Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Размножение вирусов и клеточная колориметрическая количественная оценка

Published: April 7, 2023 doi: 10.3791/64578
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1
1Tropical Infectious Diseases Research and Education Centre (TIDREC), Higher Institution Center of Excellence (HICoE), Universiti Malaya, 2Department of Medical Microbiology, Faculty of Medicine, Universiti Malaya

Summary

В настоящем протоколе описывается распространение вируса Зика (ZIKV) в клетках почек африканской зеленой мартышки Vero и количественная оценка ZIKV с использованием клеточных колориметрических методов иммунодетекции в 24-луночном и 96-луночном (высокопроизводительном) форматах.

Abstract

Вирус Зика (ZIKV) — это вирус, переносимый комарами, принадлежащий к роду Flavivirus. Инфекция ZIKV была связана с врожденными аномалиями головного мозга и, возможно, синдромом Гийена-Барре у взрослых. Исследования ZIKV для понимания механизмов заболевания важны для облегчения разработки вакцин и методов лечения. Метод количественной оценки вирусов является решающим и основополагающим в области вирусологии. Фокусообразующий анализ (FFA) - это количественный анализ вируса, который обнаруживает вирусный антиген с антителами и идентифицирует инфекционные очаги клеток с помощью метода иммуноокрашивания пероксидазой. В настоящем исследовании описывается протокол распространения вируса и количественного определения с использованием 24-луночного и 96-луночного форматов (с высокой пропускной способностью). По сравнению с другими подобными исследованиями, в этом протоколе дополнительно описана оптимизация размеров очагов, что может служить руководством для расширения использования этого анализа для других вирусов. Во-первых, размножение ZIKV производится в клетках Vero в течение 3 дней. Культуру надосадочной жидкости, содержащую ZIKV, собирают и количественно определяют с помощью FFA. Вкратце, культуру вируса инокулируют в клетки Vero и инкубируют в течение 2-3 дней. Образование очагов определяется после оптимизированных процессов окрашивания, включая фиксацию клеток, пермеабилизацию, блокировку, связывание антител и инкубацию с субстратом пероксидазы. Окрашенные вирусные очаги визуализируют с помощью стереомикроскопа (ручной подсчет в 24-луночном формате) или программного анализатора (автоматизированный подсчет в 96-луночном формате). FFA обеспечивает воспроизводимые, относительно быстрые результаты (3-4 дня) и подходит для использования для различных вирусов, включая вирусы, не образующие бляшек. Впоследствии этот протокол полезен для изучения инфекции ZIKV и может быть использован для обнаружения других клинически значимых вирусов.

Introduction

Инфекция, вызванная вирусом Зика (ZIKV), является новым вирусным заболеванием, переносимым комарами. Первая изоляция ZIKV была в Уганде в 1947 г. 1,2; С 1947 по 2007 год она оставалась без внимания, поскольку клинические симптомы чаще всего протекают бессимптомно и характеризуются самоизлечивающимся лихорадочным заболеванием. В 2007 г. эпидемия вируса Зика началась на островах Яп 3,4, за ней последовали более крупные эпидемии в регионах Тихого океана (Французская Полинезия, остров Пасхи, острова Кука и Новая Каледония) с 2013 по 2014 гг. 5,6,7,8, где впервые было зарегистрировано тяжелое неврологическое осложнение синдром Гийена-Барре (СГБ) у взрослых 9. В течение 2015 и 2016 гг. первая широкомасштабная эпидемия ZIKV охватила Северную и Южную Америку после появления азиатского генотипа ZIKV в Бразилии уже в 2013 г.10. Во время этой вспышки было зарегистрировано от 440 000 до 1,3 миллиона случаев микроцефалии и других неврологических расстройств у новорожденных. В настоящее время не существует специфического лекарства или лечения инфекции ZIKV; Таким образом, существует острая медицинская потребность в вакцинах ZIKV, способных предотвращать инфекции, особенно во время беременности.

Количественная оценка вирусов — это процесс определения количества вирусов, присутствующих в образце. Он играет важную роль в исследованиях, а академические лаборатории охватывают множество областей, таких как медицина и науки о жизни. Этот процесс также важен в коммерческих секторах, таких как производство вирусных вакцин, рекомбинантных белков, вирусных антигенов или противовирусных средств. Для количественного определения вируса можно использовать множество методов или анализов12. Выбор методов или анализов обычно зависит от характеристик вируса, желаемого уровня точности и характера эксперимента или исследования. В целом, методы количественной оценки вирусов можно разделить на две категории: молекулярные анализы, которые обнаруживают присутствие вирусных нуклеиновых кислот (ДНК или РНК), и анализы, которые измеряют инфекционность вируса in vitro12. Количественная полимеразная цепная реакция (кПЦР, для ДНК) или количественная полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (кОТ-ПЦР, для РНК)13 и цифровая капельная ПЦР14 являются примерами распространенных молекулярных методов, используемых для количественного определения вирусной нуклеиновой кислоты в данном образце15. Однако эти высокочувствительные молекулярные методы не позволяют дифференцировать жизнеспособные и нежизнеспособные вирусы15. Таким образом, исследования, требующие информации о биологических особенностях, таких как заразность вируса на клетках, не могут быть завершены с использованием вышеупомянутых молекулярных методов; Необходимы анализы, которые могут измерять и определять наличие жизнеспособных вирусов. Анализы, которые измеряют инфекционность вируса, включают бляшеобразующий анализ (PFA), 50% инфекционную дозу тканевой культуры (TCID50), флуоресцентный фокусный анализ и просвечивающую электронную микроскопию (ПЭМ)12.

