Summary
Aqui, apresentamos dois protocolos para incorporar reações de síntese proteica livre de células em matrizes de hidrogel em macroescala sem a necessidade de uma fase líquida externa.
Abstract
As redes genéticas sintéticas fornecem uma plataforma para cientistas e engenheiros projetarem e construírem novos sistemas com funcionalidade codificada em nível genético. Enquanto o paradigma dominante para a implantação de redes gênicas está dentro de um chassi celular, redes gênicas sintéticas também podem ser implantadas em ambientes livres de células. Aplicações promissoras de redes gênicas livres de células incluem biossensores, já que esses dispositivos foram demonstrados contra alvos bióticos (vírus Ebola, Zika e SARS-CoV-2) e abióticos (metais pesados, sulfetos, pesticidas e outros contaminantes orgânicos). Sistemas livres de células são tipicamente implantados na forma líquida dentro de um vaso de reação. Ser capaz de incorporar tais reações em uma matriz física, no entanto, pode facilitar sua aplicação mais ampla em um conjunto mais amplo de ambientes. Para este fim, métodos para incorporar reações de síntese proteica livre de células (CFPS) em uma variedade de matrizes de hidrogel têm sido desenvolvidos. Uma das principais propriedades dos hidrogéis propícios a este trabalho é a alta capacidade de reconstituição de água dos materiais hidrogéis. Além disso, os hidrogéis possuem características físicas e químicas funcionalmente benéficas. Os hidrogéis podem ser liofilizados para armazenamento e reidratados para uso posterior. Dois protocolos passo-a-passo para a inclusão e ensaio de reações de CFPS em hidrogéis são apresentados. Primeiro, um sistema CFPS pode ser incorporado a um hidrogel via reidratação com um lisado celular. O sistema dentro do hidrogel pode então ser induzido ou expresso constitutivamente para a expressão completa de proteínas através do hidrogel. Em segundo lugar, o lisado celular pode ser introduzido em um hidrogel no ponto de polimerização, e todo o sistema pode ser liofilizado e reidratado em um ponto posterior com uma solução aquosa contendo o indutor para o sistema de expressão codificado dentro do hidrogel. Esses métodos têm o potencial de permitir redes gênicas livres de células que conferem capacidades sensoriais a materiais hidrogéis, com potencial para implantação além do laboratório.
Introduction
A biologia sintética integra diversas disciplinas de engenharia para projetar e projetar peças, dispositivos e sistemas de base biológica que podem executar funções que não são encontradas na natureza. A maioria das abordagens da biologia sintética ainda está ligada a células vivas. Por outro lado, sistemas de biologia sintética livres de células facilitam níveis sem precedentes de controle e liberdade no projeto, permitindo maior flexibilidade e um tempo reduzido para a engenharia de sistemas biológicos, ao mesmo tempo em que eliminam muitas das restrições dos métodos tradicionais de expressão gênica baseados em células 1,2,3. A CFPS está sendo usada em um número crescente de aplicações em várias disciplinas, incluindo a construção de células artificiais, prototipagem de circuitos genéticos, desenvolvimento de biossensores e produção de metabólitos 4,5,6. A SDFC também tem sido particularmente útil para a produção de proteínas recombinantes que não podem ser prontamente expressas em células vivas, como proteínas propensas à agregação, proteínas transmembrana e proteínas tóxicas 6,7,8.
