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Immunology and Infection

Saggio di vitalità dei conidi di Trichoderma stromaticum all'interno di macrofagi di derivazione mononucleare del sangue periferico umano

Published: October 20, 2023 doi: 10.3791/65231
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 1
1Laboratory of Immunobiology - Department of Biological Sciences, State University of Santa Cruz - UESC, 2Università Degli Studi di Genova
* These authors contributed equally

Summary

La tecnica che prevede la fagocitosi dei conidi fungini da parte dei macrofagi è ampiamente utilizzata per gli studi che valutano la modulazione delle risposte immunitarie nei confronti dei funghi. Lo scopo di questo manoscritto è quello di presentare un metodo per valutare la fagocitosi e le capacità di clearance dei macrofagi di derivazione mononucleare del sangue periferico umano stimolati con Trichoderma stromaticum conidia.

Abstract

I macrofagi rappresentano una linea di difesa cruciale e sono responsabili della prevenzione della crescita e della colonizzazione di agenti patogeni in diversi tessuti. La fagocitosi conidiale è un processo chiave che consente di studiare gli eventi citoplasmatici e molecolari coinvolti nelle interazioni macrofago-patogeno, nonché di determinare il momento di morte dei conidi internalizzati. La tecnica che prevede la fagocitosi dei conidi fungini da parte dei macrofagi è ampiamente utilizzata per gli studi che valutano la modulazione delle risposte immunitarie nei confronti dei funghi. L'evasione della fagocitosi e la fuga dei fagosomi sono meccanismi di virulenza fungina. Di seguito, riportiamo i metodi che possono essere utilizzati per l'analisi della fagocitosi, della clearance e della vitalità di T. stromaticum conidia, un fungo che viene utilizzato come agente di biocontrollo e biofertilizzante ed è in grado di indurre infezioni umane. Il protocollo consiste in 1) coltura di Trichoderma , 2) lavaggio per ottenere conidi, 3) isolamento delle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) utilizzando il metodo della soluzione di polisaccarosio e la differenziazione delle PBMC in macrofagi, 4) un metodo di fagocitosi in vitro utilizzando vetrini coprioggetti rotondi e colorazione e 5) un test di clearance per valutare la vitalità dei conidi dopo la fagocitosi dei conidi. In sintesi, queste tecniche possono essere utilizzate per misurare l'efficienza di eliminazione fungina dei macrofagi.

Introduction

Il genere Trichoderma (Ordine: Hypocreales, Famiglia: Hypocreaceae) è composto da funghi saprofiti ubiquitari che sono parassiti di altre specie fungine e sono in grado di produrre una serie di enzimi commercialmente utili1. Queste specie fungine sono utilizzate per la produzione di proteine eterologhe2, la produzione di cellulosa3, etanolo, birra, vino e carta4, nell'industria tessile5, nell'industria alimentare6 e in agricoltura come agenti di controllo biologico 7,8. Oltre all'interesse industriale per queste specie fungine, il crescente numero di infezioni nell'uomo ha conferito ad alcune specie di Trichoderma lo status di patogeni opportunisti9.

Trichoderma spp. cresce rapidamente in coltura, con colonie inizialmente bianche e cotonose che virano dal giallo verdastro al verde scuro10. Sono adattati a vivere in un'ampia gamma di condizioni di pH e temperatura, e le specie opportuniste sono in grado di sopravvivere a pH e temperature fisiologiche e, quindi, colonizzare diversi tessuti umani 11,12,13. È importante sottolineare che l'aumento del tasso di infezione da Trichoderma spp. può essere associato a fattori di virulenza e questi non sono ben studiati. Inoltre, gli studi incentrati sulla comprensione della risposta immunitaria contro le specie opportuniste di Trichoderma sono ancora rari.

Durante un'infezione, insieme ai neutrofili, i macrofagi rappresentano la linea di difesa responsabile della fagocitosi e, quindi, impediscono la crescita e la colonizzazione di agenti patogeni in diversi tessuti. Utilizzando recettori di riconoscimento di pattern, come i recettori Toll-like e i recettori della lectina di tipo C, i macrofagi fagocitano i funghi e li trasformano in fagolisosomi, promuovendo così un'esplosione respiratoria, il rilascio di citochine pro-infiammatorie e la distruzione dei microrganismi fagocitati14. Il meccanismo della fagocitosi, tuttavia, può essere influenzato ed eluso da diverse strategie microbiche, come la dimensione e la forma delle cellule fungine; la presenza di capsule che ostacolano la fagocitosi; diminuzione del numero di recettori che inducono la fagocitosi; il rimodellamento della struttura delle fibre di actina nel citoplasma; ostacolare la formazione di pseudopodi; e il fagosoma o il fagolisosoma fuoriescono dopo il processo di fagocitosi14.

Molti agenti patogeni, tra cui il Cryptococcus neoformans, usano i macrofagi come nicchia per sopravvivere nell'ospite, disseminarsi e indurre l'infezione15. Il saggio di fagocitosi e clearance viene utilizzato per valutare la risposta immunitaria contro i patogeni e per identificare le strategie microbiche impiegate per eludere il sistema immunitario innato 15,16,17. Questo tipo di tecnica può anche essere utilizzata per esaminare la cinetica differenziale della fagocitosi, dell'acidificazione ritardata dei fagosomi e dell'esplosione ossidativa che si traducono in una riduzione dell'uccisione fungina18.

Diversi metodi possono essere utilizzati per valutare la fagocitosi, la sopravvivenza fungina e l'evasione del processo di maturazione del fagosoma. Questi includono la microscopia a fluorescenza, che viene utilizzata per osservare la fagocitosi, la posizione cellulare e le molecole prodotte durante la fagocitosi19; citometria a flusso, che fornisce dati quantitativi sulla fagocitosi e viene utilizzata per valutare i diversi marcatori coinvolti nel processo20,21; microscopia intravitale, che viene utilizzata per valutare la cattura microbica e la maturazione dei fagosomi22; fagocitosi mediata da anticorpi, che viene utilizzata per valutare la specificità del processo di fagocitosi per un patogeno23; e altri 24,25,26,27.

Il protocollo qui presentato impiega un metodo comune, a basso costo e diretto che utilizza un microscopio ottico e un saggio di crescita su piastra per valutare la fagocitosi e l'uccisione dei conidi fungini. Questo protocollo fornirà ai lettori istruzioni dettagliate per l'esecuzione del saggio di fagocitosi e clearance utilizzando macrofagi di derivazione mononucleare del sangue periferico umano esposti a T. stromaticum. I PBMC sono stati utilizzati perché i conidi di Trichoderma sono applicati come biocontrollo contro i fitopatogeni e come biofertilizzante per le colture vegetali in tutto il mondo e hanno causato diverse infezioni umane, chiamate Trichodermosis. Oltre a ciò, ci sono solo due lavori precedenti incentrati sull'interazione tra Trichoderma conidi e il sistema immunitario umano, in cui abbiamo esaminato i neutrofili28 e l'autofagia nei macrofagi29. Questo articolo mostra in primo luogo come la fagocitosi dei conidi di T. stromaticum da parte di macrofagi derivati da PBMC possa essere studiata, e poi come la vitalità dei conidi inghiottiti possa essere valutata utilizzando semplici tecniche basate sulla microscopia. Questo protocollo può facilitare ulteriormente le indagini sulla risposta immunitaria associata ai macrofagi o sui meccanismi correlati alla modulazione del sistema immunitario.

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Protocol

Considerazioni etiche e soggetti umani
Tutti gli esperimenti con gli esseri umani descritti in questo studio sono stati condotti secondo la Dichiarazione di Helsinki e le leggi federali brasiliane e approvati dal Comitato Etico dell'Università Statale di Santa Cruz (codice di identificazione del progetto: 550.382/2014).

Il sangue periferico umano è stato raccolto da volontari sani della città di Ilhéus, Bahia, Brasile, non esposti ad attività lavorative legate al fungo studiato. Sono stati esclusi gli individui con condizioni mediche di salute segnalate o che fanno uso di farmaci. Tutti i soggetti hanno accettato volontariamente di partecipare e hanno firmato un modulo di consenso informato prima di essere inclusi in questo studio.

1. Preparazione dei reagenti e delle soluzioni

NOTA: Preparare i seguenti reagenti e soluzioni prima di procedere. Vedere la tabella dei materiali (TOM) per le informazioni sul fornitore del reagente e del materiale.

  1. Preparare una soluzione salina sterile bilanciata tamponata con fosfato 1x (PBS).
    NOTA: In questo protocollo, non è stato utilizzato PBS privo di endotossine.
  2. Preparare il terreno di agar destrosio di patate (PDA) e versare 20 ml in ciascuna capsula di Petri per la coltura di T. stromaticum . Preparare sei piastre con PDA per ogni donatrice e utilizzare una piastra per ogni condizione: 3 ore, 24 ore, 48 ore, 72 ore, 96 ore e 120 ore. Inoltre, utilizzare tre piastre per ciascun controllo: tre per il controllo Trichoderma e tre per il controllo medio R10. Utilizzare piastre di Petri da 60 mm x 15 mm o 100 mm x 15 mm per un recupero ottimale dei conidi.
  3. Sterilizzare il glicerolo al 100%.
  4. Preparare un terreno R10 per la coltura cellulare: terreno RPMI integrato con il 10% di siero fetale bovino e l'1% di antibiotico (penicillina/streptomicina).
  5. Sterilizzare l'acqua distillata per la lisi cellulare.
  6. Preparare l'acqua a pH 7,0 per il processo di colorazione.
    NOTA: Se necessario, regolare il pH utilizzando un pHmetro e soluzioni di NaOH 0,1 M/L e HCl 0,1 M/L.
  7. Sterilizzare il vetrino coprioggetti rotondo (13 mm) e le pinzette.

2. Coltura e lavorazione del Trichoderma stromaticum

  1. Preparazione di un ceppo madre (M1) di T. stromaticum:
    NOTA: È necessario un ceppo madre (M1) per garantire che tutti gli esperimenti siano eseguiti dalla coltura della stessa generazione fresca (F1).
    1. Coltivare un inoculo di T. stromaticum in piastre di Petri con PDA a 28 °C al buio per 7-10 giorni fino a quando i conidi non vengono osservati e la coltura diventa verde.
    2. Lavare la coltura di T. stromaticum. Aggiungere 3-5 mL di PBS alla superficie di coltura utilizzando una pipetta. Raccogliere il PBS dalla piastra e distribuirlo nuovamente sulla coltura per rimuovere gradualmente i conidi utilizzando la pipetta. Ripetere questo processo quanto necessario fino a quando la sospensione non diventa verde scuro.
      NOTA: In alternativa, si suggerisce un lavaggio delicato della coltura aggiungendo 3-5 mL di PBS alla piastra seguito dall'esecuzione di un movimento circolare fino a quando la sospensione diventa verde per recuperare i conidi. Con il pipettaggio ripetuto, è possibile raccogliere più conidi.
    3. Trasferire la sospensione recuperata dalla piastra in una provetta sterile da 15 mL con una pipetta. Ripetere i passaggi 2.1.2-2.1.3 tutte le volte necessarie per ottenere più conidi.
    4. Centrifugare la sospensione a 1.160 x g per 5 minuti a 12 °C e risospendere il pellet in 5 mL di PBS. Ripetere questa fase (2.1.4) tre volte per ottenere una sospensione priva di ife.
      NOTA: Per risospendere correttamente il pellet, dopo la centrifugazione, si consiglia un breve vortex.
    5. Risospendere il pellet finale in 2-3 mL di PBS e contare i conidi in una camera Neubauer utilizzando una diluizione di 1:100 o 1:1.000.
      NOTA: In condizioni ottimali, è possibile recuperare dalla coltura una concentrazione finale di 2 x 108 conidi/mL. La valutazione della vitalità dei conidi utilizzando il metodo di esclusione del blu tripano è facoltativa.
    6. Aliquotare la sospensione in provette sterili da 1,5 mL aggiungendo 0,5 mL della sospensione dei conidi (dal punto 2.1.5) a ciascuna provetta. Quindi, aggiungere 0,5 mL di glicerolo sterile al 100% per ottenere scorte M1. Vorticare brevemente, identificare i tubi e conservare a -20 °C o -80 °C.
  2. Coltura di T. stromaticum e ottenimento dei conidi per l'esperimento
    1. Piastra 10 μL della sospensione M1 (preparata nella fase 2.1) in PDA a 28 °C al buio per 7-10 giorni fino a quando i conidi sono osservati e la coltura diventa verde per ottenere la generazione F1 fresca.
      NOTA: Per garantire una coltura di T. stromaticum fresca per l'esperimento, valutare il tempo necessario per la crescita del fungo e il tempo necessario per la differenziazione dei macrofagi.
    2. Raccogliere i conidi, ripetendo i passaggi 2.1.2-2.1.4.
    3. Risospendere il pellet finale in 2-3 mL di PBS. Valutare la vitalità dei conidi utilizzando il metodo di esclusione del blu tripano o contare i conidi come indicato al punto 2.1.5.

3. Isolamento delle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC)

NOTA: Le PBMC sono ottenute con il metodo della barriera di densità utilizzando una soluzione di polisaccarosio di densità 1,077 g/mL30.

  1. Aliquotare 15 mL della soluzione di polisaccarosio in una provetta da 50 mL per ogni campione del donatore che verrà raccolto.
  2. Raccogliere 20 ml di sangue da ciascun donatore utilizzando da tre a quattro provette EDTA. Recluta un minimo di quattro donatori per esperimento. Non raccogliere il sangue dei donatori; Invece, usa ogni campione separatamente come replica biologica. Per ogni donatore, trasferire il sangue in una provetta da 50 mL e aggiungere PBS per ottenere un volume finale di 35 mL.
  3. Trasferire lentamente la sospensione di sangue (fase 3.2) lungo la parete della provetta contenente la soluzione di polisaccarosio (fase 3.1) per formare una sospensione bifasica.
    NOTA: Per evitare che il sangue si mescoli con la soluzione di polisaccarosio, aggiungere lentamente il sangue. Si raccomanda l'uso di un minimo di 7 ml di sangue di ciascun donatore per l'isolamento PBMC.
  4. Centrifugare immediatamente la provetta contenente la sospensione bifasica a 1.600 x g per 30 minuti a 24 °C. Programmare la centrifugazione delle PBMC: utilizzare l'accelerazione 1 e la decelerazione 0 per evitare un brusco arresto della centrifugazione.
  5. Osservare la formazione di un anello bianco contenente le PBMC dopo la centrifugazione. I globuli rossi e i granulociti risiedono nello strato inferiore, lo strato successivo contiene la soluzione di polisaccarosio e le PBMC risiedono nell'anello bianco tra la soluzione di polisaccarosio e il plasma (strato superiore). Raccogliere l'anello bianco aspirando delicatamente con una pipetta o una pipetta Pasteur sterile in modo da non impigliare globuli rossi, plasma o soluzione di polisaccarosio e trasferirlo in una provetta da 15 ml.
  6. Aggiungere PBS alla provetta da 15 mL contenente le PBMC per ottenere un volume finale di 10 mL. Omogeneizzare la sospensione e centrifugare la provetta a 1.600 x g per 30 minuti a 24 °C.
  7. Lavare le cellule tre volte a 1.600 x g per 5 minuti a 24 °C con 10 mL di PBS. Quindi, risospendere il pellet finale in 2 mL di terreno R10.
  8. Valutare la vitalità cellulare utilizzando il metodo di esclusione del blu di tripano e contare le cellule in una camera di Neubauer.

4. Cinetica della fagocitosi

NOTA: I macrofagi di derivazione mononucleare del sangue periferico umano sono trattati con conidi di T. stromaticum a una molteplicità di infezione (MOI) di 1:10 o solo terreno R10 come controllo. La molteplicità dell'infezione (MOI) rappresenta il rapporto tra gli agenti infettivi aggiunti ai bersagli di infezione ed è presentata come numeri assoluti: MOI = agenti:bersagli31. In questo caso, utilizziamo 1 conidi di T. stromaticum (agente) per 10 macrofagi (bersagli). Successivamente, le cellule vengono incubate a 37 °C e al 5% di CO2 per diversi periodi di tempo (3 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h e 120 h). Successivamente, viene utilizzato un vetrino coprioggetti rotondo per visualizzare al microscopio i macrofagi aderenti coinvolti nel processo di fagocitosi. Viene fornita una figura di disegno sperimentale (Figura 1).

NOTA: Si consiglia l'uso di piastre a 24 pozzetti.

  1. Trattamento dei macrofagi di origine umana con T. stromaticum conidia
    1. Aggiungere un vetrino coprioggetti rotondo sterile (13 mm) a ciascun pozzetto utilizzando una pinzetta sterile.
    2. Regolare il volume della sospensione cellulare ottenuta nei passaggi 3,7-3,8 per placcare 8 x 105 cellule per pozzetto fino a un volume finale di 1 mL con terreno R10. Utilizzare un microscopio invertito per valutare la morfologia cellulare.
      NOTA: Le cellule devono essere sospese nel terreno e avere una morfologia arrotondata.
    3. Incubare le cellule a 37 °C in un'atmosfera di CO2 al 5% per 7 giorni e sostituire il terreno con terreno fresco R10 ogni 2 giorni per la differenziazione dei monociti in macrofagi32. Osservare la morfologia cellulare utilizzando un microscopio invertito. I macrofagi presenteranno morfologia fusiforme, con forme appiattite ed estese; Si può osservare anche un aumento del rapporto citoplasmatico e la presenza di pseudopodi. Cerca macrofagi aderenti di derivazione mononucleare.
      NOTA: Una percentuale molto piccola di monociti indifferenziati può rimanere sospesa nel terreno.
    4. Rimuovere il terreno di ciascun pozzetto utilizzando una pipetta e lavare le cellule con 1 mL di PBS per rimuovere detriti e cellule non aderenti.
    5. Utilizzare la sospensione preparata nella fase 2.2 per preparare una nuova sospensione di T. stromaticum conidia ad una concentrazione finale di 8 x 104 conidi/mL in terreno R10.
    6. Aggiungere 1 mL della sospensione di conidi preparata nella fase 4.1.5 a ciascun pozzetto di trattamento (3 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h e 120 h) per ottenere un MOI di 1:10. Ai controlli, aggiungere solo 1 mL di terreno R10 al pozzetto.
    7. Sfidare i macrofagi per 3 ore con T. stromaticum conidi a 37 °C in un'atmosfera di CO2 al 5%. Dopo 3 ore, rimuovere il terreno e lavare le cellule per rimuovere i conidi non fagocitati.
    8. Aggiungere 1 mL di terreno R10 a ciascun pozzetto e incubare la piastra per tempi diversi (3 ore, 24 ore, 48 ore, 72 ore, 96 ore e 120 ore) a 37 °C in un'atmosfera di CO2 al 5%.
  2. Colorazione e analisi
    1. Al termine dell'incubazione corrispondente (passaggio 4.1.8), rimuovere il terreno da ciascun pozzetto e aggiungere 1 mL di PBS al pozzetto.
    2. Rimuovere i vetrini coprioggetti rotondi dai pozzetti utilizzando una pinzetta sterile e un ago per colorare con un kit di colorazione.
      NOTA: In alternativa, la colorazione può essere eseguita utilizzando la colorazione May Grünwald-Giemsa33.
    3. A ciascuno dei vetrini coprioggetti rotondi, aggiungere fissatore di macchie (5 s), colorante 1 (5 s), colorante 2 (2 s) e acqua tamponata pH 7,0 (5 s), che sono i componenti del kit di colorazione. Attendere che siano asciutti e fissare i vetrini coprioggetti su un vetrino utilizzando un agente di montaggio.
    4. Quantificare il risultato: contare un totale di 100 macrofagi (Mø) per ogni condizione temporale. Utilizzando un microscopio ottico, contare il numero di macrofagi con conidi fagocitati utilizzando un obiettivo 100x e olio da immersione (equazione [1]).
      Equation 1 (1)
    5. Ottenere il numero di conidi fagocitati per macrofago: correlare i conidi presenti in 100 macrofagi diviso per il numero di macrofagi con almeno un conidio fagocitato (equazione [2])34.
      Equation 2 (2)
      NOTA: Per valutare e contare i conidi, è possibile utilizzare il software ImageJ35.
    6. Fotografare la fagocitosi da ogni campione e condizione temporale utilizzando obiettivi 40x e 100x per presentare i risultati.

Figure 1
Figura 1: Rappresentazione schematica del saggio di fagocitosi e vitalità conidiale utilizzando macrofagi di derivazione mononucleare del sangue periferico umano. (versetti da 1 a 10) Saggio di fagocitosi: Il T. stromaticum deve essere coltivato in PDA e i conidi vengono recuperati lavando la piastra con PBS. Le PBMC devono essere isolate con il metodo della barriera di densità utilizzando il protocollo descritto, coltivate in piastre a 24 pozzetti con vetrini coprioggetti rotondi sterili per 7 giorni per la differenziazione in macrofagi e quindi trattate con un MOI di 1:10 con intervalli di tempo diversi. I vetrini coprioggetti rotondi vengono rimossi e colorati con il kit di colorazione e i risultati vengono analizzati al microscopio ottico. (1-8,11-13) Saggio di vitalità dei conidi: dopo l'isolamento, i PBMC vengono coltivati in piastre da 24 pozzetti senza vetrini coprioggetti rotondi per 7 giorni per la differenziazione in macrofagi e quindi trattati con un MOI di 1:10 per diversi intervalli di tempo. Le cellule devono essere lisate mediante incubazione con acqua distillata; la sospensione viene quindi centrifugata, quindi il pellet risospeso viene placcato in PDA per analizzare la cinetica di crescita del Trichoderma. Questa figura è stata progettata utilizzando un database di immagini. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

5. Saggio di vitalità conidiale dopo fagocitosi

NOTA: Viene fornita una figura di disegno sperimentale (Figura 1).