PFA, разработанный Ренато Дульбекко в 1952 году, является одним из наиболее часто используемых методов титрования вирусов, в том числе для ZIKV16. Он используется для непосредственного определения вирусных концентраций для инфекционных литических вирионов. Метод основан на способности литического вируса продуцировать цитопатические эффекты (CPE; зоны клеточной гибели или бляшки, область инфекции, окруженная неинфицированными клетками) в монослое инокулированной клетки после вирусной инфекции. Однако у анализа есть несколько недостатков, которые влияют на его полезность. Анализ занимает много времени (занимает примерно 7-10 дней, в зависимости от вирусов), зависит от CPE и подвержен ошибкам. В настоящем исследовании мы сообщаем об иммуноколориметрическом методе, фокусообразующем анализе (FFA), для обнаружения и количественного определения ZIKV в форматах 24-луночных и 96-луночных планшетов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Распространение вирусов

  1. Подготовка клеток
    1. Выращивают клетки Vero в колбе для клеточной культуры 75см2 , содержащей 12 мл модифицированной среды Eagle's Medium (DMEM) Dulbecco с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 2 мМ L-глютамина (см. таблицу материалов). Инкубируют клетки в инкубаторе клеточных культур при температуре 37 °C с 5% CO2.
    2. Наблюдение за клетками под микроскопом; как только ячейки достигают 70%-90% слияния, они готовы к использованию (рис. 1A).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки Vero удваиваются примерно каждые 24 часа17 минут. Для разведения 1:10 требуется от 3 до 4 дней, чтобы достичь 80%-90% слияния в колбе диаметром 75см2 . Следите за клетками ежедневно или через день.
  2. Инфицирование клеточного монослоя
    1. Извлеките питательную среду из колбы с клеточной культурой с помощью серологической пипетки объемом 10 мл. Промойте колбу 3 мл фосфатно-солевого буфера (dPBS) Dulbecco 2 раза с помощью серологической пипетки объемом 5 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Стакан с 10% гипохлоритом натрия должен быть подготовлен для дезинфекции любых выброшенных инфекционных жидких отходов из колб / тарелок.
    2. Добавьте 2 мл безсывороточного DMEM (DMEM с добавлением 2 мМ L-глютамина без FBS) и 20 мкл инокулята ZIKV в колбу для клеточной культуры. Инкубируйте колбу при легком покачивании в течение 1 ч при комнатной температуре, чтобы обеспечить адсорбцию вируса.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Титрование исходного материала ZIKV будет полезно для определения объема добавки инокулята ZIKV (шаг 2).
      ВНИМАНИЕ: ZIKV классифицируется как патоген 2-го уровня биобезопасности (BSL-2). Все процедуры с материалами, содержащими ZIKV, должны проводиться в сертифицированном кабинете биобезопасности и следовать всем лабораторным стандартным операционным процедурам (СОП) с использованием соответствующих средств индивидуальной защиты.
  3. Добавление оверлейного носителя
    1. После 1 ч инкубации извлеките и выбросьте разбавленный вирусный посевной материал с помощью серологической пипетки объемом 5 мл. Промойте колбу с клеточной культурой 3 мл dPBS 2x.
    2. Добавьте 12 мл поддерживающей среды (DMEM с добавлением 2% FBS, 2 мМ L-глютамина и 100 Ед/мл пенициллина-стрептомицина) в колбу с клеточной культурой для поддержания инфицированных клеток.
    3. Инкубируют инфицированные клетки Vero в течение 3 дней в инкубаторе клеточных культур при температуре 37 °C с 5% CO2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ежедневно отслеживайте CPE инфицированных клеток Vero под микроскопом.
  4. Забор надосадочной жидкости клеточных культур, содержащей ZIKV
    1. На 3-й день после заражения может наблюдаться округление и отслоение клеток (CPE) (рис. 1B-D). Соберите надосадочную жидкость клеточной культуры, содержащую ZIKV, в центрифужную пробирку объемом 50 мл с помощью серологической пипетки объемом 10 мл.
    2. Используйте шприцевой фильтр из полиэфирсульфона 0,22 мкм (см. Таблицу материалов) для фильтрации надосадочной жидкости клеточной культуры. Аликвоту 500 мкл отфильтрованной надосадочной жидкости клеточной культуры в пробирки с завинчивающейся крышкой по 2,0 мл и хранят при -80 °C до дальнейшего использования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Собранный ZIKV можно хранить при температуре -80 °C для длительного хранения.
      ВНИМАНИЕ: При использовании иглы шприца необходимо принять дополнительные меры предосторожности, так как игла может проколоть кожу. Необходимо разработать лабораторные СОП.

