Summary
Detta manuskript presenterar ett detaljerat protokoll för att avbilda 3D-cellväggsdynamiken hos levande mossvävnad, vilket möjliggör visualisering av avskiljning av cellväggar i ggb-mutanter och förtjockning av cellväggmönster i vildtypen under utveckling under en lång period.
Abstract
Time-lapse-avbildning med fluorescensmikroskopi möjliggör observation av de dynamiska förändringarna av tillväxt och utveckling på cellulära och subcellulära nivåer. I allmänhet, för observationer under en lång period, kräver tekniken omvandling av ett fluorescerande protein; Men för de flesta system är genetisk omvandling antingen tidskrävande eller tekniskt otillgänglig. Detta manuskript presenterar ett protokoll för 3-D time-lapse avbildning av cellväggsdynamik under en 3-dagarsperiod med användning av kalkofluorfärgämne (som fläckar cellulosa i växtcellväggen), utvecklat i mossan Physcomitrium patens. Kalkofluorfärgningssignalen från cellväggen är stabil och kan pågå i 1 vecka utan uppenbart sönderfall. Med hjälp av denna metod har det visats att avskiljning av celler i ggb-mutanter (där proteinet geranylgeranyltransferas-I beta-underenhet slås ut) orsakas av oreglerad cellexpansion och cellväggsintegritetsdefekter. Dessutom förändras mönstren för kalkofluorfärgning över tiden; Mindre intensivt färgade regioner korrelerar med framtida cellutvidgning / förgreningsplatser i den vilda typen. Denna metod kan tillämpas på många andra system som innehåller cellväggar och som kan färgas av kalkofluor.
Introduction
Växtcellväggar genomgår dynamiska förändringar under cellexpansion och utveckling 1,2,3. Att upprätthålla cellväggens integritet är avgörande för växtcelladhesion under tillväxt och utveckling, liksom för svaret på miljösignaler. Även om visualisering av cellväggsdynamik hos levande celler under en lång tidsperiod är avgörande för att förstå hur celladhesion upprätthålls under utveckling och anpassning till miljöförändringar, är nuvarande metoder för att direkt observera cellväggsdynamik fortfarande utmanande.
Time-lapse-avbildning av cellulära förändringar kan ge informativ utvecklingsdynamik hos en organism med hjälp av ett högupplöst fluorescensmikroskop 4,5,6,7. Medan time-lapse 3D-avbildning har stor potential för att studera dynamiska förändringar av cellform under tillväxt och utveckling, kräver tekniken normalt omvandling av ett fluorescerande protein 4,5,6,7. Men för de flesta system är genetiska omvandlingar antingen tidskrävande eller tekniskt utmanande. Som ett alternativ har fluorescerande färgämnen som fäster vid cellulära komponenter länge varit tillgängliga. De fluorescerande färgämnena kan avge fluorescerande ljus efter bestrålning med ljus av en viss våglängd. Vanliga exempel är Edu, DAPI, PI, FM4-64 och kalkofluorvit 8,9,10. En stor nackdel är dock att dessa färgämnen vanligtvis endast kan användas i fast vävnad eller för korta experiment, delvis på grund av den skada de orsakar cellen 8,9,10.
Med protokollet som presenteras här är kalkofluorsignaler stabila när kalkofluorvitt blandas i mediet under time-lapse-experiment i mossan P. patens. Med hjälp av denna metod observerades avskiljning av celler i ggb-mutanter med hjälp av 3-D time-lapse-avbildning under en 3-dagarsperiod3 (figur 1). Denna metod kan tillämpas på många andra system som innehåller cellväggar och som kan färgas av kalkofluor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Se materialförteckningen för listan över material och utrustning och tabell 1 för listan över lösningar som ska användas i detta protokoll.
1. Förberedelse av växter för glasbottenskålar
- Odla mossprotonemvävnaden i BCDAT-agarmediet i en 13 cm petriskål under konstant vitt ljus (~ 50 μmol m-2 s-1) i 7 dagar vid 25 ° C i tillväxtkammaren.
- Filtersterilisera den vita kalkofluoren och förvara den vid 4 °C tills den används. Reagenset är stabilt i flera månader.
- Sprid den 7 dagar gamla mossvävnaden i ett 1,5 ml mikrorör innehållande 20 μL steriliserat vatten. Se till att mossprotonemvävnaden är tillräckligt dispergerad som små bitar i vattnet. För vild typ (WT), använd pincett för att separera protonemata; för ggb-mutanten , använd en P-1000-pipett.
- Tillsätt 10 μL steriliserad kalkofluorvit i 1,5 ml mikroröret och lämna mikroröret upprätt i huven i 2 minuter för färgning.
- Omedelbart efter färgning, blanda plantorna med 200 μL kyld BCDATG, innehållande BCDAT-medium kompletterat med 0,5% (w / v) glukos och 0,4% (w / v) gellangummi, genom pipettering fem gånger med en P-1000-pipett.
OBS: Se till att BCDATG-mediet kyls tillräckligt (precis innan mediet stelnar) för att undvika att stressa växterna. - Överför blandningen som innehåller växterna och BCDATG-mediet till en glasbasskål med en diameter på 27 mm. Se till att volymen BCDATG för blandning av cellerna inte överstiger 200 μl och att 200 μl BCDATG med proverna fördelas jämnt på ytan av 7 mm glasbottenskålen för att producera ett tunt lager film, så att proverna ligger inom det objektiva arbetsavståndet under avbildning.
- Efter stelning i 2 minuter vid rumstemperatur, täck det tunna skiktet med 3 ml kyld BCDATG och låt det stelna i 10 minuter för att stelna igen.
OBS: Se till att steg 1.2-1.5 utförs i en steril kåpa för att undvika kontaminering. - På botten av skålen ritar du nio linjer vardera i parallella och vinkelräta riktningar (figur 2). Markera raderna med tecken från a till h och markera kolumnerna med siffror från 1 till 8. Använd övre, nedre, höger, mitten och vänster för att markera positionerna inom varje ruta. Till exempel, om en växt är i en fyrkant i den andra raden och den sjätte kolumnen och är placerad i den övre vänstra delen av torget, får denna växt namnet "b6_upper_left".
- Förodla glasbottenskålen som innehåller växterna under rött ljus i 5 dagar vid 25 °C i tillväxtkammaren och sedan under vitt ljus i 1-2 dagar innan den utsätts för timelapse-avbildning varje dag i upp till 3 dagar. För WT, förodla växterna i svagt rött ljus (0,5 μmol m-2 s-1) från ovanstående i 5 dagar för att inducera protonematas fototropa respons, så att växterna kan fästa vid botten av diskarna11.
OBS: Det svaga röda ljuset tillhandahålls genom att leda ett vitt ljus genom ett 3 mm tjockt rött akrylplastfilter i ljustäta lådor. För ggb-mutanter är förkultivering i rött ljus valfritt, eftersom ggb-mutanterna inte har ett fototropiskt svar3.
2. Bildbehandling och 3D-rekonstruktion
- Placera glasskålen som innehåller växter på scenen i ett inverterat konfokalmikroskop, med glasbotten vänd mot målet. Använd ett konfokalmikroskop för visualisering av kalkofluor med en 20x objektivlins. Ta bilder med 405 nm-lasern, pinhålet vid 1,0, HV-förstärkning vid 100, förskjutning-bakgrundsjustering vid 0, lasereffekt vid 5%-7%, en skanningsstorlek på 1,024 x 1,024 och en skanningshastighet på 1/2 bild/s. Samla 17-30 optiska sektioner i z-serien med en stegstorlek på 1,0 μm. Namnge bilderna med koden i steg 1.6, till exempel "b6_upper_left-day0", och spara.
- Välj DAPI-kanalen i Förvärv och markera rutan Z i ND-förvärv. För att ställa in de nedre och övre gränserna för Z-stacken, klicka på knapparna Övre och Nedre.
- Om du vill rekonstruera 3D-bilderna öppnar du ND2-filen (bild 3A, se materialförteckningen) och klickar på volymen (bild 3B).
3. Avbildning av samma växter vid olika tidpunkter
- Efter varje bildbehandling, sätt tillbaka glasbasskålen i tillväxtkammaren.
- Upprepa från steg 2.1 för avbildning och 3D-rekonstruktion.
OBS: För att hitta samma växter, använd koden som nämns i steg 1.6 och ge namnet "b6_upper_left-dag1" eller "b6_upper_left-dag2", beroende på växternas ålder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denna metod möjliggör observation av cellväggsdynamik under utveckling i vildtyps- och ggb-mutanter (figur 1). Resultaten visade att regioner med mindre förtjockning av cellväggen korrelerar med cellexpansions-/förgreningsställena, vilket möjliggör förutsägelse av expansions-/förgreningsställen i vildtypen (figur 1A). Ytan på cellväggarna i ggb-mutanter slets sönder under utvecklingen på grund av okontrollerad cellexpansion3 (figur 1B). Dessutom är färgningssignalen från den trasiga ytan av ggb-mutanter (som är äldre cellulosa) starkare än cellytan (som är yngre cellulosa) under den trasiga cellväggytan.
Figur 1: 3D-tidsserier för mossutveckling. (A,B) Dynamiska förändringar i tvärväggar visades genom kalkfluorvit färgning (som fläckar cellulosa) i WT (A) och ggb-mutanter (B). För ggb-mutanter (B) indikerar vita strecklinjer under varje bild de trasiga ytcellväggarna på de expanderande cellerna och orange linjer indikerar cellerna under cellväggytan i ggb. Panel B återges med tillstånd från3. Observera att skillnaderna i kalkofluorvit signal kan detekteras på cellernas ytpositioner, och mindre täta färgningsområden (pilspetsar) är korrelerade med cellexpansions- / förgreningsställena. Skalstänger = 20 μm. Förkortningar: d = dagar; WT = vild typ; ggb = geranylgeranyltransferas-I beta. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Märkning av växters placering. På botten av skålen ritades nio linjer vardera i parallella och vinkelräta riktningar för att markera placeringen av rutor. Tecken a till h användes för att markera rader, och nummer 1 till 8 användes för att markera kolumner. Övre, nedre, höger, mitten och vänster användes för att markera positioner inom varje ruta. Till exempel, om en växt (betecknad med en grön prick) var belägen i en fyrkant vid andra raden och den sjätte kolumnen och placerad i den övre vänstra delen, namngavs växten b6_upper_left. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Rekonstruktion av 3D-bilder med en nd2 z-stack-fil . (A) Öppna en nd2-fil i NIS-elements Viewer. Klicka på LUT (cirkel) för att justera bildens kontrast och ljusstyrka och klicka på Volym (fyrkant) för att rekonstruera 3D-bilden. (B) Rekonstruerad 3D-bild från A. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Tabell 1: Lista över lösningar som används i detta protokoll. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Time-lapse 3D-rekonstruktion, eller 4D-avbildning, är ett kraftfullt verktyg för att observera dynamiken i cellulär morfologi under utvecklingsprocesser. I detta protokoll, genom att blanda kalkofluorvitt i mediet, kan dynamiken i 3-D cellulär morfologi observeras i mossan P. patens. Med hjälp av denna metod observerade vi att ytan på cellväggar i ggb-mutanter slits sönder under utveckling3. Dessutom är den minskade förtjockningen av cellväggar korrelerad med cellexpansions- / förgreningsplatserna i vildtyp, vilket möjliggör förutsägelse av expansions- / förgreningsplatserna. Vidare, eftersom kalkofluorvit kan användas med andra färgämnen, såsom mikrosfärer, kan ytterligare information om cellexpansion observeras3.
Det finns två skäl som kan förklara hur kalkofluorfärgämnet kan binda i dagar till växter utan att påverka / skada det molekylära målet. För det första kan den låga arbetskoncentrationen (10 μL i 200 μL BCDATG-medium eller 5%) vara tillräckligt låg för att mossprotonemata inte ska påverkas. För det andra kan kalkofluor fläcka det mogna stadiet av cellulosa, eftersom färgningssignalen är mycket starkare i den basala delen av vildtyp (som är äldre vävnad) än apikalområdet i apikalcellen (som är yngre vävnad), och den trasiga cellväggytan hos ggb-mutanter (som är äldre cellulosa) är starkare än cellerna (som är yngre cellulosa) under den trasiga cellväggytan.
Detta protokoll har använts för mossvävnad, som är enkel i struktur. Det nuvarande protokollet kan också tillämpas på andra system med enkla strukturer, såsom rothår och trikomer i blommande växter. Det återstår dock att se om den vita färgningen av kalkofluor fungerar för andra system med fler celllager, till exempel stjälkar. Dessutom, eftersom kalkofluorviten blandas med mediet, måste vävnaden som ska färgas nedsänkas i mediet. Därför kan optimering krävas för att tillämpa detta protokoll på andra system.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga konkurrerande eller ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Författarna tackar Dr. Soucy Patricia och Betty Nunn vid University of Louisville för hjälp med konfokalmikroskopet. Detta arbete finansierades av National Science Foundation (1456884 till M.P.R.) och av ett National Science Foundation Cooperative Agreement (1849213 till M.P.R.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-mm-thick red plastic light filter | Mitsubishi | no.102 | |
| 27 mm diameter glass base dish | Iwaki | 3930-035 | |
| Agar | Sigma | A6924 | |
| Calcofluor white | Sigma | 18909-100ML-F | Calcofluor White M2R, 1 g/L and Evans blue, 0.5 g/L |
| Confocal microscope | Nikon | A1 | NIS element software; .nd2 file in NIS-elements Viewer, download from https://www.microscope.healthcare.nikon. |
| Fluorescence microscope | Nikon | TE200 | Equipped with a DS-U3 camera; |
| Gellan gum | Nacali Tesque | 12389-96 | |
| Plant Growth Chambers | SANYO | Sanyo MLR-350H | |
| Sterilized syringe 0.22 μm filter | Millipore | SLGV033RS |
References
- Anderson, C. T., Kieber, J. J. Dynamic construction, perception, and remodeling of plant cell walls. Annual Review of Plant Biology. 71, 39-69 (2020).
- Vaahtera, L., Schulz, J., Hamann, T. Cell wall integrity maintenance during plant development and interaction with the environment. Naure Plants. 5 (9), 924-932 (2019).
- Bao, L., et al. The cellular function of ROP GTPase prenylation important for multicellularity in the moss Physcomitrium patens. Development. 149 (12), (2022).
- Colin, L., et al. Imaging the living plant cell: From probes to quantification. The Plant Cell. 34 (1), 247-272 (2022).
- Fang, Y., Spector, D. L. Live cell imaging of plants. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (2), (2010).
- Goh, T. Long-term live-cell imaging approaches to study lateral root formation in Arabidopsis thaliana. Microscopy. 68 (1), 4-12 (2019).
- Hamant, O., Das, P., Burian, A. Time-lapse imaging of developing shoot meristems using a confocal laser scanning microscope. Methods in Molecular Biology. 1992, 257-268 (2019).
- Rigal, A., Doyle, S. M., Robert, S. Live cell imaging of FM4-64, a tool for tracing the endocytic pathways in Arabidopsis root cells. Methods in Molecular Biology. 1242, 93-103 (2015).
- Yagi, N., et al. Advances in synthetic fluorescent probe labeling for live-cell imaging in plants. Plant & Cell Physiology. 62 (8), 1259-1268 (2021).
- Whitewoods, C. D., et al. CLAVATA was a genetic novelty for the morphological innovation of 3D growth in land plants. Current Biology. 28 (15), 2365-2376 (2018).
- Bao, L., et al. A PSTAIRE-type cyclin-dependent kinase controls light responses in land plants. Science Advances. 8 (4), 2116 (2022).
