Summary
Dit manuscript presenteert een gedetailleerd protocol om de 3D-celwanddynamiek van levend mosweefsel in beeld te brengen, waardoor de onthechting van celwanden in ggb-mutanten en verdikking van celwandpatronen in het wilde type tijdens de ontwikkeling gedurende een lange periode mogelijk wordt.
Abstract
Time-lapse beeldvorming met fluorescentiemicroscopie maakt observatie van de dynamische veranderingen van groei en ontwikkeling op cellulair en subcellulair niveau mogelijk. Over het algemeen vereist de techniek voor waarnemingen over een lange periode transformatie van een fluorescerend eiwit; voor de meeste systemen is genetische transformatie echter tijdrovend of technisch niet beschikbaar. Dit manuscript presenteert een protocol voor 3D time-lapse beeldvorming van celwanddynamica over een periode van 3 dagen met behulp van calcofluorkleurstof (die cellulose in de celwand van de plant kleurt), ontwikkeld in het mos Physcomitrium patens. Het calcofluorkleurstofsignaal van de celwand is stabiel en kan 1 week meegaan zonder duidelijk verval. Met behulp van deze methode is aangetoond dat het loslaten van cellen in ggb-mutanten (waarbij het eiwit geranylgeranyltransferase-I bèta-subeenheid wordt uitgeschakeld) wordt veroorzaakt door ongereguleerde celexpansie en celwandintegriteitsdefecten. Bovendien veranderen de patronen van calcofluorkleuring in de loop van de tijd; minder intens gekleurde gebieden correleren met de toekomstige celuitbreidings-/vertakkingsplaatsen in het wilde type. Deze methode kan worden toegepast op vele andere systemen die celwanden bevatten en die kunnen worden gekleurd door calcofluor.
Introduction
Celwanden van planten ondergaan dynamische veranderingen tijdens celexpansie en -ontwikkeling 1,2,3. Het handhaven van de integriteit van de celwand is van cruciaal belang voor de hechting van plantencellen tijdens groei en ontwikkeling, evenals voor de reactie op omgevingssignalen. Hoewel het visualiseren van celwanddynamiek van levende cellen over een lange periode van cruciaal belang is om te begrijpen hoe celhechting wordt gehandhaafd tijdens ontwikkeling en aanpassing aan omgevingsveranderingen, zijn de huidige methoden voor het direct observeren van celwanddynamiek nog steeds een uitdaging.
Time-lapse beeldvorming van cellulaire veranderingen kan informatieve ontwikkelingsdynamiek van een organisme bieden met behulp van een fluorescentiemicroscoop met hoge resolutie 4,5,6,7. Hoewel time-lapse 3D-beeldvorming veel potentieel heeft voor het bestuderen van dynamische veranderingen van celvorm tijdens groei en ontwikkeling, vereist de techniek normaal gesproken transformatie van een fluorescerend eiwit 4,5,6,7. Voor de meeste systemen zijn genetische transformaties echter tijdrovend of technisch uitdagend. Als alternatief zijn fluorescerende kleurstoffen die zich hechten aan cellulaire componenten al lang beschikbaar. De fluorescerende kleurstoffen kunnen fluorescerend licht uitzenden na bestraling met licht van een bepaalde golflengte. Veel voorkomende voorbeelden zijn Edu, DAPI, PI, FM4-64 en calcofluor white 8,9,10. Een groot nadeel is echter dat deze kleurstoffen meestal alleen kunnen worden gebruikt in vast weefsel of voor korte experimenten, deels vanwege de schade die ze aan de cel toebrengen 8,9,10.
Met het hier gepresenteerde protocol zijn calcofluorsignalen stabiel wanneer calcofluorwit in het medium wordt gemengd tijdens time-lapse-experimenten in de mos P. patens. Met behulp van deze methode werd het loslaten van cellen in ggb-mutanten met behulp van 3D time-lapse beeldvorming waargenomen gedurende een periode van 3 dagen3 (figuur 1). Deze methode kan worden toegepast op vele andere systemen die celwanden bevatten en die kunnen worden gekleurd door calcofluor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Zie de tabel met materialen voor de lijst met materialen en apparatuur en tabel 1 voor de lijst met oplossingen die in dit protocol moeten worden gebruikt.
1. Voorbereiding van planten voor glazen bodemschalen
- Kweek het protonemale weefsel van het mos in BCDAT agar medium in een petrischaaltje van 13 cm onder constant wit licht (~50 μmol m-2 s-1) gedurende 7 dagen bij 25 °C in de groeikamer.
- Filstaleer het calcofluorwit en bewaar bij 4 °C tot gebruik. Het reagens is enkele maanden stabiel.
- Dispergeer het 7 dagen oude mosweefsel in een microbuisje van 1,5 ml met 20 μL gesteriliseerd water. Zorg ervoor dat het protonemale weefsel van het mos voldoende verspreid is als kleine stukjes in het water. Gebruik voor wild type (WT) een tang om de protonemata te scheiden; gebruik voor de ggb-mutant een P-1000-pipet.
- Voeg 10 μL van het gesteriliseerde calcofluorwit toe aan de microbuis van 1,5 ml en laat de microbuis 2 minuten rechtop in de kap staan voor kleuring.
- Meng de planten onmiddellijk na het kleuren met 200 μL gekoeld BCDATG, met BCDAT-medium aangevuld met 0,5% (w/v) glucose en 0,4% (w/v) gellangom, door vijf keer te pipetteren met een P-1000 pipet.
OPMERKING: Zorg ervoor dat het BCDATG-medium voldoende is afgekoeld (net voordat het medium stolt) om stress van de planten te voorkomen. - Breng het mengsel met de planten en het BCDATG-medium over in een glazen basisschaal met een diameter van 27 mm. Zorg ervoor dat het volume BCDATG voor het mengen van de cellen niet meer dan 200 μL is en dat de 200 μL BCDATG met monsters gelijkmatig wordt verdeeld over het oppervlak van de 7 mm glazen bodemschaal om een dunne laag film te produceren, zodat de monsters zich tijdens de beeldvorming binnen de objectieve werkafstand bevinden.
- Na 2 minuten stollen bij kamertemperatuur, dek je de dunne laag af met 3 ml afgekoelde BCDATG en laat je hem 10 minuten opstijven om weer te stollen.
OPMERKING: Zorg ervoor dat stappen 1.2-1.5 worden uitgevoerd in een steriele kap om besmetting te voorkomen. - Teken op de bodem van de schaal negen lijnen elk in parallelle en loodrechte richtingen (figuur 2). Markeer de rijen met tekens van a tot h en markeer de kolommen met cijfers van 1 tot 8. Gebruik boven, onder, rechts, midden en links om de posities binnen elk vierkant te markeren. Als een plant zich bijvoorbeeld in een vierkant in de tweede rij en de zesde kolom bevindt en zich in de linkerbovenhoek van het vierkant bevindt, krijgt deze plant de naam "b6_upper_left".
- Precultuur de glazen bodemschaal met de planten onder rood licht gedurende 5 dagen bij 25 °C in de groeikamer en vervolgens gedurende 1-2 dagen onder wit licht voordat deze elke dag gedurende maximaal 3 dagen wordt onderworpen aan time-lapse-beeldvorming. Voor WT, precultuur de planten in zwak rood licht (0,5 μmol m-2 s-1) van het bovenstaande gedurende 5 dagen om de fototrope respons van de protonemata te induceren, zodat de planten zich aan de bodem van de schotels kunnen hechten11.
OPMERKING: Het zwakke rode licht wordt geleverd door een wit licht door een 3 mm dik rood acryl plastic filter in lichtdichte dozen te laten gaan. Voor ggb-mutanten is preculturatie bij rood licht optioneel, omdat de ggb-mutanten geen fototrope respons hebben3.
2. Beeldvorming en 3D-reconstructie
- Plaats de glazen bodemschaal met planten op het podium van een omgekeerde confocale microscoop, met de glazen bodem naar het doel gericht. Gebruik een confocale microscoop voor de visualisatie van calcofluor met een 20x objectieflens. Maak foto's met de 405 nm laser, het gaatje op 1,0, HV-gain op 100, offset-achtergrondaanpassing op 0, Laser Power op 5%-7%, een scangrootte van 1.024 x 1.024 en een scansnelheid van 1/2 frame/s. Verzamel optische secties uit de z-serie van 17-30 z-series met een stapgrootte van 1,0 μm. Geef de afbeeldingen een naam met de code in stap 1.6, zoals 'b6_upper_left-day0', en sla deze op.
- Selecteer het DAPI-kanaal in Acquisitie en vink het selectievakje Z in ND Acquisition aan. Als u de onder- en bovengrenzen voor de Z-stack wilt instellen, klikt u op de knoppen Boven en Onder .
- Als u de 3D-afbeeldingen wilt reconstrueren, opent u het .nd2-bestand (figuur 3A; zie Materiaaltabel) en klikt u op volume (figuur 3B).
3. Dezelfde planten op verschillende tijdstippen in beeld brengen
- Plaats na elke beeldvorming de glazen basisschaal terug in de groeikamer.
- Herhaal stap 2.1 voor beeldvorming en 3D-reconstructie.
OPMERKING: Om dezelfde planten te vinden, gebruikt u de code vermeld in stap 1.6 en geeft u de naam "b6_upper_left-day1" of "b6_upper_left-day2", afhankelijk van de leeftijd van planten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Deze methode maakt het mogelijk om de celwanddynamiek tijdens de ontwikkeling in wildtype- en ggb-mutanten te observeren (figuur 1). De resultaten toonden aan dat gebieden met minder verdikking van de celwand correleren met de celexpansie / vertakkingsplaatsen, waardoor de voorspelling van expansie / vertakkingslocaties in het wilde type mogelijk is (figuur 1A). Het oppervlak van de celwanden in ggb-mutanten werd tijdens de ontwikkeling verscheurd als gevolg van ongecontroleerde celexpansie3 (figuur 1B). Bovendien is het kleuringssignaal van het gebroken oppervlak van ggb-mutanten (dat oudere cellulose is) sterker dan het celoppervlak (dat jongere cellulose is) onder het gebroken celwandoppervlak.
Figuur 1: 3D-tijdreeks van mosontwikkeling. (A,B) Dynamische veranderingen in dwarswanden werden aangetoond door calcofluorwitte kleuring (die cellulose kleurt) in WT (A) en ggb-mutanten (B). Voor ggb-mutanten (B) geven witte streepjeslijnen onder elke afbeelding de gebroken oppervlaktecelwanden op de uitzettende cellen aan en oranje lijnen geven de cellen onder het celwandoppervlak aan in ggb. Paneel B is met toestemming van3 herdrukt. Merk op dat de verschillen in calcofluor wit signaal kunnen worden gedetecteerd op de oppervlakteposities van de cellen, en minder dichte kleuringsgebieden (pijlpunten) zijn gecorreleerd aan de celexpansie / vertakkingsplaatsen. Schaalstaven = 20 μm. Afkortingen: d = dagen; WT = wild type; ggb = geranylgeranyltransferase-I bèta. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Markeringslocatie van planten. Op de bodem van de schotel werden negen lijnen elk in parallelle en loodrechte richtingen getekend om de locatie van vierkanten te markeren. Tekens a tot h werden gebruikt voor het markeren van rijen en de nummers 1 tot en met 8 werden gebruikt voor het markeren van kolommen. Boven, onder, rechts, midden en links werden gebruikt voor het markeren van posities binnen elk vierkant. Als een plant (aangegeven door een groene stip) zich bijvoorbeeld in een vierkant op de tweede rij en de zesde kolom bevond en in het linkerbovengedeelte was geplaatst, kreeg de plant de naam b6_upper_left. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Afbeelding 3: Reconstructie van 3D-afbeeldingen met behulp van een nd2 z-stack-bestand. (A) Open een nd2-bestand in de NIS-elementenviewer. Klik op LUT's (cirkel) om het contrast en de helderheid van afbeeldingen aan te passen en klik op Volume (vierkant) om de 3D-afbeelding te reconstrueren. (B) Gereconstrueerd 3D-beeld van A. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel 1: Lijst van oplossingen die in dit protocol worden gebruikt. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Time-lapse 3D-reconstructie, of 4D-beeldvorming, is een krachtig hulpmiddel voor het observeren van de dynamiek van cellulaire morfologie tijdens ontwikkelingsprocessen. In dit protocol kan door het mengen van het calcofluorwit in het medium de dynamiek van 3D cellulaire morfologie worden waargenomen in het mos P. patens. Met behulp van deze methode zagen we dat het oppervlak van celwanden in ggb-mutanten tijdens ontwikkeling3 uit elkaar wordt gescheurd. Bovendien is de verminderde verdikking van celwanden gecorreleerd met de celexpansie / vertakkingslocaties in wildtype, waardoor de uitbreidings- / vertakkingslocaties kunnen worden voorspeld. Verder, omdat calcofluorwit kan worden gebruikt met andere kleurstoffen, zoals microsferen, kan aanvullende informatie over celexpansie worden waargenomen3.
Er zijn twee redenen die kunnen verklaren hoe de calcofluorkleurstof dagenlang aan planten kan binden zonder het moleculaire doelwit te beïnvloeden / beschadigen. Ten eerste kan de lage werkconcentratie (10 μL in 200 μL BCDATG-medium, of 5%) voldoende laag zijn om de mosprotonemata niet te beïnvloeden. Ten tweede kan de calcofluor het volwassen stadium van cellulose kleuren, omdat het kleuringssignaal veel sterker is in het basale deel van wild type (dat ouder weefsel is) dan het apicale gebied van de apicale cel (dat jonger weefsel is), en het gebroken celwandoppervlak van ggb-mutanten (wat oudere cellulose is) is sterker dan de cellen (dat is jongere cellulose) onder het gebroken celwandoppervlak.
Dit protocol is gebruikt voor mosweefsel, dat eenvoudig van structuur is. Het huidige protocol kan ook worden toegepast op andere systemen met eenvoudige structuren, zoals wortelharen en trichomen in bloeiende planten. Het valt echter nog te bezien of de calcofluor witte kleuring werkt voor andere systemen met meer cellagen, zoals stengels. Bovendien, omdat het calcofluorwit wordt gemengd met het medium, moet het te vervlekken weefsel in het medium worden ondergedompeld. Daarom kan optimalisatie nodig zijn om dit protocol toe te passen op andere systemen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen concurrerende of financiële belangen te hebben.
Acknowledgments
De auteurs bedanken Dr. Soucy Patricia en Betty Nunn van de Universiteit van Louisville voor hun hulp met de confocale microscoop. Dit werk werd gefinancierd door de National Science Foundation (1456884 M.P.R.) en door een National Science Foundation Cooperative Agreement (1849213 M.P.R.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-mm-thick red plastic light filter | Mitsubishi | no.102 | |
| 27 mm diameter glass base dish | Iwaki | 3930-035 | |
| Agar | Sigma | A6924 | |
| Calcofluor white | Sigma | 18909-100ML-F | Calcofluor White M2R, 1 g/L and Evans blue, 0.5 g/L |
| Confocal microscope | Nikon | A1 | NIS element software; .nd2 file in NIS-elements Viewer, download from https://www.microscope.healthcare.nikon. |
| Fluorescence microscope | Nikon | TE200 | Equipped with a DS-U3 camera; |
| Gellan gum | Nacali Tesque | 12389-96 | |
| Plant Growth Chambers | SANYO | Sanyo MLR-350H | |
| Sterilized syringe 0.22 μm filter | Millipore | SLGV033RS |
References
- Anderson, C. T., Kieber, J. J. Dynamic construction, perception, and remodeling of plant cell walls. Annual Review of Plant Biology. 71, 39-69 (2020).
- Vaahtera, L., Schulz, J., Hamann, T. Cell wall integrity maintenance during plant development and interaction with the environment. Naure Plants. 5 (9), 924-932 (2019).
- Bao, L., et al. The cellular function of ROP GTPase prenylation important for multicellularity in the moss Physcomitrium patens. Development. 149 (12), (2022).
- Colin, L., et al. Imaging the living plant cell: From probes to quantification. The Plant Cell. 34 (1), 247-272 (2022).
- Fang, Y., Spector, D. L. Live cell imaging of plants. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (2), (2010).
- Goh, T. Long-term live-cell imaging approaches to study lateral root formation in Arabidopsis thaliana. Microscopy. 68 (1), 4-12 (2019).
- Hamant, O., Das, P., Burian, A. Time-lapse imaging of developing shoot meristems using a confocal laser scanning microscope. Methods in Molecular Biology. 1992, 257-268 (2019).
- Rigal, A., Doyle, S. M., Robert, S. Live cell imaging of FM4-64, a tool for tracing the endocytic pathways in Arabidopsis root cells. Methods in Molecular Biology. 1242, 93-103 (2015).
- Yagi, N., et al. Advances in synthetic fluorescent probe labeling for live-cell imaging in plants. Plant & Cell Physiology. 62 (8), 1259-1268 (2021).
- Whitewoods, C. D., et al. CLAVATA was a genetic novelty for the morphological innovation of 3D growth in land plants. Current Biology. 28 (15), 2365-2376 (2018).
- Bao, L., et al. A PSTAIRE-type cyclin-dependent kinase controls light responses in land plants. Science Advances. 8 (4), 2116 (2022).
