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Cancer Research

रोगी-व्युत्पन्न ट्यूमर नमूनों से 3-आयामी स्फेरॉइड स्थापित करना और दवाओं के प्रति उनकी संवेदनशीलता का मूल्यांकन करना

Published: December 16, 2022 doi: 10.3791/64564
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 3, 1,2, 1,2, 1,2,4
1Felsenstein Medical Research Center, 2Davidoff Center, Rabin Medical Center, 3BioInsight Ltd., 4Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University

Summary

वर्तमान प्रोटोकॉल प्राथमिक कैंसर कोशिकाओं से 3 डी ट्यूमर कल्चर मॉडल उत्पन्न करने और सेल-व्यवहार्यता परख और सूक्ष्म परीक्षाओं का उपयोग करके दवाओं के प्रति उनकी संवेदनशीलता का मूल्यांकन करने का वर्णन करता है।

Abstract

ट्यूमर जीव विज्ञान को समझने में उल्लेखनीय प्रगति के बावजूद, नैदानिक परीक्षणों में प्रवेश करने वाले ऑन्कोलॉजी दवा उम्मीदवारों का विशाल बहुमत विफल हो जाता है, अक्सर नैदानिक प्रभावकारिता की कमी के कारण। यह उच्च विफलता दर नैदानिक प्रभावकारिता की भविष्यवाणी करने के लिए वर्तमान प्रीक्लिनिकल मॉडल की अक्षमता को उजागर करती है, मुख्य रूप से ट्यूमर विषमता और ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट को प्रतिबिंबित करने में उनकी अपर्याप्तता के कारण। इन सीमाओं को व्यक्तिगत रोगियों से प्राप्त मानव ट्यूमर के नमूनों से स्थापित 3-आयामी (3 डी) संस्कृति मॉडल (स्फेरॉइड) के साथ संबोधित किया जा सकता है। ये 3 डी संस्कृतियां स्थापित सेल लाइनों की तुलना में वास्तविक दुनिया के जीव विज्ञान का बेहतर प्रतिनिधित्व करती हैं जो ट्यूमर विषमता को प्रतिबिंबित नहीं करती हैं। इसके अलावा, 3 डी संस्कृतियां 2-आयामी (2 डी) संस्कृति मॉडल (मोनोलेयर संरचनाओं) से बेहतर हैं क्योंकि वे ट्यूमर पर्यावरण के तत्वों को दोहराते हैं, जैसे हाइपोक्सिया, नेक्रोसिस और सेल आसंजन, और प्राकृतिक कोशिका आकार और विकास को संरक्षित करते हैं। वर्तमान अध्ययन में, व्यक्तिगत रोगियों से कैंसर कोशिकाओं की प्राथमिक संस्कृतियों को तैयार करने के लिए एक विधि विकसित की गई थी जो 3 डी हैं और बहुकोशिकीय स्फेरॉइड में बढ़ते हैं। कोशिकाओं को सीधे रोगी ट्यूमर या रोगी-व्युत्पन्न जेनोग्राफ्ट्स से प्राप्त किया जा सकता है। विधि ठोस ट्यूमर (जैसे, बृहदान्त्र, स्तन और फेफड़े) के लिए व्यापक रूप से लागू होती है और लागत प्रभावी भी है, क्योंकि इसे विशेष उपकरणों पर भरोसा किए बिना एक विशिष्ट कैंसर अनुसंधान / सेल जीव विज्ञान प्रयोगशाला में अपनी संपूर्णता में किया जा सकता है। इसमें, प्राथमिक कैंसर कोशिकाओं से 3 डी ट्यूमर कल्चर मॉडल (बहुकोशिकीय स्फेरॉइड) उत्पन्न करने और दो पूरक दृष्टिकोणों का उपयोग करके दवाओं के प्रति उनकी संवेदनशीलता का मूल्यांकन करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है: एक सेल-व्यवहार्यता परख (एमटीटी) और सूक्ष्म परीक्षाएं। इन बहुकोशिकीय स्फेरॉइड का उपयोग संभावित दवा उम्मीदवारों का आकलन करने, संभावित बायोमाकर्स या चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान करने और प्रतिक्रिया और प्रतिरोध के तंत्र की जांच करने के लिए किया जा सकता है।

Introduction

इन विट्रो और विवो अध्ययनों में कैंसर उपचार विकसित करने के लिए पूरक दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करते हैं। इन विट्रो मॉडल अधिकांश प्रयोगात्मक चर के नियंत्रण की अनुमति देते हैं और मात्रात्मक विश्लेषण की सुविधा प्रदान करते हैं। वे अक्सर कम लागत वाले स्क्रीनिंग प्लेटफॉर्म के रूप में काम करते हैं और यांत्रिक अध्ययन के लिए भी इस्तेमाल किया जा सकताहै। हालांकि, उनकी जैविक प्रासंगिकता स्वाभाविक रूप से सीमित है, क्योंकि ऐसे मॉडल केवल आंशिक रूप से ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट1 को दर्शाते हैं। इसके विपरीत, विवो मॉडल में, जैसे कि रोगी-व्युत्पन्न जेनोग्राफ्ट्स (पीडीएक्स), ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट की जटिलता को पकड़ते हैं और ट्रांसलेशनल अध्ययन और रोगियों में व्यक्तिगत उपचार के लिए अधिक उपयुक्त होते हैं (यानी, एक व्यक्तिगत रोगी से प्राप्त मॉडल में दवाओं की प्रतिक्रिया की जांच करना)1। हालांकि, विवो मॉडल में दवा स्क्रीनिंग के लिए उच्च-थ्रूपुट दृष्टिकोण के लिए अनुकूल नहीं हैं, क्योंकि प्रयोगात्मक मापदंडों को इन विट्रो मॉडल के रूप में कसकर नियंत्रित नहीं किया जा सकता है और क्योंकि उनका विकास समय लेने वाला, श्रम गहन और महंगा 1,2 है।

