgelser. De repræsentative resultater, der præsenteres heri, er fra bryst- og tyktarmskræft; Denne protokol er imidlertid bredt anvendelig til andre solide tumortyper (f.eks. Cholangiocarcinom, mave-, lunge- og bugspytkirtelkræft) og er også omkostningseffektiv, da den kan udføres i sin helhed i et typisk kræftforsknings- / cellebiologilaboratorium uden at stole på specialudstyr. De multicellulære sfæroider, der genereres ved hjælp af denne tilgang, kan bruges til at vurdere potentielle lægemiddelkandidater, identificere potentielle biomarkører eller terapeutiske mål og undersøge mekanismerne for respons og resistens.

Denne protokol er opdelt i tre sektioner: (1) generering, indsamling og tælling af sfæroiderne som forberedelse til deres anvendelse som model til test af lægemiddeleffektivitet; (2) MTT-assay til vurdering af lægemiddeleffektivitet på sfæroiderne; og (3) den mikroskopiske evaluering af morfologiske ændringer efter behandling af sfæroiderne med lægemidler som en anden tilgang til evaluering af lægemiddeleffektivitet (figur 1).

Protocol

Indsamlingen af humane tumorprøver, der blev anvendt til de primære tumorcellekulturer, blev udført i henhold til IRB-godkendte protokoller (Institutional Review Board) på Rabin Medical Center med skriftligt informeret samtykke fra patienterne. Patienter, der var egnede til at deltage i undersøgelsen, omfattede mandlige og kvindelige voksne og pædiatriske kræftpatienter med ikke-metastatisk bryst-, tyktarms-, lever-, lunge-, neuroendokrine, ovarie- eller bugspytkirtelkræft, enhver pædiatrisk kræft eller metastatisk kræft. Det eneste udelukkelseskriterium var manglende evne til at give informeret samtykke.

1. Generering og indsamling af sfæroider

BEMÆRK: Isolering af primære tumorceller kan udføres som beskrevet af Kodak et ^al.8. Det er vigtigt, at primære tumorceller, der anvendes til generering af sfæroiderne, kan udledes direkte fra patientprøver opnået ved biopsi, resektion osv. eller indirekte ved hjælp af tumorprøver fra patientafledte xenograft (PDX) modeller, som beskrevet af Moskovits et ^al.9.