2. Количественная оценка вируса

  1. Подготовка клеток
    1. Высевают клетки Vero в специальные планшеты (24-луночный планшет: 0,5 мл/лунка, 7,5 x 104 клеток/лунка; 96-луночный планшет: 0,1 мл/лунка, 1,5 x 104 клеток/лунка) и инкубируют планшет в течение ночи в инкубаторе клеточных культур при 37 °C с 5% CO2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Существует пять различных временных точек для тестирования (24-луночный планшет: 48 ч, 60 ч, 72 ч, 84 ч и 96 ч после заражения; 96-луночный планшет: 24 ч, 36 ч, 48 ч, 60 ч и 72 ч после заражения); Поэтому подготовьте по одной тарелке для каждого момента времени.
    2. После 24-часовой инкубации и после того, как клетки достигнут 70%-90% слияния (рис. 1E), планшет готов к заражению. Приступают к приготовлению разбавленного запаса вируса (шаг 2.2) до заражения клеточного монослоя.
  2. Разбавление вируса
    1. Для 24- и 96-луночных планшетов подготовьте шесть стерильных пробирок микроцентрифуг по 1,5 мл для каждой чашки для проведения десятикратного разведения (от 10-1 до 10-5), включая отрицательный контроль. Для установки эксперимента с 24-луночным планшетом добавьте 450 мкл безсывороточного DMEM во все шесть пробирок с микроцентрифугой. Для установки эксперимента с 96-луночным планшетом добавьте 135 мкл безсывороточного DMEM в шесть пробирок.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перед выполнением десятикратного последовательного разведения четко промаркируйте каждую пробирку, чтобы указать разбавление ее содержимого.
    2. Для выполнения серийного разведения в 24-луночном эксперименте добавьте 50 мкл материала ZIKV, полученного на стадии 1, в пробирку 10-1 , содержащую 450 мкл безсывороточного DMEM. Для установки эксперимента с 96-луночным планшетом добавьте 15 мкл материала ZIKV в пробирку 10-1 , содержащую 135 мкл безсывороточного DMEM.
    3. Вмешайте каждую пробирку, чтобы смешать вирус и среду. Это первое десятикратное разведение.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для обеспечения точного серийного разведения необходимо правильное смешивание вируса и питательной среды в каждой пробирке для разведения.
    4. Для установки эксперимента с 24-луночным планшетом используйте свежий наконечник пипетки, чтобы ресуспендировать пробирку 10-1 и перенести 50 мкл разбавленного ZIKV в пробирку 10-2 в качестве второго десятикратного разведения. Для установки эксперимента с 96-луночным планшетом используйте свежий наконечник пипетки, чтобы ресуспендировать пробирку 10-1 и перенести 15 мкл разбавленного ZIKV в пробирку 10-2 в качестве второго десятикратного разведения.
    5. Повторите шаг 2.2.4 четыре раза до пятой пробирки (исключая отрицательный контроль).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте свежий наконечник пипетки после каждого этапа пипетирования, чтобы избежать перекрестного загрязнения.
  3. Инфицирование клеточного монослоя
    1. Удалите и выбросьте кондиционированную среду из каждой лунки (24-луночная пластина: 0,5 мл/лунка; 96-луночная пластина: 0,1 мл/лунка).
    2. Промойте каждую лунку dPBS 2x (24-луночная пластина: 300 мкл/лунка; 96-луночная пластина: 60 мкл/лунка).
    3. Работая от самого высокого к самому низкому разведению, добавьте каждый последовательно разбавленный вирусный посевной материал в лунку (24-луночная пластина: 200 мкл/лунка; 96-луночная пластина: 40 мкл/лунка).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Заражение каждого разведения будет производиться в дублированных лунках. Поддерживайте две незараженные лунки в качестве отрицательного контроля. Четко обозначьте пластину и лунки, чтобы избежать путаницы. Меняйте наконечники дозаторов после каждого этапа пипетирования, чтобы предотвратить перекрестное загрязнение.
    4. Инкубируйте планшет с легким покачиванием в течение 1 часа при комнатной температуре, чтобы обеспечить адсорбцию вируса.
  4. Добавление оверлейной клеточной питательной среды
    1. Через 1 ч инкубации удалить и утилизировать вирусную суспензию от самой низкой концентрации до самой высокой.
    2. Промыть инфицированные клетки dPBS 2x (24-луночная пластина: 300 мкл/лунка; 96-луночная пластина: 60 мкл/лунка).
    3. Наложите на лунку DMEM (с добавлением 2% FBS, 2 мМ L-глютамина и 100 Ед/мл пенициллина-стрептомицина) и 1,5% карбоксиметилцеллюлозы низкой вязкости (CMC; см. таблицу материалов) (24-луночная прокладка: 1 мл/лунка; 96-луночная пластина: 0,2 мл/лунка).
    4. Инкубируют планшет в инкубаторе клеточных культур при температуре 37 °C с 5% CO2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не тревожите планшет в течение этого инкубационного периода.
    5. Выньте планшет из инкубатора клеточных культур для окрашивания в разные моменты времени (24-луночный планшет: 48 ч, 60 ч, 72 ч, 84 ч и 96 ч после заражения; 96-луночный планшет: 24 ч, 36 ч, 48 ч, 60 ч и 72 ч после заражения).

3. Окрашивание

  1. Фиксация клеток
    1. По истечении определенных часов инкубации (24-луночная пластина: 48 ч, 60 ч, 72 ч, 84 ч и 96 ч после заражения; 96-луночная пластина: 24 ч, 36 ч, 48 ч, 60 ч и 72 ч после заражения) удалите и выбросьте оверлейную среду и промойте клетки 3 раза с помощью 1x PBS. Для 96-луночного планшета извлеките и выбросьте оверлейную среду и промойте ячейки 3 раза 60 мкл/лунку 1 PBS с помощью многоканальной пипетки.
    2. Добавьте 4% параформальдегида для фиксации клеток (24-луночная пластина: 300 мкл/лунка; 96-луночная пластина: 60 мкл/лунка). Инкубируйте пластину при комнатной температуре в течение 20 мин.
      ВНИМАНИЕ: Параформальдегид представляет собой твердый полимеризованный формальдегид. Это легковоспламеняющийся, твердый, белый кристаллический порошок, который выделяет газообразный формальдегид при смешивании с водой или нагревании. Все процедуры, связанные с использованием параформальдегида, должны проводиться в сертифицированных химических вытяжных шкафах или утвержденных отработанных шкафах в соответствии с лабораторными СОП, специфичными для формальдегидсодержащих химических веществ.
    3. Через 20 минут выбросьте параформальдегид и промойте клетки 3 раза 1 PBS. Выполните пермеабилизацию, блокировку и инкубацию антител, выполнив шаги 3.2-3.5.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При утилизации 4% параформальдегида следуйте процедуре утилизации отходов, принятой в университете или институте.
  2. Проницаемость клеток
    1. Добавьте 1% октилфеноксиполи(этиленокси)этанола (см. таблицу материалов) для пермеабилизации клеток (24-луночная пластина: 200 мкл/лунка; 96-луночная пластина: 40 мкл/лунка). Инкубируйте планшет при комнатной температуре в течение 15 мин.
    2. Через 15 мин выбросьте октилфеноксиполи(этиленокси)этанол и промойте клетки 3 раза 1x PBS.
  3. Блокировка
    1. Добавьте 3% обезжиренного молока для уменьшения неспецифического связывания в образце (24-луночный планшет: 500 мкл/лунка; 96-луночный планшет: 100 мкл/лунка). Выдерживают тарелку при комнатной температуре в течение 2 ч.
    2. Через 2 часа выбросьте 3%-ное обезжиренное молоко и промойте клетки 3 раза с помощью 1x PBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это остановка. После добавления 3% обезжиренного молока планшеты можно хранить при температуре 4 °C до 2 дней до введения первичных антител.
  4. Инкубация первичных антител
    1. Добавьте моноклональное антитело против флавивируса, 4G2 (клон D1-4G2-4-15; первичное антитело, см. таблицу материалов), разбавленное в 1% обезжиренном молоке (соотношение 1:1000) (24-луночный планшет: 200 мкл/лунка; 96-луночный планшет: 40 мкл/лунка). Инкубируйте планшет при температуре 37 °C в течение 1 ч.
    2. Через 1 ч удаляют раствор, содержащий моноклональное антитело, и промывают клетки 3 раза 1x PBS.
  5. Инкубация вторичных антител
    1. Добавьте вторичные антитела IgG к козам против мышей, конъюгированные с пероксидазой хрена (HRP) (см. таблицу материалов), разведенные в 1% обезжиренном молоке (соотношение 1:1000) (24-луночный планшет: 200 мкл/лунка; 96-луночный планшет: 40 мкл/лунка). Инкубируют планшеты при температуре 37 °C в течение 1 ч.
    2. Через 1 ч удалить раствор, содержащий вторичное антитело, и промыть клетки 3 раза 1 ПБС.
  6. Инкубация субстрата
    1. Добавьте субстрат пероксидазы 3,3'диаминобензидина (DAB) (см. таблицу материалов) и инкубируйте планшет в течение 30 мин в темноте (24-луночный планшет: 200 мкл/лунка; 96-луночный планшет: 40 мкл/лунка). Через 30 мин остановите реакцию, промыв лунки водой.
    2. Просушите пластины на воздухе в течение ночи и приступайте к перебору очагов после того, как пластины полностью высохнут.

