Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Virusförökning och cellbaserad kolorimetrisk kvantifiering

Published: April 7, 2023 doi: 10.3791/64578
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1
1Tropical Infectious Diseases Research and Education Centre (TIDREC), Higher Institution Center of Excellence (HICoE), Universiti Malaya, 2Department of Medical Microbiology, Faculty of Medicine, Universiti Malaya

Summary

Detta protokoll beskriver spridningen av zikavirus (ZIKV) i njurceller från afrikanska gröna apor och kvantifieringen av ZIKV med hjälp av cellbaserade kolorimetriska immundetektionsmetoder i format med 24 brunnar och 96 brunnar (hög genomströmning).

Abstract

Zikavirus (ZIKV) är ett myggburet virus som tillhör släktet Flavivirus. ZIKV-infektion har associerats med medfödda hjärnabnormiteter och potentiellt Guillain-Barrés syndrom hos vuxna. Forskning om ZIKV för att förstå sjukdomsmekanismerna är viktig för att underlätta utveckling av vaccin och behandling. Metoden att kvantifiera virus är avgörande och grundläggande inom virologiområdet. Focus forming assay (FFA) är en viruskvantifieringsanalys som detekterar virusantigenet med antikroppar och identifierar infektionshärdarna hos celler med hjälp av peroxidasimmunfärgningstekniken. Den aktuella studien beskriver virusföröknings- och kvantifieringsprotokollet med hjälp av både 24-brunnars och 96-brunnars (hög genomströmning) format. Jämfört med andra liknande studier har detta protokoll ytterligare beskrivit optimering av foci size, vilket kan fungera som en guide för att utöka användningen av denna analys för andra virus. För det första utförs ZIKV-förökning i Vero-celler i 3 dagar. Kultursupernatanten som innehåller ZIKV skördas och kvantifieras med hjälp av FFA. Kortfattat inokuleras viruskulturen på Vero-celler och inkuberas i 2-3 dagar. Foci-bildning bestäms sedan efter optimerade färgningsprocesser, inklusive cellfixering, permeabilisering, blockering, antikroppsbindning och inkubation med peroxidassubstrat. De färgade virusfokusen visualiseras med hjälp av ett stereomikroskop (manuell räkning i 24-hålsformat) eller mjukvaruanalysator (automatiserad räkning i 96-hålsformat). FFA ger reproducerbara, relativt snabba resultat (3-4 dagar) och är lämplig att användas för olika virus, inklusive icke-plackbildande virus. Därefter är detta protokoll användbart för studier av ZIKV-infektion och kan användas för att upptäcka andra kliniskt viktiga virus.

Introduction

Zikavirusinfektion (ZIKV) är en växande myggburen virussjukdom. Den första isoleringen av ZIKV skedde i Uganda 1947 1,2; Det förblev försummat från 1947 till 2007, eftersom de kliniska symtomen oftast är asymtomatiska och kännetecknas av självbegränsande febersjukdom. År 2007 började zikaepidemin på Yapöarna 3,4, följt av större epidemier i Stillahavsregionerna (Franska Polynesien, Påskön, Cooköarna och Nya Kaledonien) från 2013 till 2014 5,6,7,8, där den allvarliga neurologiska komplikationen Guillain-Barrés syndrom (GBS) rapporterades hos vuxna för första gången9. Under 2015 och 2016 svepte den första utbredda ZIKV-epidemin över Nord- och Sydamerika efter uppkomsten av den asiatiska genotypen ZIKV i Brasilien så tidigt som 201310. Under detta utbrott rapporterades mellan 440 000 och 1,3 miljoner fall av mikrocefali och andra neurologiska sjukdomar hos nyföddabarn. Det finns för närvarande inget specifikt botemedel eller behandling för ZIKV-infektion. Det finns därför ett akut medicinskt behov av ZIKV-vacciner som kan förebygga infektioner, särskilt under graviditet.

Viruskvantifiering är en process för att bestämma antalet virus som finns i ett prov. Det spelar en viktig roll inom forskningen, och akademiska laboratorier involverar många områden, såsom medicin och biovetenskap. Denna process är också viktig inom kommersiella sektorer, såsom produktion av virala vacciner, rekombinanta proteiner, virala antigener eller antivirala medel. Många metoder eller analyser kan användas för kvantifieringav virus 12. Valet av metoder eller analyser beror normalt på virusets egenskaper, önskad noggrannhetsnivå och typen av experiment eller forskning. I allmänhet kan metoder för att kvantifiera virus delas in i två kategorier: molekylära analyser som detekterar närvaron av viral nukleinsyra (DNA eller RNA) och analyser som mäter virusets infektionsförmåga in vitro12. Kvantitativ polymeraskedjereaktion (qPCR, för DNA) eller kvantitativ polymeraskedjereaktion med omvänd transkription (qRT-PCR, för RNA)13 och digital dropp-PCR14 är exempel på vanliga molekylära tekniker som används för att kvantifiera virusnukleinsyran i ett givet prov15. Dessa mycket känsliga molekylära tekniker kan dock inte skilja mellan livskraftiga och icke-livskraftiga virus15. Forskning som kräver information om biologiska egenskaper, t.ex. virusets smittsamhet på celler, kan därför inte slutföras med hjälp av de ovan nämnda molekylära teknikerna. Det behövs analyser som kan mäta och bestämma förekomsten av livskraftiga virus. Analyser som mäter virusets smittsamhet inkluderar plackbildande analys (PFA), 50 % vävnadskulturinfektionsdos (TCID50), fluorescerande fokusanalys och transmissionselektronmikroskopi (TEM)12.

