Summary
Denne metoden eliminerer enhver større invasjon under celleinjeksjoner forårsaket av cellesuspensjonsløsningen.
Abstract
Direkte injeksjon av celler i vev er en nødvendig prosess i celleadministrasjon og / eller erstatningsterapi. Celleinjeksjonen krever en tilstrekkelig mengde suspensjonsløsning for å tillate cellene å komme inn i vevet. Volumet av suspensjonsoppløsningen påvirker vevet, og dette kan forårsake stor invasiv skade som følge av celleinjeksjonen. Dette papiret rapporterer om en ny celleinjeksjonsmetode, kalt langsom injeksjon, som tar sikte på å unngå denne skaden. Å skyve ut cellene fra nålespissen krever imidlertid en tilstrekkelig høy injeksjonshastighet i henhold til Newtons lov om skjærkraft. For å løse den ovennevnte motsetningen ble en ikke-newtonsk væske, slik som gelatinløsning, brukt som cellesuspensjonsløsning i dette arbeidet. Gelatinløsning har temperaturfølsomhet, da formen endres fra gel til sol ved ca. 20 °C. Derfor, for å opprettholde cellesuspensjonsløsningen i gelformen, ble sprøyten holdt avkjølt i denne protokollen; Men når løsningen ble injisert i kroppen, konverterte kroppstemperaturen den til en sol. Den interstitielle vevsvæskestrømmen kan absorbere overflødig løsning. I dette arbeidet tillot den langsomme injeksjonsteknikken kardiomyocyttkuler å komme inn i vertsmyokardiet og engraft uten omgivende fibrose. Denne studien benyttet en langsom injeksjonsmetode for å injisere rensede og ballformede neonatale rottekardiomyocytter i et avsidesliggende område av hjerteinfarkt i det voksne rottehjertet. Ved 2 måneder etter injeksjonen viste hjertene til de transplanterte gruppene signifikant forbedret kontraktil funksjon. Videre viste histologiske analyser av langsomt injiserte hjerter sømløse forbindelser mellom verten og transplantatkardiomyocytter via interkalerte skiver med gap-junction-forbindelser. Denne metoden kan bidra til neste generasjons celleterapi, spesielt innen hjerteregenerativ medisin.
Introduction
Celleadministrasjon og erstatning er lovende nye terapeutiske strategier for tungt skadede organer. Blant disse nye terapeutiske strategiene har hjerteregenerativ medisin tiltrukket seg betydelig oppmerksomhet. Betennelsen forårsaket av skader medierer imidlertid arrdannelse i flere organer 1,2,3,4. Det menneskelige hjerte består av ca.10 kardiomyocytter; Derfor, teoretisk5,6, må den behandles med mer enn 109 kardiomyocytter. Administrering av et stort antall kardiomyocytter via tradisjonelle injeksjonsmetoder kan føre til betydelige vevsskader7. Denne metoden gir en ny celleinjeksjonsmetode med minimal vevsinvasjon.
Celleadministrasjon i organparenkymet krever injeksjon(er). Imidlertid eksisterer det en uoverensstemmelse ved at injeksjonen i seg selv kan føre til vevsskade. Vevsskade gir lokal inflammasjon og uhelbredelig arrdannelse i organer og vev, samt nedsatt regenerativ evne 8,9,10. Pattedyrhjertet har en ekstremt høy tilbøyelighet til å utvikle arr i stedet for å regenerere fordi det krever umiddelbar skadereparasjon for å tåle det høye blodtrykket forårsaket av den kontinuerlige pumpefunksjonen11. Ablasjonsterapi utnytter denne høye tilbøyeligheten til arrdannelse og blokkerer kretsen som sannsynligvis vil gjennomgå arrdannelse ved bruk av arytmi12. I en tidligere studie ble det observert at arrvevet isolerte de injiserte kardiomyocyttene i vertsmyokardiet. Dermed representerer dette det neste målproblemet som må overvinnes for å oppnå forbedret terapeutisk effekt innen hjerteregenerativ medisin.
Interstitiell væskestrøm i vev spiller en viktig rolle i å transportere oksygen og næringsstoffer til celler og fjerne det utskilte avfallet fra cellene. Den fysiologiske hastigheten på interstitiell væskestrøm i hvert vev/organ er forskjellig (området er 0,01-10 μm/s)13. Så vidt forfatteren vet, er det ingen data om kapasiteten til individuelle vev / organer for å støtte ekstra mengder væske uten patologisk ødem; Imidlertid forsøker dette eksperimentet å bruke en langsom injeksjonshastighet for å muligens redusere vevskader, og resultatene kan brukes til å bestemme det praktiske ved dette konseptet.