A CFPS é tipicamente realizada em reações líquidas. Isso, no entanto, pode restringir sua implantação em algumas situações, já que qualquer dispositivo livre de células líquidas deve estar contido dentro de um recipiente de reação. A justificativa para o desenvolvimento dos métodos aqui apresentados foi fornecer protocolos robustos para incorporar dispositivos de biologia sintética livres de células em hidrogéis, não como uma plataforma de produção de proteínas em si, mas, em vez disso, permitir o uso de hidrogéis como um chassi físico para a implantação de dispositivos livres de células além do laboratório. O uso de hidrogéis como chassi CFPS tem várias vantagens. Os hidrogéis são materiais poliméricos que, apesar de apresentarem alto teor de água (às vezes superior a 98%), possuem propriedades sólidas 9,10,11. Têm uso como pastas, lubrificantes e adesivos e estão presentes em produtos tão diversos como lentes de contato, curativos, fitas adesivas marinhas, corretivos de solo e fraldas infantis 9,11,12,13,14. Os hidrogéis também estão sob investigação ativa como veículos de entrega de drogas 9,15,16,17. Os hidrogéis também podem ser biocompatíveis, biodegradáveis e possuir respostas a estímulos próprios9,18,19,20. Portanto, o objetivo aqui é criar uma sinergia entre a funcionalidade derivada da biologia molecular e a ciência dos materiais. Para tanto, esforços têm sido feitos para integrar a biologia sintética livre de células com uma variedade de materiais, incluindo colágeno, laponita, poliacrilamida, fibrina, peptídeo PEG e agarose 11,21,22, bem como para revestir superfícies de vidro, papel e pano11,23,24 com dispositivos CFPS. Os protocolos aqui apresentados demonstram dois métodos para incorporar reações CFPS em matrizes de hidrogel em macroescala (i.e., >1 mm), usando agarose como material exemplar. A agarose foi escolhida devido à sua alta capacidade de absorção de água, propriedades autogelificantes controladas e propriedades mecânicas ajustáveis 11,24,25,26. Agarose também suporta CFPS funcional, é mais barato do que muitas outras alternativas de hidrogel, e é biodegradável, tornando-se uma escolha atraente como um sistema modelo experimental. Esses métodos, no entanto, foram previamente demonstrados como apropriados para incorporar CFPS em uma variedade de hidrogéis alternativos11. Considerando a ampla gama de aplicações dos hidrogéis e a funcionalidade da CFPS, os métodos aqui demonstrados podem fornecer uma base a partir da qual os pesquisadores são capazes de desenvolver materiais hidrogéis biologicamente aprimorados adequados aos seus próprios fins.
Em estudos anteriores, sistemas de microgel com faixa de tamanho de 1 μm a 400 μm foram utilizados para realizar CFPS em hidrogéis submersos em tampão de reação 23,27,28,29,30,31. A exigência de submergir hidrogéis dentro de tampões de reação CFPS, no entanto, limita as oportunidades para sua implantação como materiais por direito próprio. Os protocolos aqui apresentados permitem que as reações de CFPS ocorram dentro de hidrogéis sem a necessidade de submergir os géis em tampões de reação. Em segundo lugar, o uso de géis de macroescala (entre 2 mm e 10 mm de tamanho) permite o estudo da interação física entre hidrogéis e expressão gênica livre de células. Por exemplo, com essa técnica, é possível estudar como a matriz de hidrogel afeta as reações de CFPS11 e como as reações de CFPS podem afetar a matriz de hidrogel31. Tamanhos maiores de hidrogéis também permitem o desenvolvimento de novos materiais bioprogramáveis32. Finalmente, ao incorporar reações CFPS em hidrogéis, há também uma redução potencial na necessidade de vasos de reação plástica. Para a implantação de sensores sem células, isso tem vantagens claras sobre dispositivos dependentes de plásticos. Em conjunto, a incorporação de reações CFPS em hidrogéis fornece várias vantagens para a implantação de dispositivos livres de células além do laboratório.
O objetivo geral dos métodos aqui apresentados é permitir a operação de reações CFPS dentro de matrizes de hidrogel. Dois métodos diferentes são demonstrados para incorporar reações de produção de proteínas livres de células em materiais hidrogéis em macroescala (Figura 1). No Método A, componentes CFPS são introduzidos em hidrogéis de agarose liofilizados para formar um sistema ativo. No método B, a agarose fundida é misturada com componentes da reação CFPS para formar um sistema completo de hidrogel CFPS, que é então liofilizado e armazenado até que seja necessário. Estes sistemas podem ser reidratados com um volume de água ou tampão e analito para iniciar a reação.
Este estudo utiliza sistemas baseados em lisado celular de Escherichia coli . Estes são alguns dos sistemas CFPS experimentais mais populares, pois a preparação de lisado celular de E. coli é simples, barata e alcança altos rendimentos proteicos. O lisado celular é complementado com os componentes macromoleculares necessários para realizar a transcrição e tradução, incluindo ribossomos, RNAt, aminoacil-tRNA sintetases e fatores de iniciação, alongamento e terminação. Especificamente, este trabalho demonstra a produção de eGFP e mCherry em hidrogéis de agarose usando lisados celulares de E. coli e monitora a aparência da fluorescência usando um leitor de placas e microscopia confocal. Resultados representativos para o leitor de placas de microtitulação podem ser vistos em Whitfield et al.31, e os dados subjacentes estão disponíveis publicamente33. Além disso, a expressão de proteínas fluorescentes através dos géis é confirmada usando microscopia confocal. Os dois protocolos demonstrados neste trabalho permitem a montagem e armazenamento de dispositivos genéticos baseados em CFPS em matéria com o objetivo final de criar um ambiente físico adequado para a distribuição de circuitos gênicos livres de células de forma a apoiar a implantação em campo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Tampão de lisado celular e preparação do meio
- Preparo de 2x ágar YT+P e meio
- Preparar 2x ágar YT+P medindo 16 g/L de triptona, 10 g/L de extrato de levedura, 5 g/L de NaCl, 40 mL/L de 1 M K 2 HPO4, 22 mL/L de 1 M KH2PO4 e 15 g/L de ágar. Para o caldo 2x YT+P, siga a composição anterior, mas omita o ágar.
- Esterilizar autoclavando a 2x YT+P.
- Preparação do buffer S30A
- Preparar o tampão S30A com 5,88 g/L de Mg-glutamato, 12,195 g/L de K-glutamato e 25 mL/L de Tris 2 M, ajustado para pH 7,7 com ácido acético.
- Conservar o tampão S30A a 4 °C durante um período máximo de 1 semana.
- Preparação do tampão S30B
- Preparar o tampão S30B com 5,88 g/L Mg-glutamato e 12,195 g/L K-glutamato, ajustado para pH 8,2 com Tris 2 M.
- Conservar o tampão S30B a 4 °C durante até 1 semana.
2. Preparação do lisado celular (protocolo de 4 dias)
- Dia 1
- Despeje o 2x YT+P em placas de ágar suplementadas com 100 μg/mL de ampicilina.
- Streak E. coli a partir de -80 °C estoque de glicerol, e incubar durante a noite a 37 °C.
- Dia 2
- Inocular uma única colônia da placa 2x YT+P em 400 mL de caldo 2x YT+P (suplementado com ampicilina) em um balão defletor de 1 L.
- Incubar durante 24 h a 37 °C com agitação a 220 rpm.
- Dia 3
- Medir e registrar o OD600 das culturas de 24 h; o crescimento é suficiente em um OD600 de 3-4.
NOTA: Tomar uma alíquota de 1 mL de cultura bacteriana e realizar uma diluição seriada com meio (2x caldo YT+P) antes de medir o OD600 nm. Ter em conta o efeito de diluição no cálculo do OD600. - Transfira a cultura uniformemente entre frascos de centrífuga de 500 mL pré-resfriados.
- Centrifugar a 4.500 x g durante 15 min a 4 °C e, em seguida, eliminar o sobrenadante.
- Durante a centrifugação, complete a preparação do tampão S30A adicionando 2 mL/L de TDT 1 M ao tampão S30A previamente preparado, misturando e mantendo o tampão no gelo.
- Ressuspender os pellets de células em 200 mL de tampão S30A.
- Vórtice os frascos vigorosamente até que todo o pellet esteja completamente solubilizado, mantendo as células no gelo o máximo possível.
- Centrifugar a 4.500 x g durante 15 min a 4 °C e, em seguida, eliminar o sobrenadante.
- Repita as etapas 2.3.5-2.3.7 (inclusive).
- Adicionar 40 mL de tampão S30A a cada frasco de centrífuga, ressuspender os pellets e transferir para tubos de centrífuga de 50 mL pré-pesados.
- Centrifugar a 4.000 x g por 15 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante por decantação e remova o sobrenadante residual por pipeta, mantendo-o no gelo o máximo possível.
- Pese novamente os tubos da centrífuga, registre a nova massa e calcule a massa dos pellets.
- Congele os pellets em nitrogênio líquido e armazene-os a -80 °C.
- Medir e registrar o OD600 das culturas de 24 h; o crescimento é suficiente em um OD600 de 3-4.
- Dia 4
- Descongele os pellets no gelo.
- Por 1 g de pastilha, adicionar o seguinte: 1,2 ml de tampão S30A (TDT adicionado antes da utilização), 275 μL de inibidor de protease (8 mM stock) e 25 μL de lisozima (10 mg/ml stock).