PFA, som utvecklades av Renato Dulbecco 1952, är en av de mest använda metoderna för virustitrering, inklusive för ZIKV16. Det används för att direkt bestämma viruskoncentrationerna för infektiösa lytiska virioner. Metoden bygger på ett lytiskt virus förmåga att producera cytopatiska effekter (CPEs; zoner för celldöd eller plack, ett infektionsområde omgivet av oinfekterade celler) i ett inokulerat cellmonolager efter virusinfektion. Det finns dock flera nackdelar med analysen som påverkar dess användbarhet. Analysen är tidskrävande (tar cirka 7-10 dagar, beroende på virus), CPE-beroende och felbenägen. I den aktuella studien redovisar vi en immunokolorimetrisk teknik, focus forming assay (FFA), för att detektera och kvantifiera ZIKV i 24-brunnars plattformat och 96-håls plattformat.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Spridning av virus

  1. Förberedelse av celler
    1. Odla Vero-celler i en75 cm 2-cells odlingskolv innehållande 12 ml Dulbeccos modifierade Eagle's medium (DMEM) kompletterat med 10 % fetalt bovint serum (FBS) och 2 mM L-glutamin (se materialförteckning). Inkubera cellerna i en cellodlingsinkubator vid 37 °C med 5 % CO2 .
    2. Övervaka cellerna under ett mikroskop; när cellerna når 70%-90% sammanflöde är de redo att användas (Figur 1A).
      OBS: Vero-cellerna fördubblas ungefär var 24:e timme17. Spädningar på 1:10 bör ta 3 till 4 dagar för att nå 80%-90% sammanflöde i en 75 cm2-kolv . Övervaka cellerna dagligen eller varannan dag.
  2. Infektion i cellmonolagret
    1. Avlägsna odlingsmediet från cellodlingskolven med en 10 ml serologisk pipett. Skölj kolven med 3 ml fosfatbuffrad koksaltlösning (dPBS) 2 ml med en 5 ml serologisk pipett.
      OBS: En bägare med 10 % natriumhypoklorit måste förberedas för att desinficera eventuellt kasserat smittsamt flytande avfall från kolvar/tallrikar.
    2. Tillsätt 2 ml serumfritt DMEM (DMEM kompletterat med 2 mM L-glutamin utan FBS) och 20 μl ZIKV-inokulat i cellodlingskolven. Inkubera kolven med lätt gungning i 1 timme i rumstemperatur så att virusadsorption tillåts.
      Titrering av det ursprungliga ZIKV-lagret kommer att vara till hjälp för att bestämma volymen av ZIKV-inokulumtillsats (steg 2).
      VARNING: ZIKV är klassificerad som en patogen på biosäkerhetsnivå 2 (BSL-2). Alla procedurer med material som innehåller ZIKV måste utföras i ett certifierat biosäkerhetsskåp och följa alla laboratoriestandardrutiner (SOP) med lämplig personlig skyddsutrustning.
  3. Tillsats av överlagringsmediet
    1. Efter 1 timmes inkubation avlägsnas och kasseras det utspädda virusinokulatet med en 5 ml serologisk pipett. Skölj cellodlingskolven med 3 ml dPBS 2x.
    2. Tillsätt 12 ml underhållsmedium (DMEM kompletterat med 2 % FBS, 2 mM L-glutamin och 100 E/ml penicillin-streptomycin) i cellodlingskolven för att bibehålla de infekterade cellerna.
    3. Inkubera de infekterade Vero-cellerna i 3 dagar i en cellodlingsinkubator vid 37 °C med 5 % CO2 .
      OBS: Övervaka dagligen för CPE av infekterade Vero-celler under ett mikroskop.
  4. Skörd av supernatant som innehåller ZIKV
    1. På dag 3 efter infektion kan cellrundning och avlossning (CPE) observeras (Figur 1B-D). Skörda cellodlingssupernatanten som innehåller ZIKV i ett 50 ml centrifugrör med hjälp av en 10 ml serologisk pipett.
    2. Använd ett 0,22 μm polyetersulfonsprutfilter (se materialförteckning) för att filtrera cellkulturens supernatant. Alikvot 500 μl av den filtrerade cellodlingssupernatanten i 2,0 ml rör med skruvkork och förvara vid -80 °C tills vidare användning.
      OBS: Skördad ZIKV kan förvaras vid -80 °C för långtidsförvaring.
      VARNING: Extra försiktighetsåtgärder måste vidtas om en sprutnål används, eftersom nålen kan punktera huden. Laboratorie-SOP:er måste upprättas.