4. Определение титра вируса

  1. Ручной процесс подсчета очагов (24-луночный формат)
    1. Очаги можно визуализировать под стереомикроскопом. Выберите разведение, которое дает 50-200 очагов.
    2. Подсчитайте очаги для каждого повторения выбранного разведения. Рассчитайте среднее количество очагов для каждого из выбранных разведений.
    3. Рассчитайте единицу образования очагов на мл (ФОЕ/мл) для каждого образца по следующей формуле: ФОЕ/мл = среднее количество подсчитанных очагов/(разведение x объем добавленного разбавленного вируса).
  2. Автоматизированный процесс подсчета очагов (96-луночный формат)
    1. Отсканируйте 96-луночный планшет на коммерческом программном анализаторе.
      1. Дважды щелкните программное обеспечение (см. Таблицу материалов), чтобы открыть.
      2. Нажмите на Switch Suites и убедитесь, что пакет переключается на любой из подходящих (дополнительный рисунок 1A). Нажмите кнопку ОК.
      3. Начните сканирование, щелкнув Сканировать > Полное сканирование пластины (Дополнительный рисунок 1B).
      4. Нажмите на Dashboard (Панель мониторинга ), чтобы убедиться в том, что используется 96-луночный формат (дополнительный рисунок 2A).
      5. Выберите режим центрирования как «Автоматическое предварительное выравнивание проверено пользователем» (дополнительный рисунок 2B).
      6. Нажмите « Извлечь », чтобы загрузить пластину.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Откройте крышку тарелки и поместите ее вверх так, чтобы ряд A был вверху (дополнительный рисунок 3A).
      7. Введите название таблички и нажмите кнопку ОК. Нажмите кнопку Загрузить , чтобы загрузить пластину.
      8. Нажмите кнопку Начать , чтобы начать сканирование. После этого откалибруйте положения для A1, A12 и H1 с помощью кнопок «Вверх, вниз, влево, вправо» и нажмите «Подтвердить » (дополнительный рисунок 3B).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение начнет сканирование каждой скважины.
      9. После завершения сканирования появится обзорное изображение. Нажмите « Закрыть».
      10. Выйдите из сканирования, нажав на кнопку Вернуться к коммутатору.
    2. Посчитайте 96-луночный планшет с помощью программного обеспечения.
      1. Щелкните Count > Smart Count.
      2. В программном обеспечении отобразится «Шаг 1 из 5: Выберите пластины для подсчета». Нажмите на Load plate(s). Отметьте галочкой всю папку и нажмите « Выбрать», чтобы импортировать отсканированную пластину (дополнительный рисунок 4A).
      3. В программном обеспечении отобразится «Шаг 2 из 5: Определите параметры подсчета». Нажмите « Настроить параметры», и отобразятся параметры (диффузный процесс; маленький/нормальный/большой/самый большой/самый большой +1; точечное разделение; подсчитанная площадь; фоновый баланс; удаление волокон; стробирование).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Начните с одной скважины и проверьте вперед и назад, чтобы найти наилучшие настройки для всех скважин.
      4. После этого нажмите кнопку «Далее » (дополнительный рисунок 4B).
      5. В программном обеспечении отобразится «Шаг 3 из 5: Выбрать/отменить выбор скважин». После того, как выбор скважины для подсчета будет завершен, нажмите «Далее », чтобы продолжить.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Скважины, выбранные для подсчета, будут отображаться с буквой «C» в правом верхнем углу каждой скважины (дополнительный рисунок 5A).
      6. В программном обеспечении отобразится «Шаг 4 из 5: Настройки вывода». Нажмите на View/Modify Output Settings , чтобы проверить, подходят ли настройки (например, формат изображения). Нажмите « Сохранить и выйти» > «Далее» (дополнительный рисунок 5B).
      7. В программном обеспечении отобразится «Шаг 5 из 5: Запустить автоподсчет». Нажмите кнопку Start AutoCount (Запустить автоподсчет ) (дополнительный рисунок 6A).
      8. После завершения нажмите « Выйти из автоподсчета».
  3. Выполнение контроля качества (QC) в коммерческом программном анализаторе.
    1. На странице коммутатора нажмите « Контроль качества» > «Добавить пластины». Отметьте галочкой всю папку, чтобы импортировать подсчитанную пластину, нажмите « Выбрать» > «Начать контроль качества » (дополнительный рисунок 6B).
    2. Дважды щелкните по каждой лунке, чтобы проверить пятна. Нажмите « Количество », чтобы удалить все пятна. Программное обеспечение начнет подсчет.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что установлен флажок «Пятна: Удалить». О завершении подсчета может свидетельствовать подсчитанное количество очагов, например «30» (дополнительный рисунок 7А).
    3. После окончания подсчета (на это указывает подсчитанное количество очагов, например, «30»), нажмите «Да», чтобы удалить пятна (дополнительный рисунок 7B). Трижды щелкните левой кнопкой мыши по удаляемому месту. Щелкните правой кнопкой мыши, чтобы закончить, затем выберите «Да».
    4. Нажмите на Finish Plate и перейдите к обзору проекта после завершения контроля качества.
  4. Выполните визуализацию с помощью программного анализатора.
    1. Проверьте отсканированное, подсчитанное и контрольное изображение пластины (рисунок 2).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ZIKV может быть количественно определен с помощью FFA, как показано схематически на рисунке 3. Для 24-луночного планшета инфицированные клетки Vero фиксировали через 48 ч, 60 ч, 72 ч, 84 ч и 96 ч после заражения. Результаты показали, что клетки оставались неповрежденными (отслоения клеток не наблюдалось) через 96 ч (4 дня) после заражения (рис. 4 и дополнительный рисунок 8A-E). Появление вирусных очагов впервые наблюдалось через 48 ч (2 дня) после заражения (рис. 4A-F). Однако размер очагов был слишком мал, что затрудняло точный подсчет очагов. Оптимальный размер очагов был достигнут через 60 ч (2,5 дня) после заражения (рис. 4Б). В более поздние моменты времени (72 ч, 84 ч и 96 ч после заражения) очаги были крупнее и имели тенденцию к слиянию или наложению. Объединенные или перекрывающиеся очаги увеличивались с течением времени (рис. 4C-E). Поэтому для определения титра ZIKV в 24-луночном планшете выбирали очаги, образовавшиеся через 60 ч (2,5 дня) после заражения (рис. 4Б).