Protocol
Dyreforsøkene ble utført i henhold til Kansai-Medical University etiske retningslinjer for dyreforsøk og ble godkjent av de etiske komiteene (godkjenningsnummer: 23-104). Alle dyrene ble oppdratt under en konstant lys-mørk syklus i et bestemt patogenfritt miljø. Alle de steriliserte kirurgiske verktøyene, som saks, tang og tilbaketrekkere, ble autoklavert og tørket grundig.
1. Klargjøring av de nyfødte kardiomyocyttkulene hos nyfødte rotter
- Nyfødt rottehjertesamling
- For hjertesamlingen, følg en prosedyre som ligner den som er beskrevet i en tidligere rapport7.
- Dypp nyfødte (0-2 dager etter fødselen) Sprague-Dawley (SD) rotter i povidon-jod og 70% etanolløsninger sekvensielt, og overfør dem deretter til et lufttett etui fylt med fordampet isofluran (konsentrasjonen skal være over 10% v / v) for dyp anestesi.
- Etter bekreftelse av bevisstløshet ved tap av lokomotorisk aktivitet, halshugg rottamens du holder kroppen fra baksiden med hånden, og kutt deretter 2-4 mm vev fra brystkassens fremre senter til kaudalen og deretter i rostralretningen ved hjelp av skarp saks.
- Ta tak i bakhuden for å trekke kuttet åpent og skyv ut hjertet fra brystkassen. Klipp ventriklene med saks og senk dem i fosfatbufret saltvann (PBS) uten kalsium eller magnesium (PBS (−)).
- Spredning av de nyfødte kardiomyocytter fra rotter
- Hakk de innsamlede ventriklene spredt i en minimal mengde annonsebuffer (annonsebuffer: 116 mM NaCl, 20 mM HEPES, 12,5 mM NaH2PO 4, 5,6 mM glukose, 5,4 mM KCl, 0,8 mM MgSO4, pH 7,35) i et autoklavert konkavt glass i små biter (1 mm x 1 mm) ved hjelp av buet saks.
- Overfør hakket vev og en mikromagnetisk omrører til et 50 ml sentrifugeringsrør, og spre vevet i enkeltceller med 0,1% kollagenase, 0,1% trypsin, 20 μg / ml DNase I og 50 nM tetrametylrhodamin metylester i Ads-buffer ved 37 ° C ved omrøring i 30 minutter.
- Separat aggregatene og dispergerte celler gjennom naturlig sedimentering, samle bare de dispergerte cellene i et rør, og fordøye de resterende celleaggregatene igjen med samme fordøyelsesmedium.
- Fortsett denne prosedyren til alle cellene er fullstendig dissosiert. For å bekrefte fullstendig spredning av cellene, observer rørene under et mikroskop (4x objektivlinse).
- Samle de dispergerte cellene ved hjelp av sentrifugering ved 150 x g i 5 minutter og dissosiere dem i 1-2 ml Ads-buffer.
- Fluorescensaktivert cellesortering av kardiomyocytter
- Analyser cellene ved hjelp av fluorescensaktivert cellesortering (FACS) ved hjelp av 556-601 nm båndpassfiltre for å oppdage røde fluorescenssignaler.
- Utfør forsiktig pre-gating for å eliminere dublettfraksjoner14. Portinnstillingene for eliminering av dublett bør være i henhold til produsentens instruksjoner.
- Sett fremoverspredningen på x-aksen og det røde fluorescenssignalet på y-aksen. Tre populasjoner ble observert: en nederste populasjon som inneholder erytrocytter og døde celler, en mellompopulasjon som inneholder ikke-kardiomyocytter, inkludert fibroblaster og endotelceller, og en topppopulasjon som inneholder rene ventrikulære kardiomyocytter7.
- Fremstilling av røde fluorescensmerkede kardiomyocyttballer
- Selektivt sortere kardiomyocyttene, og sentrifuge i 5 min ved 150 x g. Fullstendig oppløs cellepellets i 1 ml alfamodifisert minimalt essensielt medium (alfa-MEM) inneholdende 10% varmeinaktivert føtalt bovint serum (FBS).
- Mål cellekonsentrasjonen ved hjelp av et hemocytometer og fortynn cellesuspensjonsløsningen til 3000 celler / ml med alfa-MEM 10% FBS.