2. Kvantifiering av virus

  1. Förberedelse av celler
    1. Frö Vero-celler i avsedda plattor (24-hålsplatta: 0,5 ml/brunn, 7,5 x 104 celler/brunn; 96-hålsplatta: 0,1 ml/brunn, 1,5 x 104 celler/brunn) och inkubera plattan över natten i en cellodlingsinkubator vid 37 °C med 5 % CO2.
      OBS: Det finns fem olika tidpunkter som ska testas (24-hålsplatta: 48 timmar, 60 timmar, 72 timmar, 84 timmar och 96 timmar efter infektion; 96-brunnsplatta: 24 timmar, 36 timmar, 48 timmar, 60 timmar och 72 timmar efter infektion); Förbered därför en tallrik för varje tidpunkt.
    2. Efter 24 timmars inkubation och när cellerna når 70%-90% sammanflöde (Figur 1E) är plattan redo för infektion. Fortsätt med att bereda det utspädda viruslagret (steg 2.2) före infektion av cellmonolagret.
  2. Utspädning av virus
    1. För plattor med 24 och 96 brunnar, förbered sex sterila 1,5 ml mikrocentrifugrör för varje platta för att utföra en tiofaldig utspädning (10-1 upp till 10-5), inklusive en negativ kontroll. För experimentuppställningen för en 24-hålsplatta, tillsätt 450 μL serumfri DMEM i alla sex mikrocentrifugrören. För experimentuppställningen för en 96-hålsplatta, tillsätt 135 μL serumfri DMEM i sex rör.
      OBS: Märk varje rör tydligt för att indikera utspädningen av dess innehåll innan du utför den tiofaldiga seriespädningen.
    2. För att utföra seriell utspädning, för 24-håls plattexperiment, tillsätt 50 μl ZIKV-stam som skördats från steg 1 till 10-1-röret som innehåller 450 μL serumfritt DMEM. För experimentet med 96 brunnars plattor, tillsätt 15 μl ZIKV-stam i 10-1-röret som innehåller 135 μL serumfritt DMEM.
    3. Virvla varje rör för att blanda viruset och mediet. Detta är den första tiofaldiga utspädningen.
      OBS: Korrekt blandning av virus och odlingsmedium i varje spädningsrör krävs för att säkerställa korrekt seriell utspädning.
    4. För 24-hålsplattexperimentet, använd en ny pipettspets för att återsuspendera 10-1-röret och överför 50 μl utspädd ZIKV till 10-2-röret som en andra tiofaldig utspädning. För experimentet med 96 brunnars plattor, använd en ny pipettspets för att återsuspendera 10-1-röret och överför 15 μl utspädd ZIKV till 10-2-röret som en andra tiofaldig utspädning.
    5. Upprepa steg 2.2.4 fyra gånger tills det femte röret (uteslut den negativa kontrollen).
      OBS: Använd en ny pipettspets efter varje pipetteringssteg för att undvika korskontaminering.
  3. Infektion i cellmonolagret
    1. Ta bort och kassera det konditionerade mediet från varje brunn (24-hålsplatta: 0.5 ml/brunn; 96-hålsplatta: 0.1 ml/brunn).
    2. Skölj varje brunn med dPBS 2x (24-hålsplatta: 300 μL/brunn; 96-hålsplatta: 60 μL/brunn).
    3. Arbeta från den högsta till den lägsta utspädningen och tillsätt varje seriellt utspätt virusinokulum i brunnen (24-hålsplatta: 200 μL/brunn; 96-hålsplatta: 40 μL/brunn).
      OBS: Infektionen av varje utspädning kommer att utföras i duplicerade brunnar. Behåll två oinfekterade brunnar som den negativa kontrollen. Märk plattan och brunnarna tydligt för att undvika förvirring. Byt pipettspetsarna efter varje pipetteringssteg för att förhindra korskontaminering.
    4. Inkubera plattan med försiktig gungning i 1 timme vid rumstemperatur för att tillåta virusadsorption.
  4. Tillsats av det överlagrade cellodlingsmediet
    1. Efter 1 timmes inkubation avlägsnas virussuspensionen från den lägsta koncentrationen till den högsta och kasseras.
    2. Tvätta de infekterade cellerna med dPBS 2x (24-hålsplatta: 300 μL/brunn; 96-hålsplatta: 60 μL/brunn).
    3. Överlägg brunnen med DMEM (kompletterat med 2 % FBS, 2 mM L-glutamin och 100 E/ml penicillin-streptomycin) och 1,5 % karboximetylcellulosa med låg viskositet (CMC; se Materialförteckning) (24-hålsplatta: 1 ml/brunn; 96-hålsplatta: 0,2 ml/brunn).
    4. Inkubera plattan i en cellodlingsinkubator vid 37 °C med 5 % CO2 .
      OBS: Stör inte plattan under denna inkubationstid.
    5. Ta ut plattan från cellodlingsinkubatorn för färgning vid olika tidpunkter (24-hålsplatta: 48 timmar, 60 timmar, 72 timmar, 84 timmar och 96 timmar efter infektion; 96-brunnars platta: 24 timmar, 36 timmar, 48 timmar, 60 timmar och 72 timmar efter infektion).

3. Färgning

  1. Cellfixering
    1. Efter de specifika inkubationstimmarna (24-hålsplatta: 48 timmar, 60 timmar, 72 timmar, 84 timmar och 96 timmar efter infektion; 96-hålsplatta: 24 timmar, 36 timmar, 48 timmar, 60 timmar och 72 timmar efter infektion), ta bort och kassera överlagringsmediet och tvätta cellerna 3x med 1x PBS. För 96-hålsplattan, ta bort och kassera överlagringsmediet och tvätta cellerna 3x med 60 μL/brunn 1x PBS med en flerkanalspipett.
    2. Tillsätt 4 % paraformaldehyd för att fixera cellerna (24-hålsplatta: 300 μL/brunn; 96-hålsplatta: 60 μL/brunn). Inkubera plattan i rumstemperatur i 20 min.
      VARNING: Paraformaldehyd är en fast polymeriserad formaldehyd. Det är ett brandfarligt, fast, vitt kristallint pulver som frigör formaldehydgas när det blandas med vatten eller värms upp. Alla procedurer som involverar användning av paraformaldehyd måste utföras i ett certifierat kemiskt dragskåp eller godkända uttömda kapslingar enligt laboratoriets SOP:er som är specifika för formaldehydhaltiga kemikalier.
    3. Efter 20 minuter kasserar du paraformaldehyden och tvättar cellerna 3 gånger med 1 x PBS. Utför permeabilisering, blockering och antikroppsinkubationer enligt steg 3.2-3.5.
      OBS: När du kasserar 4 % paraformaldehyd, följ universitetets eller institutets avfallshanteringsprocedur.
  2. Cellpermeabilisering
    1. Tillsätt 1 % oktylfenoxipoly(etylenoxi)etanol (se materialtabell) för att permeabilisera cellerna (24-hålsplatta: 200 μL/brunn; 96-hålsplatta: 40 μL/brunn). Inkubera plattan i rumstemperatur i 15 min.
    2. Efter 15 minuter, kassera oktylfenoxipoly(etylenoxi)etanolen och tvätta cellerna 3x med 1x PBS.
  3. Blockering
    1. Tillsätt 3 % skummjölk för att minska den ospecifika bindningen i provet (24-hålsplatta: 500 μL/brunn; 96-hålsplatta: 100 μL/brunn). Inkubera plattan i rumstemperatur i 2 timmar.
    2. Efter 2 timmar kasserar du den 3 % skummjölken och tvättar cellerna 3 gånger med 1 x PBS.
      OBS: Detta är en stopppunkt. Efter tillsats av 3 % skummjölk kan plattorna förvaras vid 4 °C upp till 2 dagar innan den primära antikroppsinsättningen görs.
  4. Inkubation av primära antikroppar
    1. Tillsätt monoklonal antikropp mot flavivirus, 4G2 (klon D1-4G2-4-15; primär antikropp, se materialförteckning) utspädd i 1 % skummjölk (förhållandet 1:1 000) (24-hålsplatta: 200 μL/brunn; 96-hålsplatta: 40 μL/brunn). Inkubera plattan vid 37 °C i 1 timme.
    2. Efter 1 timme avlägsnar du lösningen som innehåller den monoklonala antikroppen och tvättar cellerna 3 gånger med 1 x PBS.
  5. Inkubation av sekundära antikroppar
    1. Tillsätt get-anti-mus IgG sekundär antikropp konjugerad med pepparrotsperoxidas (HRP) (se materialtabell) utspädd i 1 % skummjölk (förhållandet 1:1 000) (24-brunnars platta: 200 μL/brunn; 96-hålars platta: 40 μL/brunn). Inkubera plattorna vid 37 °C i 1 timme.
    2. Efter 1 timme avlägsnar du lösningen som innehåller den sekundära antikroppen och tvättar cellerna 3 gånger med 1 x PBS.
  6. Inkubation av substrat
    1. Tillsätt 3,3'diaminobenzidin (DAB)peroxidassubstrat (se materialtabell) och inkubera plattan i 30 minuter i mörker (24-hålsplatta: 200 μL/brunn; 96-hålsplatta: 40 μL/brunn). Efter 30 minuter stoppar du reaktionen genom att tvätta brunnarna med vatten.
    2. Lufttorka plattorna över natten och fortsätt till foci enumeration efter att plattorna är helt torra.