- Vórtice vigorosamente até que os pellets estejam completamente solubilizados sem grumos remanescentes, mantendo-os no gelo tanto quanto possível.
- Em tubos de centrífuga de 50 mL, sonicar as suspensões celulares a 120 W, 20 kHz, 30% de amplitude e pulsos liga/desliga de 20 s/40 s por 5 min de sonicação.
- Centrifugar a 4.000 x g por 1 h a 4 °C para pellet os detritos celulares.
- Transfira o sobrenadante para tubos de centrífuga frescos de 50 mL.
- Incubar tubos a 37 °C a 220 rpm durante 80 min.
- Preparar materiais de diálise adicionando 1 mL/L de TDT 1 M ao tampão S30B. Misture e adicione 900 mL a um copo estéril de 1 L. Adicione um agitador magnético e mantenha-o a 4 °C.
- Após a reação de escoamento, transferir o extrato celular da etapa 2.4.7 para tubos de microcentrífuga de 2 mL e centrifugar a 20.000 x g por 10 min a 4 °C.
- Consolidar o sobrenadante sem pellets no gelo em um tubo centrífugo de 50 mL.
- Determinar o volume total de extrato celular produzido e hidratar o número necessário de de diálise de 10K MWCO submergindo-os em S30B por 2 min.
- Carregar os através de uma seringa com até 3 mL de extrato. Diálise até três por copo de 1 L, agitando a 4 °C durante 3 h.
- Após a diálise estar completa, o que esclarece o extrato, transfira o extrato para tubos de microcentrífuga de 2 mL. Centrifugar a 20.000 x g por 10 min a 4 °C.
- Consolidar o extrato clarificado em um tubo de centrífuga fresco sobre gelo e vórtice brevemente para misturar.
- Determinar a concentração de proteína do extrato usando um fluorômetro.
- Diluir o extracto até uma concentração de 44,5 mg/ml utilizando ddH2O pré-refrigerado.
- Alíquota em alíquotas de 200 μL, congelar em nitrogênio líquido e armazenar a -80 °C.
3. Preparação de hidrogéis liofilizados (Método A)
- Pesar 0,75 g de agarose, adicionar ddH2O a um volume de 100 mL e micro-ondas em rajadas de 30 s em altas temperaturas para criar caldo de agarose derretida.
- Usando uma pipeta, transfira 50 μL de agarose fundida para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e deixe o gel polimerizar por 20-30 min (a polimerização ocorre mais rapidamente se os géis forem transferidos para uma geladeira).
- Congelar os tubos de microcentrífuga, contendo os géis polimerizados, em nitrogênio líquido.
- Remova a tampa dos tubos da centrífuga, cubra as aberturas do tubo da centrífuga com filme de cera e perfure a película várias vezes com uma ponta de agulha ou pipeta.
- Transfira os tubos de microcentrífuga contendo os géis polimerizados para armazenamento de −80 °C por 1-2 h.
- Recupere os tubos de centrífuga do armazenamento de -80 °C e coloque em um liofilizador, garantindo que os tubos estejam completamente secos.
- Acione o liofilizador com as seguintes configurações: temperatura: -20 °C, pressão: 0,1 mbar.
- Deixe o gel liofilizar durante a noite.
- Recupere os géis do liofilizador e coloque-os em armazenamento de -80 °C até que seja necessário.
NOTA: Os géis podem ser armazenados liofilizados por até 1 ano.
4. Preparação do estoque de solução energética 14x
- Combinar todos os componentes da reação (Tabela 1) em um tubo de centrífuga de 15 mL sobre gelo para produzir uma solução de energia de 14x.
- Aliquot a solução de energia 14x em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL e armazenar a -80 °C (alíquotas de menor volume podem ser usadas).
NOTA: A solução de energia 14x pode ser armazenada durante vários meses a -80 °C se for evitado o congelamento-descongelamento repetido dos tubos.
5. Preparação do estoque de aminoácidos 4x
- Descongele, no gelo, todos os 20 componentes de aminoácidos de um kit RTS Amino Acid Sampler. Vórtice os aminoácidos para garantir que eles estão completamente dissolvidos.
- Em um tubo de centrífuga de 50 mL, combinar todos os 20 aminoácidos e adicionar 12 mL de vórtice ddH2O. estéril até que a solução fique clara, com apenas uma leve névoa de coloração branca.