1. Forbered en enkeltcellesuspension af vedhængende primære tumorcellekulturer med 75% -100% sammenløb ved at tage en lille kolbe (T25) med en enkeltcelle vedhængende primær cellekultur, fjerne cellekulturmediet, vaske med PBS og derefter tilføje 1 ml 1x Accutase (en celleløsgørelsesopløsning) (se materialetabellen) i 3 minutter ved 37 °C.
2. Neutraliser Accutase-opløsningen ved at tilsætte 5 ml cellekulturmedium (RPMI-1640 dyrkningsmedium suppleret med 10% FBS, 1:100 penicillin-streptomycin, 1% ikke-essentielle aminosyrer og 1% L-glutamin; se materialetabellen).
3. Opsug cellerne med en 10 ml serologisk pipette, og deponer dem i et 15 ml konisk rør. Centrifuger glasset ved 800 x g i 5 minutter ved stuetemperatur.
4. Fjern cellekulturmediet, tilsæt 5 ml frisk cellekulturmedium oven på cellepelleten, og bland forsigtigt.
5. Tæl de levedygtige celler med et hæmocytometer¹⁰. For at gøre dette skal du tage en prøve på 50 μL af cellesuspensionen og blande den med 50 μL trypanblå. Tæl de levende celler (de celler, der er negative for blå farve), og beregn det samlede antal levende celler i suspensionen.
6. Forbered et "3D-kulturmedium" (et cellekulturmedium suppleret med 5% kældermembranmatrix; se materialetabellen).
   BEMÆRK: "3D-kulturmediet" er væskelignende ved stuetemperatur. Ved 37 °C bliver konsistensen mere gellignende (så cellerne forbliver sammen), selvom den stadig kan pipetteres (da den kun indeholder 5% kældermembranmatrix).
7. Beregn antallet af celler, der er nødvendige til analysen, og det samlede krævede volumen; hver brønd skal indeholde 2.000-8.000 celler i 200 μL medium.
8. Forbered en cellesuspension med det ønskede antal celler (f.eks. 4.000 celler) i 200 μL af "3D-dyrkningsmediet" og bland forsigtigt med pipetten for at sikre en homogen fordeling.
9. Overfør suspensionen til en pipetteringsbeholder. Ved hjælp af en flerkanalpipette tilsættes 200 μL af cellesuspensionen til hvert hul i en 96-brøndplade med ultralav fastgørelse (se materialetabellen). Før hver samling af cellerne blandes suspensionen godt.
10. Pladen centrifugeres ved 300 x g i 10 minutter ved stuetemperatur for at gennemtvinge klyngedannelsen af cellerne og derved forbedre celleaggregeringen og inkubere pladen ved 37 °C i en 5 % CO₂ befugtet inkubator.
11. Hver 2-3 dage opdateres "3D-kulturmediet". Pladen centrifugeres ved 300 x g i 10 minutter ved stuetemperatur, 50 % af mediet (100 μL) fjernes og kasseres forsigtigt, og der tilsættes 100 μL frisk "3D-dyrkningsmedium" som erstatning for den eksisterende opløsning. Gentag trin 1.11, og sæt pladen tilbage i den 5 % CO₂ befugtede inkubator på 37 °C.
    BEMÆRK: Fjernelsen af mediet skal udføres, når pladen holdes på 45°, og mediet må kun opsamles fra den øverste del for at undgå at samle cellerne. Der bør ikke anvendes et vakuumsugesystem. Det friske medium skal tilsættes langsomt og forsigtigt for ikke at forstyrre sfæroiderne, som allerede er begyndt at danne sig.
12. Undersøg cellerne under et mikroskop hver 1-2 dage for at overvåge sfærisk dannelse. Mål diameteren af de sfæroider, der dannes ved hjælp af "skala" -værktøjet i billedbehandlingssoftwaren (se materialetabellen).
    BEMÆRK: Mikroskopisk inspektion bør først afsløre uregelmæssige runde til ovale kroppe, der antager en sfærisk form, efterhånden som tiden skrider frem^11,12.
    1. Når sfæroiddiameteren når 100-200 μm, skal du udføre lægemiddeleffektivitetseksperimenterne.
       BEMÆRK: Lægemiddeleffektivitetseksperimenterne udføres, når sfæroiderne når denne diameter, da størstedelen af cellerne på det tidspunkt formerer sig, hvilket er befordrende for evaluering af responsen på behandlingen. Sfæroider med større diameter indeholder en nekrotisk kerne og et hvilende lag^11,12, hvilket resulterer i en mindre andel af prolifererende celler, der reagerer på behandlingen.
13. Til sfærisk opsamling skal du bruge en 1.000 μL pipette til at opsamle sfæroider fra hver brønd og deponere dem i et 15 ml konisk rør.
    BEMÆRK: Sfæroider er i sagens natur skrøbelige og kræver skånsom håndtering. Når du overfører mediet med sfæroiderne til det koniske rør, skal du holde røret ved 45 ° og pipette langsomt på rørets væg. Sfæroider er synlige for øjet.
14. Det koniske rør centrifugeres ved 300 x g i 5 minutter ved stuetemperatur, og supernatanten suges forsigtigt og kasseres med en pipette.
15. Tilsæt 0,5 ml af cellekulturmediet, og resuspender pelleten godt, men forsigtigt. Undgå at lave bobler.
16. Udfør sfærisk tælling ved at følge nedenstående trin.
    1. Brug en plade med 96 brønde og tegn et plustegn på undersiden af en brønd for at opdele brønden i kvadranter (for at hjælpe med at spore tællingen).
    2. Tilsæt 50 μL af suspensionen til brønden, og tæl sfæroiderne manuelt under mikroskopet (ved hjælp af en 10x objektivlinse).
    3. Tæl sfæroiderne i hver kvadrant, pas på ikke at tælle to gange, og beregn det samlede antal sfæroider i brønden.
       BEMÆRK: For nøjagtigheden af tællingen tælles mindst 50 sfæroider i en brønd. Hvis der er mindre end 50 sfæroider, blandes suspensionen forsigtigt for at sikre homogen fordeling og tælles igen med et større volumen af suspensionen tilsat til et nyt hul. Alternativt, hvis der er mindre end 50 sfæroider i en brønd, kan sfæroiderne centrifugeres og resuspenderes forsigtigt i et volumen på <0,5 ml. Hvis der er over 100 sfæroider, tilsættes cellekulturmedium til sfæroidsuspensionen, blandes forsigtigt og fortælles.
    4. Beregn sfæroidekoncentrationen (sfæroidtal/tællevolumen [μL]), og beregn derefter det samlede antal sfæroider i suspensionen (sfærisk koncentration × totalvolumen).