4. Bestämning av virustitern

  1. Manuell fokusräkningsprocess (24-hålsformat)
    1. Foci kan visualiseras under ett stereomikroskop. Välj den utspädning som ger 50-200 fokus.
    2. Räkna fokuspunkterna för varje replikat av den valda utspädningen. Beräkna det genomsnittliga antalet fokusområden för var och en av de valda utspädningarna.
    3. Beräkna den foci bildande enheten per ml (FFU/ml) för varje prov med formeln nedan: FFU/ml = genomsnittligt antal foci count/(utspädning x volym utspätt virus tillsatt).
  2. Automatiserad fokusräkningsprocess (96-hålsformat)
    1. Skanna plattan med 96 brunnar på en kommersiell programvaruanalysator.
      1. Dubbelklicka på programvaran (se Materialförteckning) för att öppna.
      2. Klicka på Byt svit och se till att sviten byts till någon som är tillämplig (tilläggsfigur 1A). Klicka på OK.
      3. Starta skanningen genom att klicka på Skanna > Skanning av hela plattan (kompletterande bild 1B).
      4. Klicka på Dashboard för att se till att fångstformatet är 96-brunnsformatet (kompletterande figur 2A).
      5. Välj centreringsläge som "Automatisk förjustering verifierad av användare" (kompletterande figur 2B).
      6. Klicka på Mata ut för att ladda plattan.
        OBS: Öppna locket på plattan och placera den uppåt med rad A upptill (tilläggsfigur 3A).
      7. Ange skyltens namn och klicka på OK. Klicka på Ladda för att ladda plattan.
      8. Klicka på Start för att starta skanningen. Kalibrera sedan positionerna för A1, A12 och H1 med knapparna "Upp, Ner, Vänster, Höger" och klicka på Bekräfta (Tilläggsfigur 3B).
        OBS: Programvaran börjar skanna varje brunn.
      9. När skanningen är klar kommer en översiktsbild att dyka upp. Klicka på Stäng.
      10. Avsluta skanningen genom att klicka på Tillbaka till växeln.
    2. Räkna 96-brunnsplattan med hjälp av programvaran.
      1. Klicka på Antal > smart antal.
      2. På programvaran kommer det att visa "Steg 1 av 5: Välj plattor att räkna". Klicka på Lastplatta. Markera hela mappen och klicka på Välj för att importera den skannade plåten (kompletterande figur 4A).
      3. På programvaran kommer den att visa "Steg 2 av 5: Definiera räkneparametrar". Klicka på Justera parametrar, så kommer parametrarna att visas (diffus process; liten/normal/stor/största/största +1; punktseparation; räknat område; bakgrundsbalans; fiberborttagning; gating).
        OBS: Börja med en brunn och kolla fram och tillbaka för att hitta de bästa inställningarna för alla brunnar.
      4. När du är klar klickar du på Nästa (kompletterande figur 4B).
      5. På programvaran kommer det att visa "Steg 3 av 5: Välj/avmarkera brunnar". När valet av brunnen som ska räknas är klart klickar du på Nästa för att fortsätta.
        OBS: De brunnar som valts för att räknas kommer att visas med ett "C" i det övre högra hörnet av varje brunn (tilläggsfigur 5A).
      6. På programvaran kommer den att visa "Steg 4 av 5: Utgångsinställningar". Klicka på Visa/ändra utdatainställningar för att kontrollera om inställningarna (t.ex. bildformat) är lämpliga. Klicka på Spara och avsluta > Nästa (tilläggsfigur 5B).
      7. På programvaran kommer den att visa "Steg 5 av 5: Starta AutoCount". Klicka på Starta AutoCount (kompletterande figur 6A).
      8. När du är klar klickar du på Avsluta AutoCount.
  3. Utför kvalitetskontroll (QC) i den kommersiella programvaruanalysatorn.
    1. På växelsidan klickar du på Kvalitetskontroll > Lägg till platta. Bocka i hela mappen för att importera den räknade plattan, klicka på Välj > Starta QC (Supplement Figure 6B).
    2. Dubbelklicka på varje brunn för att granska fläckarna. Klicka på Räkna för att ta bort eventuella fläckar. Programvaran börjar räkna.
      OBS: Se till att "Fläckar: Ta bort" är markerat. Slutförandet av räkningen kan indikeras av det räknade antalet fokus, t.ex. "30" (tilläggsfigur 7A).
    3. När räkningen är klar (indikeras av det räknade antalet fokus, t.ex.ample "30"), klicka på "Ja" för att ta bort fläckar (kompletterande figur 7B). Vänsterklicka tre gånger på den plats som ska tas bort. Högerklicka för att avsluta och klicka sedan på Ja.
    4. Klicka på Finish Plate och gå till Projektöversikt när QC är klar.
  4. Utför avbildning med hjälp av programvaruanalysatorn.
    1. Kontrollera den skannade, räknade och QC-plåtbilden (Figur 2).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ZIKV kan kvantifieras med hjälp av FFA, som beskrivs schematiskt i figur 3. För 24-hålsplattan fixerades de infekterade Vero-cellerna 48 timmar, 60 timmar, 72 timmar, 84 timmar och 96 timmar efter infektion. Resultaten visade att cellerna förblev intakta (ingen cellavlossning observerades) efter 96 timmar (4 dagar) efter infektion (Figur 4 och Supplement Figur 8A-E). Uppkomsten av virushärdar observerades först 48 timmar (2 dagar) efter infektion (Figur 4A-F). Fokusstorleken var dock för liten, vilket gjorde det svårt att räkna fokusen exakt. Den optimala fokusstorleken uppnåddes 60 timmar (2,5 dagar) efter infektion (Figur 4B). Vid de senare tidpunkterna (72 timmar, 84 timmar och 96 timmar efter infektion) var härdarna större och tenderade att smälta samman eller överlappa varandra. De sammanslagna eller överlappande fokusområdena ökade med tiden (figur 4C-E). Därför valdes härdar som bildats 60 timmar (2,5 dagar) efter infektionen för att bestämma ZIKV-titern i en 24-hålsplatta (Figur 4B).