इन विट्रो मॉडल 100 से अधिक वर्षों के लिए उपलब्ध हैं, और सेल लाइनें 70 से अधिक वर्षों से उपलब्धहैं। पिछले कई दशकों के दौरान, हालांकि, ठोस ट्यूमर के उपलब्ध इन विट्रो मॉडल की जटिलता नाटकीय रूप से बढ़ गई है। यह जटिलता 2-आयामी (2 डी) संस्कृति मॉडल (मोनोलेयर संरचनाएं) से होती है जो या तो ट्यूमर-व्युत्पन्न स्थापित सेल लाइनें या प्राथमिक सेल लाइनें हैं, जो 3-आयामी (3 डी) मॉडल 1 से जुड़े हाल के दृष्टिकोणहैं। 2 डी मॉडल के भीतर, एक महत्वपूर्ण अंतर स्थापित और प्राथमिक सेल लाइनों4 के बीच है। स्थापित सेल लाइनें अमर हो जाती हैं; इसलिए, एक ही सेल लाइन का उपयोग कई वर्षों में विश्व स्तर पर किया जा सकता है, जो ऐतिहासिक परिप्रेक्ष्य से, सहयोग, डेटा के संचय और कई उपचार रणनीतियों के विकास की सुविधा प्रदान करता है। हालांकि, इन सेल लाइनों में आनुवंशिक विचलन हर मार्ग के साथ जमा होते हैं, इस प्रकार उनकी जैविक प्रासंगिकता से समझौता करते हैं। इसके अलावा, उपलब्ध सेल लाइनों की सीमित संख्या रोगियों में ट्यूमर की विषमता को प्रतिबिंबित नहीं करती है 4,5। प्राथमिक कैंसर सेल लाइनें सीधे बायोप्सी, फुफ्फुस बहाव, या शोधन के माध्यम से प्राप्त ट्यूमर के नमूनों से प्राप्त होती हैं। इसलिए, प्राथमिक कैंसर सेल लाइनें जैविक रूप से अधिक प्रासंगिक हैं क्योंकि वे ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट और ट्यूमर विशेषताओं के तत्वों को संरक्षित करते हैं, जैसे कि अंतरकोशिकीय व्यवहार (जैसे, स्वस्थ और कैंसर कोशिकाओं के बीच क्रॉस-टॉक) और कैंसर कोशिकाओं के स्टेम जैसे फेनोटाइप। हालांकि, प्राथमिक सेल लाइनों की प्रतिकृति क्षमता सीमित है, जो एक संकीर्ण संस्कृति समय की ओर जाता है और ट्यूमर कोशिकाओं की संख्या को सीमित करता है जिनका उपयोग विश्लेषण के लिए किया जा सकता है 4,5।

3 डी संस्कृतियों का उपयोग करने वाले मॉडल 2 डी संस्कृति मॉडल की तुलना में अधिक जैविक रूप से प्रासंगिक हैं क्योंकि विवो स्थितियों को बरकरार रखा गया है। इस प्रकार, 3 डी संस्कृति मॉडल प्राकृतिक कोशिका आकार और विकास को संरक्षित करते हैं और ट्यूमर के वातावरण के तत्वों को दोहराते हैं, जैसे हाइपोक्सिया, नेक्रोसिस और सेल आसंजन। कैंसर अनुसंधान में सबसे अधिक इस्तेमाल किए जाने वाले 3 डी मॉडल में बहुकोशिकीय स्फेरॉइड, पाड़-आधारित संरचनाएं और मैट्रिक्स-एम्बेडेड संस्कृतियां 4,6,7 शामिल हैं।

वर्तमान प्रोटोकॉल प्राथमिक कैंसर कोशिकाओं से 3 डी ट्यूमर कल्चर मॉडल (बहुकोशिकीय स्फेरॉइड) उत्पन्न करता है और दो पूरक दृष्टिकोणों का उपयोग करके दवाओं के प्रति उनकी संवेदनशीलता का मूल्यांकन करता है: एक सेल-व्यवहार्यता परख (एमटीटी) और सूक्ष्म परीक्षाएं। यहां प्रस्तुत प्रतिनिधि परिणाम स्तन और बृहदान्त्र कैंसर से हैं; हालांकि, यह प्रोटोकॉल अन्य ठोस ट्यूमर प्रकारों (जैसे, कोलेंजियोकार्सिनोमा, गैस्ट्रिक, फेफड़े और अग्नाशय के कैंसर) पर व्यापक रूप से लागू होता है और लागत प्रभावी भी है, क्योंकि इसे विशेष उपकरणों पर भरोसा किए बिना एक विशिष्ट कैंसर अनुसंधान / सेल जीवविज्ञान प्रयोगशाला में अपनी संपूर्णता में किया जा सकता है। इस दृष्टिकोण का उपयोग करके उत्पन्न बहुकोशिकीय स्फेरॉइड का उपयोग संभावित दवा उम्मीदवारों का आकलन करने, संभावित बायोमाकर्स या चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान करने और प्रतिक्रिया और प्रतिरोध के तंत्र की जांच करने के लिए किया जा सकता है।

इस प्रोटोकॉल को तीन वर्गों में विभाजित किया गया है: (1) दवा प्रभावकारिता के परीक्षण के लिए एक मॉडल के रूप में उनके उपयोग की तैयारी में स्फेरॉइड की पीढ़ी, संग्रह और गिनती; (2) स्फेरॉइड पर दवा प्रभावकारिता का आकलन करने के लिए एमटीटी परख; और (3) दवा प्रभावकारिता के मूल्यांकन के लिए एक अन्य दृष्टिकोण के रूप में दवाओं के साथ स्फेरॉइड के उपचार के बाद रूपात्मक परिवर्तनों का सूक्ष्म मूल्यांकन (चित्रा 1)।

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Protocol

प्राथमिक ट्यूमर सेल संस्कृतियों के लिए उपयोग किए जाने वाले मानव ट्यूमर के नमूनों का संग्रह रोगियों से लिखित सूचित सहमति के साथ राबिन मेडिकल सेंटर में संस्थागत समीक्षा बोर्ड (आईआरबी) -अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार किया गया था। अध्ययन में भाग लेने के लिए पात्र रोगियों में गैर-मेटास्टैटिक स्तन, बृहदान्त्र, यकृत, फेफड़े, न्यूरोएंडोक्राइन, अंडाशय, या अग्नाशय के कैंसर, किसी भी बाल चिकित्सा कैंसर, या किसी भी मेटास्टैटिक कैंसर के साथ पुरुष और महिला वयस्क और बाल चिकित्सा कैंसर रोगी शामिल थे। एकमात्र बहिष्करण मानदंड सूचित सहमति प्रदान करने की क्षमता की कमी थी।

1. स्फेरॉइड का उत्पादन और संग्रह

नोट: प्राथमिक ट्यूमर कोशिकाओं का अलगाव कोडक एट अल.8 द्वारा वर्णित के रूप में किया जा सकता है। महत्वपूर्ण रूप से, स्फेरॉइड उत्पन्न करने के लिए उपयोग की जाने वाली प्राथमिक ट्यूमर कोशिकाओं को सीधे बायोप्सी, रिसेक्शन आदि द्वारा प्राप्त रोगी के नमूनों से प्राप्त किया जा सकता है, या अप्रत्यक्ष रूप से रोगी-व्युत्पन्न जेनोग्राफ्ट (पीडीएक्स) मॉडल से ट्यूमर के नमूनों का उपयोग करके, जैसा कि मोस्कोविट्स एट अल.9 द्वारा वर्णित है।

  1. एकल-सेल अनुयायी प्राथमिक सेल संस्कृति के साथ एक छोटा फ्लास्क (टी 25) लेकर, सेल कल्चर मीडिया को हटाकर, पीबीएस के साथ धोकर, और फिर 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए 1 एमएल 1 एक्स एक्यूटेस (एक सेल डिटेचमेंट समाधान) जोड़कर 75% -100% संगम के प्राथमिक ट्यूमर सेल संस्कृतियों का एकल-सेल निलंबन तैयार करें।
  2. सेल कल्चर माध्यम के 5 एमएल को जोड़कर एक्यूटेस समाधान को बेअसर करें (आरपीएमआई -1640 संस्कृति माध्यम 10% एफबीएस, 1: 100 पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन, 1% गैर-आवश्यक अमीनो एसिड, और 1% एल-ग्लूटामाइन के साथ पूरक; सामग्री की तालिका देखें)।
  3. कोशिकाओं को 10 एमएल सीरोलॉजिकल पिपेट के साथ एस्पिरेट करें, और उन्हें 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में जमा करें। कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 800 x g पर ट्यूब को सेंट्रीफ्यूज करें।
  4. सेल कल्चर माध्यम को हटा दें, सेल गोली के शीर्ष पर 5 एमएल ताजा सेल कल्चर माध्यम जोड़ें, और धीरे से मिलाएं।
  5. हेमोसाइटोमीटर10 के साथ व्यवहार्य कोशिकाओं की गणना करें। ऐसा करने के लिए, सेल सस्पेंशन के 50 μL का एक एलिकोट लें, और इसे ट्रिपैन ब्लू के 50 μL के साथ मिलाएं। जीवित कोशिकाओं (नीले रंग के लिए नकारात्मक कोशिकाओं) की गणना करें, और निलंबन में जीवित कोशिकाओं की कुल संख्या की गणना करें।
  6. एक "3 डी संस्कृति माध्यम" तैयार करें (5% तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के साथ पूरक एक सेल संस्कृति माध्यम; सामग्री की तालिका देखें)।
    नोट: "3 डी संस्कृति माध्यम" कमरे के तापमान पर तरल जैसा है। 37 डिग्री सेल्सियस पर, स्थिरता अधिक जेल जैसी हो जाती है (ताकि कोशिकाएं एक साथ रहें), हालांकि इसे अभी भी पाइप किया जा सकता है (क्योंकि इसमें केवल 5% तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स होता है)।
  7. परख के लिए आवश्यक कोशिकाओं की संख्या और आवश्यक कुल मात्रा की गणना करें; प्रत्येक कुएं में 200 μL माध्यम में 2,000-8,000 कोशिकाएं होनी चाहिए।
  8. "3 डी कल्चर माध्यम" के 200 μL में वांछित संख्या में कोशिकाओं (जैसे, 4,000 कोशिकाओं) के साथ एक सेल निलंबन तैयार करें और एक समरूप वितरण सुनिश्चित करने के लिए पिपेट के साथ धीरे से मिलाएं।
  9. निलंबन को पाइपिंग जलाशय में स्थानांतरित करें। मल्टी-चैनल पिपेट का उपयोग करके, अल्ट्रा-लो अटैचमेंट 96-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में सेल सस्पेंशन का 200 μL जोड़ें ( सामग्री की तालिका देखें)। कोशिकाओं के प्रत्येक संग्रह से पहले, निलंबन को अच्छी तरह से मिलाएं।
  10. कोशिकाओं के क्लस्टरिंग को लागू करने के लिए कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 300 x g पर प्लेट को सेंट्रीफ्यूज करें, जिससे सेल एकत्रीकरण में सुधार होता है, और प्लेट को 5% सीओ2 ह्यूमिडिफाइड इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट किया जाता है।
  11. हर 2-3 दिनों में, "3 डी संस्कृति माध्यम" को ताज़ा करें। कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 300 x g पर प्लेट को सेंट्रीफ्यूज करें, धीरे से माध्यम के 50% (100 μL) को हटा दें और छोड़ दें, और मौजूदा समाधान को बदलने के लिए ताजा "3 डी कल्चर माध्यम" का 100 μL जोड़ें। चरण 1.11 दोहराएं, और प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 ह्यूमिडिफाइड इनक्यूबेटर में वापस रखें।
    नोट: माध्यम को हटाने का प्रदर्शन तब किया जाना चाहिए जब प्लेट 45 ° पर रखी जाती है, और कोशिकाओं को इकट्ठा करने से बचने के लिए माध्यम को केवल ऊपरी भाग से एकत्र किया जाना चाहिए। वैक्यूम सक्शन सिस्टम का उपयोग नहीं किया जाना चाहिए। स्फेरॉइड को बाधित न करने के लिए ताजा माध्यम को धीरे-धीरे और धीरे से जोड़ने की आवश्यकता है, जो पहले से ही बनना शुरू हो जाएगा।
  12. स्फेरॉइड गठन की निगरानी के लिए हर 1-2 दिनों में माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं का निरीक्षण करें। इमेजिंग सॉफ्टवेयर में "स्केल" टूल का उपयोग करके गठित स्फेरॉइड के व्यास को मापें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    नोट: माइक्रोस्कोपिक निरीक्षण को पहले अनियमित गोल-से-अंडाकार निकायों को प्रकट करना चाहिए जो समयबढ़ने के साथ एक स्फेरॉइड आकार ग्रहण करते हैं।
    1. जब स्फेरॉइड व्यास 100-200 μm तक पहुंच जाता है, तो दवा प्रभावकारिता प्रयोग करें।
      नोट: दवा प्रभावकारिता प्रयोग तब किए जाते हैं जब स्फेरॉइड इस व्यास तक पहुंचते हैं, क्योंकि उस समय, अधिकांश कोशिकाएं बढ़ रही होती हैं, जो उपचार की प्रतिक्रिया का मूल्यांकन करने के लिए अनुकूल है। बड़े व्यास के स्फेरॉइड में एक नेक्रोटिक कोर और एक क्वीसेंट परत11,12 होती है, जिसके परिणामस्वरूप उपचार का जवाब देने वाली कोशिकाओं का एक छोटा अनुपात होता है।
  13. स्फेरॉइड संग्रह के लिए, प्रत्येक कुएं से स्फेरॉइड एकत्र करने के लिए 1,000 μL पिपेट का उपयोग करें, और उन्हें 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में जमा करें।
    नोट: स्फेरॉइड स्वाभाविक रूप से नाजुक होते हैं और कोमल हैंडलिंग की आवश्यकता होती है। शंक्वाकार ट्यूब में स्फेरॉइड के साथ माध्यम को स्थानांतरित करते समय, ट्यूब को 45 ° पर रखें, और ट्यूब की दीवार पर धीरे-धीरे पिपेट करें। स्फेरॉइड आंखों को दिखाई देते हैं।
  14. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए शंक्वाकार ट्यूब को 300 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें, और सावधानीपूर्वक एक पिपेट का उपयोग करके सुपरनैटेंट को छोड़ दें।
  15. सेल कल्चर माध्यम के 0.5 एमएल जोड़ें, और गोली को अच्छी तरह से लेकिन धीरे से फिर से निलंबित करें। बुलबुले बनाने से बचें।
  16. नीचे दिए गए चरणों का पालन करते हुए स्फेरॉइड गिनती करें।
    1. 96-वेल प्लेट का उपयोग करें और कुएं को क्वाड्रेंट्स में विभाजित करने के लिए कुएं के नीचे एक प्लस साइन बनाएं (गिनती को ट्रैक करने में मदद करने के लिए)।
    2. कुएं में निलंबन के 50 μL जोड़ें, और माइक्रोस्कोप के तहत मैन्युअल रूप से स्फेरॉइड की गणना करें (10x उद्देश्य लेंस का उपयोग करके)।
    3. प्रत्येक चतुर्थांश में स्फेरॉइड की गणना करें, सावधानी बरतें कि दोगुनी गिनती न करें, और कुएं में स्फेरॉइड की कुल संख्या की गणना करें।
      नोट: गिनती की सटीकता के लिए, एक कुएं में कम से कम 50 स्फेरॉइड की गणना करें। यदि 50 से कम स्फेरॉइड हैं, तो समरूप वितरण सुनिश्चित करने के लिए धीरे से निलंबन मिलाएं, और एक नए कुएं में जोड़े गए निलंबन की बड़ी मात्रा का उपयोग करके फिर से गिनते हैं। वैकल्पिक रूप से, यदि एक कुएं में 50 से कम स्फेरॉइड हैं, तो स्फेरॉइड को सेंट्रीफ्यूज किया जा सकता है और <0.5 एमएल की मात्रा में धीरे से फिर से निलंबित किया जा सकता है। यदि 100 से अधिक स्फेरॉइड हैं, तो स्फेरॉइड निलंबन में सेल कल्चर माध्यम जोड़ें, धीरे से मिलाएं, और फिर से गिनती करें।
    4. स्फेरॉइड एकाग्रता (स्फेरॉइड गिनती / गिनती मात्रा [μL]) की गणना करें, और फिर निलंबन में स्फेरॉइड की कुल संख्या की गणना करें (स्फेरॉइड एकाग्रता × कुल मात्रा)।

2. दवा प्रभावकारिता परख (एमटीटी परख)

नोट: विवरण के लिए, कृपया वैन मीरलू एट अल.13 देखें। इसके अलावा, एमटीटी परख के लिए, केवल सेल कल्चर माध्यम का उपयोग किया जाना चाहिए और "3 डी कल्चर माध्यम" का उपयोग नहीं किया जाना चाहिए (तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स को जोड़ना आवश्यक नहीं है और संभावित रूप से एमटीटी परख में हस्तक्षेप कर सकता है)।

  1. एक नई ट्यूब में, सेल कल्चर माध्यम के प्रति 200 μL में 200 स्फेरॉइड की एकाग्रता पर एक स्फेरॉइड निलंबन तैयार करें (RPMI-1640 संस्कृति माध्यम 10% FBS, 1: 100 पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन, 1% गैर-आवश्यक अमीनो एसिड और 1% एल-ग्लूटामाइन के साथ पूरक)।
    1. प्रत्येक दवा उपचार के लिए, 15 एमएल ट्यूब में स्फेरॉइड का एक स्टॉक तैयार करें। दोहराव के लिए आवश्यक कुओं की संख्या से प्रत्येक दवा के लिए आवश्यक मात्रा की गणना करें: (5-8) × 200 μL। आवश्यक अंतिम एकाग्रता के लिए ट्यूब में दवा जोड़ें।
      नोट: कृपया वर्तमान अध्ययन और उनकी खुराक के लिए उपयोग की जाने वाली दवाओं के बारे में प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग देखें। इसके अलावा, दवाओं के वाणिज्यिक विवरण सामग्री की तालिका में सूचीबद्ध हैं।
  2. एक अल्ट्रा-लो अटैचमेंट 96-वेल प्लेट के कुओं में स्फेरॉइड निलंबन के 200 μL को स्थानांतरित करें, और प्लेट को 5% CO2 ह्यूमिडिफाइड इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। परख के लिए 96-वेल प्लेट की बाहरी पंक्तियों और स्तंभों का उपयोग न करें, क्योंकि इन कुओं को वाष्पीकरण में वृद्धि की विशेषता है, जिससे दोहराए जाने वाले प्रयोगों के बीच परिवर्तनशीलता बढ़ सकती है; इसके बजाय, इन कुओं में पीबीएस जोड़ें।
    नोट: यह महत्वपूर्ण है कि संस्कृति को 96-वेल प्लेट में शामिल करने से पहले स्फेरॉइड की संस्कृति सजातीय है। इसके अलावा, एक नियंत्रण स्थिति (यानी, अनुपचारित स्फेरॉइड) को हर प्रयोग में शामिल किया जाना चाहिए।
  3. 24-72 घंटे के लिए अध्ययन दवा के साथ स्फेरॉइड को इनक्यूबेट करने के बाद, कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 300 x g पर प्लेट को सेंट्रीफ्यूज करें, और धीरे से सेल कल्चर माध्यम के 170 μL को हटा दें, कुएं के नीचे 30 μL (जिसमें स्फेरॉइड शामिल हैं) छोड़ दें।
    नोट: सेल कल्चर माध्यम के 170 μL को हटाने का काम सावधानी से किया जाना चाहिए, ताकि स्फेरॉइड को हटाया न जा सके। प्लेट को 45 ° पर पकड़ें, और एक हाथ (कंट्रास्ट के लिए एक गहरा दस्ताने पहने हुए) कुओं के नीचे रखें ताकि स्फेरॉइड दिखाई दें (सफेद बिंदु)।
  4. एमटीटी समाधान तैयार करें (फिनोल मुक्त आरपीएमआई में 0.714 मिलीग्राम / एमएल, सामग्री की तालिका देखें)।
  5. प्रत्येक कुएं में 70 μL MTT घोल को 100 μL प्रति कुएं की अंतिम मात्रा में जोड़ें (कुएं में अंतिम MTT एकाग्रता 0.05 मिलीग्राम प्रति 100 μL होगी)। इसके अलावा, कोशिकाओं के बिना एमटीटी समाधान के साथ "रिक्त" कुएं तैयार करें।
    नोट: एमटीटी प्रकाश-संवेदनशील है। इसलिए, हुड में प्रकाश बंद किया जाना चाहिए, और एमटीटी समाधान वाली ट्यूब को एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर किया जाना चाहिए।
  6. 3-4 घंटे के लिए 5% सीओ2 ह्यूमिडिफाइड इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेट को इनक्यूबेट करें जब तक कि कुओं में घोल के रंग में बदलाव न देखा जाए (बैंगनी रंग जीवित कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करता है)।
