Summary
כתב יד זה מציג פרוטוקול מפורט להדמיה של הדינמיקה התלת-ממדית של דופן התא ברקמת טחב חי, המאפשר הדמיה של ניתוק דפנות התא במוטנטים מסוג ggb ועיבוי דפוסי דופן התא בסוג הבר במהלך ההתפתחות לאורך תקופה ארוכה.
Abstract
הדמיה בהילוך מהיר עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי מאפשרת התבוננות בשינויים הדינמיים של גדילה והתפתחות ברמה התאית והתת-תאית. באופן כללי, עבור תצפיות על פני תקופה ארוכה, הטכניקה דורשת טרנספורמציה של חלבון פלואורסצנטי; עם זאת, עבור רוב המערכות, טרנספורמציה גנטית גוזלת זמן או אינה זמינה מבחינה טכנית. כתב יד זה מציג פרוטוקול להדמיית קיטוע זמן תלת-ממדי של דינמיקת דופן התא במשך 3 ימים באמצעות צבע קלקופלור (המכתים תאית בדופן תא הצמח), שפותח בפטנס פיסקומיטריום טחב. אות צבע הקלקופלור מדופן התא יציב ויכול להימשך שבוע ללא ריקבון ברור. באמצעות שיטה זו, הוכח כי ניתוק התאים במוטציות ggb (שבו תת-היחידה בטא geranylgeranyltransferase-I הוא דפק החוצה) נגרמת על ידי התרחבות תאים בלתי מבוקרת פגמים שלמות דופן התא. יתר על כן, דפוסי צביעת calcofluor להשתנות עם הזמן; אזורים מוכתמים פחות בעוצמה מתואמים עם אתרי ההתפשטות/הסתעפות העתידיים של התאים בסוג הבר. שיטה זו יכולה להיות מיושמת על מערכות רבות אחרות המכילות קירות התא וכי יכול להיות מוכתם על ידי calcofluor.
Introduction
דפנות תאי הצמח עוברות שינויים דינמיים במהלך התרחבות התאים והתפתחותם 1,2,3. שמירה על שלמות דופן התא היא קריטית להידבקות תאי צמח במהלך גדילה והתפתחות, כמו גם לתגובה לאותות סביבתיים. למרות שהדמיית דינמיקה של דופן התא של תאים חיים לאורך תקופת זמן ארוכה היא קריטית להבנת האופן שבו הידבקות התא נשמרת במהלך הפיתוח והסתגלות לשינויים סביבתיים, השיטות הנוכחיות לצפייה ישירה בדינמיקה של דופן התא עדיין מאתגרות.
הדמיה בהילוך מהיר של שינויים תאיים יכולה לספק דינמיקה התפתחותית אינפורמטיבית של אורגניזם באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ברזולוציה גבוהה 4,5,6,7. בעוד שהדמיית תלת-ממד בהילוך מהיר היא בעלת פוטנציאל רב לחקר שינויים דינמיים בצורת התא במהלך גדילה והתפתחות, הטכניקה דורשת בדרך כלל טרנספורמציה של חלבון פלואורסצנטי 4,5,6,7. עם זאת, עבור רוב המערכות, טרנספורמציות גנטיות גוזלות זמן רב או מאתגרות מבחינה טכנית. כחלופה, צבעים פלואורסצנטיים המתחברים לרכיבים תאיים זמינים זה מכבר. הצבעים הפלואורסצנטיים יכולים לפלוט אור פלואורסצנטי לאחר הקרנה עם אור באורך גל מסוים. דוגמאות נפוצות הן Edu, DAPI, PI, FM4-64 ו- calcofluor לבן 8,9,10. חיסרון עיקרי אחד, עם זאת, הוא שצבעים אלה יכולים לשמש בדרך כלל רק ברקמות קבועות או לניסויים קצרים, בין השאר בשל הנזק שהם גורמים לתא 8,9,10.
עם הפרוטוקול המוצג כאן, אותות calcofluor יציבים כאשר calcofluor לבן מעורבב בתוך התווך במהלך ניסויים time-lapse ב טחב P. patens. באמצעות שיטה זו, ניתוק תאים במוטציות ggb באמצעות הדמיה תלת-ממדית בהילוך מהיר נצפהבמשך תקופה של 3 ימים 3 (איור 1). שיטה זו יכולה להיות מיושמת על מערכות רבות אחרות המכילות קירות התא וכי יכול להיות מוכתם על ידי calcofluor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: עיין בטבלת החומרים לקבלת רשימת החומרים והציוד ובטבלה 1 לקבלת רשימת הפתרונות שישמשו בפרוטוקול זה.
1. הכנת צמחים לכלים תחתונים מזכוכית
- לגדל את הרקמה פרוטונמלית טחב בתווך אגר BCDAT בצלחת פטרי 13 ס"מ תחת אור לבן קבוע (~ 50 μmol m-2 s-1) במשך 7 ימים ב 25 ° C בתא הצמיחה.
- יש לסנן-לעקר את הקלקופלור בלבן ולאחסן בטמפרטורה של 4°C עד לשימוש. מגיב יציב במשך מספר חודשים.
- פזרו את רקמת הטחב בת 7 הימים לתוך מיקרו-צינורית בנפח 1.5 מ"ל המכילה 20 מיקרוליטר מים מעוקרים. ודא שרקמת הטחב פרוטונמלית מפוזרת מספיק כחתיכות קטנות במים. עבור סוג פראי (WT), השתמש במלקחיים כדי להפריד את הפרוטונמטה; עבור מוטציית GGB , השתמש בפיפט P-1000.
- הוסף 10 μL של calcofluor לבן מעוקר לתוך microtube 1.5 מ"ל ולהשאיר את microtube זקוף במכסה המנוע במשך 2 דקות עבור צביעה.
- מיד לאחר הצביעה, יש לערבב את הצמחים עם 200 μL של BCDATG מקורר, המכיל BCDAT בינוני בתוספת 0.5% (w/v) גלוקוז ו-0.4% (w/v) gellan gum, על ידי פיפטה חמש פעמים עם פיפטה P-1000.
הערה: ודא שמדיום BCDATG מקורר מספיק (ממש לפני שהתווך מתמצק) כדי למנוע לחץ על הצמחים. - מעבירים את התערובת המכילה את הצמחים ואת מדיום BCDATG לצלחת בסיס זכוכית בקוטר 27 מ"מ. ודא כי נפח BCDATG לערבוב התאים אינו עולה על 200 μL וכי 200 μL של BCDATG עם דגימות מופץ באופן שווה על פני השטח של צלחת תחתית זכוכית 7 מ"מ כדי לייצר שכבה דקה של סרט, כך הדגימות נמצאות במרחק העבודה האובייקטיבי במהלך ההדמיה.
- לאחר התמצקות במשך 2 דקות בטמפרטורת החדר, מכסים את השכבה הדקה ב-3 מ"ל BCDATG מקורר ומניחים לה להתייצב למשך 10 דקות כדי להתמצק שוב.
הערה: ודא ששלבים 1.2-1.5 מתבצעים במכסה מנוע סטרילי כדי למנוע זיהום. - בתחתית המנה, ציירו תשעה קווים כל אחד בכיוונים מקבילים ומאונכים (איור 2). סמן את השורות בתווים מ- a עד h וסמן את העמודות במספרים מ- 1 עד 8. השתמש בחלק העליון, התחתון, הימני, האמצעי והשמאלי כדי לסמן את המיקומים בתוך כל ריבוע. לדוגמה, אם צמח נמצא בריבוע בשורה השנייה ובעמודה השישית וממוקם בחלק השמאלי העליון של הריבוע, אז צמח זה מקבל את השם "b6_upper_left".
- קדם גידול צלחת תחתית זכוכית המכילה את הצמחים תחת אור אדום במשך 5 ימים ב 25 ° C בתא הצמיחה, ולאחר מכן תחת אור לבן במשך 1-2 ימים לפני להיות נתון הדמיה time-lapse כל יום עד 3 ימים. עבור WT, טרום גידול הצמחים באור אדום חלש (0.5 μmol m-2 s-1) מלעיל במשך 5 ימים כדי לגרום לתגובה פוטוטרופית של הפרוטונמטה, כך שהצמחים יכולים להתחבר לתחתית הכלים11.
הערה: האור האדום החלש מסופק על ידי העברת אור לבן דרך מסנן פלסטיק אקרילי אדום בעובי 3 מ"מ לתוך קופסאות חסינות אור. עבור מוטנטים של ggb, גידול באור אדום הוא אופציונלי, מכיוון שלמוטנטים של ggb אין תגובה פוטוטרופית3.
2. הדמיה ושחזור תלת מימד
- הניחו את צלחת תחתית הזכוכית המכילה צמחים על במה של מיקרוסקופ קונפוקלי הפוך, כאשר תחתית הזכוכית פונה למטרה. השתמש במיקרוסקופ קונפוקלי להדמיה של calcofluor עם עדשה אובייקטיבית 20x. צלם תמונות עם לייזר של 405 ננומטר, חור הסיכה ב- 1.0, רווח HV ב- 100, כוונון רקע היסט ב- 0, עוצמת לייזר ב- 5%-7%, גודל סריקה של 1,024 x 1,024 ומהירות סריקה של 1/2 מסגרת לשנייה. אסוף 17-30 מקטעים אופטיים מסדרה z בגודל צעד של 1.0 מיקרומטר. תן שם לתמונות באמצעות הקוד בשלב 1.6, כגון "b6_upper_left-day0", ושמור.
- בחר את ערוץ DAPI ברכישה וסמן את התיבה Z ב- ND Acquisition. כדי להגדיר את הגבול התחתון והעליון עבור ערימת Z, לחץ על הלחצנים העליון והתחתון.
- לבנייה מחדש של התמונות התלת-ממדיות, פתחו את קובץ ה-nd2 (איור 3A; ראו טבלת חומרים) ולחצו על אמצעי האחסון (איור 3B).
3. הדמיה של אותם צמחים בנקודות זמן שונות
- לאחר כל הדמיה, החזירו את צלחת בסיס הזכוכית לתא הצמיחה.
- חזור על הפעולה משלב 2.1 עבור הדמיה ושחזור תלת-ממדי.
הערה: כדי למצוא את אותם צמחים, השתמש בקוד המוזכר בשלב 1.6 ותן את השם "b6_upper_left-day1", או "b6_upper_left-day2", בהתאם לגיל הצמחים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
שיטה זו מאפשרת תצפית על דינמיקה של דופן התא במהלך ההתפתחות במוטנטים מסוג בר ומוטציות ggb (איור 1). התוצאות הראו שאזורים עם פחות עיבוי של דופן התא מתואמים עם אתרי ההתפשטות/הסתעפות של התא, מה שמאפשר חיזוי של אתרי התפשטות/הסתעפות בסוג הבר (איור 1A). פני השטח של דפנות התא במוטנטים של ggb נקרעו לגזרים במהלך ההתפתחות עקב התפשטות בלתי מבוקרת של תאים3 (איור 1B). יתר על כן, אות הצביעה של פני השטח השבורים של מוטנטים ggb (שהוא תאית ישנה יותר) חזק יותר משטח התא (שהוא תאית צעירה יותר) מתחת לפני השטח של דופן התא השבורה.
איור 1: סדרת זמן תלת-ממדית של התפתחות טחב. (A,B) שינויים דינמיים בדפנות צולבות הודגמו על-ידי צביעה לבנה של קלקופלור (שמכתימה תאית) במוטציות WT (A) ו-ggb (B). עבור מוטנטים של ggb (B), קווי מקף לבנים מתחת לכל תמונה מציינים את דפנות תאי פני השטח השבורים בתאים המתרחבים, וקווים כתומים מציינים את התאים שמתחת לפני השטח של דופן התא ב- ggb. לוח B מודפס מחדש באישור3. שימו לב שניתן לזהות את ההבדלים באות הלבן של הקלקופלור על מיקומי פני השטח של התאים, ואזורי צביעה פחות צפופים (ראשי חץ) מתואמים לאתרי ההתפשטות/הסתעפות של התא. פסי קנה מידה = 20 מיקרומטר. קיצורים: d = ימים; WT = סוג פראי; ggb = geranylgeranyltransferase-I בטא. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: סימון מיקום הצמחים. בתחתית המנה שורטטו תשעה קווים כל אחד בכיוונים מקבילים ומאונכים כדי לסמן את מיקום הריבועים. תווים a עד h שימשו לסימון שורות, ומספרים 1 עד 8 שימשו לסימון עמודות. עליון, תחתון, ימני, אמצעי ושמאלי שימשו לסימון מיקומים בתוך כל ריבוע. לדוגמה, אם צמח (מסומן בנקודה ירוקה) היה ממוקם בריבוע בשורה השנייה ובטור השישי, וממוקם בחלק השמאלי העליון, אז הצמח נקרא b6_upper_left. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: שחזור תמונות תלת-ממדיות באמצעות קובץ nd2 z-stack . (A) פתח קובץ nd2 במציג רכיבי NIS. לחצו על LUT (עיגול) כדי להתאים את הניגודיות והבהירות של תמונות ולחצו על עוצמת קול (ריבוע) כדי לבנות מחדש את התמונה התלת-ממדית. (B) תמונה תלת-ממדית משוחזרת מ-A. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
טבלה 1: רשימת הפתרונות המשמשים בפרוטוקול זה. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שחזור תלת-ממדי בהילוך מהיר, או הדמיה 4-D, הוא כלי רב עוצמה לצפייה בדינמיקה של המורפולוגיה התאית במהלך תהליכים התפתחותיים. בפרוטוקול זה, על ידי ערבוב הקלקופלור הלבן בתווך, ניתן לראות את הדינמיקה של המורפולוגיה התאית התלת-ממדית בטחב P. patens. באמצעות שיטה זו, ראינו כי פני השטח של דפנות התא במוטציות ggb נקרעים לגזרים במהלך התפתחות3. יתר על כן, העיבוי המופחת של דפנות התא מתואם עם אתרי ההתפשטות/הסתעפות התא בסוג פראי, מה שמאפשר חיזוי של אתרי ההתפשטות/הסתעפות. יתר על כן, מכיוון שניתן להשתמש בלבן calcofluor עם צבעים אחרים, כגון מיקרוספרות, ניתן לראות מידע נוסף על התרחבות התא3.
ישנן שתי סיבות שיכולות להסביר כיצד צבע הקלקופלור יכול להיקשר במשך ימים לצמחים מבלי להשפיע/לפגוע במטרה המולקולרית. ראשית, ריכוז העבודה הנמוך (10 μL ב-200 μL של מדיום BCDATG, או 5%) עשוי להיות נמוך מספיק כדי שהפרוטונמטה של הטחב לא תושפע. שנית, הקלקופלור עלול להכתים את השלב הבוגר של התאית, מכיוון שאות הצביעה חזק הרבה יותר בחלק הבסיסי של סוג הבר (שהוא רקמה עתיקה יותר) מאשר באזור האפי של התא האפי (שהוא רקמה צעירה יותר), ומשטח דופן התא השבור של מוטנטים GGB (שהוא תאית עתיקה יותר) חזק יותר מהתאים (שהיא תאית צעירה יותר) מתחת לפני השטח של דופן התא השבורה.
פרוטוקול זה שימש עבור רקמת טחב, שהוא פשוט במבנה. הפרוטוקול הנוכחי עשוי להיות מיושם גם במערכות אחרות בעלות מבנים פשוטים, כגון שערות שורש וטריכומות בצמחים פורחים. עם זאת, נותר לראות אם הצביעה הלבנה calcofluor עובד עבור מערכות אחרות עם שכבות תאים יותר, כגון גבעולים. יתר על כן, מכיוון שלבן הקלקופלור מעורבב עם המדיום, הרקמה שיש להכתים חייבת להיות שקועה בתוך המדיום. לכן, ייתכן שיהיה צורך באופטימיזציה על מנת להחיל פרוטוקול זה על מערכות אחרות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין אינטרסים מתחרים או כלכליים.
Acknowledgments
המחברים מודים לד"ר סוסי פטרישיה ובטי נון מאוניברסיטת לואיוויל על הסיוע במיקרוסקופ הקונפוקלי. עבודה זו מומנה על ידי הקרן הלאומית למדע (1456884 ל- M.P.R.) ועל ידי הסכם שיתוף פעולה של הקרן הלאומית למדע (1849213 ל- M.P.R).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-mm-thick red plastic light filter | Mitsubishi | no.102 | |
| 27 mm diameter glass base dish | Iwaki | 3930-035 | |
| Agar | Sigma | A6924 | |
| Calcofluor white | Sigma | 18909-100ML-F | Calcofluor White M2R, 1 g/L and Evans blue, 0.5 g/L |
| Confocal microscope | Nikon | A1 | NIS element software; .nd2 file in NIS-elements Viewer, download from https://www.microscope.healthcare.nikon. |
| Fluorescence microscope | Nikon | TE200 | Equipped with a DS-U3 camera; |
| Gellan gum | Nacali Tesque | 12389-96 | |
| Plant Growth Chambers | SANYO | Sanyo MLR-350H | |
| Sterilized syringe 0.22 μm filter | Millipore | SLGV033RS |
References
- Anderson, C. T., Kieber, J. J. Dynamic construction, perception, and remodeling of plant cell walls. Annual Review of Plant Biology. 71, 39-69 (2020).
- Vaahtera, L., Schulz, J., Hamann, T. Cell wall integrity maintenance during plant development and interaction with the environment. Naure Plants. 5 (9), 924-932 (2019).
- Bao, L., et al. The cellular function of ROP GTPase prenylation important for multicellularity in the moss Physcomitrium patens. Development. 149 (12), (2022).
- Colin, L., et al. Imaging the living plant cell: From probes to quantification. The Plant Cell. 34 (1), 247-272 (2022).
- Fang, Y., Spector, D. L. Live cell imaging of plants. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (2), (2010).
- Goh, T. Long-term live-cell imaging approaches to study lateral root formation in Arabidopsis thaliana. Microscopy. 68 (1), 4-12 (2019).
- Hamant, O., Das, P., Burian, A. Time-lapse imaging of developing shoot meristems using a confocal laser scanning microscope. Methods in Molecular Biology. 1992, 257-268 (2019).
- Rigal, A., Doyle, S. M., Robert, S. Live cell imaging of FM4-64, a tool for tracing the endocytic pathways in Arabidopsis root cells. Methods in Molecular Biology. 1242, 93-103 (2015).
- Yagi, N., et al. Advances in synthetic fluorescent probe labeling for live-cell imaging in plants. Plant & Cell Physiology. 62 (8), 1259-1268 (2021).
- Whitewoods, C. D., et al. CLAVATA was a genetic novelty for the morphological innovation of 3D growth in land plants. Current Biology. 28 (15), 2365-2376 (2018).
- Bao, L., et al. A PSTAIRE-type cyclin-dependent kinase controls light responses in land plants. Science Advances. 8 (4), 2116 (2022).