För 96-hålsplattan fixerades de infekterade Vero-cellerna 24 timmar, 36 timmar, 48 timmar, 60 timmar och 72 timmar efter infektion. Resultaten visade att cellerna förblev intakta efter 72 timmar (3 dagar) efter infektion (Figur 5A-F och Supplement Figur 9A-E). Uppkomsten av virushärdar observerades först 24 timmar (1 dag) efter infektion (Figur 5A). Fokusstorleken var dock för liten upp till 36 timmar (1,5 dagar) efter infektion, vilket gjorde det svårt att exakt bestämma antalet härdar (Figur 5A,B). Den optimala fokusstorleken uppnåddes 48 timmar (2 dagar) efter infektion (Figur 5C). Vid de senare tidpunkterna (60 timmar och 72 timmar efter infektion) observerades överlappande eller sammanslagna fokus, och antalet överlappande härdar ökade med tiden (Figur 5D,E). Därför valdes fokusområden som bildades 48 timmar (2 dagar) efter infektionen för att bestämma virustitern för ZIKV-isolat (figur 5C). Fokusbildningen kan visualiseras och räknas upp med hjälp av kommersiella mjukvaruanalysatorer som ett alternativ.

Figure 1
Figur 1: Mikroskopisk bild av Vero-celler. (A) Vero-celler i 40x förstoring visade 70%-90% sammanflöde i en 75 cm2-cells odlingskolv för virusförökning. (B) CPE på Vero-celler efter att ha infekterats med ZIKV dag 1 efter infektion vid 100x förstoring. (C) CPE på Vero-celler efter att ha infekterats med ZIKV dag 2 efter infektion vid 100x förstoring. (D) CPE på Vero-celler efter att ha infekterats med ZIKV dag 3 efter infektion vid 100x förstoring. (E) Vero-celler vid 40x förstoring visade 70%-90% sammanflöde i en 24-hålsplatta efter 24 timmars inkubation för viruskvantifiering. Skalstapel: 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Bild av en skanning, räkning och kontrollplatta i 96-hålsformat med hjälp av en kommersiell programvaruanalysator. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Arbetsflöde för färgning för den foci bildande analysen. Färgningsprocesserna inklusive cellfixering, permeabilisering, blockering, antikroppsbindning och inkubation med peroxidassubstrat. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: Foci-bildande analys för ZIKV P6-740 i 24-hålsplattor vid olika tidpunkter. (A) Foci är mindre tydliga på dag 2 (48 timmar) efter infektion. (B) Optimal foci storlek kan ses på dag 2,5 (60 timmar) efter infektion. (C-E) Foci har slagit samman dag 3 (72 timmar), dag 3,5 (84 timmar) och dag 4 (96 timmar) efter infektion. (F) Negativ kontroll av plattan. Skalstapel: 1 000 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 5
Figur 5: Foci-formningsanalys för ZIKV P6-740 i 96-hålsplattor vid olika tidpunkter. (A) Foci är mindre distinkta för att räknas på den kommersiella programvaruanalysatorn dag 1 (24 timmar) efter infektion. (B) Foci är mindre distinkta för att räknas på den kommersiella mjukvaruanalysatorn på dag 1,5 (36 timmar) efter infektion. (C) Optimal foci storlek kan ses på dag 2 (48 timmar) efter infektion. (D,E) Foci har slagit sig samman dag 2,5 (60 timmar) och dag 3 (72 timmar) efter infektion. (F) Negativ kontroll av plattan. Skalstapel: 1 000 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Kompletterande bild 1: Skärmbilder av startsidan för analysatorn för kommersiell programvara. (A) Växla sviten till valfri tillämplig på den kommersiella programvaruanalysatorn. Klicka på "OK" när du är klar. (B) För att börja skanna på den kommersiella programvaruanalysatorn, klicka på "Skanna" och klicka sedan på "Fullständig plåtskanning". Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 2: Skärmbilder för att visa "Fångstformat" och det valda centreringsläget som "Användarverifierad automatisk förjustering" på den kommersiella programvaruanalysatorn. (A) För att se fångstformatet, klicka på "Dashboard" och välj 96-brunnsformatet som fångstformat. (B) För centreringsläge, välj "Auto Prealignment User Verified". Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 3: Placering av 96-brunnars platta på den kommersiella programvaruanalysatorns plattläsarfack och en skärmdump för att kalibrera positionerna för brunnarna A1, A12 och H1. (A) Placera plattan uppåt med rad A överst. (B) För att kalibrera positionerna för brunnarna A1, A12 och H1, använd knapparna "Upp, Ner, Vänster, Höger". När du är klar klickar du på "Bekräfta". Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 4: Skärmbilder för att välja mappar som innehåller skannade plåtar för räkning på den kommersiella programvaruanalysatorn och "Steg 2 av 5: Definiera räkneparametrar". (A) För att räkna de skannade plåtarna, klicka på "Ladda plåt(ar)". Markera hela mappen och klicka på "Välj" för att importera de skannade plåtarna. (B) Justera räkneparametrarna. Klicka på "Nästa" när parametrarna är inställda. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 5: Skärmbilder av den kommersiella programvaruanalysatorn "Steg 3 av 5: Välj/avmarkera brunnar" och "Steg 4 av 5: Utgångsinställningar". (A) Välj och avmarkera de brunnar som ska räknas och klicka på "Nästa" när du är klar. (B) För utdatainställningar, klicka på "Visa/ändra utdatainställningar" för att kontrollera om inställningarna är lämpliga (t.ex. bildformat). Klicka på "Spara och avsluta" när du är klar och klicka sedan på "Nästa". Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande bild 6: Skärmbilder av den kommersiella programvaruanalysatorn "Steg 5 av 5: Starta AutoCount" och sidan för kvalitetskontroll. (A) När du är redo för plåträkning klickar du på "Starta AutoCount". (B) På sidan för kvalitetskontroll, markera hela mappen för att importera den räknade plattan, klicka på "Välj" och klicka sedan på "Starta QC". Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande bild 7: Skärmbilder av sidan för kvalitetskontroll av den kommersiella programvaruanalysatorn. (A) Dubbelklicka på varje brunn för att granska fläckar. Klicka på "Räkna" för att ta bort en fläck. Kryssa i "Fläckar: Ta bort". (B) Trippelklicka åt vänster för att ta bort fläckar. Högerklicka för att avsluta och klicka sedan på "Ja". Klicka här för att ladda ner den här filen.