NOTA: Utilizzare piastre a 24 pozzetti.

  1. Sfida i macrofagi di origine umana con T. stromaticum conidia.
    1. Ripetere i passaggi 4.1.2-4.1.8 per differenziare i monociti e trattare i macrofagi con T. stromaticum conidia.
      NOTA: Non utilizzare vetrini coprioggetti rotondi nei pozzetti. Utilizzare gli stessi intervalli di tempo utilizzati per saggiare la cinetica di fagocitosi in modo che la fagocitosi possa essere correlata con la vitalità dei conidi.
    2. Valutare l'impatto del terreno R10 sulla crescita di T. stromaticum utilizzando pozzetti con la sospensione preparata al punto 4.1.5 (terreno R10 + conidi) come controllo.
  2. Saggio di vitalità conidiale
    1. Rimuovere il terreno dopo ogni periodo di incubazione (3 ore, 24 ore, 48 ore, 72 ore, 96 ore e 120 ore) e lavare le cellule due volte con PBS per rimuovere i conidi che non sono stati fagocitati.
      NOTA: Il controllo contenente R10 medio + conidi non deve essere lavato.
    2. Aggiungere 0,5 mL di acqua distillata sterile in ciascun pozzetto e incubare la piastra a 37 °C e 5% di CO2 per 30 min. Trascorso questo tempo, osservare la morfologia delle cellule al microscopio invertito per assicurarsi che le cellule siano state lisate.
    3. Raccogliere la sospensione e trasferirla in provette da 1,5 ml. Centrifugare la sospensione utilizzando una mini centrifuga a 6.000 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.
    4. Scartare con cura il surnatante, risospendere il pellet in 10 μL di acqua distillata sterile e inoculare 10 μL di sospensione nella piastra contenente PDA a 28 °C al buio.
    5. Preparare un controllo positivo per la crescita di T. stromaticum : utilizzare la sospensione di T. stromaticum conidi (fase 2.2) per preparare una nuova sospensione con una concentrazione finale di 8 x 106 conidi/mL. Piastra 10 μL di questa sospensione in PDA a 28 °C al buio.
      NOTA: 10 μL di questa sospensione conterranno lo stesso numero di conidi (8 x 104) che è stato utilizzato per infettare i macrofagi di derivazione mononucleare del sangue. La differenza tra questo controllo positivo e quello menzionato al punto 5.1.2 è che il controllo menzionato al punto 5.1.2 viene utilizzato per valutare il possibile impatto del terreno R10 sulla crescita del Trichoderma durante il periodo di fagocitosi. Questo controllo positivo nella fase 5.2.5 utilizzando la sospensione di T. stromaticum conidia raccolta in PBS rappresenta un controllo per la crescita di Trichoderma senza l'influenza del terreno R10 per riflettere il modo in cui il fungo cresce naturalmente. Utilizzando questo controllo, è possibile valutare se il terreno R10 influenza la crescita del Trichoderma .
    6. Osservare ogni giorno la cinetica di crescita di T. stromaticum nel PDA e fotografare la coltura.
    7. Analisi: Due punti possono essere utilizzati per valutare i risultati: 1) il tempo (in giorni) necessario affinché la coltura occupi l'intera piastra di coltura, e 2) il tempo (in giorni) fino alla comparsa della caratteristica pigmentazione verde dei conidi di T. stromaticum in coltura.

6. Analisi statistica

  1. Utilizzare un test di Kruskal-Wallis per determinare differenze statisticamente significative tra gli 8 gruppi/trattamenti. Si consideri p < 0,05 come statisticamente significativo. Tutti i dati sono presentati come medie ± deviazione standard (SD). Nelle figure, # indica la significatività statistica a p < 0,05.

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Representative Results

La tecnica che prevede la fagocitosi dei conidi fungini da parte dei macrofagi è ampiamente utilizzata per gli studi che valutano la modulazione delle risposte immunitarie nei confronti dei funghi. Abbiamo utilizzato la fagocitosi dei conidi di T. stromaticum per valutare la vitalità dei conidi dopo la fagocitosi, poiché l'evasione della fagocitosi e la fuga dei fagosomi sono meccanismi di virulenza fungina. I ricercatori dovrebbero eseguire queste tecniche come uno dei primi saggi quando studiano una specie di interesse clinico.

Figure 2
Figura 2: Fagocitosi dei conidi di T. stromaticum da parte di macrofagi di derivazione mononucleare del sangue periferico umano. Risultati rappresentativi della cinetica di fagocitosi (A) sotto obiettivi 40x e (B) 100x che mostrano macrofagi derivati da PBMC contenenti T. stromaticum conidia. (C) T. stromaticum conidia liberi e attaccati alla membrana esterna; (D) T. stromaticum conidi completamente internalizzati dai macrofagi; (E) conidi di T. stromaticum in un piano superiore; (F) fagocitosi multipla; e (G) germinazione dei conidi all'interno (H) e all'esterno dei macrofagi. Frecce: gialle, conidi liberi; bianco, conidi attaccati alla membrana esterna; conidi neri, completamente interiorizzati; germinazione rossa dei conidi all'interno dei macrofagi. Frecce tratteggiate: nere, fagocitosi multipla; conidi rossi che germinano nel terreno R10 al di fuori dei macrofagi; bianco, conidi nel piano superiore. La barra della scala indica 20 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.

La Figura 2 mostra i risultati rappresentativi della cinetica di fagocitosi. All'inizio del processo di fagocitosi, si possono osservare conidi liberi di T. stromaticum, così come conidi attaccati alla membrana esterna dei macrofagi o da essi completamente internalizzati (Figura 2A-C). Meno conidi possono essere osservati liberi o attaccati alla membrana esterna dei macrofagi con l'aumentare del tempo di fagocitosi.

In particolare, in questo lavoro, i conidi potrebbero essere trovati liberi e attaccati alla membrana esterna (Figura 2C) all'inizio del processo di fagocitosi, completamente internalizzati dai macrofagi (Figura 2D), o in un piano superiore rispetto ai macrofagi (Figura 2E) ma non fagocitati, e più di un conidio potrebbe essere trovato nello stesso macrofago (Figura 2F). Dopo lunghi periodi di tempo (96 ore), i conidi fagocitati potrebbero germinare all'interno dei macrofagi (Figura 2G) e i conidi liberi potrebbero germinare nel terreno R10 per formare ife a 37 °C (Figura 2H).

Dopo la fagocitosi, è stato possibile osservare che i conidi di T. stromaticum sono rimasti vitali anche dopo 120 ore di interazione con i macrofagi umani derivati da PBMC. I risultati rappresentativi mostrano la coltura dei conidi recuperati (Figura 3A) e rappresentano il tempo (in giorni) necessario affinché la coltura occupi l'intera piastra di coltura (Figura 3B) e formi conidi colorati di verde (Figura 3C). Solo i conidi discreti di T. stromaticum sono stati in grado di eludere il fagosoma e di essere trovati liberi nel citoplasma del sangue periferico umano, i macrofagi di derivazione mononucleare29. La capacità del Trichoderma di diminuire la produzione di specie reattive dell'ossigeno e dell'azoto può anche contribuire alla sopravvivenza dei conidi all'interno del fagosoma e spiegare la vitalità dopo la fagocitosi 28,29,36. Finora, abbiamo dimostrato che i conidi fagocitati rimangono vitali e sono in grado di crescere nel terreno PDA anche dopo 120 ore. È stato anche segnalato che altri microrganismi sopravvivono dopo l'inghiottimento da parte dei macrofagi, come Aspergillus27,37 e Cryptococcus38.

Figure 3
Figura 3: Capacità di clearance dei macrofagi di derivazione mononucleare del sangue periferico umano infettati da T. stromaticum conidia. Dopo un challenge con T. stromaticum conidia (3 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h o 120 h) i macrofagi derivati da PBMC sono stati lisati e la sospensione è stata placcata in PDA per valutare la vitalità dei conidi fagocitati. (A) Vengono mostrati i risultati rappresentativi della crescita di T. stromaticum dopo fagocitosi da parte di macrofagi derivati da PBMC. Monitoraggio (B) della crescita di T. stromaticum e (C) della conidiazione in giorni diversi per il controllo positivo con T. stromaticum in PBS (vedere fase 5.2.5), il controllo per il terreno R10 (vedere fase 5.1.2) e i conidi fagocitati dai macrofagi per diversi periodi di tempo (3 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h, 120 h). Risultati rappresentativi di quattro donatori sani. Media ± deviazione standard (SD). Test di Kruskal-Wallis. Il simbolo # indica la significatività a p < 0,05, n = 4. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Per diversi patogeni fungini, tra cui Aspergillus fumigatus, Cryptococcus, Candida albicans e altri, la fagocitosi conidiale o del lievito è un processo chiave che consente di studiare gli eventi citoplasmatici e molecolari nelle interazioni macrofago-patogeno, nonché di determinare il momento della morte dei conidi internalizzati 14,39,40. La fagocitosi è il processo chiave nell'interazione Trichoderma-ospite. Il genere Trichoderma modula diverse vie di fagocitosi, tra cui Dectin-1 e Dectin-2, il recettore Toll-like 2 e il recettore Toll-like 4, MHC e NF-κB 25,28,41,42,43. I Trichoderma causano tricodermisi in individui compromessi e non immunocompromessi9. È importante sottolineare che diverse specie di questo genere sono utilizzate in agricoltura e sono la potenziale fonte di Trichodermosis. La comprensione dei fattori di virulenza di T. stromaticum e del meccanismo della risposta immunitaria nel corpo umano contro questi funghi è urgentemente necessaria, poiché i rischi professionali causati dalle specie di Trichoderma, tra cui T. stromaticum, stanno aumentando in modo allarmante. Il metodo qui presentato fornisce dettagli per l'esecuzione del saggio di fagocitosi e uccisione per lo studio dell'interazione Trichoderma-macrofago nei macrofagi derivati dal sangue periferico umano; Tuttavia, questo metodo può essere utilizzato anche per studiare i macrofagi di diversi tessuti, inclusi i macrofagi alveolari, peritoneali o di lignaggio.

La prima fase di questo protocollo inizia con una sospensione di stock madre (M1) per ottenere colture fresche del fungo. Le colture di Trichoderma crescono rapidamente, poiché di solito prendono il controllo dell'intera piastra e iniziano a mostrare conidi di colore verde entro 5 giorni. La temperatura e la luce sono fattori cruciali per la crescita del Trichoderma e le alterazioni di questi fattori possono influenzare la cinetica del Trichoderma e compromettere l'esperimento44.

Dopo aver lavato la coltura di T. stromaticum, è necessario recuperare un volume finale compreso tra 5 e 8 ml. L'intensità del colore della sospensione è proporzionale alla concentrazione dei conidi. La sospensione dei conidi ottenuta può essere utilizzata per saggi in vitro e in vivo, ad esempio per la valutazione della fagocitosi26, delle trappole extracellulari dei neutrofili28, dell'esposizione intranasale36,41, dell'esposizione intraperitoneale26, dell'infezione intracutanea45 e dell'infezione endovenosa46. Precedenti ricerche condotte con macrofagi umani hanno valutato l'autofagia indotta da Trichoderma29 e la capacità del genere di inibire la formazione di trappole extracellulari nei neutrofili28, che è un meccanismo utilizzato per eliminare patogeni fungini e altri microrganismi.

È importante notare che il terreno di coltura utilizzato per mantenere le cellule può influire sulla germinazione conidiale (Figura 3G,H). Se la germinazione non è desiderata per un particolare esperimento, si consiglia di eseguire un test di screening iniziale con il terreno di coltura cellulare per stabilire la cinetica di crescita del Trichoderma in quel particolare terreno. Questo test deve essere eseguito prima di iniziare gli esperimenti in vitro con la linea cellulare desiderata e l'esperimento deve essere interrotto dopo 72 ore se il terreno risulta non compatibile. La germinazione dei conidi di Trichoderma (Figura 3G,H) può essere osservata a partire da 96 ore all'interno e all'esterno dei macrofagi.

Poiché le specie di Trichoderma presentano differenze nella morfologia e nella temperatura e nel pH ottimali per la loro crescita, i risultati qui presentati potrebbero non essere riproducibili per tutte le specie del genere e questo protocollo potrebbe richiedere adattamenti quando eseguito con altre specie. Ad esempio, i conidi di Trichoderma asperelloides germinano più rapidamente in coltura rispetto a quelli di T. stromaticum.

I precedenti protocolli documentati per valutare la fagocitosi e l'uccisione del patogeno utilizzando la citometria a flusso e la microscopia a fluorescenza richiedono reagenti costosi, ma forniscono informazioni specifiche sul processo di fagocitosi19. Il protocollo presentato in questo articolo richiede solo un microscopio ottico e la crescita della piastra per valutare la fagocitosi e fornisce immagini complete del processo di fagocitosi. Diversi protocolli possono essere utilizzati per ottenere macrofagi differenziati e indurre la lisi dei macrofagi. Questi protocolli includono l'uso di tempi diversi per la differenziazione dei macrofagi invece dei 7 giorni utilizzati qui26 o l'uso di desossicolato47 al 2,5% per lisare i macrofagi invece di acqua distillata a 37 °C e 5% di CO2 per 30 minuti, come utilizzato qui in questo protocollo. Questi metodi sono stati efficacemente utilizzati per diverse specie fungine come A. fumigatus27, A. nidulans18 e Cryptococcus neoformans15.

Alcune limitazioni di questo protocollo sono legate all'uso di PBS che non è privo di endotossine, all'uso di vetrini coprioggetti rotondi e all'uso di sangue umano. Si consiglia di testare il PBS (non privo di endotossine) sulle cellule per assicurarsi che non possa attivare i monociti e influenzare l'esperimento. L'uso di vetrini coprioggetti rotondi è molto utile per colorare e contare le cellule, ma le cellule potrebbero non diffondersi uniformemente sotto il vetrino, poiché alcune cellule migrano verso il bordo del pozzetto della piastra e questa differenza può avere un impatto sul numero totale stimato di cellule nei vetrini coprioggetti rotondi. Poiché non utilizziamo l'immunofluorescenza o tecniche simili in questo protocollo, la presenza di conidi non fagocitati in un piano superiore rispetto ai macrofagi può portare a un'errata interpretazione dei risultati della fagocitosi. Poiché utilizziamo sangue proveniente da donatori umani, la conta finale delle PBMC varia da un donatore all'altro e un basso numero di cellule donatrici potrebbe non essere sufficiente per tutti gli esperimenti.

In sintesi, queste tecniche possono essere utilizzate per misurare la funzione dei macrofagi e la clearance fungina, in particolare per funghi filamentosi come Trichoderma e altri microbi, come lieviti e batteri. Inoltre, questo protocollo fornisce indicazioni future per lo studio della reale variabilità nella risposta immunitaria contro i funghi che formano conidi nelle popolazioni umane, che non possono essere osservate utilizzando modelli animali isogenici o linee cellulari.

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Disclosures

Tutti gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto dalle seguenti istituzioni finanziarie brasiliane: Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia (FAPESB) con sovvenzioni RED0011/2012 e RED008/2014. U.R.S., J.O.C. e M.E.S.M. riconoscono la borsa di studio concessa rispettivamente da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e FAPESB.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL centrifuge tubes Corning CLS431470 15 mL centrifuge tubes, polypropylene, conical bottom with lid, individually sterile
24-Well Flat Bottom Cell Culture Plate Kasvi K12-024 Made of polystyrene with alphanumeric identification; The Cell Culture Plate is DNase, RNase and pyrogen-free and free of cytotoxic substances; Sterilized by gamma radiation;
Cell culture CO2 incubator Sanyo 303082 A CO2 incubator serves to create and control conditions similar to a human body, thus allowing the in vitro growth and proliferation of different cell types.
Centrifuge Microtube (eppendorf type) 1.5 mL Capp 5101500 Made from polypropylene, with a cap attached to the tube for opening and closing with just one hand. It has a polished interior against protein adhesion and for sample visibility, being free of DNase, RNase and Pyrogens
Circular coverslip 15 mm Olen K5-0015 Circular coverslips are used for microscopy techniques in cell culture. Made of super transparent translucent glass; with thickness of 0.13 mm
Class II Type B2 (Total Exhaust) Biosafety Cabinets Esco Lifesciences group 2010274 Airstream Class II Type B2 Biosafety Cabinets (AB2) provide product, operator and environmental protection and are suitable for work with trace amounts of toxic chemicals and agents assigned to biological safety levels I, II or III. In a Class II Type B2 cabinet, all inflow and downflow air is exhausted after HEPA/ULPA filtration to the external environment without recirculation across the work surface.
Dextrose Potato Agar medium Merck 145 Potato Dextrose Agar is used in the cultivation and enumeration of yeasts and fungi
EDTA vacuum blood collection tube FirstLab FL5-1109L EDTA is the recommended anticoagulant for hematology routines as it is the best anticoagulant for preserving cell morphology.
Entellan Merck 1.07961  Fixative agent; Entellan is a waterless mounting medium for permanent mounting for microscopy.
Fetal Bovine Serum Gibco A2720801 Fetal bovine serum (FBS) is a universal growth supplement of cell and tissue culture media. FBS is a natural cocktail of most of the factors required for cell attachment, growth, and proliferation, effective for most types of human and animal (including insect) cells.
Flaticon  database of images
Glycerol Merck 24900988 The cryoprotectant agent glycerol is used for freezing cells and spores
Histopaque-1077 polysucrose solution
Image J  Image analysis software
Microscopy slides Precision 7105 Slide for Microscopy 26 x 76 mm Matte Lapped Thickness 1.0 to 1.2 mm. Made of special optical glass and packaged with silk paper divider with high quality transparency free of imperfections
Mini centrifuge Prism C1801 The Prism Mini Centrifuge was designed to be extremely compact with an exceptionally small footprint. Includes 2 interchangeable quick-release rotors that spin up to 6000 rpm. An electronic brake provides quick deceleration and the self-opening lid allows easy access to the sample, reducing handling time.
Neubauer chamber Kasvi K5-0011 The Neubauer Counting Chamber is used for counting cells or other suspended particles.
Panoptic fast  Laborclin 620529 Laborclin's  panoptic fast c is a kit for quick staining in hematology
Penicillin/Streptomycin Solution - 10,000U LGC- Biotechnology  BR3011001 antibiotic is used in order to avoid possible contamination by manipulation external to the laminar flow.
Petri dish 90 x 15 mm Smooth Cralplast 18248 Disposable Petri dish; Made of highly transparent polystyrene (PS); flat bottom; Smooth;Size: 90 x 15 mm.
Phosphate buffered saline (PBS) thermo fisher Scientific 10010001 PBS is a water-based saline solution with a simple formulation. It is isotonic and non-toxic to most cells. It includes sodium chloride and phosphate buffer and is formulated to prevent osmotic shock while maintaining the water balance of living cells.
Pipette Pasteur 3 mL Sterile Accumax AP-3-B-S STERILE ACCUMAX PASTEUR 3 ML PIPETTE with 3 mL capacity, made of transparent low-density polyethylene (LDPE) and individually sterile
Refrigerated Centrifuge Thermo Scientific TS-HM16R The Thermo Scientific Heraeus Megafuge 16R Refrigerated Centrifuge is a refrigerated centrifuge with the user-friendly control panel makes it easy to pre-set the speed, RCF value, running time, temperature, and running profile. The Megafuge 16R can reach maximum speeds of 15,200 RPM and maximum RCF of 25,830 x g.
RPMI-1640 Medium Merck MFCD00217820 HEPES Modification, with L-glutamine and 25 mM HEPES, without sodium bicarbonate, powder, suitable for cell culture
The single channel micropipettes Eppendorf Z683809 Single-channel micropipettes are used to accurately transfer and measure very small amounts of liquids.
Tip for Micropipettor Corning 4894 Capacity of 10 µL and 1,000 µL Autoclavable
Triocular inverted microscope LABOMED VU-7125500 It allows you to observe cells inside tubes and bottles, without having to open them, thus avoiding contamination problems.

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Test di vitalità Trichoderma stromaticum Conidi Macrofagi di derivazione nucleare del sangue periferico umano Fagocitosi Interazioni macrofagi-patogeni Risposte immunitarie contro i funghi Fuga di fagosomi Virulenza fungina Agente di biocontrollo Agente di biofertilizzanti Infezioni umane Coltura di Trichoderma Conidi di lavaggio Cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) Differenziazione dei macrofagi Metodo di fagocitosi in vitro Saggio di clearance Efficienza di clearance fungina
Saggio di vitalità dei conidi di <em>Trichoderma stromaticum</em> all'interno di macrofagi di derivazione mononucleare del sangue periferico umano
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