Summary
Este manuscrito apresenta um protocolo detalhado para a imagem da dinâmica da parede celular 3D do tecido de musgo vivo, permitindo a visualização do descolamento das paredes celulares em mutantes ggb e do espessamento dos padrões da parede celular no tipo selvagem durante o desenvolvimento durante um longo período.
Abstract
A imagem de lapso de tempo com microscopia de fluorescência permite a observação das mudanças dinâmicas de crescimento e desenvolvimento nos níveis celular e subcelular. Em geral, para observações durante um longo período, a técnica requer a transformação de uma proteína fluorescente; no entanto, para a maioria dos sistemas, a transformação genética é demorada ou tecnicamente indisponível. Este manuscrito apresenta um protocolo para imagem de time-lapse 3-D da dinâmica da parede celular durante um período de 3 dias usando corante calcofluor (que cora celulose na parede celular da planta), desenvolvido no musgo Physcomitrium patens. O sinal de corante calcofluor da parede celular é estável e pode durar 1 semana sem decaimento óbvio. Usando este método, foi demonstrado que o descolamento de células em mutantes ggb (nos quais a subunidade beta da proteína geranilgeraniltransferase-I é nocauteada) é causado por expansão celular desregulada e defeitos de integridade da parede celular. Além disso, os padrões de coloração de calcofluor mudam ao longo do tempo; regiões coradas menos intensamente correlacionam-se com os futuros locais de expansão/ramificação celular no tipo selvagem. Este método pode ser aplicado a muitos outros sistemas que contêm paredes celulares e que podem ser corados por calcofluor.
Introduction
As paredes celulares das plantas sofrem alterações dinâmicas durante a expansão e o desenvolvimento celular 1,2,3. Manter a integridade da parede celular é fundamental para a adesão das células vegetais durante o crescimento e desenvolvimento, bem como para a resposta aos sinais ambientais. Embora a visualização da dinâmica da parede celular de células vivas durante um longo período de tempo seja fundamental para entender como a adesão celular é mantida durante o desenvolvimento e a adaptação às mudanças ambientais, os métodos atuais para observar diretamente a dinâmica da parede celular ainda são desafiadores.
A imagem de lapso de tempo de alterações celulares pode fornecer dinâmica de desenvolvimento informativa de um organismo usando um microscópio de fluorescência de alta resolução 4,5,6,7. Embora a imagem 3D de lapso de tempo tenha um grande potencial para estudar mudanças dinâmicas da forma celular durante o crescimento e desenvolvimento, a técnica normalmente requer a transformação de uma proteína fluorescente 4,5,6,7. No entanto, para a maioria dos sistemas, as transformações genéticas são demoradas ou tecnicamente desafiadoras. Como alternativa, os corantes fluorescentes que se ligam aos componentes celulares estão disponíveis há muito tempo. Os corantes fluorescentes podem emitir luz fluorescente após irradiação com luz de um certo comprimento de onda. Exemplos comuns são Edu, DAPI, PI, FM4-64 e calcofluor branco 8,9,10. Uma grande desvantagem, no entanto, é que esses corantes normalmente só podem ser usados em tecido fixo ou para experimentos curtos, em parte devido ao dano que causam à célula 8,9,10.
Com o protocolo aqui apresentado, os sinais de calcofluor são estáveis quando o calcofluor branco é misturado dentro do meio durante experimentos de lapso de tempo no musgo P. patens. Usando esse método, o descolamento de células em mutantes ggb usando imagens de lapso de tempo 3-D foi observado durante um período de 3 dias3 (Figura 1). Este método pode ser aplicado a muitos outros sistemas que contêm paredes celulares e que podem ser corados por calcofluor.
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Protocol
NOTA: Consulte a Tabela de Materiais para a lista de materiais e equipamentos e a Tabela 1 para a lista de soluções a serem usadas neste protocolo.
1. Preparação de plantas para pratos de fundo de vidro
- Cultivar o tecido protonemal de musgo em meio de ágar BCDAT em uma placa de Petri de 13 cm sob luz branca constante (~50 μmol m-2 s-1) por 7 dias a 25 °C na câmara de crescimento.
- Filtrar-esterilizar o calcofluor branco e conservar a 4 °C até à sua utilização. O reagente é estável por vários meses.
- Disperse o tecido de musgo de 7 dias de idade em um microtubo de 1,5 mL contendo 20 μL de água esterilizada. Certifique-se de que o tecido protonemal do musgo esteja suficientemente disperso como pequenos pedaços na água. Para o tipo selvagem (WT), use fórceps para separar os prótonos; para o mutante ggb , use uma pipeta P-1000.
- Adicione 10 μL do branco calcofluor esterilizado no microtubo de 1,5 mL e deixe o microtubo ereto no exaustor por 2 minutos para coloração.
- Imediatamente após a coloração, misture as plantas com 200 μL de BCDATG resfriado, contendo meio BCDAT suplementado com 0,5% (p/v) de glicose e 0,4% (p/v) de goma gelana, pipetando cinco vezes com uma pipeta P-1000.
NOTA: Certifique-se de que o meio BCDATG esteja resfriado o suficiente (pouco antes de o meio solidificar) para evitar o estresse das plantas. - Transfira a mistura contendo as plantas e o meio BCDATG para um prato de base de vidro de 27 mm de diâmetro. Certifique-se de que o volume de BCDATG para misturar as células não seja superior a 200 μL e que os 200 μL de BCDATG com amostras sejam distribuídos uniformemente na superfície da placa de fundo de vidro de 7 mm para produzir uma fina camada de filme, de modo que as amostras estejam dentro da distância de trabalho objetiva durante a imagem.
- Depois de solidificar por 2 min à temperatura ambiente, cubra a camada fina com 3 mL de BCDATG resfriado e deixe ajustar por 10 min para solidificar novamente.
NOTA: Certifique-se de que as etapas 1.2-1.5 sejam conduzidas em um exaustor estéril para evitar a contaminação. - No fundo do prato, desenhe nove linhas cada uma em direções paralelas e perpendiculares (Figura 2). Marque as linhas com caracteres de a a h e marque as colunas com números de 1 a 8. Use superior, inferior, direita, meio e esquerda para marcar as posições dentro de cada quadrado. Por exemplo, se uma planta está em um quadrado na segunda linha e na sexta coluna e está posicionada na parte superior esquerda do quadrado, então essa planta recebe o nome de "b6_upper_left".
- Pré-cultura do prato de fundo de vidro contendo as plantas sob luz vermelha por 5 dias a 25 °C na câmara de crescimento e, em seguida, sob luz branca por 1-2 dias antes de ser submetido a imagens de lapso de tempo todos os dias por até 3 dias. Para WT, pré-cultura das plantas em luz vermelha fraca (0,5 μmol m-2 s-1) do acima por 5 dias para induzir a resposta fototrópica dos prótonos, de modo que as plantas possam se fixar ao fundo dos pratos11.
NOTA: A luz vermelha fraca é fornecida passando uma luz branca através de um filtro de plástico acrílico vermelho de 3 mm de espessura em caixas à prova de luz. Para os mutantes ggb, a precultura em luz vermelha é opcional, pois os mutantes ggb não têm uma resposta fototrópica 3.
2. Imagem e reconstrução 3D
- Coloque o prato de fundo de vidro contendo plantas no palco de um microscópio confocal invertido, com o fundo de vidro voltado para a objetiva. Use um microscópio confocal para a visualização de calcofluor com uma lente objetiva de 20x. Tire imagens com o laser de 405 nm, o orifício em 1,0, o ganho de HV a 100, o ajuste de fundo de deslocamento a 0, a potência do laser a 5%-7%, um tamanho de digitalização de 1.024 x 1.024 e uma velocidade de digitalização de 1/2 quadro/s. Colete seções ópticas da série z de 17 a 30 com um tamanho de etapa de 1,0 μm. Nomeie as imagens usando o código na etapa 1.6, como "b6_upper_left-day0" e salve.
- Selecione o canal DAPI em Aquisição e marque a caixa Z em ND Aquisição. Para definir os limites inferior e superior da pilha Z, clique nos botões Superior e Inferior.
- Para reconstruir as imagens 3D, abra o arquivo .nd2 (Figura 3A; consulte Tabela de materiais) e clique no Volume (Figura 3B).
3. Imagens das mesmas plantas em diferentes pontos de tempo
- Após cada imagem, coloque o prato de base de vidro de volta na câmara de crescimento.
- Repita a partir da etapa 2.1 para geração de imagens e reconstrução 3D.
NOTA: Para encontrar as mesmas plantas, use o código mencionado na etapa 1.6 e dê o nome "b6_upper_left-dia1" ou "b6_upper_left-dia2", de acordo com a idade das plantas.
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Representative Results
Esse método permite a observação da dinâmica da parede celular durante o desenvolvimento em mutantes do tipo selvagem e ggb (Figura 1). Os resultados mostraram que regiões com menor espessamento da parede celular se correlacionam com os locais de expansão/ramificação celular, permitindo a predição de locais de expansão/ramificação no tipo silvestre (Figura 1A). A superfície das paredes celulares em mutantes ggb foi rasgada durante o desenvolvimento devido à expansão celular descontrolada3 (Figura 1B). Além disso, o sinal de coloração da superfície quebrada dos mutantes ggb (que é celulose mais velha) é mais forte do que a superfície celular (que é celulose mais jovem) abaixo da superfície da parede celular quebrada.
Figura 1: Séries temporais 3D de desenvolvimento de musgo. (A,B) Mudanças dinâmicas nas paredes transversais foram mostradas pela coloração branca de calcofluor (que cora celulose) em mutantes WT (A) e ggb (B). Para os mutantes ggb (B), as linhas de traço branco abaixo de cada imagem indicam as paredes celulares da superfície quebrada nas células em expansão, e as linhas laranjas indicam as células abaixo da superfície da parede celular em ggb. O Painel B é reimpresso com permissão de3. Observe que as diferenças no sinal branco de calcofluor podem ser detectadas nas posições superficiais das células, e regiões de coloração menos densas (pontas de seta) estão correlacionadas com os locais de expansão/ramificação celular. Barras de escala = 20 μm. Abreviaturas: d = dias; WT = tipo selvagem; ggb = geranilgeraniltransferase-I beta. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Marcação da localização das plantas. Na parte inferior do prato, nove linhas cada foram desenhadas em direções paralelas e perpendiculares para marcar a localização dos quadrados. Os caracteres de a a h foram usados para marcar linhas, e os números de 1 a 8 foram usados para marcar colunas. Superior, inferior, direita, média e esquerda foram usadas para marcar posições dentro de cada quadrado. Por exemplo, se uma planta (denotada por um ponto verde) estava localizada em um quadrado na segunda linha e na sexta coluna, e posicionada na parte superior esquerda, então a planta foi nomeada b6_upper_left. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Reconstrução de imagens 3D usando um arquivo z-stack nd2. (A) Abra um arquivo nd2 no NIS-elements Viewer. Clique em LUTs (círculo) para ajustar o contraste e o brilho das imagens e clique em Volume (quadrado) para reconstruir a imagem 3D. (B) Imagem 3D reconstruída de A. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1: Lista de soluções utilizadas neste protocolo. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.
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Discussion
A reconstrução 3D de lapso de tempo, ou imagem 4D, é uma ferramenta poderosa para observar a dinâmica da morfologia celular durante os processos de desenvolvimento. Neste protocolo, misturando o branco calcofluor no meio, a dinâmica da morfologia celular 3D pode ser observada no musgo P. patens. Utilizando esse método, observamos que a superfície das paredes celulares em mutantes ggb é rasgada durante o desenvolvimento3. Além disso, o espessamento reduzido das paredes celulares está correlacionado com os locais de expansão/ramificação celular no tipo selvagem, permitindo a previsão dos locais de expansão/ramificação. Além disso, como o calcofluor branco pode ser usado com outros corantes, como microesferas, informações adicionais sobre a expansão celular podem ser observadas3.
Existem duas razões que poderiam explicar como o corante calcofluor pode se ligar por dias às plantas sem afetar / danificar o alvo molecular. Primeiro, a baixa concentração de trabalho (10 μL em 200 μL de meio BCDATG, ou 5%) pode ser suficientemente baixa para que os protonatos de musgo não sejam afetados. Em segundo lugar, o calcofluor pode manchar o estágio maduro da celulose, porque o sinal de coloração é muito mais forte na parte basal do tipo selvagem (que é tecido mais velho) do que a região apical da célula apical (que é tecido mais jovem), e a superfície da parede celular quebrada dos mutantes ggb (que é celulose mais velha) é mais forte do que as células (que é celulose mais jovem) abaixo da superfície da parede celular quebrada.
Este protocolo tem sido usado para o tecido de musgo, que é simples em estrutura. O protocolo atual também pode ser aplicado a outros sistemas com estruturas simples, como pelos radiculares e tricomas em plantas com flores. No entanto, resta saber se a coloração branca de calcofluor funciona para outros sistemas com mais camadas celulares, como caules. Além disso, como o calcofluor branco é misturado com o meio, o tecido a ser corado deve ser imerso dentro do meio. Portanto, a otimização pode ser necessária para aplicar esse protocolo a outros sistemas.
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Disclosures
Os autores declaram não haver interesses concorrentes ou financeiros.
Acknowledgments
Os autores agradecem à Dra. Soucy Patricia e Betty Nunn, da Universidade de Louisville, pela assistência com o microscópio confocal. Este trabalho foi financiado pela National Science Foundation (1456884 a M.P.R.) e por um Acordo de Cooperação da National Science Foundation (1849213 a M.P.R.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-mm-thick red plastic light filter | Mitsubishi | no.102 | |
| 27 mm diameter glass base dish | Iwaki | 3930-035 | |
| Agar | Sigma | A6924 | |
| Calcofluor white | Sigma | 18909-100ML-F | Calcofluor White M2R, 1 g/L and Evans blue, 0.5 g/L |
| Confocal microscope | Nikon | A1 | NIS element software; .nd2 file in NIS-elements Viewer, download from https://www.microscope.healthcare.nikon. |
| Fluorescence microscope | Nikon | TE200 | Equipped with a DS-U3 camera; |
| Gellan gum | Nacali Tesque | 12389-96 | |
| Plant Growth Chambers | SANYO | Sanyo MLR-350H | |
| Sterilized syringe 0.22 μm filter | Millipore | SLGV033RS |
References
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