Для 96-луночного планшета инфицированные клетки Vero фиксировали через 24 ч, 36 ч, 48 ч, 60 ч и 72 ч после заражения. Результаты показали, что клетки оставались нетронутыми через 72 ч (3 дня) после заражения (Рисунок 5A-F и дополнительный рисунок 9A-E). Появление вирусных очагов впервые наблюдалось через 24 ч (1 сутки) после заражения (рис. 5А). Однако размер очагов был слишком мал до 36 ч (1,5 дня) после заражения, что затрудняло точное определение количества очагов (рис. 5A, B). Оптимальный размер очагов был достигнут через 48 ч (2 дня) после заражения (рис. 5С). В более поздние временные точки (через 60 ч и 72 ч после заражения) наблюдались перекрывающиеся или объединенные очаги, и количество перекрывающихся очагов увеличивалось с течением времени (рис. 5D, E). Поэтому для определения титра вируса изолятов ZIKV выбирали очаги, образовавшиеся через 48 ч (2 дня) после заражения (рис. 5С). В качестве альтернативы образование очагов можно визуализировать и перечислить с помощью коммерческих программных анализаторов.

Figure 1
Рисунок 1: Микроскопическое изображение клеток Vero. (A) Клетки Vero при 40-кратном увеличении показали 70%-90% слияние в колбе с клеточной культурой 75см2 для размножения вируса. (B) CPE на клетках Vero после заражения вирусом ZIKV на 1-й день после заражения при 100-кратном увеличении. (C) CPE на клетках Vero после заражения вирусом ZIKV на 2-й день после заражения при 100-кратном увеличении. (D) CPE на клетках Vero после инфицирования ZIKV на 3-й день после инфекции при 100-кратном увеличении. (E) Клетки Vero при 40-кратном увеличении показали 70%-90% слияние в 24-луночном планшете после 24 ч инкубации для количественного определения вируса. Масштабная линейка: 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Изображение 96-луночной контрольной пластины, отсканированной, подсчитанной и обработанной с помощью коммерческого программного анализатора. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Рабочий процесс окрашивания для анализа с образованием очагов. Процессы окрашивания, включая фиксацию клеток, пермеабилизацию, блокировку, связывание антител и инкубацию с субстратом пероксидазы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Анализ формирования очагов для ZIKV P6-740 в 24-луночных планшетах в разные моменты времени. (А) Очаги менее отчетливы на 2-й день (48 ч) после заражения. (B) Оптимальный размер очагов можно увидеть на 2,5-й день (60 ч) после заражения. (К-Э) Очаги слились на 3-й день (72 ч), 3,5-й день (84 ч) и 4-й день (96 ч) после заражения. (F) Отрицательный контроль пластины. Масштабная линейка: 1 000 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Анализ формирования очагов ZIKV P6-740 в 96-луночных планшетах в разные моменты времени. (A) Очаги менее отчетливы для подсчета на анализаторе коммерческого программного обеспечения на 1-й день (24 ч) после заражения. (B) Очаги менее отчетливы для подсчета на анализаторе коммерческого программного обеспечения на 1,5-й день (36 ч) после заражения. (C) Оптимальный размер очагов можно увидеть на 2-й день (48 ч) после заражения. (Д,Э) Очаги сливаются на 2,5-й день (60 ч) и 3-й день (72 ч) после заражения. (F) Отрицательный контроль пластины. Масштабная линейка: 1 000 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительный рисунок 1: Скриншоты стартовой страницы коммерческого анализатора программного обеспечения. (A) Переключите пакет на любой подходящий на коммерческом анализаторе программного обеспечения. После этого нажмите «ОК». (B) Чтобы начать сканирование на коммерческом программном анализаторе, нажмите «Сканирование», а затем нажмите «Полное сканирование пластины». Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный рисунок 2: Снимки экрана для просмотра "Формата захвата" и выбранного режима центрирования как "Auto Prealignment User Verified" на анализаторе коммерческого программного обеспечения. (A) Чтобы просмотреть формат захвата, нажмите «Панель управления» и выберите 96-луночный формат в качестве формата захвата. (B) Для режима центрирования выберите «Автоматическое предварительное выравнивание проверено пользователем». Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный рисунок 3: Размещение 96-луночного планшета на лотке считывателя планшетов коммерческого программного обеспечения и снимок экрана для калибровки положений для скважин A1, A12 и H1. (A) Поместите тарелку вверх так, чтобы ряд А был вверху. (B) Для калибровки положений скважин А1, А12 и Н1 используйте кнопки «Вверх, Вниз, Влево, Вправо». После этого нажмите «Подтвердить». Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный рисунок 4: Скриншоты для выбора папок, содержащих отсканированные пластины, для подсчета на коммерческом программном анализаторе и "Шаг 2 из 5: Определение параметров подсчета". (A) Чтобы подсчитать отсканированные пластины, нажмите «Загрузить пластины». Отметьте галочкой всю папку и нажмите «Выбрать», чтобы импортировать отсканированные пластины. (B) Отрегулируйте параметры подсчета. Нажмите «Далее» после того, как параметры будут установлены. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный рисунок 5: Скриншоты коммерческого программного анализатора «Шаг 3 из 5: Выбор/отмена выбора скважин» и «Шаг 4 из 5: Настройки вывода». (A) Выберите и отмените выбор скважин для подсчета и нажмите «Далее» после завершения. (B) Для настройки вывода нажмите «Просмотр/Изменение настроек вывода», чтобы проверить, подходят ли настройки (например, формат изображения). После этого нажмите «Сохранить и выйти», а затем нажмите «Далее». Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный рисунок 6: Скриншоты коммерческого анализатора программного обеспечения "Шаг 5 из 5: Запуск автоподсчета" и страницы контроля качества. (A) Когда все будет готово к подсчету пластин, нажмите «Начать автоподсчет». (B) На странице контроля качества отметьте галочкой всю папку, чтобы импортировать подсчитанную пластину, нажмите «Выбрать», затем нажмите «Начать контроль качества». Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный рисунок 7: Скриншоты страницы контроля качества коммерческого анализатора программного обеспечения. (A) Дважды щелкните каждую лунку, чтобы проверить места. Нажмите «Посчитать», чтобы удалить любое пятно. Поставьте галочку напротив пункта «Пятна: Удалить». (B) Трижды щелкните левой кнопкой мыши, чтобы удалить пятна. Щелкните правой кнопкой мыши, чтобы закончить, затем выберите «Да». Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный рисунок 8: Анализ формирования очагов для ZIKV P6-740 в 24-луночных планшетах в разные моменты времени. Десятикратное серийное разведение (от 10-1 до 10-5) проводили на ZIKV P6-740 и проводили инфекцию на клетках Vero в двух экземплярах, включая отрицательный контроль. Необработанное изображение данных было получено с помощью стереомикроскопа, при этом масштабная линейка показывала 1000 мкм. (A) День 2 (48 ч) после заражения. (B) 2,5 (60 ч) день после заражения. (C) 3-й день (72 ч) после заражения. (D) 3,5-й день (84 ч) после заражения. (E) 4-й день (96 ч) после заражения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный рисунок 9: Анализ формирования очагов для ZIKV P6-740 в 96-луночных планшетах в разные моменты времени. Десятикратное серийное разведение (от 10-1 до 10-5) проводили на ZIKV P6-740 и проводили инфекцию на клетках Vero в двух экземплярах, включая отрицательный контроль. Необработанное изображение данных было получено с помощью стереомикроскопа, а масштабная линейка показывала 1000 мкм. (A) День 1 (24 ч) после заражения. (B) 1,5 (36 ч) день после заражения. (C) 2-й день (48 ч) после заражения. (D) День 2,5 (60 ч) после заражения. (E) 3-й день (72 ч) после заражения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Существует несколько тестов для определения титра вируса; PFA имеет аналогичный протокол количественного определения вируса, что и FFA, в котором вирусный инокулят разбавляется, чтобы можно было различить отдельные бляшки или очаги. После окрашивания каждый налет или очаг указывает на наличие одной инфекционной частицы в посевном материале19. PFA окрашивают в кристально-фиолетовый цвет, чтобы визуализировать образование бляшек, вызванное лизисом или гибелью клеток. Следовательно, PFA занимает больше времени, так как вирусу требуется больше времени, чтобы вызвать CPE, и он ограничен только вирусами, которые вызывают лизис или гибель клеток. Многие лаборатории успешно использовали СЖК для определения инфекционных титров флавивирусов, в том числе ZIKV 19,20,21,22,23,24,25. FFA представляет собой клеточный колориметрический иммунодетектирующий метод, который обнаруживает вирусный антиген с антителами и, следовательно, идентифицирует очаги инфицированных клеток с помощью метода иммуноокрашивания, но не бляшки12,26. FFA предлагает ZIKV некоторые преимущества по сравнению с PFA. Одним из явных преимуществ является то, что он основан на распознавании антителами вирусных компонентов без различимых CPE. Кроме того, использование вирус-специфических антител также полезно для идентификации различных вирусов или серотипов вируса в смешанных популяциях27. Таким образом, FFA является более специфичным, чем PFA, поскольку он измеряет все вирусные инфекции и не зависит от вирусов, которые вызывают гибель клеток в достаточном количестве для образования видимой бляшки28. FFA также имеет более короткий инкубационный период, чем PFA, что требует очевидного CPE, что означает лизис и гибель клеток. Наконец, метод FFA с использованием 96-луночного планшета обеспечивает преимущество использования большего количества репликаций и больших разведений для обнаружения и титрования вируса27,29. Кроме того, представленный анализ СЖК может быть легко адаптирован для тестов на нейтрализацию вирусов и методов скрининга противовирусных соединений. Использование коммерческих или бесплатных автоматизированных приборов или программного обеспечения для подсчета клеток может еще больше повысить удобство использования (согласованность, точность, пропускную способность) FFA и связанных с ним методов.

При сравнении 24-луночного планшета с 96-луночным планшетом важно отметить, что 24-луночный формат требует большего количества клеток для выращивания в монослойных культурах, а также большего количества сред и вирусов. В результате формат 24-луночного планшета может не подходить для использования с образцами с ограниченным объемом. Это ограничение можно преодолеть, используя 96-луночный формат, как описано в данной статье. Во-первых, 96-луночный формат требует меньше материала, что делает его более экономичным вариантом. Кроме того, автоматизированный подсчет окрашенных вирусных очагов в 96-луночном формате обеспечивает высокую пропускную способность и быстрый анализ, что невозможно в 24-луночном формате, требующем ручного подсчета. Этот автоматизированный процесс подсчета также повышает воспроизводимость и снижает субъективность по сравнению с ручным подсчетом, что приводит к более точным и надежным результатам FFA. Поэтому 96-луночный формат с автоматизированными системами визуализации настоятельно рекомендуется для лабораторий, которым требуется высокая пропускная способность и надежное количественное определение вируса.