Tilläggsfigur 8: Foci-formningsanalys för ZIKV P6-740 i 24-hålsplattor vid olika tidpunkter. En tiofaldig seriell utspädning (10-1 till 10-5) utfördes på ZIKV P6-740 och infektion utfördes på Vero-celler i duplikat, inklusive en negativ kontroll. En rådatabild togs med hjälp av ett stereomikroskop, där skalstrecket visade 1 000 μm. (A) Dag 2 (48 timmar) efter infektion. (B) Dag 2,5 (60 timmar) efter infektion. (C) Dag 3 (72 timmar) efter infektion. (D) Dag 3,5 (84 timmar) efter infektion. (E) Dag 4 (96 timmar) efter infektion. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Tilläggsfigur 9: Foci-formningsanalys för ZIKV P6-740 i 96-hålars plattor vid olika tidpunkter. En tiofaldig seriell utspädning (10-1 till 10-5) utfördes på ZIKV P6-740 och infektion utfördes på Vero-celler i duplikat, inklusive en negativ kontroll. En rådatabild togs med hjälp av ett stereomikroskop, där skalstrecket visade 1 000 μm. (A) Dag 1 (24 timmar) efter infektion. (B) Dag 1,5 (36 timmar) efter infektion. (C) Dag 2 (48 timmar) efter infektion. (D) Dag 2,5 (60 timmar) efter infektion. (E) Dag 3 (72 timmar) efter infektion. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det finns flera analyser för att bestämma virustiter; PFA har ett liknande viruskvantifieringsprotokoll som FFA, där virusinokulet späds ut så att enskilda plack eller härdar kan urskiljas. Efter färgning indikerar varje plack eller fokus en enda infektiös partikel i inokulet19. PFA färgas med kristallviolett för att visualisera plackbildning orsakad av celllys eller död. Därför är PFA mer tidskrävande, eftersom det kräver längre tid för viruset att orsaka CPE, och det är endast begränsat till de virus som inducerar celllys eller död. Många laboratorier har framgångsrikt använt FFA för att bestämma infektiösa virustitrar för flavivirus, inklusive ZIKV 19,20,21,22,23,24,25. FFA är en cellbaserad kolorimetrisk immundetektionsmetod som detekterar virusantigenet med antikroppar och därför identifierar fokusområdena hos infekterade celler med hjälp av immunfärgningstekniken, men inte plack12,26. FFA erbjuder vissa fördelar för ZIKV jämfört med PFA. En klar fördel är att den är baserad på antikroppsigenkänning av virala komponenter utan urskiljbara CPE. Dessutom är det användbart att använda virusspecifika antikroppar för att identifiera olika virus eller virala serotyper i blandade populationer27. Därför är FFA mer specifik än PFA eftersom den mäter alla virusinfektioner och inte är beroende av de virus som orsakar tillräckligt med celldöd för att bilda ett synligt plack28. FFA har också en kortare inkubationstid än PFA, vilket kräver en uppenbar CPE som innebär celllys och död. Slutligen, med hjälp av en 96-brunnars platta, ger FFA-metoden fördelen att använda fler replikat och större utspädningar för att detektera och titrera viruset27,29. Dessutom kan den rapporterade FFA-analysen enkelt anpassas för virusneutraliseringstester och metoder för att screena för antivirala föreningar. Att införliva kommersiella eller kostnadsfria automatiserade cellräkningsinstrument eller programvara kan ytterligare förbättra användbarheten (konsistens, noggrannhet, genomströmning) av FFA och dess tillhörande metoder.

När man jämför 24-hålsplattan med 96-hålsplattan är det viktigt att notera att 24-hålsformatet kräver att ett större antal celler odlas i monolagerkulturer, samt större mängder media och viruslager. Som ett resultat av detta kanske 24-hålars plattformatet inte är lämpligt för användning med prover med begränsade volymer. Den här begränsningen kan lösas genom att använda 96-brunnsformatet, enligt beskrivningen i det här dokumentet. För det första kräver formatet med 96 brunnar mindre material, vilket gör det till ett mer kostnadseffektivt alternativ. Dessutom möjliggör den automatiska räkningen av färgade virushärdar i 96-hålsformatet hög genomströmning och snabb analys, vilket inte är möjligt i 24-brunnsformatet, vilket kräver manuell räkning. Denna automatiserade räkningsprocess ökar också reproducerbarheten och minskar subjektiviteten jämfört med manuell räkning, vilket leder till mer exakta och tillförlitliga resultat av FFA. Därför rekommenderas 96-hålsformatet med automatiserade bildsystem starkt för laboratorier som kräver hög genomströmning och tillförlitlig viruskvantifiering.