- Fordel dem i celle ikke-klebende 96-brønnsplater (100 μL per brønn), sentrifuge i 5 minutter ved 100 x g og kultur for 2-3 d i en cellekulturinkubator med 5% CO2 ved 37 ° C.
- Før injeksjonsforsøkene høstes en kardiomyocyttkule fra hver brønn via aspirasjon med dyrkningsmediet ved hjelp av en 1000 μL pipette, og samler dem i et 15 ml rør.
- Beis med PKH26 etter produsentens instruksjoner for sporing etter engraftment.
2. Forberedelser for langsom injeksjonsmetode
- Fremstilling av gelatinstamoppløsningen
- Vei gelatinen, løs den opp i annonsebufferen for å produsere en 10 % w/v-løsning, og autoklav den.
- Produksjon av celleinjeksjonsutstyr
- Generell enhetsdesign: Forbered apparatet vist i figur 1. Dette systemet er kombinert med et sprøytekjøleapparat og hovedinjeksjonsapparat.
- Forbered hovedinjeksjonsapparatet beskrevet nedenfor:
- For en neonatal kardiomyocyttinjeksjon, bruk en 29 G, 50 mm lang nål utstyrt med en sprøyte.
- Koble en kraftoverføringssprøyte (18G, 1 ml) rygg mot rygg ved hjelp av en celleinjeksjonssprøyte (figur 1). Koble kanylen på kraftoverføringssprøyten til et tynt polypropylenrør med lav lumenutvidelsesevne.
- Koble deretter den andre siden av kraftoverføringsslangen til nålen på den samme sprøyten (18G, 1 ml), og sett den i en sprøytepumpe. Fyll de to kraftoverføringssprøytene og slangene med vann uten luftbobler.
MERK: Når ett stempel på kraftoverføringssprøyten trykkes inn, overføres trykket direkte til den andre sprøyten, og stempelet stikker ut.
- Sett opp kjølesystemet for injeksjonssprøyten som beskrevet nedenfor.
- Vind et kobberrør (ytre diameter = 1 mm; innvendig diameter = 0,3 mm; tykkelse = 0,35 mm) tett rundt den celleholdige delen av celleinjeksjonssprøyten, og etterlater 10 mm overflødig rør i begge ender.
- Koble kobberrøret til fleksibelt plastrør. Koble videre de andre endene av plastslangen til en ekstern pumpe, fyll ledningen med kjølevann og avkjøl vannet ved å senke overflødig kobberrør i knust is (figur 1).
MERK: Dette kjølesystemet opprettholder cellesuspensjonsløsningen i sylinderen ved ca. 2 °C.
3. Utvikling av en rotte hjerteinfarkt modell ved stump koronar okklusjon
- Bedøv med hannimmun (F344/Njcl-rnu/rnu) med luft som inneholder 3 % isofluran. Sett en kanyle inn i luftrøret og koble den til åndedrettsvernet.
- Koble en kanyle til en isofluran fordamper med en kontroller for å opprettholde en 3% isofluran konsentrasjon og dermed opprettholde tilstrekkelig anestesi. Bekreft ingen respons på smertestimuli. Påfør veterinærsalve på øynene for å forhindre tørrhet.
- Fest lemmene med kuttede kirurgiske bånd på en 40 °C oppvarmet kirurgisk plate. Vri rottens kropp til høyre for kroppsaksen og bruk venstre armhule som kirurgisk felt.
- Fjern håret i det kirurgiske feltet ved hjelp av en hårfjerningskrem og tørk huden med povidon-jod. Bruk skarp saks til å klippe et 1,5 cm snitt i huden og pectoralis major muskel.
- Bekreft det tredje interkostalrommet og riv interkostalmusklene og costal pleura ved hjelp av mikrotang med stumpe tips. Hold brystet åpent ved hjelp av en retractor. Fjern forsiktig det tynne perikardiet med tang.
- For å konstruere en infarktmodell av hjertets sidevegg, finn posisjonen 1 mm caudal til spissen av venstre atrium for å identifisere den stumpe koronararterien, pass en 7-0 silkesutur, øs opp vev som er 2,5 mm bredt og 2,5 mm dypt fra dorsal til ventral, og liger vevet tett.
- Bekreft vellykket ligering ved svak sammentrekning distalt fra ligaturen. Etter å ha fjernet tilbaketrekkeren forsiktig, plasser en 5-0 silkesutur mellom andre og fjerde interkostalrom, og lukk torakotomien.
- Reduser isofluran konsentrasjonen til 1 %. Sutur forsiktig muskel og hud med 5-0 silke. Reduser isofluran konsentrasjonen til 0 % og vent i ca. 5 minutter til spontan respirasjon starter.
- Påfør lokalt 2 mg / ml lidokain i saltvann til snittet. Administrer 1 ml saltvann via en subkutan injeksjon. Påfør veterinærsalve lokalt for å forhindre infeksjoner.
- Fjern rotta fra intubasjonsrøret, og gå tilbake til dyreburet; Deretter løfter du rottene i individuelle bur i 1 uke.
- Analyser endringene i hjertesystolisk pumpefunksjon ved hjelp av ekkokardiografi.
MERK: Hjertefunksjonen vil bli redusert på grunn av lateralt hjerteinfarkt.
4. Ekkoveiledet perkutan celletransplantasjon ved bruk av langsom injeksjonsmetode
- Forvarm 10 % gelatinkraft ved 37 °C til den blir flytende.
- Fortynn 10 % gelatinbestand med forvarmet ADS-buffer for å oppnå den endelige injiserbare 5 % w/v gelatinoppløsningen (100 μL kreves per dyr).
- Stopp 96 kardiomyocyttballer (totalt: 28 800 kardiomyocytter/dyr) i 100 mikrol forvarmet injeksjonsoppløsning.
- Legg suspensjonen klargjort i trinn 4.3 inn i celleinjeksjonssprøyten, slik at overflødig luft unngås.
- For å eliminere bobler i sprøyten, hold den vertikalt med nålen oppover, knips på sprøyten og samle eventuelle bobler på den øvre kanten av sprøyten.
MERK: I løpet av dette trinnet, observer kardiomyocyttkulene gradvis legge seg på gummipakningen på stempelet. - Oppretthold sprøytens vertikale stilling, skyv stempelet sakte opp og kast boblene og overflødig cellesuspensjonsoppløsning inntil 20 mikrol av cellesuspensjonen er igjen i sprøyten. Skyv stempelet forsiktig med konstant hastighet slik at kardiomyocyttkulen forblir hvilende på gummipakningen på stempelet.
- Senk den hettede sprøyten direkte i et isbad i 5 minutter.
- Plasser en avkjølt sprøyte i injeksjonsapparatet. Fest injeksjonssprøyteapparatet tett på en fin bevegelsesanordning på dyrestadiet ved hjelp av en X-Y-Z posisjonsjusterbar håndlaget klemme. Den fine bevegelsesanordningen kan bevege nåleposisjonen ved hjelp av x-retning 20 mm skyve, y-retning sving og z-retning bøyebevegelser.
- Bedøv rottene i en forseglet boks fylt med luft som inneholder 3% isofluran. Bekreft anestesi uten respons på smertestimuli. Påfør veterinærsalve på øynene for å forhindre tørrhet.
- Fest lemmene med kuttede kirurgiske bånd på en 40 °C oppvarmet ekkoplate. For å opprettholde tilstrekkelig anestesi må den inhalerte luften inneholde en ca. 3 % konsentrasjon av isofluran.
- Fjern håret ved injeksjonsfeltet (2 cm i diameter) og brystet med hårfjerningskrem og tørk huden med povidon-jod.
- Påfør ekko-gel på brystet og ekkosonden. Plasser ekkosonden nær brystet langs kraniale og kaudale akser og begynn å oppnå B-modus ekkokardiografi etter produsentens manual.
- Før kanylespissen inn i myokard sett forfra (figur 2 og tilleggsvideo 1).
- For å aktivere hovedsprøytepumpen, trykk på Start-knappen og drei hjulet for å justere til et forhåndsbestemt tall for en injeksjonshastighet på ca. 0,02 μL/s. Påfør veterinærsalve lokalt rundt nåleposisjonen for å forhindre infeksjoner.
MERK: Det er nødvendig å bestemme riktig oppringingsnummer for ønsket injeksjonshastighet ved bruk av en injeksjonsoppløsning. Etter injeksjonen, fjern kanylen ved hjelp av et eksemplarisk bevegelsessystem. - Reduser isofluran konsentrasjonen til 0 % og vent i ca. 5 minutter til dyret gjenvinner tilstrekkelig bevissthet til å opprettholde sternal hvile.