С другой стороны, некоторые люди используют иммунофлуоресцентный фокусный анализ для обнаружения ZIKV 25,27,28,30,31. Иммунофлуоресцентно-фокусный анализ аналогичен СЖК, за исключением того, что его проводят путем иммуноокрашивания антигенов флуорохром-конъюгированными специфическими антителами с последующим подсчетом очагов инфекции под флуоресцентным микроскопом25. В этом анализе используются более дорогостоящие реагенты, и для завершения анализа требуется флуоресцентная микроскопия. Таким образом, иммунофлуоресцентный фокусный анализ ограничен лучше оборудованными лабораториями, такими как референс-лаборатории. Использовать этот анализ в условиях ограниченных ресурсов непросто.

Несмотря на то, что FFA имеет много преимуществ, у него есть и некоторые ограничения. По сравнению с другими анализами, такими как PFA, FFA включает в себя больше этапов в процессе окрашивания. В то время как этапы после фиксации являются гибкими и допускают ночные или более длительные паузы, окрашивание очагов все равно занимает больше времени. Кроме того, FFA требует наличия специфических или перекрестно реагирующих антител в процессе окрашивания, что ограничивает его применимость для идентификации и количественного определения новых или новых вирусов. Более того, стоимость FFA выше по сравнению с PFA, для окрашивания которого требуется только кристально-фиолетовый цвет. Кроме того, стоит отметить, что автоматизированный процесс подсчета (96-луночный формат) может быть выполнен только в лаборатории с соответствующим оборудованием; Следовательно, он не подойдет для лабораторий без необходимого оборудования.

В заключение мы приводим подробные протоколы распространения и количественного определения ZIKV с использованием колориметрического иммунодетектирующего анализа на клеточной основе или FFA в форматах 24-луночных и 96-луночных планшетов. Метод имеет ряд практических преимуществ по сравнению с классическим PFA. Он быстрее и подходит для приложений с высокой пропускной способностью, если применяется с автоматизированной системой визуализации для подсчета очагов. Стандартизация надежных протоколов для этого исследования внесет большой вклад в изучение вируса Зика, а также может быть широко адаптирована для количественной оценки других клинически важных вирусов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.