2. Lægemiddeleffektivitetsanalyse (MTT-analyse)

BEMÆRK: For detaljer, se van Meerloo et ^al.13. Til MTT-analysen skal der også kun anvendes cellekulturmediet og ikke "3D-kulturmediet" (tilføjelse af kældermembranmatrixen er ikke nødvendig og kan potentielt forstyrre MTT-assayet).

1. I et nyt rør fremstilles en sfærisk suspension i en koncentration på 200 sfæroider pr. 200 μL cellekulturmedium (RPMI-1640 dyrkningsmedium suppleret med 10% FBS, 1:100 penicillin-streptomycin, 1% ikke-essentielle aminosyrer og 1% L-glutamin).
   1. For hver lægemiddelbehandling fremstilles et lager af sfæroider i et 15 ml rør. Beregn den nødvendige mængde for hvert lægemiddel med antallet af brønde, der er nødvendige for gentagelser: (5-8) × 200 μL. Tilsæt lægemidlet til røret til den endelige koncentration, der er nødvendig.
      BEMÆRK: Se afsnittet om repræsentative resultater vedrørende de lægemidler, der anvendes til denne undersøgelse og deres dosering. Også de kommercielle detaljer om stofferne er opført i materialetabellen.
2. 200 μL af den kugleformede suspension overføres til hullerne i en 96-brøndplade med ultralav fastgørelse, og pladen inkuberes ved 37 °C i en 5 % CO₂ befugtet inkubator. Brug ikke de eksterne rækker og kolonner på 96-brøndpladen til analysen, da disse brønde er kendetegnet ved øget fordampning, hvilket kan føre til øget variabilitet mellem gentagelsesforsøgene; Tilføj i stedet PBS til disse brønde.
   BEMÆRK: Det er nøglen, at kulturen af sfæroiderne er homogen, før kulturen aliquoteres ind i 96-brøndpladen. Desuden skal en kontrolbetingelse (dvs. ubehandlede sfæroider) inkluderes i hvert forsøg.
3. Efter inkubation af sfæroiderne med forsøgslægemidlet i 24-72 timer, centrifugeres pladen ved 300 x g i 5 minutter ved stuetemperatur, og 170 μL af cellekulturmediet fjernes, idet der efterlades 30 μL (som inkluderer sfæroiderne) i bunden af brønden.
   BEMÆRK: Fjernelsen af 170 μL cellekulturmedium skal udføres omhyggeligt for ikke at fjerne sfæroiderne. Hold pladen 45°, og anbring den ene hånd (iført en mørk handske som kontrast) under hullerne, så sfæroiderne er synlige (hvide prikker).
4. Forbered MTT-opløsningen (0,714 mg/ml i phenolfri RPMI, se materialetabellen).
5. Der tilsættes 70 μL MTT-opløsning til hvert hul til et slutvolumen på 100 μL pr. hul (den endelige MTT-koncentration i brønden vil være 0,05 mg pr. 100 μL). Derudover forberede "Blank" brønde med MTT-opløsning uden celler.
   BEMÆRK: MTT er lysfølsom. Derfor skal lyset i emhætten være slukket, og røret, der indeholder MTT-opløsningen, skal dækkes med aluminiumsfolie.
6. Pladen inkuberes ved 37 °C i en 5% CO₂ befugtet inkubator i 3-4 timer, indtil der observeres en ændring i opløsningens farve i brøndene (lilla farve repræsenterer levende celler).
7. Når der observeres en ændring, tilsættes 100 μL stopopløsning (0,1 N HCI isopropanol) til hvert hul, og forsigtigt blandes indholdet af hullerne uden at skabe bobler.
8. Pladens absorbans aflæses i en fluorometer-ELISA-læser (se materialetabellen) ved en bølgelængde på 570 nm og en baggrundsbølgelængde på 630-690 nM.
   BEMÆRK: Hvis den tilgængelige fluorometer-ELISA-læser ikke kan læse 96-brøndens plade med ultralav fastgørelse, overføres indholdet af hvert hul til en tilsvarende fladbundet plade med 96 brønde.
9. Beregn cellelevedygtigheden ved at følge nedenstående trin.
   1. For hver brønd beregnes det "specifikke signal" ("specifikt signal" = signalet ved 570 nm - signalet ved 630-690 nm). Beregn derefter gennemsnitsværdien af "Blank" -brøndene, og træk denne værdi fra hver brønd.
   2. Beregn gennemsnittet af de "specifikke signaler" i kontrolhullerne, der indeholder celler, der ikke blev behandlet med forsøgslægemidlet ("AV-SS-unt").
   3. Beregn levedygtigheden (procentdelen) af celler i hver brønd i forhold til brøndene med ubehandlede celler.
      BEMÆRK: Levedygtighed = (specifikt signal i hver brønd/"AV-SS-unt") × 100

3. Overvågning og analyse af de morfologiske ændringer i sfæroiderne

BEMÆRK: Hvad angår MTT-analysen, bør kun cellekulturmediet og ikke "3D-kulturmediet" anvendes i denne evaluering (tilføjelse af kældermembranmatrixen er ikke nødvendig og kan potentielt forstyrre analysen).

1. Efter tælling af sfæroider fortyndes suspensionen i cellekulturmedium (RPMI-1640 dyrkningsmedium suppleret med 10% FBS, 1:100 penicillin-streptomycin, 1% ikke-essentielle aminosyrer og 1% L-glutamin) til ca. 1-2 sfæroider pr. 20 μL.
2. Sæt 80 μL cellekulturmedium i hullerne på en 96-brøndplade med ultralav fastgørelse, og tilsæt derefter 20 μL af sfæroidsuspensionen til hullerne.
   BEMÆRK: Brøndene vil derfor indeholde 1-2 sfæroider i et volumen på 100 μL.
3. Kontroller omhyggeligt brøndene under mikroskopet, og markér brøndene, der indeholder en sfæroide, da de vil blive brugt til denne analyse.
4. Forbered forsøgslægemidlet i en koncentration, der er dobbelt så stor som koncentrationen af interesse. Tilsæt 100 μL af lægemiddelopløsningen til de relevante brønde (den samlede koncentration i brønden vil derefter være 1x).
5. Tag et billede af hvert hul på dag 0 (før du tilføjer forsøgslægemidlet), og brug "skala"-værktøjet i billedbehandlingssoftwaren (se materialetabellen) til at bestemme diametrene på sfæroiderne.
6. Pladen inkuberes ved 37 °C i en 5% CO₂ befugtet inkubator, og morfologien undersøges og diameteren af sfæroider (ved hjælp af "skala" -værktøjet) dagligt i 3-7 dage, afhængigt af hvornår lægemiddeleffekten observeres (f.eks. Cellespredning, invasive bælge, strukturødelæggelse osv.).
7. I slutningen af eksperimentet plottes ændringerne i sfæroiddiametre (i forhold til dag 0) over tid.
   BEMÆRK: Ændring (procent) = (sfærisk diameter på en bestemt dag / diameteren af den sfæroid på dag 0) × 100

Representative Results

Denne protokol præsenterer procedurer til generering af en homogen kultur af sfæroider fra primære tumorceller, kvantitativ evaluering af lægemiddeleffektivitet på sfærisk kultur (MTT-assay) og bestemmelse af effekten af studielægemidler på sfærisk morfologi. Data fra de repræsentative forsøg med sfæroider genereret fra tyktarms- og brystkræftcellekulturer præsenteres. Lignende forsøg blev udført under anvendelse af andre tumortyper, herunder cholangiocarcinom, mave-, lunge- og bugspytkirtelkræft (data ikke vist). Alle de eksperimenter, der præsenteres heri, blev udført i tre eksemplarer.

Figur 2 viser de sfæroider, der blev genereret fra den primære tyktarmskræftcellekultur. Som det ses i figur 2, afhænger antallet af genererede sfæroider af antallet af celler, der oprindeligt blev podet i hver brønd. Væksten af sfæroiderne til over 100 μm i diameter tog 10-14 dage. Tumorcellernes oprindelse (fx forskellige patienter og forskellige oprindelser) bestemte væksthastigheden. Såning af brøndene med flere celler forkortede ikke den tid, der kræves til sfærisk generering, men øgede snarere antallet af dannede sfæroider. Især ved langvarig dyrkning af tyktarmskræftsfæroider begyndte de at binde sig til hinanden og dannede klynger af sfæroider i druelignende strukturer (figur 3), hvilket forhindrede en homogen kultur og dermed forbød brugen af sfæroider i MTT-assays.

Figur 4 viser effekten af tre behandlinger (10 μM palbociclib, 10 μM sunitinib og deres kombination ved 10 μM hver) på levedygtigheden af sfæroider afledt af to primære kræftformer. I dette tilfælde blev der først etableret en PDX-model, og tumorcellerne, der blev anvendt til sfæroidanalysen, blev afledt af PDX-modellen⁹. Den første PDX-model blev etableret ved hjælp af en tyktarmskræftprøve fra en 50-årig mandlig patient, og den anden ved hjælp af en brystkræftprøve fra en 62-årig kvinde. Som påvist i figur 4A,B førte kombinationen af palbociclib og sunitinib efter 3 dages behandling til en signifikant reduktion i levedygtigheden målt ved MTT-assayet. Som påvist i figur 4C,D var de morfologiske ændringer, der forekom ved behandling, meget tydelige. På dag 0 var alle sfæroider intakte. I modsætning hertil var de sfæroider, der blev behandlet med kontrollen (DMSO), stadig intakte på dag 3, mens de sfæroider, der blev behandlet med kombinationen, blev adskilt, og deres morfologi var "åben", hvor celler løsrev sig fra den faste struktur, hvilket tyder på ødelæggelsen af sfæroidstrukturen.

Figur 5 viser opfølgningen af sfæroiderne over tid. Disse sfæroider, genereret fra brystkræftceller afledt af en 44-årig kvindelig patient, blev behandlet med en af to kombinationer (trastuzumab [10 μg / ml] plus vinorelbin [1 μg / ml] eller 5-fluorouracil [200 μM] plus cisplatin [300 μM]). Som vist i figur 5A blev størrelsen af sfæroider behandlet med 5-fluorouracil plus cisplatin reduceret på dag 3, og sfæroierne blev fuldstændig ødelagt på dag 7. I modsætning hertil havde behandlingen med trastuzumab plus vinorelbin kun en mindre effekt på sfæroidernes morfologi (f.eks. et vist niveau af en "åben" struktur), men effekten var ikke signifikant. Figur 5B viser den gennemsnitlige ændring i diameteren af sfæroider i forhold til dag 0 (fem sfæroider blev fulgt i hver behandlingsgruppe).