- Aliquot os aminoácidos 4x em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL (alíquotas de 500 μL).
- Congele rapidamente as alíquotas da solução de aminoácidos 4x em nitrogênio líquido e mova as alíquotas para armazenamento de -80 °C.
6. Calibração do tampão livre de células
NOTA: O tampão CFPS usado para as reações de hidrogel foi calibrado para as concentrações ótimas de TDT, Mg-glutamato e K-glutamato seguindo o protocolo de Banks et al.34 modificado de Sun et al.35. As composições das reações de calibração foram selecionadas pelo método de planejamento de experimentos (DOE), sendo selecionados sete níveis fatoriais para K-glutamato (200 mM, 400 mM, 600 mM, 1.000 mM, 1.200 mM, 1.400 mM), Mg-glutamato (0 mM, 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM, 60 mM) e TDT (0 mM, 5, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM) estoques. O JMP Pro 15 foi usado para gerar um desenho DOE personalizado (Tabela 2) e conduzir a análise para determinar as concentrações ótimas dos fatores.
- Recupere o extrato livre de células do armazenamento de -80 °C e descongele no gelo.
- Descongelar os aminoácidos 4x, solução energética 14x, PEG-8000 40%, DNA plasmidial, 3 M K-glutamato, 100 mM Mg-glutamato e 100 mM TDT estoques no gelo.
- Crie uma mistura mestre de calibração combinando 12,5 μL dos aminoácidos 4x, 3,57 μL da solução energética 14x, 2,5 μL de PEG-8000 a 40%, 3 μg de DNA plasmidial e 10 μL de extrato livre de células (44,5 mg/mL) e faça até 35 μL por reação com ddH2O.
- Distribua os 35 μL da mistura mestra nos poços de uma placa preta de microtitulação de 384 poços.
- Seguindo o desenho do DOE, adicione o volume apropriado de Mg-glutamato, K-glutamato e TDT a cada reação, juntamente com ddH2O para fazer com que cada reação atinja 50 μL.
- Transfira a placa de microtitulação para um leitor de placas para detecção e análise de fluorescência usando as configurações do leitor de placas descritas (para mCherry): excitação: 587 nm, emissão: 610 nm, largura de banda de comprimento de onda: 12 nm, óptica: topo, temperatura: 37 °C, com leituras de fluorescência sendo coletadas a cada 5 min por 4 h de tempo total de leitura. Incubar as placas com agitação em uma configuração pulsada a 60 rpm.
- Carregue os resultados no projeto JMP DOE e gere um perfil de previsão para determinar os níveis ideais de concentração para K-glutamato, Mg-glutamato e TDT com base nas variáveis de resposta desejadas; Neste caso, a fluorescência máxima e a taxa de reação foram as variáveis resposta.
- Combine os reagentes conforme mostrado na Tabela 3 para criar o buffer CFPS 2X
- Alíquota e armazenamento a -80 °C
7. CFPS em hidrogéis liofilizados reidratados (Método A)
NOTA: Os plasmídeos utilizados nas reações de CFPS foram criados usando componentes da ferramenta modular EcoFlex para E. coli36 e descritos em Whitfield et al.11 O mCherry e o eGFP estavam sob o controle do promotor JM23100 constitutivo. Esses componentes estão disponíveis no Addgene.
- Recupere o extrato livre de células do armazenamento de -80 °C e descongele no gelo por aproximadamente 20 min.
- Coletar o tampão CFPS 2x e o DNA plasmidial e descongelar no gelo.
- Recolha os hidrogéis liofilizados e deixe-os atingir a temperatura ambiente durante 15 minutos, deixando os géis em pé no banco.
- Transfira os géis para tubos de microcentrífuga de 1,5 mL, aparando os géis com bisturi, se necessário, para que caibam nos poços.
- Em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL, combinar 10 μL de extrato livre de células com 25 μL de tampão 2x CFPS e 4 μg de DNA plasmidial; perfazer um volume total de 50 μL com ddH2O para criar a solução CFPS.
- Pipetar a solução CFPS para os hidrogéis liofilizados.
- Deixe os géis de molho no sistema CFPS por 5-10 min à temperatura ambiente.
- Transfira os géis para uma placa de microtitulação preta de 384 poços usando uma espátula.
- Transfira a placa de microtitulação para um leitor de placas para detecção e análise de fluorescência usando as configurações do leitor de placas descritas na etapa 6.6. Resultados representativos estão disponíveis em estudos prévios31,33.