Å andra sidan använder vissa människor den immunofluorescerande fokusanalysen för att detektera ZIKV 25,27,28,30,31. Immunofluorescensfokusanalysen är parallell med FFA, förutom att den utförs genom immunfärgning av antigenerna med fluorokromkonjugerade specifika antikroppar, följt av räkning av infektionshärdar under ett fluorescensmikroskop25. Denna analys använder mer kostsamma reagenser och behöver fluorescensmikroskopi för att slutföra analysen. Därför är immunfluorescensfokusanalysen begränsad till bättre utrustade laboratorier, såsom remisslaboratorier. Det är inte lätt att använda denna analys i en resurskrävande miljö.

Även om FFA har många fördelar, har den också vissa begränsningar. Jämfört med andra analyser, såsom PFA, involverar FFA fler steg under färgningsprocesserna. Även om stegen efter fixering är flexibla och tillåter övernattning eller längre pauser, tar färgningen av fokusen fortfarande längre tid att slutföra. Dessutom kräver FFA specifika eller korsreagerande antikroppar i färgningsprocessen, vilket begränsar dess tillämplighet för att identifiera och kvantifiera nya eller nya virus. Dessutom är kostnaden för FFA högre jämfört med PFA, som endast kräver kristallviolett för färgning. Utöver det är det värt att notera att den automatiserade räkningsprocessen (96-brunnsformat) endast kan utföras i ett laboratorium med lämplig utrustning; Därför kommer den inte att vara lämplig för laboratorier utan nödvändig utrustning.

Sammanfattningsvis rapporterar vi detaljerade protokoll för förökning och kvantifiering av ZIKV med hjälp av den cellbaserade kolorimetriska immundetektionsanalysen eller FFA i 24-brunnars platt- och 96-brunnars plattformat. Metoden erbjuder en rad praktiska fördelar jämfört med den klassiska PFA. Den är snabbare och kan användas för tillämpningar med hög genomströmning när den används med ett automatiserat bildsystem för fokusräkning. Standardiseringen av tillförlitliga protokoll för denna studie kommer i hög grad att bidra till zikaforskningen och kan också anpassas brett för att kvantifiera andra kliniskt viktiga virus.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att de inte har några motstridiga intressen.

Acknowledgments

Denna forskning fick stöd från Malaysias ministerium för högre utbildning inom ramen för Long-Term Research Grant Scheme (LRGS MRUN Phase 1: LRGS MRUN/F1/01/2018) och finansiering för programmet Higher Institution Centre of Excellence (HICoE) (MO002-2019). Figur 3 i denna studie som visar arbetsflödet för färgning för den foci bildande analysen är anpassad från "DAB Immunohistochemistry" av BioRender.com (2022). Hämtad från https://app.biorender.com/biorender-templates/t-5f3edb2eb20ace00af8faed9-dab-immunohistochemistry.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 µm Polyethersulfone syringe filter Sartorius S6534-FMOSK
1.5 mL microcentrifuge tube Nest 615601
10 mL sterile serological pipette Labserv 14955156
1x Dulbecco’s phosphate-buffered saline (dPBS) Gibco 14190-136
2.0 mL Screw cap tube  Axygen SCT-200-SS-C-S
24-well plate Corning 3526
25 mL Sterile serological pipettes Labserv 14955157
3,3'Diaminobenzidine (DAB) peroxidase substrate Thermo Scientific 34065
37 °C incubator with 5% CO2 Sanyo MCO-18AIC
5 mL sterile serological pipette Labserv 14955155
50 mL centrifuge tube Falcon LAB352070
75 cm2 tissue culture flask  Corning 430725U
96-well plate Falcon 353072
Anti-flavivirus monoclonal antibody, 4G2 (clone D1-4G2-4-15) MilliporeSigma MAB10216
Autoclaved 20x Phosphate buffered saline (PBS) N/A N/A 22.8 g of 8 mM Na2HPO4, 4.0 g of 1.5 mM KH2PO4, 160 g of 0.14 M NaCl, 4.0 g of 2.7 mM KCl, 1 L of MilliQ H2O
Biological safety cabinet, Class II Holten HB2448
CTL S6 Universal ELISpot/FluoroSpot Analyzer ImmunoSpot, Cellular Technology Limited (CTL) CTL-S6UNV12 Commercial software analyzer
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco 12800-017
Fetal bovine serum (FBS) Bovogen SFBS
Goat anti-mouse IgG secondary antibody conjugated with horseradish peroxidase (HRP) MilliporeSigma 12-349
Hemacytometer Laboroptik LTD Neubauer improved
IGEPAL CA-630 detergent Sigma-Aldrich I8896 Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanolIGEPAL 
Inverted microscope ZEISS TELAVAL 31
Laboratory rocker FINEPCR CR300
L-Glutamine Gibco 25030-081
Low viscosity carboxymethyl cellulose (CMC) Sigma-Aldrich C5678
Multichannel micropipette (10 - 100 µL) Eppendorf 3125000036
Multichannel micropipette (30 - 300 µL) Eppendorf 3125000052
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
Penicillin-streptomycin Gibco 15140-122
Single channel pipettes (10 - 100 µL) Eppendorf 3123000047
Single channel pipettes (100 - 1000 µL) Eppendorf 3123000063
Single channel pipettes (20 - 200 µL) Eppendorf 3123000055
Skim milk Sunlac Low Fat N/A Prepare 3% Skim milk in 1x PBS for blocking stage in staining
Sodium Hypochlorite Clorox N/A To disinfect any discarded infectious liquid waste from flasks/plates
Stereomicroscope Nikon SMZ1000
Syringe disposable, Luer Lock, 10 mL with 21 G Needle Terumo SS10L21G
Vero African green monkey kidney cells  - ECACC 88020401 Received from collaborator. However, Vero cells obtained from other suppliers should be able to be used with some optimization.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dick, G. W. A., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. Zika virus. I. Isolations and serological specificity. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 46 (5), 509-520 (1952).
  2. Dick, G. W. A., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. Zika virus. II. Pathogenicity and physical properties. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 46 (5), (1952).
  3. Duffy, M. R., et al. Zika virus outbreak on Yap Island, Federated States of Micronesia. The New England Journal of Medicine. 360 (24), 2536-2543 (2009).
  4. Musso, D., Nilles, E. J., Cao-Lormeau, V. M. Rapid spread of emerging Zika virus in the Pacific area. Clinical Microbiology and Infection. 20 (10), O595-O596 (2014).
  5. Cao-Lormeau, V. -M., et al. Zika virus, French polynesia, South pacific, 2013. Emerging Infectious Diseases. 20 (6), 1085-1086 (2014).
  6. Dupont-Rouzeyrol, M., et al. Co-infection with Zika and dengue viruses in 2 patients, New Caledonia, 2014. Emerging Infectious Diseases. 21 (2), 381-382 (2015).
  7. Roth, A., et al. Concurrent outbreaks of dengue, chikungunya and Zika virus infections-an unprecedented epidemic wave of mosquito-borne viruses in the Pacific 2012-2014. Euro Surveillance. 19 (41), 20929 (2014).
  8. Tognarelli, J., et al. A report on the outbreak of Zika virus on Easter Island, South Pacific, 2014. Archives of Virology. 161 (3), 665-668 (2016).
  9. Oehler, E., et al. Zika virus infection complicated by Guillain-Barre syndrome-case report, French Polynesia, December 2013. Euro Surveillance. 19 (9), 20720 (2014).
  10. Faria, N. R., et al. Zika virus in the Americas: early epidemiological and genetic findings. Science. 352 (6283), 345-349 (2016).
  11. Rapid risk assessment: Zika virus epidemic in the Americas: potential association with microcephaly and Guillain-Barré syndrome - 4th update. European Centre for Disease Prevention and Control. , Stockholm. Available from: https://www.ecdc.europa.eu/en/publications-data/rapid-risk-assessment-zika-virus-epidemic-americas-potential-association (2015).
  12. Payne, S. Methods to study viruses. Viruses. , 37-52 (2017).
  13. Bustin, S. A., Mueller, R. Real-time reverse transcription PCR (qRT-PCR) and its potential use in clinical diagnosis. Clinical Science. 109 (4), 365-379 (2005).
  14. Sedlak, R. H., Jerome, K. R. Viral diagnostics in the era of digital polymerase chain reaction. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 75 (1), 1-4 (2013).
  15. Bae, H. -G., Nitsche, A., Teichmann, A., Biel, S. S., Niedrig, M. Detection of yellow fever virus: a comparison of quantitative real-time PCR and plaque assay. Journal of Virological Methods. 110 (2), 185-191 (2003).
  16. Dulbecco, R. Production of plaques in monolayer tissue cultures by single particles of an animal virus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 38 (8), 747-752 (1952).
  17. Nahapetian, A. T., Thomas, J. N., Thilly, W. G. Optimization of environment for high density Vero cell culture: effect of dissolved oxygen and nutrient supply on cell growth and changes in metabolites. Journal of Cell Science. 81, 65-103 (1986).
  18. Agbulos, D. S., Barelli, L., Giordano, B. V., Hunter, F. F. Zika virus: quantification, propagation, detection, and storage. Current Protocols in Microbiology. 43, (2016).
  19. Brien, J. D., Lazear, H. M., Diamond, M. S. Propagation, quantification, detection, and storage of West Nile virus. Current Protocols in Microbiology. 31, (2013).
  20. Bolívar-Marin, S., Bosch, I., Narváez, C. F. Combination of the focus-forming assay and digital automated imaging analysis for the detection of dengue and Zika viral loads in cultures and acute disease. Journal of Tropical Medicine. 2022, 2177183 (2022).
  21. Dangsagul, W., et al. Zika virus isolation, propagation, and quantification using multiple methods. PLoS One. 16 (7), e0255314 (2021).
  22. Brien, J. D., et al. Genotype-specific neutralization and protection by antibodies against dengue virus type 3. Journal of Virology. 84 (20), 10630-10643 (2010).
  23. Lazear, H. M., et al. A mouse model of Zika virus pathogenesis. Cell Host & Microbe. 19 (5), 720-730 (2016).
  24. Miner, J. J., et al. Zika virus infection during pregnancy in mice causes placental damage and fetal demise. Cell. 165 (5), 1081-1091 (2016).
  25. Kang, W., Shin, E. -C. Colorimetric focus-forming assay with automated focus counting by image analysis for quantification of infectious hepatitis C virions. PLoS One. 7 (8), e43960 (2012).
  26. Brien, J. D., et al. Isolation and quantification of Zika virus from multiple organs in a mouse. Journal of VIsualized Experiments. (150), e59632 (2019).
  27. Payne, A. F., Binduga-Gajewska, I., Kauffman, E. B., Kramer, L. D. Quantitation of flaviviruses by fluorescent focus assay. Journal of Virological Methods. 134 (1-2), 183-189 (2006).
  28. Moser, L. A., et al. Growth and adaptation of Zika virus in mammalian and mosquito cells. PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (11), e0006880 (2018).
  29. Ishimine, T., Tadano, M., Fukunaga, T., Okuno, Y. An improved micromethod for infectivity assays and neutralization tests of dengue viruses. Biken Journal. 30 (2), 39-44 (1987).
  30. Leiva, S., et al. Application of quantitative immunofluorescence assays to analyze the expression of cell contact proteins during Zika virus infections. Virus Research. 304, 198544 (2021).
  31. Lee, E. M., Titus, S. A., Xu, M., Tang, H., Zheng, W. High-throughput Zika viral titer assay for rapid screening of antiviral drugs. ASSAY and Drug Development Technologies. 17 (3), 128-139 (2019).

Tags

Immunologi och infektion utgåva 194 Zikavirus (ZIKV) Flavivirus medfödda hjärnabnormiteter Guillain-Barrãs© syndrom virologi fokusbildande analys (FFA) viralt antigen peroxidasimmunfärgningsteknik 24-brunnsformat 96-brunnsformat Foci-storleksoptimering Vero-celler inkubation färgningsprocesser cellfixering permeabilisering blockering antikroppsbindning peroxidassubstrat
Virusförökning och cellbaserad kolorimetrisk kvantifiering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tan, J. Y., Wong, J. E., Zainal, N., … More

Tan, J. Y., Wong, J. E., Zainal, N., AbuBakar, S., Tan, K. K. Virus Propagation and Cell-Based Colorimetric Quantification. J. Vis. Exp. (194), e64578, doi:10.3791/64578 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter