Hasta Kaynaklı Tümör Örneklerinden 3 Boyutlu Sferoidlerin Oluşturulması ve İlaçlara Duyarlılıklarının Değerlendirilmesi

Summary

Bu protokol, primer kanser hücrelerinden 3D tümör kültürü modelleri oluşturmayı ve hücre canlılık testleri ve mikroskobik incelemeler kullanarak ilaçlara duyarlılıklarını değerlendirmeyi açıklamaktadır.

Abstract

Tümör biyolojisini anlamadaki kayda değer ilerlemelere rağmen, klinik çalışmalara giren onkoloji ilaç adaylarının büyük çoğunluğu, genellikle klinik etkinlik eksikliği nedeniyle başarısız olmaktadır. Bu yüksek başarısızlık oranı, mevcut preklinik modellerin, esas olarak tümör heterojenliğini ve tümör mikroçevresini yansıtmadaki yetersizlikleri nedeniyle klinik etkinliği tahmin edememelerini aydınlatmaktadır. Bu sınırlamalar, bireysel hastalardan elde edilen insan tümör örneklerinden oluşturulan 3 boyutlu (3D) kültür modelleri (sferoidler) ile ele alınabilir. Bu 3D kültürler, gerçek dünya biyolojisini, tümör heterojenliğini yansıtmayan yerleşik hücre çizgilerinden daha iyi temsil eder. Ayrıca, 3B kültürler 2 boyutlu (2B) kültür modellerinden (tek katmanlı yapılar) daha iyidir, çünkü hipoksi, nekroz ve hücre yapışması gibi tümör ortamının unsurlarını çoğaltırlar ve doğal hücre şeklini ve büyümesini korurlar. Bu çalışmada, 3D olan ve çok hücreli sferoidlerde büyüyen bireysel hastalardan kanser hücrelerinin primer kültürlerinin hazırlanması için bir yöntem geliştirilmiştir. Hücreler doğrudan hasta tümörlerinden veya hasta kaynaklı ksenogreftlerden türetilebilir. Yöntem, katı tümörlere (örneğin, kolon, meme ve akciğer) yaygın olarak uygulanabilir ve aynı zamanda özel ekipmanlara güvenmeden tipik bir kanser araştırması / hücre biyolojisi laboratuvarında tamamen gerçekleştirilebildiği için uygun maliyetlidir. Burada, primer kanser hücrelerinden 3D tümör kültürü modelleri (çok hücreli sferoidler) oluşturmak ve iki tamamlayıcı yaklaşım kullanarak ilaçlara duyarlılıklarını değerlendirmek için bir protokol sunulmuştur: bir hücre canlılık testi (MTT) ve mikroskobik incelemeler. Bu çok hücreli sferoidler, potansiyel ilaç adaylarını değerlendirmek, potansiyel biyobelirteçleri veya terapötik hedefleri tanımlamak ve yanıt ve direnç mekanizmalarını araştırmak için kullanılabilir.

Introduction

İn vitro ve in vivo çalışmalar, kanser tedavilerinin geliştirilmesinde tamamlayıcı yaklaşımları temsil etmektedir. İn vitro modeller çoğu deneysel değişkenin kontrolüne izin verir ve nicel analizleri kolaylaştırır. Genellikle düşük maliyetli tarama platformları olarak hizmet ederler ve mekanik çalışmalar için de kullanılabilirler¹. Bununla birlikte, biyolojik alaka düzeyleri doğal olarak sınırlıdır, çünkü bu tür modeller tümör mikroçevresini sadece kısmen yansıtır¹. Buna karşılık, hasta kaynaklı ksenogreftler (PDX) gibi in vivo modeller, tümör mikroçevresinin karmaşıklığını yakalar ve translasyonel çalışmalar ve hastalarda bireyselleştirici tedavi için daha uygundur (yani, bireysel bir hastadan türetilen bir modelde ilaçlara verilen yanıtı araştırmak)¹. Bununla birlikte, in vivo modeller, deneysel parametreler in vitro modeller kadar sıkı bir şekilde kontrol edilemediğinden ve gelişimleri zaman alıcı, emek yoğun ve maliyetli olduğundan ilaç taraması için yüksek verimli yaklaşımlara elverişli değildir ^1,2.

İn vitro modeller 100 yılı aşkın bir süredir mevcuttur ve hücre hatları 70 yılı aşkın bir süredir mevcuttur³. Bununla birlikte, son birkaç on yılda, solid tümörlerin mevcut in vitro modellerinin karmaşıklığı çarpıcı bir şekilde artmıştır. Bu karmaşıklık, tümör kaynaklı yerleşik hücre hatları veya birincil hücre hatları olan 2 boyutlu (2B) kültür modellerinden (tek katmanlı yapılar), 3 boyutlu (3B) modelleri içeren daha yeni yaklaşımlara kadar uzanır¹. 2B modellerde, kurulan ve birincil hücre çizgileri⁴ arasında önemli bir ayrım vardır. Kurulan hücre hatları ölümsüzleştirilir; Bu nedenle, aynı hücre hattı, tarihsel bir perspektiften bakıldığında, işbirliğini, veri birikimini ve birçok tedavi stratejisinin geliştirilmesini kolaylaştıran uzun yıllar boyunca küresel olarak kullanılabilir. Bununla birlikte, bu hücre hatlarındaki genetik anormallikler her geçişte birikir ve böylece biyolojik alaka düzeylerini tehlikeye atar. Ayrıca, mevcut hücre hatlarının sınırlı sayısı, ^4,5 hastalarında tümörlerin heterojenliğini yansıtmamaktadır. Primer kanser hücre hatları doğrudan biyopsiler, plevral efüzyonlar veya rezeksiyonlar yoluyla elde edilen rezeke tümör örneklerinden elde edilir. Bu nedenle, birincil kanser hücre hatları, tümör mikroçevresinin unsurlarını ve hücreler arası davranışlar (örneğin, sağlıklı ve kanserli hücreler arasındaki çapraz konuşma) ve kanser hücrelerinin kök benzeri fenotipleri gibi tümör özelliklerini korudukları için biyolojik olarak daha önemlidir. Bununla birlikte, birincil hücre hatlarının replikatif kapasitesi sınırlıdır, bu da dar bir kültür süresine yol açar ve analizler için kullanılabilecek tümör hücrelerinin sayısını sınırlar ^4,5.

3D kültürleri kullanan modeller, in vivo koşullar korunduğundan 2D kültür modellerinden biyolojik olarak daha önemlidir. Böylece, 3D kültür modelleri doğal hücre şeklini ve büyümesini korur ve hipoksi, nekroz ve hücre yapışması gibi tümör ortamının unsurlarını çoğaltır. Kanser araştırmalarında en yaygın kullanılan 3D modeller arasında çok hücreli sferoidler, iskele tabanlı yapılar ve matrise gömülü kültürler^bulunur 4,6,7.

Mevcut protokol, primer kanser hücrelerinden 3D tümör kültürü modelleri (çok hücreli sferoidler) üretmekte ve iki tamamlayıcı yaklaşım kullanarak ilaçlara duyarlılıklarını değerlendirmektedir: hücre canlılığı testi (MTT) ve mikroskobik incelemeler. Burada sunulan temsili sonuçlar meme ve kolon kanserinden; Bununla birlikte, bu protokol diğer katı tümör tiplerine (örneğin, kolanjiyokarsinom, gastrik, akciğer ve pankreas kanseri) yaygın olarak uygulanabilir ve aynı zamanda tipik bir kanser araştırması / hücre biyolojisi laboratuvarında özel ekipmana dayanmadan tamamen gerçekleştirilebildiği için uygun maliyetlidir. Bu yaklaşım kullanılarak üretilen çok hücreli sferoidler, potansiyel ilaç adaylarını değerlendirmek, potansiyel biyobelirteçleri veya terapötik hedefleri tanımlamak ve yanıt ve direnç mekanizmalarını araştırmak için kullanılabilir.

Bu protokol üç bölüme ayrılmıştır: (1) ilaç etkinliğini test etmek için bir model olarak kullanılmalarına hazırlık olarak sferoidlerin oluşturulması, toplanması ve sayılması; (2) Sferoidler üzerindeki ilaç etkinliğini değerlendirmek için MTT testi; ve (3) ilaç etkinliğinin değerlendirilmesinde başka bir yaklaşım olarak sferoidlerin ilaçlarla tedavisini takiben morfolojik değişikliklerin mikroskobik olarak değerlendirilmesi (Şekil 1).

Protocol

Primer tümör hücre kültürleri için kullanılan insan tümör örneklerinin toplanması, Rabin Tıp Merkezi'nde kurumsal inceleme kurulu (IRB) onaylı protokollere göre, hastalardan yazılı bilgilendirilmiş onam alınarak gerçekleştirildi. Çalışmaya katılmaya uygun hastalar arasında metastatik olmayan meme, kolon, karaciğer, akciğer, nöroendokrin, yumurtalık veya pankreas kanseri, herhangi bir pediatrik kanser veya herhangi bir metastatik kanseri olan erkek ve kadın yetişkin ve pediatrik kanser hastaları vardı. Tek dışlama kriteri, bilgilendirilmiş onam sağlama kapasitesinin olmamasıydı.

1. Sferoidlerin üretimi ve toplanması

NOT: Primer tümör hücrelerinin izolasyonu Kodak ve ^ark.8 tarafından tarif edildiği gibi gerçekleştirilebilir. Önemli olarak, sferoidleri üretmek için kullanılan primer tümör hücreleri, doğrudan biyopsi, rezeksiyon vb. ile elde edilen hasta örneklerinden veya Moskovits ve ^ark.9 tarafından tanımlandığı gibi, hasta kaynaklı ksenograft (PDX) modellerinden tümör örnekleri kullanılarak dolaylı olarak türetilebilir.

1. Tek hücreli yapışkan primer hücre kültürüne sahip küçük bir şişe (T25) alarak, hücre kültürü ortamını çıkararak, PBS ile yıkayarak ve daha sonra 37 ° C'de 3 dakika boyunca 1 mL 1x Accutase (bir hücre ayırma çözeltisi) ekleyerek ( Malzeme Tablosuna bakınız) %75-%100 birleşimli yapışkan primer tümör hücre kültürlerinin tek hücreli bir süspansiyonunu hazırlayın.
2. 5 mL hücre kültürü ortamı ekleyerek Accutase çözeltisini nötralize edin (% 10 FBS, 1:100 penisilin-streptomisin,% 1 esansiyel olmayan amino asitler ve% 1 L-glutamin ile desteklenmiş RPMI-1640 kültür ortamı; Malzeme Tablosuna bakınız).
3. Hücreleri 10 mL'lik bir serolojik pipetle aspire edin ve 15 mL'lik bir konik tüpte biriktirin. Tüpü 800 x g'de oda sıcaklığında 5 dakika boyunca santrifüj edin.
4. Hücre kültürü ortamını çıkarın, hücre peletinin üzerine 5 mL taze hücre kültürü ortamı ekleyin ve yavaşça karıştırın.
5. Canlı hücreleri bir hemositometre¹⁰ ile sayın. Bunu yapmak için, hücre süspansiyonunun 50 μL'lik bir alikotunu alın ve 50 μL tripan mavisi ile karıştırın. Canlı hücreleri (mavi renk için negatif olan hücreler) sayın ve süspansiyondaki toplam canlı hücre sayısını hesaplayın.
6. Bir "3D kültür ortamı" hazırlayın (% 5 bazal membran matrisi ile desteklenmiş bir hücre kültürü ortamı; Malzeme Tablosuna bakınız).
   NOT: "3D kültür ortamı" oda sıcaklığında sıvı gibidir. 37 ° C'de, tutarlılık daha jel benzeri hale gelir (böylece hücreler birlikte kalır), ancak yine de pipetlenebilir (sadece% 5 bazal membran matrisi içerdiğinden).
7. Tahlil için gereken hücre sayısını ve gereken toplam hacmi hesaplayın; her bir kuyucuk 200 μL ortamda 2.000-8.000 hücre içermelidir.
8. "3B kültür ortamının" 200 μL'sinde istenen sayıda hücreye (örneğin, 4.000 hücre) sahip bir hücre süspansiyonu hazırlayın ve homojen bir dağılım sağlamak için pipetle hafifçe karıştırın.
9. Süspansiyonu bir pipetleme haznesine aktarın. Çok kanallı bir pipet kullanarak, ultra düşük 96 delikli bir bağlantı plakasının her bir kuyucuğuna 200 μL hücre süspansiyonu ekleyin (bkz. Hücrelerin her toplanmasından önce, süspansiyonu iyice karıştırın.
10. Hücrelerin kümelenmesini zorlamak için plakayı oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj edin, böylece hücre agregasyonunu iyileştirin ve plakayı% 5 CO₂ nemlendirilmiş inkübatörde 37 ° C'de inkübe edin.
11. Her 2-3 günde bir, "3D kültür ortamını" yenileyin. Plakayı oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjleyin, ortamın %50'sini (100 μL) nazikçe çıkarın ve atın ve mevcut çözeltiyi değiştirmek için 100 μL taze "3D kültür ortamı" ekleyin. 1.11. adımı tekrarlayın ve plakayı 37 ° C, % 5 CO₂ nemlendirilmiş inkübatöre geri yerleştirin.
    NOT: Ortamın çıkarılması, plaka 45°'de tutulduğunda yapılmalı ve hücrelerin toplanmasını önlemek için ortam sadece üst kısımdan toplanmalıdır. Vakum emme sistemi kullanılmamalıdır. Taze ortam, oluşmaya başlamış olan sferoidleri bozmamak için yavaş ve nazikçe eklenmelidir.
12. Sferoid oluşumu izlemek için hücreleri her 1-2 günde bir mikroskop altında inceleyin. Görüntüleme yazılımındaki "ölçek" aracı kullanılarak oluşturulan kürelerin çapını ölçün ( Malzeme Tablosuna bakınız).
    NOT: Mikroskobik inceleme öncelikle zaman ilerledikçe küresel bir şekil alan düzensiz yuvarlak-oval cisimleri ortaya çıkarmalıdır^11,12.
    1. Küresel çap 100-200 μm'ye ulaştığında, ilaç etkinlik deneylerini gerçekleştirin.
       NOT: İlaç etkinliği deneyleri, sferoidler bu çapa ulaştığında gerçekleştirilir, çünkü o sırada hücrelerin çoğunluğu çoğalır, bu da tedaviye yanıtı değerlendirmeye elverişlidir. Daha büyük çaplı sferoidler nekrotik bir çekirdek ve sessiz bir tabaka^11,12 içerir^, bu da tedaviye yanıt veren çoğalan hücrelerin daha küçük bir oranı ile sonuçlanır.
13. Sferoid toplama için, her bir kuyucuktan küreleri toplamak için 1.000 μL'lik bir pipet kullanın ve bunları 15 mL'lik bir konik tüpe koyun.
    NOT: Sferoidler doğası gereği kırılgandır ve nazik kullanım gerektirir. Ortamı sferoidlerle birlikte konik tüpe aktarırken, tüpü 45 ° C'de tutun ve tüpün duvarında yavaşça pipet yapın. Sferoidler gözle görülebilir.
14. Konik tüpü oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj edin ve bir pipet kullanarak süpernatantı dikkatlice aspire edin ve atın.
15. Hücre kültürü ortamının 0.5 mL'sini ekleyin ve peleti iyi ama nazikçe yeniden askıya alın. Kabarcık yapmaktan kaçının.
16. Aşağıdaki adımları izleyerek küresel sayım gerçekleştirin.
    1. 96 delikli bir plaka kullanın ve kuyuyu kadranlara bölmek için kuyunun alt tarafına bir artı işareti çizin (sayımı izlemeye yardımcı olmak için).
    2. Kuyuya 50 μL süspansiyon ekleyin ve sferoidleri mikroskop altında manuel olarak sayın (10x objektif lens kullanarak).
    3. Her kadrandaki sferoidleri sayın, iki kez saymamaya dikkat edin ve kuyudaki toplam sferoid sayısını hesaplayın.
       NOT: Sayımın doğruluğu için, bir kuyuda en az 50 sferoid sayın. 50'den az sferoid varsa, homojen dağılımı sağlamak için süspansiyonu yavaşça karıştırın ve yeni bir kuyucuğa eklenen süspansiyonun daha büyük bir hacmini kullanarak tekrar sayın. Alternatif olarak, bir kuyuda 50'den az sferoid varsa, sferoidler santrifüj edilebilir ve <0,5 mL'lik bir hacimde yavaşça yeniden askıya alınabilir. 100'den fazla sferoid varsa, sferoid süspansiyona hücre kültürü ortamı ekleyin, yavaşça karıştırın ve anlatın.
    4. Küresel konsantrasyonu hesaplayın (küresel sayım/sayma hacmi [μL]) ve ardından süspansiyondaki toplam sferoid sayısını hesaplayın (küresel konsantrasyon × toplam hacim).

2. İlaç etkinliği testi (MTT testi)

NOT: Ayrıntılar için lütfen van Meerloo et ^al.13'e bakınız. Ayrıca, MTT testi için, "3D kültür ortamı" değil, yalnızca hücre kültürü ortamı kullanılmalıdır (bazal membran matrisinin eklenmesi gerekli değildir ve MTT testine potansiyel olarak müdahale edebilir).

1. Yeni bir tüpte, 200 μL hücre kültürü ortamı başına 200 sferoid konsantrasyonunda bir sferoid süspansiyonu hazırlayın (% 10 FBS, 1:100 penisilin-streptomisin,% 1 esansiyel olmayan amino asitler ve% 1 L-glutamin ile desteklenmiş RPMI-1640 kültür ortamı).
   1. Her ilaç tedavisi için, 15 mL'lik bir tüpte bir sferoid stoğu hazırlayın. Her ilaç için gereken miktarı, tekrarlar için gereken kuyucuk sayısına göre hesaplayın: (5-8) × 200 μL. İlacı, tüpe gereken son konsantrasyona ekleyin.
      NOT: Bu çalışmada kullanılan ilaçlar ve dozajları ile ilgili temsili sonuçlar bölümüne bakınız. Ayrıca, ilaçların ticari detayları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.
2. Küresel süspansiyonun 200 μL'sini ultra düşük bir bağlantı 96 delikli plakanın kuyucuklarına aktarın ve plakayı% 5 CO₂ nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 ° C'de inkübe edin. Tahlil için 96 delikli plakanın dış sıralarını ve sütunlarını kullanmayın, çünkü bu kuyucuklar, tekrarlanan deneyler arasında artan değişkenliğe yol açabilecek artan buharlaşma ile karakterize edilir; bunun yerine, bu kuyulara PBS ekleyin.
   NOT: Sferoidlerin kültürünün, kültür 96 delikli plakaya aktarılmadan önce homojen olması önemlidir. Ayrıca, her deneye bir kontrol koşulu (yani, işlenmemiş sferoidler) dahil edilmelidir.
3. Sferoidleri 24-72 saat boyunca çalışma ilacı ile inkübe ettikten sonra, plakayı oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj edin ve hücre kültürü ortamının 170 μL'sini yavaşça çıkarın, kuyunun dibinde 30 μL (sferoidleri içerir) bırakın.
   NOT: 170 μL hücre kültürü ortamının çıkarılması, sferoidlerin çıkarılmaması için dikkatli bir şekilde yapılmalıdır. Plakayı 45°'de tutun ve bir elinizi (kontrast için koyu renkli bir eldiven giyerek) kuyucukların altına yerleştirin, böylece sferoidler görünür hale gelir (beyaz noktalar).
4. MTT çözeltisini hazırlayın (fenol içermeyen RPMI'da 0.714 mg / mL, Malzeme Tablosuna bakınız).
5. Her bir kuyucuğa, kuyu başına 100 μL'lik son bir hacme 70 μL MTT çözeltisi ekleyin (kuyudaki son MTT konsantrasyonu, 100 μL başına 0.05 mg olacaktır). Ek olarak, hücresiz MTT çözeltisi ile "Boş" kuyular hazırlayın.
   NOT: MTT ışığa duyarlıdır. Bu nedenle, davlumbazdaki ışık kapatılmalı ve MTT çözeltisini içeren tüp alüminyum folyo ile kaplanmalıdır.
6. Kuyucuklardaki çözeltinin renginde bir değişiklik gözlenene kadar plakayı 37 ° C'de% 5 CO₂ nemlendirilmiş inkübatörde 3-4 saat boyunca inkübe edin (mor renk canlı hücreleri temsil eder).
7. Bir değişiklik gözlendiğinde, her bir kuyucuğa 100 μL durdurma çözeltisi (izopropanolde 0.1N HCl) ekleyin ve kabarcıklar oluşturmadan kuyucukların içeriğini hafifçe karıştırın.
8. Plakanın bir Florometre-ELISA okuyucusunda ( Malzeme Tablosuna bakınız) 570 nm dalga boyunda ve 630-690 nM arka plan dalga boyunda emilimini okuyun.
   NOT: Mevcut Florometre-ELISA okuyucu ultra düşük bağlantı 96 delikli plakayı okuyamıyorsa, her bir kuyucuğun içeriğini karşılık gelen düz tabanlı 96 delikli plakaya aktarın.
9. Aşağıdaki adımları izleyerek hücre canlılığını hesaplayın.
   1. Her kuyucuk için "spesifik sinyali" hesaplayın ("spesifik sinyal" = 570 nm'deki sinyal - 630-690 nm'deki sinyal). Ardından, "Boş" kuyuların ortalama değerini hesaplayın ve bu değeri her kuyudan çıkarın.
   2. Çalışma ilacı ("AV-SS-unt") ile tedavi edilmeyen hücreleri içeren kontrol kuyucuğundaki "spesifik sinyallerin" ortalamasını hesaplayın.
   3. Her bir kuyucuktaki hücrelerin canlılığını (yüzdesini) tedavi edilmemiş hücrelere sahip kuyucuklara göre hesaplayın.
      NOT: Canlılık = (her kuyucukta spesifik sinyal/"AV-SS-unt") × 100

3. Sferoidlerdeki morfolojik değişikliklerin izlenmesi ve analiz edilmesi

NOT: MTT testine gelince, bu değerlendirmede "3D kültür ortamı" değil, sadece hücre kültürü ortamı kullanılmalıdır (bazal membran matrisinin eklenmesi gerekli değildir ve analize potansiyel olarak müdahale edebilir).

1. Sferoidleri saydıktan sonra, hücre kültürü ortamındaki süspansiyonu (% 10 FBS, 1:100 penisilin-streptomisin,% 1 esansiyel olmayan amino asitler ve% 1 L-glutamin ile desteklenmiş RPMI-1640 kültür ortamı) 20 μL başına yaklaşık 1-2 sferoide seyreltin.
2. Ultra düşük bir bağlantı 96 delikli plakanın kuyucuklarına 80 μL hücre kültürü ortamı koyun ve ardından kuyucuklara 20 μL küresel süspansiyon ekleyin.
   NOT: Bu nedenle, kuyular 100 μL'lik bir hacimde 1-2 sferoid içerecektir.
3. Mikroskop altındaki kuyucukları dikkatlice kontrol edin ve bu analiz için kullanılacakları için bir küre içeren kuyucukları işaretleyin.
4. Çalışma ilacını, ilgi konsantrasyonunun iki katı olan bir konsantrasyonda hazırlayın. İlgili kuyucuklara 100 μL ilaç çözeltisi ekleyin (kuyudaki toplam konsantrasyon daha sonra 1x olacaktır).
5. 0. Günde (çalışma ilacını eklemeden önce) her bir kuyucuğun görüntüsünü yakalayın ve sferoidlerin çaplarını belirlemek için görüntüleme yazılımındaki "ölçek" aracını kullanın ( Malzeme Tablosuna bakın).
6. Plakayı% 5 CO₂ nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 ° C'de inkübe edin ve morfolojiyi inceleyin ve ilaç etkisinin ne zaman gözlemlendiğine bağlı olarak 3-7 gün boyunca günlük olarak sferoidlerin çapını ("ölçek" aracını kullanarak) ölçün (örneğin, hücre yayılımı, istilacı baklalar, yapı yıkımı, vb.).
7. Deneyin sonunda, zaman içinde küresel çaplardaki (0. Güne göre) değişiklikleri çizin.
   NOT: Değişim (yüzde) = (belirli bir gündeki küresel çap / 0. Gündeki kürenin çapı) × 100

Representative Results

Bu protokol, primer tümör hücrelerinden homojen bir sferoid kültürü oluşturmak, sferoid kültür (MTT testi) üzerindeki ilaç etkinliğini kantitatif olarak değerlendirmek ve çalışma ilaçlarının sferoid morfoloji üzerindeki etkisini belirlemek için prosedürler sunmaktadır. Kolon ve meme kanseri hücre kültürlerinden üretilen sferoidlerdeki temsili deneylerden elde edilen veriler sunulmuştur. Benzer deneyler, kolanjiyokarsinom, gastrik, akciğer ve pankreas kanseri dahil olmak üzere diğer tümör tipleri kullanılarak gerçekleştirildi (veriler gösterilmedi). Burada sunulan tüm deneyler üçlü olarak gerçekleştirilmiştir.

Şekil 2 , birincil kolon kanseri hücre kültüründen üretilen sferoidleri göstermektedir. Şekil 2'de görüldüğü gibi, üretilen sferoidlerin sayısı, başlangıçta her bir kuyucukta tohumlanan hücrelerin sayısına bağlıdır. Sferoidlerin çapı 100 μm'nin üzerine çıkması 10-14 gün sürdü. Tümör hücrelerinin kökeni (örneğin, farklı hastalar ve farklı kökenler) büyüme hızını belirledi. Kuyucukların daha fazla hücre ile tohumlanması, sferoid üretimi için gereken süreyi kısaltmamış, aksine oluşan sferoid sayısını arttırmıştır. Özellikle, kolon kanseri sferoidlerinin uzun süreli kültürü üzerine, birbirlerine yapışmaya başladılar ve üzüm benzeri yapılarda sferoid kümeleri oluşturdular (Şekil 3), bu da homojen bir kültürü engelledi ve böylece MTT tahlillerinde sferoidlerin kullanılmasını yasakladı.

Şekil 4, üç tedavinin (10 μM palbociclib, 10 μM sunitinib ve bunların her biri 10 μM'de kombinasyonları) iki primer kanserden türetilen sferoidlerin yaşayabilirliği üzerindeki etkisini göstermektedir. Bu durumda önce bir PDX modeli oluşturulmuş ve sferoid analiz için kullanılan tümör hücreleri PDX model^9'dan türetilmiştir. İlk PDX modeli, 50 yaşındaki bir erkek hastadan alınan kolon kanseri örneği kullanılarak ve ikincisi 62 yaşındaki bir kadından alınan meme kanseri örneği kullanılarak oluşturulmuştur. Şekil 4A, B'de gösterildiği gibi, 3 günlük tedaviden sonra, palbociclib artı sunitinib kombinasyonu, MTT testi ile ölçülen canlılıkta önemli bir azalmaya yol açmıştır. Şekil 4C,D'de gösterildiği gibi, tedavi ile ortaya çıkan morfolojik değişiklikler çok açıktı. 0. günde, tüm sferoidler sağlamdı. Buna karşılık, 3. Günde, kontrol (DMSO) ile tedavi edilen sferoidler hala sağlamdı, oysa kombinasyonla tedavi edilen sferoidler söküldü ve morfolojileri "açık" idi, hücreler katı yapıdan ayrılıyordu, bu da küresel yapının tahrip olduğunu gösteriyordu.

Şekil 5 , sferoidlerin zaman içindeki takibini göstermektedir. 44 yaşındaki bir kadın hastadan türetilen meme kanseri hücrelerinden üretilen bu sferoidler, iki kombinasyondan biriyle tedavi edildi (trastuzumab [10 μg / mL] artı vinorelbin [1 μg / mL] veya 5-fluorourasil [200 μM] artı sisplatin [300 μM]). Şekil 5A'da gösterildiği gibi, 5-florourasil artı sisplatin ile muamele edilen sferoidlerin boyutu 3. Güne kadar azaltıldı ve sferoidler 7. Güne kadar tamamen yok edildi. Buna karşılık, trastuzumab artı vinorelbin ile yapılan tedavi, sferoidlerin morfolojisi üzerinde sadece küçük bir etkiye sahipti (örneğin, bir miktar "açık" bir yapı), ancak etki anlamlı değildi. Şekil 5B , sferoidlerin çapındaki 0. Güne göre ortalama değişimi göstermektedir (her tedavi grubunda beş sferoid izlenmiştir).

Şekil 1: Hasta kaynaklı tümör örneklerinden 3D sferoidlerin oluşturulması ve ilaçlara duyarlılıklarının değerlendirilmesi için protokole genel bakış. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Başlangıçta tohumlanan hücrelerin sayısı ile zaman içinde birincil kolon kanseri hücre kültüründen sferoidlerin oluşumu. Farklı sayıda hücre, ultra düşük bir bağlantı 96 delikli plakada "3D kültür ortamında" tohumlandı ve mikroskop altında gözlendi (4x büyütme). Ölçek çubuğu = 100 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Kültürde 12 gün sonra birincil kolon kanseri hücrelerinden sferoidler (kuyu başına 2.000 ilk hücre tohumlamasıyla). İki örnek (A,B), sferoidlerin birbirine bağlanmasıyla oluşturulan kümeleri göstermektedir (10x büyütme). Ölçek çubuğu = 100 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Palbociclib (10 μM), sunitinib (10 μM) ve kombinasyonlarının (her biri 10 μM) kolon ve meme kanseri (PDX türevi) dahil olmak üzere primer tümör hücrelerinden sferoidler üzerindeki etkileri. (A) kolon ve (B) meme kanseri hücrelerinden türetilen sferoidler üzerinde bir MTT testi yapıldı. MTT sinyalleri, DMSO ile tedavi edilen hücrelerden gelen değerlere normalleştirildi. Değerler, dört ila sekiz çoğaltma arasındaki araçları temsil eder. Hata çubukları SEM'i temsil eder. *p < 0.05 ve tek bir aracı (t-testi). Çeşitli tedavilerin hücre büyümesi üzerindeki etkileri de 0. günde ve (C) kolon ve (D) meme kanseri hücrelerinden türetilen sferoidlerin 3 günlük tedavisinden sonra mikroskobik olarak değerlendirildi (10x büyütme). Ölçek çubuğu = 100 μm. Şekil Moskovits ve ^ark.9'dan uyarlanmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Trastuzumab (10 μg/mL) artı vinorelbin (1 μg/mL) ve 5-florourasil (200 μM) artı sisplatinin (300 μM) zamanla meme kanserinden türeyen sferoidler üzerindeki etkileri. (A) Her kuyucuk bir küre içeriyordu ve zaman içinde mikroskop altında izlendi (10x büyütme). Ölçek çubuğu = 100 μm. (B) Sferoidlerin çapının (0. Güne göre) tedavi süresine göre değişimi. *p = 5-florourasil artı sisplatin ve kontroller için 0.05 (t-testi). Her tedavi grubu, her bir kuyucukta bir küre bulunan dört ila altı kuyukuyu içeriyordu. Ortalama değişim sunulur. Hata çubukları SEM'i temsil eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

Mevcut protokol, insan tümör örneklerinden türetilen 3D birincil hücre kültürleri (sferoidler) üretmek için basit bir yöntemi açıklamaktadır. Bu sferoidler, potansiyel ilaç adaylarını ve ilaç kombinasyonlarını değerlendirmek, potansiyel biyobelirteçleri veya terapötik hedefleri tanımlamak ve yanıt ve direnç mekanizmalarını araştırmak da dahil olmak üzere çeşitli analizler için kullanılabilir. Protokol, doğrudan hasta örneklerinden türetilen primer tümör hücrelerini veya hasta örnekleri kullanılarak kurulabilen PDX modellerinden tümör hücrelerini kullanır. İkinci yaklaşım, aynı primer tümörle in vitro ve in vivo deneylerin yapılmasına izin verir. Tutarlılık daha önce PDX modelleri ile bu modellerden türetilen 3D kültürler arasındaki ilaç duyarlılığı deneylerinin sonuçlarında gösterilmiştir⁹, böylece bu in vitro / in vivo yaklaşımın uygunluğunu desteklemektedir.

Mevcut protokolün temel avantajları, çoğu katı tümöre geniş uygulanabilirliği ve kanser araştırması / hücre biyolojisi laboratuvarlarının tipik yetenekleri / ekipmanı ile uyumluluğundan kaynaklanan maliyet etkinliğini içerir (yani, özel ekipmana veya dış kaynak kullanımına gerek yoktur). Ek olarak, mevcut protokol, yüksek verimli nicel canlılık testlerinin (örneğin, MTT) kullanılmasına izin veren homojen bir küresel popülasyon oluşturur. Homojen bir sferoid popülasyon oluşturmak, anlamlı sonuçlar elde etmek için önemlidir, çünkü çalışmalar sferoid boyutun tedaviye yanıtı etkilediğini göstermiştir. Daha büyük sferoidler, daha küçük sferoidlerin aksine, nekrotik bir çekirdek ile karakterize edilir. Bununla birlikte, çoğu hücre daha küçük sferoidlerde doğrusal büyüme aşamasındadır. Ayrıca, sferoidin büyüklüğü aynı zamanda doku yapısının sertliğini de etkiler, bu da bileşiklerin (canlılık testleri için kullanılanlar gibi) sferoid^14'e difüzyonunu etkileyebilir. Mevcut protokolün ana sınırlaması, geniş uygulanabilirliği ile bile, yaklaşımın küre üretemediği durumlar olmasıdır. Önemli olarak, böyle bir başarısızlık tümör tipine özgü değil, hastaya özgüdür. Bazı hastalardan alınan tümör örneklerinin neden bu protokolü kullanarak sferoidler oluşturmadığını araştırmak için ek çalışmalara ihtiyaç vardır.

Mevcut protokol iki temel prensibe dayanmaktadır: (1) hücre kümeleri olmayan bir hücre süspansiyonuna sahip olmak (yani, tek hücreli bir süspansiyon) ve (2) % 5 bazal membran matrisi (çözünür bir hücre dışı matris) içeren bir ortama sahip ultra düşük bir bağlantı plakası kullanmak. Tohumlanan hücrelerin ilk sayısı, oluşan sferoidlerin sayısını etkiler, ancak sferoid oluşumu için gereken süreyi etkilemez, bu da her sferoidin tek bir tümör hücresinden üretildiğini gösterir. Özellikle, sferoidlerin kümelenmesi, özellikle uzun süreli inkübasyondan sonra meydana gelir. Bu kümeleme homojen kültürü bozar ve MTT kullanımını yasaklar (her bir kuyucuğa eşit sayıda sferoid dağıtmanın zorluğu nedeniyle). Bu kümelenme, kültürü seyrelterek ve sferoidleri daha büyük kuyucuklara aktararak önlenebilir. Homojen bir kültür elde edilemezse, MTT testleri kullanılamaz, ancak morfolojik değerlendirme ve küresel çapların ölçümü hala yapılabilir. Morfolojik değerlendirmenin daha emek yoğun olduğu belirtilmelidir, çünkü kuyu başına bir sferoidin tahsisini ve her sferoidin mikroskop altında izlenmesini gerektirir.

Bir MTT testi için uygun sferoid sayısının belirlenmesi, yorumlanması için önemlidir. Bu nedenle, MTT testi için en uygun sferoid sayısını belirlemek için önce bilinen sayıda sferoid (örneğin, kopyalarda kuyu başına 50, 100, 200 ve 400) ile standart bir eğri oluşturulması önerilir. Grafiğin doğrusal aralığının ortası analiz için kullanılmalıdır, böylece bir sinyali tespit etmek için yeterli küre vardır, ancak çok fazla değildir (yani, sinyalin plato fazına ulaşılmaması için). Ayrıca, orta aralığın kullanılması, ilaca yanıt (yani, azaltılmış sinyal) ve yanıt vermeme (yani, sferoidin sürekli büyümesi ve artan sinyal) durumlarında sinyalin doğrusal aralıkta tutulmasına izin verir. Son olarak, MTT testi, farklı hastalardan tümörler arasında farklı olabilecek hücre metabolik aktivitesini değerlendirdiğinden, her primer tümör örneği için standart bir eğri oluşturulmalıdır.

Özetle, primer kanser hücrelerinden 3D tümör kültürü modelleri oluşturmak ve mikroskop altında hücre canlılığı testi (MTT) ve morfolojik inceleme kullanarak ilaçlara duyarlılıklarını değerlendirmek için kullanılan bu protokol, mevcut 2D in vitro yaklaşımları ve in vivo yaklaşımları tamamlayan değerli, biyolojik olarak ilgili bir aracı temsil etmektedir.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 Fluorouracil	TEVA Israel	lot 16c22NA	Fluorouracil, Adrucil
Accutase	Gibco	A1110501	StemPro Accutase Cell Dissociation
Cisplatin	TEVA Israel	20B06LA	Abiplatin,
Cultrex	Trevigen	3632-010-02	Basement membrane matrix, type 3
DMSO (dimethyl sulfoxide)	Sigma Aldrich	D2650-100ML
Fetal bovine serum (FBS)	Thermo Fisher Scientific	2391595
Flurometer ELISA reader	Biotek	Synergy H1	Gen5 3.11
Hydrochloric acid (HCl)	Sigma Aldrich	320331	for stop solution
ImageJ	National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA	Version 1.52a	Open-source software ImageJ
Isopropanol	Gadot	P180008215	for stop solution
L-glutamine	Gibco	1843977
MTT	Sigma Aldrich	M5655-1G	3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide
Non-essential amino acids	Gibco	11140050
Palbociclib	Med Chem Express	CAS # 571190-30-2
PBS	Gibco	14190094	Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)*Without Calcium and Magnesium
Penicillin–streptomycin	Invitrogen	2119399
Phenol-free RPMI 1640	Biological industries, Israel	01-103-1A
Pippeting reservoir	Alexred	RED LTT012025
RPMI-1640 culture medium	Gibco	11530586
Sunitinib	Med Chem Express	CAS # 341031-54-7
Trastuzumab	F. Hoffmann - La Roche Ltd, Basel, Switherland	10172154 IL	Herceptin
Trypan blue 0.5% solution	Biological industries, Israel	03-102-1B
Ultra-low attachment 96 well plate	Greiner Bio-one	650970
Vinorelbine	Ebewe	11733027-03	Navelbine