8. Síntese de proteínas livres de células em hidrogéis destacáveis (Método B)
- Recupere o extrato livre de células do armazenamento de -80 °C e descongele no gelo por aproximadamente 20 minutos.
- Coletar o DNA plasmidial e descongelar no gelo.
- Em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL sobre gelo, combinar 10 μL de extrato livre de células com 3 μg de DNA plasmidial e 25 μL de tampão 2x CFPS, perfazendo um volume total de 37,5 μL.
- Meça 3 g de agarose e adicione a 100 mL de tampão ddH2O para criar 3% de agarose.
- Micro-ondas a 3% agarose em 30 s explosões em alta potência.
- Pipetar 12,5 μL de agarose fundida em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL contendo mistura de CFPS para um volume total de 50 μL.
- Deixe a agarose fundida arrefecer, mas não polimerize, deixando a agarose num bloco térmico regulado para 50 °C.
- Combinar a agarose fundida com a solução CFPS; misturar através de pipetagem e agitação com a ponta, e certifique-se de mover-se rapidamente para evitar a polimerização em gel antes que a solução CFPS possa ser misturada.
- Deixe os géis arrefecerem à temperatura ambiente e polimerizem durante aproximadamente 2 min.
- Transferir a agarose polimerizada para tubos de microcentrífuga de 1,5 mL com espátula e congelar em nitrogênio líquido.
- Coloque os hidrogéis congelados em -80 °C durante 1 h.
- Recuperar os géis do armazenamento; Remova as tampas dos tubos de microcentrífuga, cubra os tubos com filme de cera e perfure o filme para permitir que a umidade seja seca.
- Acione o liofilizador com as seguintes configurações: temperatura: -20 °C, pressão: 0,1 mbar, liofilização por 18 h (durante a noite).
- Conservar os dispositivos CFPS liofilizados em armazenamento de -80 °C até à utilização.
- Os dispositivos CFPS liofilizados, com um volume úmido aproximado de 50 μL, podem ser reidratados com 50 μL de ddH2O sem excesso de líquido. A reidratação leva aproximadamente 30 min.
- Transfira os géis para uma placa de microtitulação preta de 384 poços usando uma espátula.
- Transfira a placa de microtitulação para um leitor de placas para detecção e análise de fluorescência usando as configurações do leitor de placas descritas na etapa 6.6. Resultados representativos estão disponíveis em publicações anteriores31,33.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Este protocolo detalha dois métodos para incorporar reações de CFPS em matrizes de hidrogel, com a Figura 1 apresentando uma visão geral esquemática das duas abordagens. Ambos os métodos são passíveis de liofilização e armazenamento a longo prazo. O método A é a metodologia mais utilizada por dois motivos. Primeiro, mostrou-se o método mais aplicável para trabalhar com uma variedade de materiais hidrogéis11. Em segundo lugar, o método A permite o teste paralelo de construções genéticas. O método B é mais apropriado para a fabricação de um sistema otimizado e implantação em campo. Ambos os protocolos permitem que muitas amostras sejam preparadas de uma só vez para auxiliar na reprodutibilidade experimental. Esse recurso também é útil para o desenvolvimento a longo prazo da tecnologia, pois os dispositivos liofilizados podem ser enviados em estado seco e reconstituídos no local quando necessário.
A abordagem descrita no protocolo e na Figura 1 pode ser usada para a expressão de construções de um único gene ou para a co-expressão de múltiplos genes. Os dados apresentados na Figura 2 mostram a expressão de eGFP e mCherry em gel de agarose a 0,75%. A microscopia confocal foi utilizada para confirmar que a expressão proteica foi homogênea em todo o hidrogel, inclusive nos planos internos. Especificamente, a síntese proteica não foi confinada às bordas externas do hidrogel, e a fluorescência interna não foi o resultado da difusão proteica. Para confirmar isso, ao colocar um hidrogel que expressa eGFP em contato físico com um hidrogel que expressa mCherry, foi possível ver a difusão de proteínas de um hidrogel para outro. A taxa de difusão entre os dois foi insuficiente para explicar a extensa localização da fluorescência vermelha ou verde no interior do material. Este experimento também ilustra uma vantagem chave da implantação de dispositivos livres de células em hidrogéis - a funcionalidade do dispositivo pode ser organizada espacialmente de uma maneira que não é possível em reações livres de células líquidas. Além disso, para a criação de redes gênicas, é necessária a síntese simultânea de mais de um único produto gênico. Os resultados mostrados na Figura 2 (linha inferior) confirmaram a co-expressão de mCherry e eGFP em agarose. Neste trabalho, ambas as proteínas foram expressas, não havendo competição espacial entre elas. Novamente, uma sobreposição da faixa de comprimento de onda vermelha e verde demonstra a distribuição espacial uniforme de ambas as proteínas dentro do hidrogel.
Tabela 1: Estoques de soluções energéticas de 14x. Clique aqui para baixar esta tabela.
Tabela 2: Planejamento de uma matriz experimental para otimização de TDT, Mg-glutamato e K-glutamato dentro das reações de síntese de proteínas livres de células. Clique aqui para baixar esta tabela.
Tabela 3: Os componentes do buffer CFPS 2x. Clique aqui para baixar esta tabela.
Figura 1: Esquema dos dois protocolos. No primeiro método (Método A, demonstrado neste trabalho) os materiais hidrogéis são preparados primeiro e depois liofilizados (etapa 1) sem componentes livres de células. Esses hidrogéis secos podem ser armazenados e reconstituídos quando necessário (etapa 2) com o volume correto de reação livre de células antes da incubação para produção de proteína (etapa 3) O método variante, Método B, incorpora todos, ou alguns, dos componentes da reação livre de células na fabricação inicial do hidrogel. Após a liofilização (passo 1), os hidrogéis podem então ser reconstituídos em água isolada ou em tampão contendo um analito de interesse (passo 2). A produção de proteínas (etapa 3) continua como antes. Um terceiro método, no qual componentes liofilizados livres de células são reconstituídos com polímeros de hidrogel, é descrito em Whitfield et al.11 , mas encontrou uso com apenas um número limitado de hidrogéis até o momento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Síntese de proteínas livres de células de eGFP e mCherry em hidrogel usando lisados celulares de E. coli. Géis de agarose (0,75%) foram preparados sem molde de DNA (superior) com 4 μg de eGFP ou molde mCherry (meio) ou com 4 μg de molde de eGFP e mCherry (inferior). Os hidrogéis foram incubados por 4 h antes da microscopia confocal nos canais vermelho e verde. Uma sobreposição dos dois canais também é mostrada, e a sobreposição inclui a imagem de contraste de interferência diferencial (DIC). Hidrogéis contendo eGFP ou mCherry foram preparados separadamente, mas incubados em contato físico entre si. O diâmetro do gel é de 6 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Aqui são descritos dois protocolos para a incorporação de reações CFPS baseadas em lisado celular de E. coli em hidrogéis de agarose. Esses métodos permitem a expressão gênica simultânea em todo o material. O protocolo pode ser adaptado para outros sistemas CFPS e tem sido conduzido com sucesso com kits CFPS disponíveis comercialmente, além dos lisados celulares preparados em laboratório detalhados aqui. É importante ressaltar que o protocolo permite a expressão gênica na ausência de uma fase líquida externa. Isso significa que o sistema é autônomo e não requer um banho de reação livre de células. Diferentemente dos métodos anteriores em que as reações de CFPS ocorriam dentro de hidrogéis, a necessidade de tampões externos e vasos de reação é removida com este método. Espera-se que esses métodos permitam aos pesquisadores explorar o uso de materiais de hidrogel como chassi para dispositivos de biologia sintética livres de células, fornecendo uma rota para mover tais dispositivos para fora do laboratório.