Figur 1: Oversigt over protokollen til etablering af 3D-sfæroider fra patientafledte tumorprøver og evaluering af deres følsomhed over for lægemidler. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2: Dannelse af sfæroider fra en primær tyktarmskræftcellekultur over tid ved antallet af oprindeligt podede celler. Forskellige antal celler blev podet i "3D-kulturmedium" i en ultra-lav vedhæftningsplade med 96 brønde og observeret under mikroskopet (4x forstørrelse). Skalabjælke = 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3: Sfæroider fra primære tyktarmskræftceller (med indledende cellesåning på 2.000 pr. Brønd) efter 12 dage i kultur. De to eksempler (A,B) viser klynger skabt ved fastgørelse af sfæroider til hinanden (10x forstørrelse). Skalabjælke = 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 4: Virkningerne af palbociclib (10 μM), sunitinib (10 μM) og deres kombination (10 μM hver) på sfæroider fra primære tumorceller, herunder tyktarms- og brystkræft (PDX-afledt). Et MTT-assay blev udført på sfæroider afledt af (A) tyktarms- og (B) brystkræftceller. MTT-signalerne blev normaliseret til værdier fra DMSO-behandlede celler. Værdierne repræsenterer middelværdierne fra fire til otte replikater. Fejlbjælkerne repræsenterer SEM. *p < 0,05 i forhold til en enkelt agent (t-test). Virkningerne af de forskellige behandlinger på cellevækst blev også evalueret mikroskopisk på dag 0 og efter 3 dages behandling af sfæroider afledt af (C) tyktarm og (D) brystkræftceller (10x forstørrelse). Skalabjælke = 100 μm. Figuren er tilpasset fra Moskovits et ^al.9. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 5: Virkningerne af trastuzumab (10 μg/ml) plus vinorelbin (1 μg/ml) og 5-fluorouracil (200 μM) plus cisplatin (300 μM) på sfæroider afledt af brystkræft over tid. (A) Hver brønd omfattede en sfærisk og blev overvåget over tid under mikroskop (10x forstørrelse). Skalabjælke = 100 μm. (B) Ændringen i diameteren af sfæroiderne (i forhold til dag 0) efter behandlingens varighed. *p = 0,05 for 5-fluorouracil plus cisplatin versus kontroller (T-test). Hver behandlingsgruppe omfattede fire til seks brønde, med en sfærisk i hver brønd. Den gennemsnitlige ændring præsenteres. Fejlbjælkerne repræsenterer SEM. Klik her for at se en større version af denne figur.

Discussion

Denne protokol beskriver en simpel metode til generering af 3D primære cellekulturer (sfæroider) afledt af humane tumorprøver. Disse sfæroider kan bruges til forskellige analyser, herunder evaluering af potentielle lægemiddelkandidater og lægemiddelkombinationer, identifikation af potentielle biomarkører eller terapeutiske mål og undersøgelse af mekanismerne for respons og resistens. Protokollen bruger enten primære tumorceller afledt direkte fra patientprøver eller tumorceller fra PDX-modeller, som kan etableres ved hjælp af patientprøver. Sidstnævnte fremgangsmåde giver mulighed for at udføre in vitro og in vivo eksperimenter med den samme primære tumor. Der er tidligere påvist konsistens i resultaterne af lægemiddelfølsomhedsforsøg mellem PDX-modeller og 3D-kulturer afledt af disse modeller⁹, hvilket understøtter relevansen af denne in vitro/in vivo-tilgang .

De vigtigste fordele ved den nuværende protokol inkluderer dens brede anvendelighed til de fleste solide tumorer og dens omkostningseffektivitet, som stammer fra dens kompatibilitet med de typiske kapaciteter / udstyr til kræftforskning / cellebiologilaboratorier (dvs. intet behov for specialudstyr eller outsourcing). Derudover genererer den nuværende protokol en homogen sfærisk population, som tillader anvendelse af kvantitative levedygtighedsassays med høj kapacitet (f.eks. MTT). Generering af en homogen sfærisk population er vigtig for at opnå meningsfulde resultater, da undersøgelser har vist, at sfæroidstørrelsen påvirker responsen på behandlingen. Større sfæroider, i modsætning til mindre sfæroider, er kendetegnet ved en nekrotisk kerne. Imidlertid er de fleste celler i det lineære vækststadium i mindre sfæroider. Desuden påvirker størrelsen af sfæroiden også stivheden af dens vævsstruktur, hvilket kan påvirke diffusionen af forbindelser (såsom dem, der anvendes til levedygtighedsanalyser) i sfæroiden¹⁴. Hovedbegrænsningen ved den nuværende protokol er, at selv med dens brede anvendelighed er der tilfælde, hvor tilgangen ikke genererer sfæroider. Det er vigtigt, at en sådan fiasko ikke er tumortypespecifik, men snarere patientspecifik. Yderligere undersøgelser er nødvendige for at undersøge, hvorfor tumorprøver fra visse patienter ikke danner sfæroider ved hjælp af denne protokol.

Den nuværende protokol er baseret på to nøgleprincipper: (1) at have en cellesuspension uden celleklynger (dvs. en enkeltcellesuspension) og (2) at bruge en ultralav fastgørelsesplade med et medium indeholdende 5% kældermembranmatrix (en opløselig ekstracellulær matrix). Det oprindelige antal frøede celler påvirker antallet af sfæroider, der dannes, men ikke den tid, der kræves til sfærisk dannelse, hvilket tyder på, at hver sfærisk genereres fra en enkelt tumorcelle. Især forekommer klyngedannelse af sfæroider, især efter langvarig inkubation. Denne klyngedannelse forstyrrer den homogene kultur og forbyder brugen af MTT (på grund af vanskeligheden ved at dispensere et lige antal sfæroider i hver brønd). Denne klyngedannelse kan undgås ved at fortynde kulturen og overføre sfæroiderne til større brønde. Hvis en homogen kultur ikke kan opnås, kan MTT-assays ikke anvendes, selvom den morfologiske vurdering og målingen af sfæroiddiametrene stadig kan udføres. Det skal bemærkes, at den morfologiske vurdering er mere arbejdskrævende, da den kræver tildeling af en sfærisk pr. Brønd og overvågning af hver sfærisk under mikroskopet.

Det er vigtigt for fortolkningen at bestemme det passende antal sfæroider til et MTT-assay. Det anbefales derfor først at generere en standardkurve med kendte antal sfæroider (f.eks. 50, 100, 200 og 400 pr. brønd i replikater) for at bestemme det optimale antal sfæroider til MTT-assayet. Midten af plotets lineære område skal bruges til analysen, så der er nok sfæroider til at detektere et signal, men ikke for mange (dvs. så signalets plateaufase ikke nås). Desuden giver brug af mellemområdet mulighed for at holde signalet inden for det lineære område i tilfælde af respons på lægemidlet (dvs. reduceret signal) såvel som ikke-respons (dvs. den fortsatte vækst af sfæroiden og øget signal). Endelig, da MTT-analysen vurderer cellemetabolisk aktivitet, som kan være forskellig mellem tumorer fra forskellige patienter, bør der genereres en standardkurve for hver primær tumorprøve.

Sammenfattende repræsenterer denne protokol til generering af 3D-tumorkulturmodeller fra primære kræftceller og evaluering af deres følsomhed over for lægemidler ved hjælp af et cellelevedygtighedsassay (MTT) og morfologisk undersøgelse under mikroskopet et værdifuldt, biologisk relevant værktøj, der supplerer de nuværende 2D in vitro-tilgange såvel som in vivo-tilgange.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 Fluorouracil	TEVA Israel	lot 16c22NA	Fluorouracil, Adrucil
Accutase	Gibco	A1110501	StemPro Accutase Cell Dissociation
Cisplatin	TEVA Israel	20B06LA	Abiplatin,
Cultrex	Trevigen	3632-010-02	Basement membrane matrix, type 3
DMSO (dimethyl sulfoxide)	Sigma Aldrich	D2650-100ML
Fetal bovine serum (FBS)	Thermo Fisher Scientific	2391595
Flurometer ELISA reader	Biotek	Synergy H1	Gen5 3.11
Hydrochloric acid (HCl)	Sigma Aldrich	320331	for stop solution
ImageJ	National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA	Version 1.52a	Open-source software ImageJ
Isopropanol	Gadot	P180008215	for stop solution
L-glutamine	Gibco	1843977
MTT	Sigma Aldrich	M5655-1G	3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide
Non-essential amino acids	Gibco	11140050
Palbociclib	Med Chem Express	CAS # 571190-30-2
PBS	Gibco	14190094	Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)*Without Calcium and Magnesium
Penicillin–streptomycin	Invitrogen	2119399
Phenol-free RPMI 1640	Biological industries, Israel	01-103-1A
Pippeting reservoir	Alexred	RED LTT012025
RPMI-1640 culture medium	Gibco	11530586
Sunitinib	Med Chem Express	CAS # 341031-54-7
Trastuzumab	F. Hoffmann - La Roche Ltd, Basel, Switherland	10172154 IL	Herceptin
Trypan blue 0.5% solution	Biological industries, Israel	03-102-1B
Ultra-low attachment 96 well plate	Greiner Bio-one	650970
Vinorelbine	Ebewe	11733027-03	Navelbine