이 글에서는 3차원 종양 스페로이드를 구성하기 위한 표준화된 방법을 보여줍니다. 자동화된 이미징 시스템을 사용한 스페로이드 관찰 및 이미지 기반 딥러닝 분석을 위한 전략도 설명합니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
방법 논문
약물 평가 연구를 위한 3D 종양 스페로이드 생성
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
최근 수십 년 동안 단층 배양 세포 외에도 3차원 종양 스페로이드가 항암제 평가를 위한 잠재적으로 강력한 도구로 개발되었습니다. 그러나 종래의 배양 방법은 3차원 수준에서 균질한 방식으로 종양 스페로이드를 조작하는 능력이 부족합니다. 이러한 한계를 해결하기 위해 본 논문에서는 평균 크기의 종양 스페로이드를 구성하는 편리하고 효과적인 방법을 제시합니다. 또한 전체 플레이트를 스캔하고 3차원 스페로이드에 대한 데이터를 얻을 수 있는 인공 지능 기반 분석 소프트웨어를 사용한 이미지 기반 분석 방법에 대해 설명합니다. 몇 가지 매개 변수가 연구되었습니다. 표준 종양 스페로이드 구성 방법과 고처리량 이미징 및 분석 시스템을 사용하면 3차원 스페로이드에서 수행되는 약물 테스트의 효과와 정확성을 크게 높일 수 있습니다.
서론
암은 인간이 가장 두려워하는 질병 중 하나이며, 특히 높은 사망률때문에 1. 최근 몇 년 동안 새로운 치료법이 도입됨에 따라 암 치료 가능성이 높아졌습니다 2,3,4,5. 2차원(2D) 및 3차원(3D) 체외 모델은 실험실 환경에서 암을 연구하는 데 사용됩니다. 그러나 2D 모델은 항종양 민감도를 나타내는 모든 중요한 매개변수를 즉각적이고 정확하게 평가할 수 없습니다. 따라서 약물 치료 테스트에서 생체 내 상호작용을 완전히 나타내지 못한다6.
2020년부터 글로벌 3차원(3D) 문화 시장이 크게 성장했습니다. NASDAQ OMX의 한 보고서에 따르면 3D 세포 배양 시장의 글로벌 가치는 2025년 말까지 27억 달러를 초과할 것입니다. 2D 배양 방법과 비교하여 3D 세포 배양은 증식 및 분화뿐만 아니라 장기 생존을 위해 최적화할 수 있는 유리한 특성을 나타냅니다
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
1. 스페로이드 구조
- 배양 접시의 유착 방지 처리
- 유착방지제 시약 100 μL를 U자형 웰 바닥이 있는 48웰 플레이트의 각 웰에 피펫팅하고, 10분 동안 유지한다. 10분 후, 코팅 시약을 흡인하고, 멸균된 PBS로 2회 세척한다.
- 배양 접시를 사용할 때까지 인큐베이터(37°C, 5%CO2로 가습된 공기)에 넣는다.
- 세포 준비, 수집 및 계수
- 세포에 특이적인 배양 배지를 사용하여 세포 배양 플라스크에서 세포를 배양한다(보충표 2). 예를 들어, NCI-H23, CT-26 세포는 RPMI 1640에서 배양되고, HT-29 세포는 McCoy's 5A 배지에서 배양된다. 이 두 매체에는 각각 10% 열 비활성화 FBS 및 1% P/S가 보충됩니다.
- 증식 동안 모든 세포를 표준 배양 조건(5%CO2로 가습된 공기 중에서 37°C)으로 유지한다. 여기서, NCI-H23 세포주는 다음 단계의 예로서 사용된다.
- T25 플라스크에서 배양된 세포를 1x PBS로 두 번 세척하여 배양 배지를 제거합니다(대수 단계에서 세포를 선택하고 80%-90%의 밀도로 세포를 계대하는....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
그림 1A,B는 이 연구에서 종양 스페로이드를 구성하는 데 사용된 프로세스를 보여줍니다. 우리는 먼저 48웰 U자형 바닥 플레이트에 세포를 시드했습니다. 이 단계는 2D 세포 배양에 사용되는 단계와 거의 동일합니다. 우리는 우물을 둘러싸고 있는 물이 있는 공통 인큐베이터에 플레이트를 보관하여 증착된 세포가 자가 조립 과정에서 스페로이드를 형성하기 시작하도록 했습니다. 정상적인 작동 조건에서 대부분의 유형의 종양 스페로이드는 표적 배지를 사용한 후 5일 후에 완전히 형성되었습니다(보충 표 2). 디지털 현미경으로 5일 이내에 스페로이드 구성 상태를 확인했습니다(그림 1D). 성장 과정이 완료된 후, 겔을 첨가하여 각 웰에서 개별 스페로이드를 감싸고, 각 스페로이드에 대해 생체 내 유사 세포외 기질(ECM)을 생성했습니다. 그런 다음 약물 검사가 수.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
미세 환경은 종양 성장에 중요한 역할을 합니다. 그것은 세포 외 기질, 산소 구배, 영양 및 기계적 상호 작용의 제공에 영향을 미칠 수 있으며, 따라서 유전자 발현, 신호 경로 및 종양 세포의 많은 기능에 영향을 미칠 수 있습니다 19,20,21. 많은 경우에, 2D 세포는 그러한 효과를 내지 못하거나 심지어 반대 효과를 생성하여, 약물 치료의 평가에 영향을 미친다. 그러나 3D 모델의 출현으로 이 문제가 해결되었습니다. 예를 들어, 폐암 치료 시스템에 대한 AMG510의 효과에 대한 평가는 3D 방법을 사용하여 완료되었습니다. 폐 관련 침습성 세포주에서 AMG510 치료를 모니터링하기 위해 겔 내에 내장된 종양 스페로이드를 생성하여 3D 종양-스페로이드-ECM(TSE) 모델을 구축했습니다. AMG510은 G12C 돌연변이 KRAS.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
중요한 의견과 제안을 해주신 모든 실험실 구성원에게 감사드립니다. 이 연구는 Jiangsu Commission of Health (K2019030)의 핵심 프로젝트에 의해 지원되었습니다. 개념화는 C.W.와 Z.C.에 의해, 방법론은 W.H.와 M.L.에 의해 수행되었고, 조사는 W.H.와 M.L.에 의해 수행되었고, 데이터 큐레이션은 W.H., Z.Z., S.X., M.L.에 의해 수행되었고, 원래 초안 준비는 Z.Z., J.Z., S.X., W.H., 및 X.L., 검토 및 편집은 Z.C.에서, 프로젝트 관리는 C.W.와 Z.C.에서, 자금 조달은 C.W.에서 수행했습니다. 모든 저자는 출판된 버전의 원고를 읽고 동의했습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.5-10 &무; L 피펫 팁 | AXYGEN | T-300 | |
| 1.5 mL 종기 방지 마이크로튜브 | Axygen | MCT-150-C | |
| 100-1000μ L 피펫 팁 | KIRGEN | KG1313 | |
| 15 mL 원심분리기 튜브 | 네스트 | 601052 | |
| 200 μ L 피펫 팁 | AXYGEN | T-200-Y | |
| 3D 젤 | Avatarget | MA02 | |
| 48-웰 U 바닥 플레이트 | Avatarget | P02-48UWP | |
| 50 mL 원심분리기 튜브 | 네스트 | 602052 | |
| Alamar Blue | Thermo | ||
| 접착 방지 헹굼 용액 | STEMCELL# | 07010 | |
| 인증 FBS | BI | 04-001-1ACS | |
| 탈이온수 | 알라딘 | W433884-500ml | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Gibco | 11965-092 | |
| DMSO | sigma | D2650-100ML | |
| Excel 소프트웨어 | Microsoft Office | ||
| Graphpad 프리즘 소프트웨어 | GraphPad 소프트웨어 | ||
| High Content Imager 및 SMART 시스템 | Avatarget | 1-I01 | |
| Image J 소프트웨어 | National Institutes of Health | ||
| Insulin-Transferrin-Selenium-A Supplement (100X) | Gibco | 51300-044 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| PBS | Solarbio | P1020 | |
| Penicillin/ 스트렙토마이신 Sol | Gibco | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-093 | |
| Scientific Fluoroskan Ascent | Thermo | Fluoroskan Ascent | |
| T25 Flask | JET Biofil | TCF012050 | |
| Trypsin, 0.25% (1X) | Hyclone | SH30042.01 |
참고문헌
- Carioli, G., et al. European cancer mortality predictions for the year 2021 with focus on pancreatic and female lung cancer. Annals of Oncology. 32 (4), 478-487 (2021).
- Katti, A., Diaz, B. J., Caragine, C. M., Sanjana, N. E., Dow, L. E. CRISPR in cancer ....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