5. Evaluering av hjertefunksjon
- Bedøv rottene i en forseglet boks fylt med luft som inneholder 3% isofluran. Bekreft anestesi uten respons på smertestimuli. Påfør veterinærsalve på øynene for å forhindre tørrhet.
- Påfør elektrifiserende krem for EKG-oppkjøp på lemspissene. Fest lemmene med kuttede kirurgiske bånd på en 40 °C oppvarmet ekkoplate. Bruk et fysiologisk overvåkingssystem for å oppdage sanntids EKG og hjertefrekvens.
- I henhold til produsentens instruksjoner, bestem først langaksevinkelen ved hjelp av ekkobildet i B-modus som viser venstre ventrikkelapex til utstrømningskanalen, og roter deretter ekkosonden 90 ° for å bytte til kortaksevisningen.
- Bruk bare det kaudale til rostralaksens fine bevegelsessystem i dyrestadiet, juster kortaksevisningen til papillærmuskelnivået. Endre deretter bildemodus til M-modus ved å trykke på M-mode-knappen , og ta opp en video i 5 s ved å trykke på Cine-loop-knappen .
- For å analysere og beregne brøkforkortingen ved hjelp av programvaren, trykk på måleknappen og et vertikalt linjeverktøy for å definere de endesystoliske og endediastoliske indre dimensjonene i venstre ventrikkel. Programvaren beregner automatisk prosentbrøkforkortelse (FS).
- Reduser isofluran konsentrasjonen til 0 % og vent i ca. 5 minutter til dyret gjenvinner tilstrekkelig bevissthet til å opprettholde sternal hvile.
6. Immunhistokjemi
- Fest den avlivede kroppen (utfør eutanasi som i trinn 1.1.3) på bordet ved hjelp av kuttede kirurgiske bånd, avgift hjertene, vask med PBS, og senk hjertet i 4% paraformaldehyd / PBS.
- Dissekere hjertene i tre seksjoner, dypp dem i 40% sukrose for kryobeskyttelse, legg dem inn i en optimal skjæretemperatur (OCT) forbindelse, og frys dem ved -80 ° C.
- Fest kryoseksjonerte vev (8 μm tykkelse) til aminosilanbelagte glassglassglass. Etter tilstrekkelig tørking med ikke-oppvarmet vind generert av en generell hårføner, senk glasslysbildene i trisbufret saltvann som inneholder 0,2% Tween-20 (TBS-T).
- Dypp dem i en blokkerende løsning i 30 minutter ved 25 °C. Hell 100 mikrol av den primære antistoffholdige blokkeringsløsningen på lysbildet, og inkuber over natten ved 4 °C med parafinforsegling for å holde antistoffoppløsningen spredt på vevet.
MERK: Antistoffkonsentrasjonen er vist i materialfortegnelsen. - Legg lysbildene horisontalt i en håndlaget boks med høy luftfuktighet ved å bruke den naturlige dampen fra vått papir for å forhindre fordampning. Vask lysbildene tre ganger med TBS-T.
- Behandles med det sekundære antistoffholdig blokkerende middel i 1 time ved 25 °C på samme måte som det primære antistoffet. Etter tre vasker, observer fluorescenssignalene ved hjelp av et fluorescensmikroskop og konfokal lasermikroskop.
MERK: Antistoffkonsentrasjonen er vist i materialfortegnelsen. - Statistisk analyse: For sammenligning av cellevolum, som vist i figur 3A, utfør en ikke-paret t-test; For å vurdere hjertefunksjonell restitusjon etter administrering av kardiomyositt ved bruk av langsom injeksjonsmetode, som vist i figur 4A, bruk en paret t-test. I dette arbeidet ble forskjellene ansett som statistisk signifikante ved P < .01. Feilfelt representerer standardavviket.
Representative Results
Effekter av langsom injeksjon på celleoverlevelse og kollagenavsetning
Nyfødte rottekardiomyocyttballer merket med PKH26 ble injisert i normalt nakenrottemyokard ved bruk av normal eller langsom injeksjonsmetode. Resultatene viste at den langsomme injeksjonsmetoden signifikant økte det transplanterte cellevolumet (figur 3A) og signifikant reduserte type I kollagenavsetning på stedet (figur 3B).
Effekter av langsom injeksjon på behandlingseffekt i en rotteinfarktmodell
Den ekkokardiografveiledede langsomme injeksjonsmetoden ble brukt til å injisere neonatale rottekardiomyocyttballer eller PBS(−) inn i infarkthjertene til modellrotter. Den celleinjiserte gruppen alene viste signifikant forbedring i hjertekontraksjonsfunksjonen etter 2 måneder (figur 4A). Immunhistokjemiske analyser viste sømløs sammenheng mellom de transplanterte cellene og vertsmyocyttene via interkalerte skiver med gap-junctions (figur 4B).
Figur 1: Skjematisk fremstilling av hele injeksjonssystemet. (A) Hovedinjeksjonsapparat. (B) Kjølesystem for injeksjonssprøyte. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2 Ekkokardiografiveiledet perkutan langsom injeksjon. (A) Innstilling av dyret, ekkosonden og injeksjonsapparatet. (B) Ekkokardiografisk bilde av injeksjonssprøyten og hjertet. Legg merke til at venstre og høyre bilde er det samme, men en gul linje er lagt til for å indikere nåleposisjonen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Effekt av langsom injeksjonsmetode på transplantert cellevolum og kollagenavsetning. (A) De transplanterte cellevolumene (N = 3) ble beregnet ut fra serielle seksjoner. Feilfeltene angir standardavvik. *P < 0,01 i en ikke-paret t-test. (B) Immunhistokjemisk farging for type I kollagen. Skalalinjen indikerer 200 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Forbedringer i hjertefunksjon og histologisk integrasjon med kardiomyocyttkuler transplantert ved langsom injeksjonsmetode . (A) Representativ ekkokardiograf M-modus visninger. Grafen viser overgangen til fraksjonsforkortelser i den kardiomyocytttransplanterte gruppen (heltrukket rød linje; N = 4) og kjøretøy (cellesuspensjonsoppløsning for langsom injeksjonsmetode) gruppe (stiplet blå linje; N = 3). Forkortelser: MI = hjerteinfarkt; Cx43 = connexin 43; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol; PKH26 = rød fluorescerende cellemembranetikett. Feilfeltene angir standardavvikene. *P < 0,01 i en paret t-test. (B) Immunhistokjemiske analyser av forholdet mellom de transplanterte kardiomyocyttkulene og vertskardiomyocytter. De konvensjonelle lasermikroskopiske observasjonene med en 2x objektivlinse er vist i venstre kolonne. Innzoomede versjoner (ved hjelp av et 20x objektivobjektivt objektiv) av to områder vist i boksen, merket med * og #, presenteres nedenfor. Skala barer: toppbilde = 300 μm; * og # = 30 μm. Konfokale lasermikroskopiske bilder ved hjelp av en 20x objektivlinse vises sammen for comaparison. Tre posisjoner vises. I de sammenslåtte bildene indikerer pilspissene eksistensen av gapkryss (Cx43) som direkte forbinder transplantatet og vertskardiomyocytter. Skalalinjen indikerer 30 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsvideo 1: Ekkoveiledet langsom injeksjonsmetode. B-mode ekkokardiogrammet i frontal visning viser kanylespissen avansert inn i myokard. Klikk her for å laste ned denne filen.
Discussion
Et av de kritiske punktene i den vellykkede ytelsen til den langsomme injeksjonsmetoden er utarbeidelsen av et effektivt injeksjonssystem ved hjelp av en kraftig sprøytepumpe og et sterkt trykkoverføringsrør. Et høytrykkssystem er nødvendig for å skyve gel ut fra spissen av en fin nål. Det andre kritiske punktet er stabilisering av hjertet. Hjerteslag mot en injeksjonsnål som føres inn i myokardiet, kan skade vevet. I denne studien ble det utført en ekkoveiledet injeksjon for å unngå at dyrene gjennomgikk en ny åpen brystskade og for å administrere celleinjeksjonen i et stabilisert hjerte med lungene oppblåst. Videre, i noen applikasjoner for større dyr eller mennesker, bør noen injeksjonsutstyr festet på hjertet betraktes som en del av den strategiske utformingen av applikasjonen. For åpne brystinjeksjoner i hjertene til små dyr, anbefales bruk av en lang, fleksibel nål gitt deres høyere hjertefrekvens.
I dette arbeidet økte den langsomme injeksjonsmetoden signifikant det overlevende kardiomyocyttvolumet sammenlignet med normal injeksjonsmetode. Den normale injeksjonen forårsaker celleskade via skjærspenning15. I motsetning til dette forårsaker den langsomme injeksjonsmetoden ikke slik stress teoretisk fordi den bruker en ikke-newtonsk løsning i tillegg til den langsomme injeksjonen.
Når det gjaldt lokal fibrose, viste det interstitielle rommet rundt de normalt injiserte overlevende kardiomyocyttene sterk og utbredt type I kollagenavleiring. I motsetning til dette var type I-kollagensignalene rundt de innpodede kardiomyocyttene podet ved hjelp av langsom injeksjonsmetode mye svakere og mer begrenset. Dette antyder at den langsomme injeksjonsmetoden forårsaket betydelig mindre skade. Den langsomme injeksjonen av neonatale kardiomyocytter i det voksne myokardiet forbedret signifikant kontraktilfunksjonen til det infarkterte hjertet. De histologiske analysene antydet at poding av kardiomyocyttene med langsom injeksjonsmetode resulterte i direkte forbindelser og funksjonell kobling med vertkardiomyocyttene. Dette fenomenet forklarer mekanismen for funksjonell gjenoppretting av vertsmyokardiet. Så vidt vi vet, er dette den første rapporten om transplanterte neonatale kardiomyocytter med storskala sømløse forbindelser til verten voksne kardiomyocytter. De funksjonelle forbindelsene med vertsmyokardiet via elektrisk og mekanisk kobling kan gjøre de engraftede kardiomyocyttene modne og tillate dem å fungere som funksjonelle myocytter som bidrar til vertshjertefunksjonen. Langsiktige fysiske kraftinteraksjoner mellom verten og transplantatkardiomyocytter er avgjørende for full modning. Derfor kan det være nødvendig med 2 måneder etter injeksjonen for funksjonell gjenvinning av infarkthjertet. Den tidsavhengige gjenopprettingen av pasientens hjertefunksjon kan være et forventet fenomen i terapeutiske applikasjoner, og dette kan være et kjennetegn på vellykket etablering av de novo funksjonell kobling og integrasjon mellom verten og podede kardiomyocytter.
Den langsomme injeksjonsmetoden kan utføres under åpen brystkirurgi. I tillegg kan denne metoden brukes på mus. For fremtidige anvendelser i humanterapi må vi fortsatt løse flere problemer. Injeksjonshastigheten bør optimaliseres ved å ta hensyn til bufferkapasiteten til den interstitielle væskestrømmen i hvert humant målorgan. Xenofrie materialer, som gelatin fra mennesker eller biologisk nedbrytbare syntetiske materialer, bør brukes. Klinisk GMP-grad langsom injeksjonsapparat, slik som kompakte organspesifikke engangsverktøy eller et gjenbrukbart bredt organ anvendelig apparat, bør utvikles.
Disclosures
Forfatteren har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet av et tilskudd fra JSPS KAKENHI (Grant No. 23390072 og 19K07335) og AMED (Grant No. A-149).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18-gauge needle & tuberculin, 1 mL | Terumo | NN1838R, SS-01T | |
| 29-gauge 50 mm-long needle | Ito Corporation, Tokyo, Japan | 14903 Type-A | |
| A copper tube | General Suppliers | outer diameter, 1 mm; inner diameter, 0.3 mm; thickness, 0.35 mm | |
| Ads Buffer | Each ingredient was purchased from Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japan | Hand made, Composition: 116 mM NaCl, 20 mM HEPES, 12.5 mM NaH2PO4, 5.6 mM glucose, 5.4 mM KCl, 0.8 mM MgSO4, pH 7.35 | |
| alpha-MEM | Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japan | 051-07615 | |
| Anti-collagen type I rabbit polyclonal antibody (H+L) | Proteintech | 14695-1-AP | using dilution 1:100 |
| Anti-Connexin-43 rabbit polyclonal antibody (H+L) | Sigma Aldrich | C6219 | using dilution 1:100 |
| Anti-rabbit IgG (H+L) donley polyclonal antibody-AlexaFluo488 | Thermo Scientific | A21206 | using dilution 1:300 |
| blocking solution (Blocking One) | Nacalai Tesque, Kyoto, Japan | 03953-95 | |
| collagenase | Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japan | 034-22363 | |
| confocal laser microscope | Carl Zeiss Inc., Oberkochen, Germany | LSM510 META | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| FACS Aria III | Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA | ||
| fetal bovine serum | BioWest, FL, USA | S1820-500 | |
| fine movement device (Micromanipulator) | Narishige Co., Ltd., Tokyo, Japan | M-44 | |
| fluorescence microscope | Nikon Instruments, Tokyo, Japan | Eclipse Ti2 | |
| gelatin from bovine skin | Sigma-Aldrich | G9382 | dissolving in PBS (-) to 10%, and autoclaving it |
| Neonatal Sprague-Dawley (SD) rats | Japan SLC Inc., Shizuoka, Japan | 0–2 d after birth | |
| non-adhesive 96-well plates (spheloid plate) | Sumitomo Bakelite, Tokyo, Japan | MS-0096S | |
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound | Sakura Finetek USA, Inc., CA, USA | Tissue-Tek OCT compound | |
| peristaltic pump (for cooling system) | As One Co., Osaka, Japan | SMP-23AS | |
| PKH26 | Sigma-Aldrich | PKH26GL | |
| Stir Bar, Micro, Magnetic, PTFE, Length x Dia. in mm: 5 x 2 | Chemglass life sciences LLC, NJ, USA | CG-2003-120 | |
| syringe | Ito Corporation, Tokyo, Japan | MS-N25 | |
| syringe pump with remote controller | As One Co., Osaka, Japan | MR-1, CT-10 | |
| tetramethylrhodamine methyl ester | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | T668 | |
| trypsin | DIFCO, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA | 215240 | |
| Tween-20 | Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japan | 167-11515 | |
| veterinarian ointment | Fujita Pharmaceutical Co., Ltd. | Hibikusu ointment #WAK-95832 | |
| Vevo 2100 Imaging System | Fujifilm VisualSonics, Inc., Toronto, Canada | Vevo 2100 | |
| Vevo 2100 Imaging System software version 1.0.0 | Fujifilm VisualSonics, Inc., Toronto, Canada | Vevo 2100 | |
| Weakly curved needle with ophthalmic thread | Natsume Seisakusho Co., Ltd., Tokyo, Japan | C7-70 |
References
- Chavkin, N. W., et al. The cell surface receptors Ror1/2 control cardiac myofibroblast differentiation. Journal of the American Heart Association. 10 (13), e019904 (2021).
- Li, H., et al. The cell membrane repair protein MG53 modulates transcription factor NF-κB signaling to control kidney fibrosis. Kidney International. 101 (1), 119-130 (2022).
- Liu, X., Liu, Y., Khodeiry, M. M., Lee, R. K. The role of monocytes in optic nerve injury. Neural Regeneration Research. 18 (8), 1666-1671 (2023).
- Weber, F., Treeck, O., Mester, P., Buechler, C. Expression and function of BMP and activin membrane-bound inhibitor (BAMBI) in chronic liver diseases and hepatocellular carcinoma. International Journal of Molecular Sciences. 24 (4), 3473 (2023).
- Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).
- Hattori, F., Fukuda, K. Strategies for replacing myocytes with induced pluripotent stem in clinical protocols. Transplantation Reviews. 26 (3), 223-232 (2012).
- Hattori, F., et al. Nongenetic method for purifying stem cell-derived cardiomyocytes. Nature Methods. 7 (1), 61-66 (2010).
- Fernandes, S., et al. Human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes engraft but do not alter cardiac remodeling after chronic infarction in rats. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 49 (6), 941-949 (2010).
- Shiba, Y., et al. Allogeneic transplantation of iPS cell-derived cardiomyocytes regenerates primate hearts. Nature. 538 (7625), 388-391 (2016).
- Wendel, J. S., et al. Functional effects of a tissue-engineered cardiac patch from human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in a rat infarct model. Stem Cells Translational Medicine. 4 (11), 1324-1332 (2015).
- Hattori, F. Technology Platforms for Heart Regenerative Therapy Using Pluripotent Stem Cells. Stem Cells and Cancer Stem Cells, Volume 7: Therapeutic Applications in Disease and Injury. , 33-45 (2012).
- Tao, S., et al. Ablation lesion characterization in scarred substrate assessed using cardiac magnetic resonance. JACC: Clinical Electrophysiology. 5 (1), 91-100 (2019).
- Rutkowski, J. M., Swartz, M. A. A driving force for change: interstitial flow as a morphoregulator. Trends in Cell Biology. 17 (1), 44-50 (2007).
- Hattori, F. How to purify cardiomyocytes for research and therapeutic purposes. Cardiac Regeneration using Stem Cells. Fukuda, K., Yuasa, S. , CRC Press. Boca Raton, FL. (2013).
- Li, M., Tian, X., Zhu, N., Schreyer, D. J., Chen, X. Modeling process-induced cell damage in the biodispensing process. Tissue Engineering. Part C, Methods. 16 (3), 533-542 (2010).