Acknowledgments

Это исследование получило поддержку от Министерства высшего образования Малайзии в рамках Схемы долгосрочных исследовательских грантов (LRGS MRUN Phase 1: LRGS MRUN/F1/01/2018) и финансирование программы Центра передового опыта высших учебных заведений (HICoE) (MO002-2019). Рисунок 3 в этом исследовании, показывающий рабочий процесс окрашивания для анализа с образованием очагов, адаптирован из «Иммуногистохимии DAB» BioRender.com (2022). Источник — https://app.biorender.com/biorender-templates/t-5f3edb2eb20ace00af8faed9-dab-immunohistochemistry.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 µm Polyethersulfone syringe filter Sartorius S6534-FMOSK
1.5 mL microcentrifuge tube Nest 615601
10 mL sterile serological pipette Labserv 14955156
1x Dulbecco’s phosphate-buffered saline (dPBS) Gibco 14190-136
2.0 mL Screw cap tube  Axygen SCT-200-SS-C-S
24-well plate Corning 3526
25 mL Sterile serological pipettes Labserv 14955157
3,3'Diaminobenzidine (DAB) peroxidase substrate Thermo Scientific 34065
37 °C incubator with 5% CO2 Sanyo MCO-18AIC
5 mL sterile serological pipette Labserv 14955155
50 mL centrifuge tube Falcon LAB352070
75 cm2 tissue culture flask  Corning 430725U
96-well plate Falcon 353072
Anti-flavivirus monoclonal antibody, 4G2 (clone D1-4G2-4-15) MilliporeSigma MAB10216
Autoclaved 20x Phosphate buffered saline (PBS) N/A N/A 22.8 g of 8 mM Na2HPO4, 4.0 g of 1.5 mM KH2PO4, 160 g of 0.14 M NaCl, 4.0 g of 2.7 mM KCl, 1 L of MilliQ H2O
Biological safety cabinet, Class II Holten HB2448
CTL S6 Universal ELISpot/FluoroSpot Analyzer ImmunoSpot, Cellular Technology Limited (CTL) CTL-S6UNV12 Commercial software analyzer
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco 12800-017
Fetal bovine serum (FBS) Bovogen SFBS
Goat anti-mouse IgG secondary antibody conjugated with horseradish peroxidase (HRP) MilliporeSigma 12-349
Hemacytometer Laboroptik LTD Neubauer improved
IGEPAL CA-630 detergent Sigma-Aldrich I8896 Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanolIGEPAL 
Inverted microscope ZEISS TELAVAL 31
Laboratory rocker FINEPCR CR300
L-Glutamine Gibco 25030-081
Low viscosity carboxymethyl cellulose (CMC) Sigma-Aldrich C5678
Multichannel micropipette (10 - 100 µL) Eppendorf 3125000036
Multichannel micropipette (30 - 300 µL) Eppendorf 3125000052
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
Penicillin-streptomycin Gibco 15140-122
Single channel pipettes (10 - 100 µL) Eppendorf 3123000047
Single channel pipettes (100 - 1000 µL) Eppendorf 3123000063
Single channel pipettes (20 - 200 µL) Eppendorf 3123000055
Skim milk Sunlac Low Fat N/A Prepare 3% Skim milk in 1x PBS for blocking stage in staining
Sodium Hypochlorite Clorox N/A To disinfect any discarded infectious liquid waste from flasks/plates
Stereomicroscope Nikon SMZ1000
Syringe disposable, Luer Lock, 10 mL with 21 G Needle Terumo SS10L21G
Vero African green monkey kidney cells  - ECACC 88020401 Received from collaborator. However, Vero cells obtained from other suppliers should be able to be used with some optimization.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dick, G. W. A., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. Zika virus. I. Isolations and serological specificity. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 46 (5), 509-520 (1952).
  2. Dick, G. W. A., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. Zika virus. II. Pathogenicity and physical properties. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 46 (5), (1952).
  3. Duffy, M. R., et al. Zika virus outbreak on Yap Island, Federated States of Micronesia. The New England Journal of Medicine. 360 (24), 2536-2543 (2009).
  4. Musso, D., Nilles, E. J., Cao-Lormeau, V. M. Rapid spread of emerging Zika virus in the Pacific area. Clinical Microbiology and Infection. 20 (10), O595-O596 (2014).
  5. Cao-Lormeau, V. -M., et al. Zika virus, French polynesia, South pacific, 2013. Emerging Infectious Diseases. 20 (6), 1085-1086 (2014).
  6. Dupont-Rouzeyrol, M., et al. Co-infection with Zika and dengue viruses in 2 patients, New Caledonia, 2014. Emerging Infectious Diseases. 21 (2), 381-382 (2015).
  7. Roth, A., et al. Concurrent outbreaks of dengue, chikungunya and Zika virus infections-an unprecedented epidemic wave of mosquito-borne viruses in the Pacific 2012-2014. Euro Surveillance. 19 (41), 20929 (2014).
  8. Tognarelli, J., et al. A report on the outbreak of Zika virus on Easter Island, South Pacific, 2014. Archives of Virology. 161 (3), 665-668 (2016).
  9. Oehler, E., et al. Zika virus infection complicated by Guillain-Barre syndrome-case report, French Polynesia, December 2013. Euro Surveillance. 19 (9), 20720 (2014).
  10. Faria, N. R., et al. Zika virus in the Americas: early epidemiological and genetic findings. Science. 352 (6283), 345-349 (2016).
  11. Rapid risk assessment: Zika virus epidemic in the Americas: potential association with microcephaly and Guillain-Barré syndrome - 4th update. European Centre for Disease Prevention and Control. , Stockholm. Available from: https://www.ecdc.europa.eu/en/publications-data/rapid-risk-assessment-zika-virus-epidemic-americas-potential-association (2015).
  12. Payne, S. Methods to study viruses. Viruses. , 37-52 (2017).
  13. Bustin, S. A., Mueller, R. Real-time reverse transcription PCR (qRT-PCR) and its potential use in clinical diagnosis. Clinical Science. 109 (4), 365-379 (2005).
  14. Sedlak, R. H., Jerome, K. R. Viral diagnostics in the era of digital polymerase chain reaction. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 75 (1), 1-4 (2013).
  15. Bae, H. -G., Nitsche, A., Teichmann, A., Biel, S. S., Niedrig, M. Detection of yellow fever virus: a comparison of quantitative real-time PCR and plaque assay. Journal of Virological Methods. 110 (2), 185-191 (2003).
  16. Dulbecco, R. Production of plaques in monolayer tissue cultures by single particles of an animal virus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 38 (8), 747-752 (1952).
  17. Nahapetian, A. T., Thomas, J. N., Thilly, W. G. Optimization of environment for high density Vero cell culture: effect of dissolved oxygen and nutrient supply on cell growth and changes in metabolites. Journal of Cell Science. 81, 65-103 (1986).
  18. Agbulos, D. S., Barelli, L., Giordano, B. V., Hunter, F. F. Zika virus: quantification, propagation, detection, and storage. Current Protocols in Microbiology. 43, (2016).
  19. Brien, J. D., Lazear, H. M., Diamond, M. S. Propagation, quantification, detection, and storage of West Nile virus. Current Protocols in Microbiology. 31, (2013).
  20. Bolívar-Marin, S., Bosch, I., Narváez, C. F. Combination of the focus-forming assay and digital automated imaging analysis for the detection of dengue and Zika viral loads in cultures and acute disease. Journal of Tropical Medicine. 2022, 2177183 (2022).
  21. Dangsagul, W., et al. Zika virus isolation, propagation, and quantification using multiple methods. PLoS One. 16 (7), e0255314 (2021).
  22. Brien, J. D., et al. Genotype-specific neutralization and protection by antibodies against dengue virus type 3. Journal of Virology. 84 (20), 10630-10643 (2010).
  23. Lazear, H. M., et al. A mouse model of Zika virus pathogenesis. Cell Host & Microbe. 19 (5), 720-730 (2016).
  24. Miner, J. J., et al. Zika virus infection during pregnancy in mice causes placental damage and fetal demise. Cell. 165 (5), 1081-1091 (2016).
  25. Kang, W., Shin, E. -C. Colorimetric focus-forming assay with automated focus counting by image analysis for quantification of infectious hepatitis C virions. PLoS One. 7 (8), e43960 (2012).
  26. Brien, J. D., et al. Isolation and quantification of Zika virus from multiple organs in a mouse. Journal of VIsualized Experiments. (150), e59632 (2019).
  27. Payne, A. F., Binduga-Gajewska, I., Kauffman, E. B., Kramer, L. D. Quantitation of flaviviruses by fluorescent focus assay. Journal of Virological Methods. 134 (1-2), 183-189 (2006).
  28. Moser, L. A., et al. Growth and adaptation of Zika virus in mammalian and mosquito cells. PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (11), e0006880 (2018).
  29. Ishimine, T., Tadano, M., Fukunaga, T., Okuno, Y. An improved micromethod for infectivity assays and neutralization tests of dengue viruses. Biken Journal. 30 (2), 39-44 (1987).
  30. Leiva, S., et al. Application of quantitative immunofluorescence assays to analyze the expression of cell contact proteins during Zika virus infections. Virus Research. 304, 198544 (2021).
  31. Lee, E. M., Titus, S. A., Xu, M., Tang, H., Zheng, W. High-throughput Zika viral titer assay for rapid screening of antiviral drugs. ASSAY and Drug Development Technologies. 17 (3), 128-139 (2019).

Tags

Иммунология и инфекция Выпуск 194 Вирус Зика (ZIKV) Флавивирус Врожденные аномалии головного мозга Синдром Гийена-Барра© Вирусология Фокусообразующий анализ (FFA) Вирусный антиген Метод иммуноокрашивания пероксидазой 24-луночный формат 96-луночный формат Оптимизация размеров очагов Vero-клетки инкубация процессы окрашивания клеточная фиксация пермеабилизация блокирование связывание антител пероксидазный субстрат
Размножение вирусов и клеточная колориметрическая количественная оценка
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tan, J. Y., Wong, J. E., Zainal, N., … More

Tan, J. Y., Wong, J. E., Zainal, N., AbuBakar, S., Tan, K. K. Virus Propagation and Cell-Based Colorimetric Quantification. J. Vis. Exp. (194), e64578, doi:10.3791/64578 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter