Summary
Dette manuskriptet presenterer en detaljert protokoll for å avbilde 3-D-celleveggdynamikken til levende mosevev, slik at visualisering av løsningen av cellevegger i ggb-mutanter og fortykning av celleveggmønstre i vill type under utvikling over en lang periode.
Abstract
Time-lapse-avbildning med fluorescensmikroskopi tillater observasjon av de dynamiske endringene i vekst og utvikling på cellulært og subcellulært nivå. Generelt, for observasjoner over en lang periode, krever teknikken transformasjon av et fluorescerende protein; Men for de fleste systemer er genetisk transformasjon enten tidkrevende eller teknisk utilgjengelig. Dette manuskriptet presenterer en protokoll for 3-D time-lapse-avbildning av celleveggdynamikk over en 3-dagers periode ved bruk av kalkofluorfargestoff (som flekker cellulose i plantecelleveggen), utviklet i mosen Physcomitrium patens. Kalkofluorfargesignalet fra celleveggen er stabilt og kan vare i 1 uke uten tydelig forfall. Ved hjelp av denne metoden har det vist seg at løsningen av celler i ggb-mutanter (hvor proteinet geranylgeranyltransferase-I beta-subenheten er slått ut) skyldes uregulert celleutvidelse og celleveggintegritetsdefekter. Videre endres mønstrene av kalkofluorfarging over tid; Mindre intenst fargede regioner korrelerer med fremtidige celleutvidelses- / forgreningssteder i vill type. Denne metoden kan brukes på mange andre systemer som inneholder cellevegger og som kan farges av kalkofluor.
Introduction
Plantecellevegger gjennomgår dynamiske endringer under celleutvidelse og utvikling 1,2,3. Opprettholdelse av celleveggintegritet er avgjørende for plantecelleadhesjon under vekst og utvikling, samt for respons på miljøsignaler. Selv om visualisering av celleveggdynamikk av levende celler over lang tid er avgjørende for å forstå hvordan celleadhesjon opprettholdes under utvikling og tilpasning til miljøendringer, er dagens metoder for direkte observasjon av celleveggdynamikk fortsatt utfordrende.
Time-lapse-avbildning av cellulære endringer kan gi informativ utviklingsdynamikk av en organisme ved hjelp av et høyoppløselig fluorescensmikroskop 4,5,6,7. Mens time-lapse 3-D-avbildning har stort potensial for å studere dynamiske endringer i celleform under vekst og utvikling, krever teknikken normalt transformasjon av et fluorescerende protein 4,5,6,7. Men for de fleste systemer er genetiske transformasjoner enten tidkrevende eller teknisk utfordrende. Som et alternativ har fluorescerende fargestoffer som festes til cellulære komponenter lenge vært tilgjengelige. De fluorescerende fargestoffene kan avgi fluorescerende lys etter bestråling med lys av en viss bølgelengde. Vanlige eksempler er Edu, DAPI, PI, FM4-64 og kalkofluorhvit 8,9,10. En stor ulempe er imidlertid at disse fargestoffene vanligvis bare kan brukes i fast vev eller for korte eksperimenter, delvis på grunn av skaden de forårsaker på cellen 8,9,10.
Med protokollen presentert her, er kalkofluorsignaler stabile når kalkofluorhvitt blandes i mediet under time-lapse-eksperimenter i mosen P. patens. Ved hjelp av denne metoden ble løsningen av celler i ggb-mutanter ved hjelp av 3-D time-lapse-avbildning observert over en 3-dagers periode3 (figur 1). Denne metoden kan brukes på mange andre systemer som inneholder cellevegger og som kan farges av kalkofluor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Se materialfortegnelsen for listen over materialer og utstyr og tabell 1 for listen over løsninger som skal brukes i denne protokollen.
1. Forberedelse av planter til glassbunnretter
- Dyrk mosens protonemalvev i BCDAT-agarmedium i en 13 cm petriskål under konstant hvitt lys (~50 μmol m-2 s-1) i 7 dager ved 25 °C i vekstkammeret.
- Filtrer kalkofluorhviten og oppbevar ved 4 °C til bruk. Reagenset er stabilt i flere måneder.
- Spred det 7 dager gamle mosevevet i et 1,5 ml mikrorør inneholdende 20 μL sterilisert vann. Sørg for at mosens protonemale vev er tilstrekkelig spredt som små biter i vannet. For vill type (WT), bruk tang for å skille protonemata; for GGB-mutanten , bruk en P-1000 pipette.
- Tilsett 10 μL av den steriliserte kalkofluorhvite i 1,5 ml mikrorøret og la mikrorøret stå oppreist i hetten i 2 minutter for farging.
- Umiddelbart etter farging, bland plantene med 200 μL avkjølt BCDATG, inneholdende BCDAT-medium tilsatt 0,5% (w / v) glukose og 0,4% (w / v) gellangummi, ved å pipettere fem ganger med en P-1000 pipette.
MERK: Sørg for at BCDATG-mediet er avkjølt nok (like før mediet størkner) for å unngå å stresse plantene. - Overfør blandingen som inneholder plantene og BCDATG-mediet til en glassbunnskål med en diameter på 27 mm. Forsikre deg om at volumet av BCDATG for blanding av cellene ikke er mer enn 200 μL, og at 200 μL BCDATG med prøver fordeles jevnt på overflaten av 7 mm glassbunnskålen for å produsere et tynt lag film, slik at prøvene er innenfor objektiv arbeidsavstand under avbildning.
- Etter å ha størknet i 2 minutter ved romtemperatur, dekk det tynne laget med 3 ml avkjølt BCDATG og la det stivne i 10 minutter for å stivne igjen.
MERK: Sørg for at trinn 1.2-1.5 utføres i en steril hette for å unngå kontaminering. - På bunnen av fatet tegner du ni linjer hver i parallelle og vinkelrette retninger (figur 2). Merk radene med tegn fra a til h, og merk kolonnene med tall fra 1 til 8. Bruk øvre, nedre, høyre, midtre og venstre for å markere posisjonene innenfor hver firkant. For eksempel, hvis en plante er i en firkant i andre rad og sjette kolonne og er plassert i øvre venstre del av torget, får denne planten navnet "b6_upper_left".
- Forkultur glassfatet som inneholder plantene under rødt lys i 5 dager ved 25 °C i vekstkammeret, og deretter under hvitt lys i 1-2 dager før de utsettes for time-lapse-avbildning hver dag i opptil 3 dager. For WT, preculture plantene i svakt rødt lys (0,5 μmol m-2 s-1) fra ovenstående i 5 dager for å indusere den fototrope responsen til protonemata, slik at plantene kan feste seg til bunnen av oppvasken11.
MERK: Det svake røde lyset gis ved å sende et hvitt lys gjennom et 3 mm tykt rødt akrylplastfilter i lystette bokser. For ggb-mutanter er preculturing i rødt lys valgfritt, da ggb-mutantene ikke har en fototropisk respons3.
2. Avbildning og 3D-rekonstruksjon
- Plasser glassbunnfatet som inneholder planter på scenen i et omvendt konfokalmikroskop, med glassbunnen mot målet. Bruk et konfokalmikroskop for visualisering av kalkofluor med en 20x objektivlinse. Ta bilder med 405 nm laser, knappenålshullet på 1,0, HV-forsterkning ved 100, offset-bakgrunnsjustering ved 0, lasereffekt ved 5%-7%, en skannestørrelse på 1,024 x 1,024 og en skannehastighet på 1/ 2 bilde/s. Samle 17-30 z-serien optiske seksjoner med en trinnstørrelse på 1,0 μm. Navngi bildene ved hjelp av koden i trinn 1.6, for eksempel "b6_upper_left-dag0", og lagre.
- Velg DAPI-kanalen i Brukeranskaffelse, og merk av i Z-boksen i ND-anskaffelse. Hvis du vil angi nedre og øvre grense for Z-stakken, klikker du på knappene Topp og Bunn.
- Hvis du vil rekonstruere 3D-bildene, åpner du ND2-filen (figur 3A; se Materialfortegnelse) og klikker på Volum (figur 3B).
3. Avbilde de samme plantene på forskjellige tidspunkter
- Etter hver avbildning, sett glassfatet tilbake i vekstkammeret.
- Gjenta fra trinn 2.1 for avbildning og 3D-rekonstruksjon.
MERK: For å finne de samme plantene, bruk koden nevnt i trinn 1.6 og gi navnet "b6_upper_left-day1", eller "b6_upper_left-day2", i henhold til plantens alder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne metoden tillater observasjon av celleveggdynamikk under utvikling i villtype og ggb mutanter (figur 1). Resultatene viste at regioner med mindre fortykkelse av celleveggen korrelerer med celleutvidelses- / forgreningsstedene, noe som muliggjør prediksjon av ekspansjons- / forgreningssteder i vill type (figur 1A). Overflaten av celleveggene i ggb mutanter ble revet fra hverandre under utviklingen på grunn av ukontrollert celleutvidelse3 (figur 1B). Videre er fargesignalet til den ødelagte overflaten av ggb-mutanter (som er eldre cellulose) sterkere enn celleoverflaten (som er yngre cellulose) under den ødelagte celleveggoverflaten.
Figur 1: 3-D tidsserier av moseutvikling. (A,B) Dynamiske endringer i tverrvegger ble vist ved kalkofluorhvit farging (som flekker cellulose) i WT (A) og ggb mutanter (B). For ggb-mutanter (B) indikerer hvite streklinjer under hvert bilde de ødelagte overflatecelleveggene på de ekspanderende cellene, og oransje linjer indikerer cellene under celleveggoverflaten i ggb. Panel B er gjengitt med tillatelse fra3. Merk at forskjellene i kalkofluor hvitt signal kan detekteres på overflateposisjonene til cellene, og mindre tette fargeregioner (pilspisser) er korrelert til celleutvidelses- / forgreningsstedene. Skalastenger = 20 μm. Forkortelser: d = dager; WT = vill type; ggb = geranylgeranyltransferase-I beta. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Markering av plassering av planter. På bunnen av fatet ble ni linjer hver tegnet i parallelle og vinkelrette retninger for å markere plasseringen av firkanter. Tegn a til h ble brukt til å markere rader, og tallene 1 til 8 ble brukt til å markere kolonner. Øvre, nedre, høyre, midtre og venstre ble brukt til å markere posisjoner innenfor hver firkant. For eksempel, hvis en plante (betegnet med en grønn prikk) var plassert i et torg i andre rad og sjette kolonne, og plassert i øvre venstre del, ble planten kalt b6_upper_left. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Rekonstruksjon av 3D-bilder ved hjelp av en nd2 z-stack-fil. (A) Åpne en nd2-fil i NIS-elements Viewer. Klikk LUTs (sirkel) for å justere kontrasten og lysstyrken i bildene, og klikk Volum (firkant) for å rekonstruere 3D-bildet. (B) Rekonstruert 3D-bilde fra A. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tabell 1: Liste over løsninger som brukes i denne protokollen. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Time-lapse 3-D rekonstruksjon, eller 4-D bildebehandling, er et kraftig verktøy for å observere dynamikken i cellulær morfologi under utviklingsprosesser. I denne protokollen, ved å blande kalkofluorhviten i mediet, kan dynamikken i 3-D cellulær morfologi observeres i mosen P. patens. Ved hjelp av denne metoden observerte vi at overflaten av cellevegger i ggb-mutanter blir revet fra hverandre under utvikling3. Videre er den reduserte fortykkelsen av cellevegger korrelert med celleutvidelses- / forgreningsstedene i vill type, noe som muliggjør prediksjon av ekspansjons- / forgreningsstedene. Videre, fordi kalkofluorhvit kan brukes med andre fargestoffer, for eksempel mikrosfærer, kan ytterligere informasjon om celleutvidelse observeres3.
Det er to grunner som kan forklare hvordan kalkofluorfargestoffet kan binde seg i dager til planter uten å påvirke / skade det molekylære målet. For det første kan den lave arbeidskonsentrasjonen (10 μL i 200 μL BCDATG-medium, eller 5 %) være tilstrekkelig lav til at moseprotonemata ikke påvirkes. For det andre kan kalkofluor farge det modne stadiet av cellulose, fordi fargesignalet er mye sterkere i den basale delen av villtype (som er eldre vev) enn det apikale området av apikalcellen (som er yngre vev), og den ødelagte celleveggoverflaten av ggb-mutanter (som er eldre cellulose) er sterkere enn cellene (som er yngre cellulose) under den ødelagte celleveggoverflaten.
Denne protokollen har blitt brukt til mosevev, som er enkel i struktur. Den nåværende protokollen kan også brukes på andre systemer med enkle strukturer, for eksempel rothår og trikomer i blomstrende planter. Det gjenstår imidlertid å se om den kalkofluorhvite fargingen fungerer for andre systemer med flere cellelag, for eksempel stengler. Videre, fordi kalkofluorhviten blandes med mediet, må vevet som skal farges nedsenkes i mediet. Derfor kan optimalisering være nødvendig for å bruke denne protokollen på andre systemer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne oppgir ingen konkurrerende eller økonomiske interesser.
Acknowledgments
Forfatterne takker Dr. Soucy Patricia og Betty Nunn ved University of Louisville for hjelp med konfokalmikroskopet. Dette arbeidet ble finansiert av National Science Foundation (1456884 til MPR) og av en National Science Foundation Cooperative Agreement (1849213 til MPR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-mm-thick red plastic light filter | Mitsubishi | no.102 | |
| 27 mm diameter glass base dish | Iwaki | 3930-035 | |
| Agar | Sigma | A6924 | |
| Calcofluor white | Sigma | 18909-100ML-F | Calcofluor White M2R, 1 g/L and Evans blue, 0.5 g/L |
| Confocal microscope | Nikon | A1 | NIS element software; .nd2 file in NIS-elements Viewer, download from https://www.microscope.healthcare.nikon. |
| Fluorescence microscope | Nikon | TE200 | Equipped with a DS-U3 camera; |
| Gellan gum | Nacali Tesque | 12389-96 | |
| Plant Growth Chambers | SANYO | Sanyo MLR-350H | |
| Sterilized syringe 0.22 μm filter | Millipore | SLGV033RS |
References
- Anderson, C. T., Kieber, J. J. Dynamic construction, perception, and remodeling of plant cell walls. Annual Review of Plant Biology. 71, 39-69 (2020).
- Vaahtera, L., Schulz, J., Hamann, T. Cell wall integrity maintenance during plant development and interaction with the environment. Naure Plants. 5 (9), 924-932 (2019).
- Bao, L., et al. The cellular function of ROP GTPase prenylation important for multicellularity in the moss Physcomitrium patens. Development. 149 (12), (2022).
- Colin, L., et al. Imaging the living plant cell: From probes to quantification. The Plant Cell. 34 (1), 247-272 (2022).
- Fang, Y., Spector, D. L. Live cell imaging of plants. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (2), (2010).
- Goh, T. Long-term live-cell imaging approaches to study lateral root formation in Arabidopsis thaliana. Microscopy. 68 (1), 4-12 (2019).
- Hamant, O., Das, P., Burian, A. Time-lapse imaging of developing shoot meristems using a confocal laser scanning microscope. Methods in Molecular Biology. 1992, 257-268 (2019).
- Rigal, A., Doyle, S. M., Robert, S. Live cell imaging of FM4-64, a tool for tracing the endocytic pathways in Arabidopsis root cells. Methods in Molecular Biology. 1242, 93-103 (2015).
- Yagi, N., et al. Advances in synthetic fluorescent probe labeling for live-cell imaging in plants. Plant & Cell Physiology. 62 (8), 1259-1268 (2021).
- Whitewoods, C. D., et al. CLAVATA was a genetic novelty for the morphological innovation of 3D growth in land plants. Current Biology. 28 (15), 2365-2376 (2018).
- Bao, L., et al. A PSTAIRE-type cyclin-dependent kinase controls light responses in land plants. Science Advances. 8 (4), 2116 (2022).