  7. जब कोई परिवर्तन देखा जाता है, तो प्रत्येक कुएं में स्टॉप सॉल्यूशन (आइसोप्रोपेनोल में 0.1 एन एचसीएल) का 100 μL जोड़ें, और बुलबुले बनाए बिना धीरे से कुओं की सामग्री को मिलाएं।
  8. फ्लोरोमीटर-एलिसा रीडर में प्लेट के अवशोषण को पढ़ें ( सामग्री की तालिका देखें) 570 एनएम की तरंग दैर्ध्य और 630-690 एनएम की पृष्ठभूमि तरंग दैर्ध्य पर।
    नोट: यदि उपलब्ध फ्लोरोमीटर-एलिसा रीडर अल्ट्रा-लो अटैचमेंट 96-वेल प्लेट को नहीं पढ़ सकता है, तो प्रत्येक कुएं की सामग्री को संबंधित फ्लैट-बॉटम 96-वेल प्लेट में स्थानांतरित करें।
  9. नीचे दिए गए चरणों का पालन करते हुए सेल व्यवहार्यता की गणना करें।
    1. प्रत्येक कुएं के लिए, "विशिष्ट संकेत" की गणना करें ("विशिष्ट संकेत" = 570 एनएम पर संकेत - 630-690 एनएम पर संकेत)। फिर, "रिक्त" कुओं के औसत मूल्य की गणना करें, और प्रत्येक कुएं से इस मान को घटाएं।
    2. नियंत्रण कुओं में "विशिष्ट संकेतों" के औसत की गणना करें जिनमें कोशिकाएं होती हैं जिन्हें अध्ययन दवा ("एवी-एसएस-यूंट") के साथ इलाज नहीं किया गया था।
    3. अनुपचारित कोशिकाओं वाले कुओं के सापेक्ष प्रत्येक कुएं में कोशिकाओं की व्यवहार्यता (प्रतिशत) की गणना करें।
      नोट: व्यवहार्यता = (प्रत्येक कुएं में विशिष्ट संकेत / "एवी-एसएस-यूंट") × 100

3. स्फेरॉइड में रूपात्मक परिवर्तनों की निगरानी और विश्लेषण

नोट: एमटीटी परख के लिए, इस मूल्यांकन में केवल सेल कल्चर माध्यम का उपयोग किया जाना चाहिए और "3 डी संस्कृति माध्यम" का उपयोग नहीं किया जाना चाहिए (तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स को जोड़ना आवश्यक नहीं है और संभावित रूप से विश्लेषण में हस्तक्षेप कर सकता है)।

  1. स्फेरॉइड की गिनती के बाद, सेल कल्चर माध्यम (आरपीएमआई -1640 कल्चर माध्यम के साथ पूरक आरपीएमआई -1640 कल्चर माध्यम) में निलंबन को पतला करें, जिसमें 10% एफबीएस, 1: 100 पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन, 1% गैर-आवश्यक अमीनो एसिड और 1% एल-ग्लूटामाइन शामिल हैं।
  2. एक अल्ट्रा-लो अटैचमेंट 96-वेल प्लेट के कुओं में 80 μL सेल कल्चर माध्यम डालें, और फिर कुओं में स्फेरॉइड सस्पेंशन के 20 μL जोड़ें।
    नोट: इसलिए, कुओं में 100 μL की मात्रा में 1-2 स्फेरॉइड होंगे।
  3. माइक्रोस्कोप के नीचे कुओं की सावधानीपूर्वक जांच करें, और उन कुओं को चिह्नित करें जिनमें एक स्फेरॉइड होता है, क्योंकि उनका उपयोग इस विश्लेषण के लिए किया जाएगा।
  4. अध्ययन दवा को एक एकाग्रता में तैयार करें जो रुचि की एकाग्रता का दोगुना है। संबंधित कुओं में दवा के घोल का 100 μL जोड़ें (कुएं में कुल एकाग्रता तब 1x होगी)।
  5. दिन 0 पर प्रत्येक कुएं की एक छवि कैप्चर करें (अध्ययन दवा जोड़ने से पहले) और स्फेरॉइड के व्यास को निर्धारित करने के लिए इमेजिंग सॉफ्टवेयर में "स्केल" टूल का उपयोग करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
  6. 5% सीओ2 ह्यूमिडिफाइड इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेट को इनक्यूबेट करें, और आकृति विज्ञान की जांच करें और 3-7 दिनों के लिए रोजाना स्फेरॉइड ("स्केल" टूल का उपयोग करके) के व्यास को मापें, यह इस बात पर निर्भर करता है कि दवा प्रभाव कब देखा जाता है (जैसे, सेल प्रसार, आक्रामक फली, संरचना विनाश, आदि)।
  7. प्रयोग के अंत में, समय के साथ स्फेरॉइड व्यास (दिन 0 के सापेक्ष) में परिवर्तन को प्लॉट करें।
    नोट: परिवर्तन (प्रतिशत) = (एक विशिष्ट दिन पर स्फेरॉइड व्यास / दिन 0 पर उस स्फेरॉइड का व्यास) × 100

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Representative Results

यह प्रोटोकॉल प्राथमिक ट्यूमर कोशिकाओं से स्फेरॉइड की एक समरूप संस्कृति उत्पन्न करने के लिए प्रक्रियाओं को प्रस्तुत करता है, मात्रात्मक रूप से स्फेरॉइड संस्कृति (एमटीटी परख) पर दवा प्रभावकारिता का मूल्यांकन करता है, और स्फेरॉइड आकृति विज्ञान पर अध्ययन दवाओं के प्रभाव का निर्धारण करता है। बृहदान्त्र और स्तन कैंसर कोशिका संस्कृतियों से उत्पन्न स्फेरॉइड में प्रतिनिधि प्रयोगों से डेटा प्रस्तुत किए जाते हैं। इसी तरह के प्रयोग अन्य ट्यूमर प्रकारों का उपयोग करके किए गए थे, जिनमें कोलेंजियोकार्सिनोमा, गैस्ट्रिक, फेफड़े और अग्नाशय के कैंसर (डेटा नहीं दिखाया गया है)। यहां प्रस्तुत सभी प्रयोग तीन प्रतियों में किए गए थे।

चित्रा 2 प्राथमिक बृहदान्त्र कैंसर कोशिका संस्कृति से उत्पन्न स्फेरॉइड को दर्शाता है। जैसा कि चित्र 2 में देखा गया है, उत्पन्न स्फेरॉइड की संख्या प्रत्येक कुएं में शुरू में बीज ति कोशिकाओं की संख्या पर निर्भर करती है। 100 μm व्यास से अधिक स्फेरॉइड की वृद्धि में 10-14 दिन लगे। ट्यूमर कोशिकाओं की उत्पत्ति (जैसे, विभिन्न रोगियों और विभिन्न उत्पत्ति) ने विकास दर निर्धारित की। अधिक कोशिकाओं के साथ कुओं को सीडिंग करने से स्फेरॉइड उत्पादन के लिए आवश्यक समय कम नहीं हुआ, बल्कि स्फेरॉइड की संख्या में वृद्धि हुई। विशेष रूप से, बृहदान्त्र कैंसर स्फेरॉइड की लंबी संस्कृति पर, उन्होंने एक-दूसरे से जुड़ना शुरू कर दिया और अंगूर जैसी संरचनाओं में स्फेरॉइड के समूहों का गठन किया (चित्रा 3), जिसने एक समरूप संस्कृति को रोका और इस प्रकार, एमटीटी परख में स्फेरॉइड के उपयोग पर प्रतिबंध लगा दिया।

चित्र 4 दो प्राथमिक कैंसर से प्राप्त स्फेरॉइड की व्यवहार्यता पर तीन उपचारों (10 μM palbociclib, 10 μM sunitinib, और प्रत्येक पर 10 μM पर उनके संयोजन) के प्रभाव को प्रस्तुत करता है। इस मामले में, एक पीडीएक्स मॉडल पहले स्थापित किया गया था, और स्फेरॉइड विश्लेषण के लिए उपयोग की जाने वाली ट्यूमर कोशिकाओं को पीडीएक्स मॉडल9 से प्राप्त किया गया था। पहला पीडीएक्स मॉडल 50 वर्षीय पुरुष रोगी से बृहदान्त्र कैंसर के नमूने का उपयोग करके स्थापित किया गया था, और दूसरा 62 वर्षीय महिला से स्तन कैंसर के नमूने का उपयोग करके स्थापित किया गया था। जैसा कि चित्रा 4 ए, बी में दिखाया गया है, उपचार के 3 दिनों के बाद, पल्बोकिलिब प्लस सुनिटिनिब के संयोजन से एमटीटी परख द्वारा मापी गई व्यवहार्यता में महत्वपूर्ण कमी आई। जैसा कि चित्रा 4 सी, डी में दिखाया गया है, उपचार के साथ होने वाले रूपात्मक परिवर्तन बहुत स्पष्ट थे। दिन 0 पर, सभी स्फेरॉइड बरकरार थे। इसके विपरीत, दिन 3 पर, नियंत्रण (डीएमएसओ) के साथ इलाज किए गए स्फेरॉइड अभी भी बरकरार थे, जबकि संयोजन के साथ इलाज किए गए स्फेरॉइड को अलग कर दिया गया था, और उनकी आकृति विज्ञान "खुला" था, जिसमें कोशिकाएं ठोस संरचना से अलग हो गई थीं, जो स्फेरॉइड संरचना के विनाश का सुझाव देती थीं।

चित्रा 5 समय के साथ स्फेरॉइड के अनुवर्ती को प्रस्तुत करता है। 44 वर्षीय महिला रोगी से प्राप्त स्तन कैंसर कोशिकाओं से उत्पन्न इन स्फेरॉइड का इलाज दो संयोजनों में से एक के साथ किया गया था (ट्रास्टुज़ुमाब [10 μg / mL] प्लस vinorelbine [1 μg / mL], या 5-फ्लूरोरैसिल [200 μM] प्लस सिस्प्लाटिन [300 μM])। जैसा कि चित्रा 5 ए में दिखाया गया है, 5-फ्लोरोरैसिल प्लस सिस्प्लाटिन के साथ इलाज किए गए स्फेरॉइड का आकार दिन 3 तक कम हो गया था, और स्फेरॉइड 7 वें दिन तक पूरी तरह से नष्ट हो गए थे। इसके विपरीत, ट्रास्टुज़ुमाब प्लस विनोरेलबिन के साथ उपचार का स्फेरॉइड की आकृति विज्ञान पर केवल मामूली प्रभाव पड़ा (उदाहरण के लिए, "खुली" संरचना का कुछ स्तर), लेकिन प्रभाव महत्वपूर्ण नहीं था। चित्रा 5 बी दिन 0 के सापेक्ष स्फेरॉइड के व्यास में औसत परिवर्तन प्रस्तुत करता है (प्रत्येक उपचार समूह में पांच स्फेरॉइड का पालन किया गया था)।

Figure 1
चित्रा 1: रोगी-व्युत्पन्न ट्यूमर नमूनों से 3 डी स्फेरॉइड स्थापित करने और दवाओं के प्रति उनकी संवेदनशीलता का मूल्यांकन करने के लिए प्रोटोकॉल का अवलोकन। कृपया इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: प्रारंभिक बीज कोशिकाओं की संख्या से समय के साथ एक प्राथमिक बृहदान्त्र कैंसर कोशिका संस्कृति से स्फेरॉइड का गठन। विभिन्न संख्या में कोशिकाओं को "3 डी कल्चर माध्यम" में एक अल्ट्रा-लो अटैचमेंट 96-वेल प्लेट में बीज दिया गया था और माइक्रोस्कोप (4x आवर्धन) के तहत देखा गया था। स्केल पट्टी = 100 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: संस्कृति में 12 दिनों के बाद प्राथमिक बृहदान्त्र कैंसर कोशिकाओं (2,000 प्रति अच्छी तरह से प्रारंभिक सेल सीडिंग के साथ) से स्फेरॉइड। दो उदाहरण (ए, बी) एक दूसरे से स्फेरॉइड के लगाव (10x आवर्धन) द्वारा बनाए गए समूहों को दिखाते हैं। स्केल पट्टी = 100 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: कोलन और स्तन कैंसर (पीडीएक्स-व्युत्पन्न) सहित प्राथमिक ट्यूमर कोशिकाओं से स्फेरॉइड पर पाल्बोकिलिब (10 μM), सुनिटिनिब (10 μM), और उनके संयोजन (प्रत्येक 10 μM) के प्रभाव। (ए) बृहदान्त्र और (बी) स्तन कैंसर कोशिकाओं से प्राप्त स्फेरॉइड पर एक एमटीटी परख आयोजित की गई थी। एमटीटी संकेतों को डीएमएसओ-उपचारित कोशिकाओं से मूल्यों के लिए सामान्यीकृत किया गया था। मान चार से आठ प्रतिकृतियों तक साधनों का प्रतिनिधित्व करते हैं। त्रुटि पट्टियाँ SEM. *p < 0.05 बनाम एकल एजेंट (t-test) का प्रतिनिधित्व करती हैं. सेल वृद्धि पर विभिन्न उपचारों के प्रभावों का मूल्यांकन दिन 0 पर और (सी) बृहदान्त्र और (डी) स्तन कैंसर कोशिकाओं (10x आवर्धन) से प्राप्त स्फेरॉइड के उपचार के 3 दिनों के बाद सूक्ष्म रूप से किया गया था। स्केल बार = 100 μm। यह आंकड़ा मोस्कोविट्स एट अल.9 से अनुकूलित है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्र 5: समय के साथ स्तन कैंसर से प्राप्त स्फेरॉइड पर ट्रास्टुज़ुमाब (10 μg / mL) प्लस vinorelbine (1μg / mL) और 5-फ्लूरोरैसिल (200 μM) प्लस सिस्प्लाटिन (300 μM) का प्रभाव। (ए) प्रत्येक कुएं में एक स्फेरॉइड शामिल था और माइक्रोस्कोप (10x आवर्धन) के तहत समय के साथ निगरानी की गई थी। स्केल बार = 100 μm. (B) उपचार की अवधि से स्फेरॉइड के व्यास में परिवर्तन (दिन 0 के सापेक्ष)। * 5-फ्लोरोरासिल प्लस सिस्प्लैटिन बनाम नियंत्रण (टी-टेस्ट) के लिए पी = 0.05। प्रत्येक उपचार समूह में चार से छह कुएं शामिल थे, जिनमें से प्रत्येक कुएं में एक स्फेरॉइड था। औसत परिवर्तन प्रस्तुत किया गया है। त्रुटि पट्टियाँ SEM का प्रतिनिधित्व करती हैं. कृपया इस आरेख का बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

वर्तमान प्रोटोकॉल मानव ट्यूमर के नमूनों से प्राप्त 3 डी प्राथमिक सेल संस्कृतियों (स्फेरॉइड) को उत्पन्न करने के लिए एक सरल विधि का वर्णन करता है। इन स्फेरॉइड का उपयोग विभिन्न विश्लेषणों के लिए किया जा सकता है, जिसमें संभावित दवा उम्मीदवारों और दवा संयोजनों का मूल्यांकन करना, संभावित बायोमाकर्स या चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान करना और प्रतिक्रिया और प्रतिरोध के तंत्र की जांच करना शामिल है। प्रोटोकॉल या तो रोगी के नमूनों से सीधे प्राप्त प्राथमिक ट्यूमर कोशिकाओं या पीडीएक्स मॉडल से ट्यूमर कोशिकाओं का उपयोग करता है, जिसे रोगी के नमूनों का उपयोग करके स्थापित किया जा सकता है। उत्तरार्द्ध दृष्टिकोण एक ही प्राथमिक ट्यूमर के साथ इन विट्रो और विवो प्रयोगों के संचालन की अनुमति देता है। इन मॉडलों 9 से प्राप्त पीडीएक्स मॉडल और 3 डी संस्कृतियों के बीच दवा संवेदनशीलता प्रयोगों के परिणामों में पहले स्थिरता दिखाई गई है, इस प्रकार इस इन विट्रो / इन विवो दृष्टिकोण की प्रासंगिकता का समर्थन कियागया है।

वर्तमान प्रोटोकॉल के मुख्य लाभों में अधिकांश ठोस ट्यूमर और इसकी लागत-प्रभावशीलता के लिए इसकी व्यापक प्रयोज्यता शामिल है, जो कैंसर अनुसंधान / सेल जीव विज्ञान प्रयोगशालाओं की विशिष्ट क्षमताओं / उपकरणों के साथ इसकी संगतता से उपजा है (यानी, विशेष उपकरण या आउटसोर्सिंग की कोई आवश्यकता नहीं है)। इसके अतिरिक्त, वर्तमान प्रोटोकॉल एक समरूप स्फेरॉइड आबादी उत्पन्न करता है, जो उच्च-थ्रूपुट मात्रात्मक व्यवहार्यता परख (जैसे, एमटीटी) के उपयोग की अनुमति देता है। सार्थक परिणाम प्राप्त करने के लिए एक समरूप स्फेरॉइड आबादी उत्पन्न करना महत्वपूर्ण है, क्योंकि अध्ययनों से पता चला है कि स्फेरॉइड आकार उपचार की प्रतिक्रिया को प्रभावित करता है। बड़े स्फेरॉइड, छोटे स्फेरॉइड के विपरीत, एक नेक्रोटिक कोर की विशेषता है। हालांकि, अधिकांश कोशिकाएं छोटे स्फेरॉइड में रैखिक विकास चरण में हैं। इसके अलावा, स्फेरॉइड का आकार इसकी ऊतक संरचना की कठोरता को भी प्रभावित करता है, जो स्फेरॉइड14 में यौगिकों (जैसे व्यवहार्यता परख के लिए उपयोग किए जाने वाले) के प्रसार को प्रभावित कर सकता है। वर्तमान प्रोटोकॉल की मुख्य सीमा यह है कि, इसकी व्यापक प्रयोज्यता के साथ भी, ऐसे उदाहरण हैं जब दृष्टिकोण स्फेरॉइड उत्पन्न करने में विफल रहता है। महत्वपूर्ण रूप से, ऐसी विफलता ट्यूमर-प्रकार विशिष्ट नहीं है, बल्कि रोगी-विशिष्ट है। यह पता लगाने के लिए अतिरिक्त अध्ययन की आवश्यकता है कि कुछ रोगियों के ट्यूमर के नमूने इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके स्फेरॉइड क्यों नहीं बनाते हैं।

वर्तमान प्रोटोकॉल दो प्रमुख सिद्धांतों पर आधारित है: (1) बिना सेल क्लस्टर (यानी, एक एकल-सेल निलंबन) के साथ एक सेल निलंबन होना और (2) 5% तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स (एक घुलनशील बाह्य मैट्रिक्स) वाले माध्यम के साथ अल्ट्रा-लो अटैचमेंट प्लेट का उपयोग करना। बीज वाली कोशिकाओं की प्रारंभिक संख्या स्फेरॉइड की संख्या को प्रभावित करती है जो बनते हैं लेकिन स्फेरॉइड गठन के लिए आवश्यक समय नहीं, यह सुझाव देते हुए कि प्रत्येक स्फेरॉइड एक ट्यूमर सेल से उत्पन्न होता है। विशेष रूप से, स्फेरॉइड का क्लस्टरिंग होता है, खासकर लंबे समय तक इनक्यूबेशन के बाद। यह क्लस्टरिंग समरूप संस्कृति को बाधित करता है और एमटीटी के उपयोग को प्रतिबंधित करता है (प्रत्येक कुएं में समान संख्या में स्फेरॉइड वितरित करने में कठिनाई के कारण)। संस्कृति को पतला करके और स्फेरॉइड को बड़े कुओं में स्थानांतरित करके इस क्लस्टरिंग से बचा जा सकता है। यदि एक समरूप संस्कृति प्राप्त नहीं की जा सकती है, तो एमटीटी परख का उपयोग नहीं किया जा सकता है, हालांकि रूपात्मक मूल्यांकन और स्फेरॉइड व्यास का माप अभी भी किया जा सकता है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि रूपात्मक मूल्यांकन अधिक श्रम-गहन है क्योंकि इसके लिए प्रति कुएं एक स्फेरॉइड के आवंटन और माइक्रोस्कोप के तहत प्रत्येक स्फेरॉइड की निगरानी की आवश्यकता होती है।

एमटीटी परख के लिए स्फेरॉइड की उचित संख्या निर्धारित करना इसकी व्याख्या के लिए महत्वपूर्ण है। इस प्रकार, एमटीटी परख के लिए स्फेरॉइड की इष्टतम संख्या निर्धारित करने के लिए पहले स्फेरॉइड की ज्ञात संख्या (जैसे, 50, 100, 200, और 400 प्रति कुएं, प्रतिकृति में) के साथ एक मानक वक्र उत्पन्न करने की सिफारिश की जाती है। प्लॉट की रैखिक सीमा के मध्य का उपयोग विश्लेषण के लिए किया जाना चाहिए ताकि सिग्नल का पता लगाने के लिए पर्याप्त स्फेरॉइड हों लेकिन बहुत अधिक न हों (यानी, ताकि सिग्नल के पठार चरण तक नहीं पहुंचा जा सके)। इसके अलावा, मध्य श्रेणी का उपयोग करने से दवा की प्रतिक्रिया (यानी, कम संकेत) के साथ-साथ गैर-प्रतिक्रिया (यानी, स्फेरॉइड की निरंतर वृद्धि और बढ़े हुए संकेत) के मामलों में रैखिक सीमा के भीतर सिग्नल रखने की अनुमति मिलती है। अंत में, चूंकि एमटीटी परख सेल चयापचय गतिविधि का आकलन करती है, जो विभिन्न रोगियों के ट्यूमर के बीच भिन्न हो सकती है, प्रत्येक प्राथमिक ट्यूमर नमूने के लिए एक मानक वक्र उत्पन्न किया जाना चाहिए।

सारांश में, प्राथमिक कैंसर कोशिकाओं से 3 डी ट्यूमर कल्चर मॉडल उत्पन्न करने और माइक्रोस्कोप के तहत सेल-व्यवहार्यता परख (एमटीटी) और आकृति विज्ञान परीक्षा का उपयोग करके दवाओं के प्रति उनकी संवेदनशीलता का मूल्यांकन करने के लिए यह प्रोटोकॉल एक मूल्यवान, जैविक रूप से प्रासंगिक उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है जो वर्तमान 2 डी इन विट्रो दृष्टिकोणों के साथ-साथ विवो दृष्टिकोणों का पूरक है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

कोई नहीं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5 Fluorouracil TEVA Israel lot 16c22NA Fluorouracil, Adrucil
Accutase Gibco A1110501 StemPro Accutase Cell Dissociation
Cisplatin TEVA Israel 20B06LA Abiplatin, 
Cultrex  Trevigen 3632-010-02 Basement membrane matrix, type 3
DMSO (dimethyl sulfoxide) Sigma Aldrich D2650-100ML
Fetal bovine serum (FBS) Thermo Fisher Scientific 2391595
Flurometer ELISA reader Biotek Synergy H1 Gen5 3.11
Hydrochloric acid (HCl)  Sigma Aldrich 320331 for stop solution
ImageJ National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA  Version 1.52a Open-source software ImageJ
Isopropanol Gadot P180008215 for stop solution
L-glutamine Gibco 1843977
MTT  Sigma Aldrich M5655-1G 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide
Non-essential amino acids  Gibco 11140050
Palbociclib   Med Chem Express CAS # 571190-30-2
PBS Gibco 14190094 Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)*Without Calcium and Magnesium
Penicillin–streptomycin  Invitrogen 2119399
Phenol-free RPMI 1640 Biological industries, Israel 01-103-1A
Pippeting reservoir Alexred RED LTT012025
RPMI-1640 culture medium  Gibco 11530586
Sunitinib Med Chem Express CAS # 341031-54-7
Trastuzumab F. Hoffmann - La Roche Ltd, Basel, Switherland 10172154 IL Herceptin
Trypan blue 0.5% solution Biological industries, Israel 03-102-1B
Ultra-low attachment 96 well plate Greiner Bio-one 650970
Vinorelbine Ebewe 11733027-03 Navelbine

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References

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Moskovits, N., Itzhaki, E., Tarasenko, N., Chausky, E., Bareket-Samish, A., Kaufman, A., Meerson, R., Stemmer, S. M. Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs. J. Vis. Exp. (190), e64564, doi:10.3791/64564 (2022).

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