Fundamental para o sucesso de ambas as abordagens é o uso de lisados celulares de alta qualidade. Um lisado celular de alta qualidade deve ter uma alta concentração de proteínas (>40 mg/mL), deve ser mantido frio durante a preparação e não deve ter sido submetido a repetidos ciclos de congelamento-descongelamento. Além disso, é fundamental que os modelos de DNA sejam de alta pureza. Para conseguir isso, os plasmídeos devem ser extraídos das células usando um kit de preparação de plasmídeos de alta pureza e alto rendimento para que as reações transcricionais prossigam dentro do ambiente CFPS. Esses estágios críticos são comuns a todos os aplicativos CFPS e não são exclusivos desse método. No entanto, é a preparação dos componentes da SDFP que tem maior impacto na efetividade dos protocolos. Em termos de materiais, é necessário conseguir uma liofilização rápida e eficaz dos hidrogéis. Se o liofilizador não atingir uma temperatura suficientemente fria (abaixo de -45 °C), o gel será seco em vez de liofilizado, o que pode comprometer a estrutura interna da matriz de hidrogel e pode causar a degradação dos sistemas CFPS incorporados. O método B também tem uma preocupação única; especificamente, ao adicionar a mistura CFPS à agarose fundida para formar o gel, a agarose fundida deve ser deixada arrefecer suficientemente antes que a mistura CFPS seja adicionada para evitar a degradação térmica das reações CFPS. No entanto, permitir que a agarose esfrie demais resultará na polimerização do gel e impedirá a adição do sistema CFPS. Finalmente, os hidrogéis possuem um grau de autofluorescência, que pode entrar em conflito com os sinais de fluorescência gerados durante as reações de CFPS. É importante, portanto, incluir controles negativos apropriados e repórteres genéticos que não tenham as mesmas características de fluorescência que o material.
Os protocolos aqui demonstrados centram-se no uso de agarose como hidrogel modelo. Agarose é um excelente sistema modelo para este trabalho, pois é amplamente disponível, barato e demonstra excelente capacidade de produção de proteínas. Investigações anteriores também demonstraram que a agarose pode ser um substituto para o agente de apinhamento PEG em reações CFPS, indicando que as interações entre o chassi do polímero e as reações CFPS podem aumentar a produção de proteína11. Esses métodos, no entanto, também são passíveis de modificações usando uma ampla gama de matrizes alternativas de hidrogel com propriedades físicas e químicas variadas. O método foi aplicado na goma xantana, no alginato, na goma acila gelana, na poliacrilamida, nos hidrogéis de ácido hialurônico e nos géis de poloxamer F-108 e F-1279. Em alguns cenários, observa-se redução da produção de proteínas em comparação com controles líquidos ou outros hidrogéis. No entanto, nesses cenários, um trade-off pode ser alcançado, onde a funcionalidade do próprio material (por exemplo, suas propriedades adesivas ou biocompatibilidade) é de benefício significativo, de modo que uma redução na produção de proteína pode ser aceita. Modificações nas concentrações dos hidrogéis também podem ser feitas. Para a agarose, os métodos são passíveis de concentrações de polímeros na faixa de 0,5%-1,5% p/v, por exemplo. Uma concentração de gel mais alta normalmente resulta, em um sentido material, em um dispositivo mais robusto que é mais resistente ao manuseio e preserva melhor a reação CFPS interna. O trade-off com o aumento da concentração de gel, no entanto, é que a reação pode ter uma taxa de produção reduzida ou rendimento proteico11,37. A relação entre a concentração do polímero e a produção de proteína, no entanto, não é linear e varia dependendo do hidrogel utilizado11. Como tal, para qualquer novo polímero de hidrogel, um grau de experimentação é necessário para equilibrar a funcionalidade do material contra a funcionalidade livre de células.
A incorporação de reações CFPS em materiais hidrogéis sem a necessidade de buffers externos representa uma rota interessante para a implantação de dispositivos livres de células. Os dispositivos livres de células têm o benefício de eliminar a necessidade de liberação de organismos geneticamente modificados fora de um ambiente de laboratório controlado. Além disso, as reações de incorporação em hidrogéis eliminam a necessidade de vasos de reação (normalmente plásticos) após a reconstituição. Dado que muitos hidrogéis são biodegradáveis, isso oferece um caminho potencial para reduzir os resíduos plásticos. Da mesma forma, o protocolo aqui detalhado também demonstra que tanto o hidrogel quanto a CFPS são passíveis de liofilização. Embora ciclos repetidos de liofilização não sejam recomendados e provavelmente danificarão a função CFPS e hidrogel, para dispositivos de uso único. A capacidade de liofilizar e reconstituir os componentes reduz o peso do dispositivo e elimina a necessidade de uma cadeia de frio durante o transporte. Essas propriedades acabam simplificando a logística e reduzindo os custos de transporte dos dispositivos. Além disso, os hidrogéis têm muitas propriedades funcionais úteis próprias; Por exemplo, eles podem atuar como pastas, lubrificantes e adesivos. Os hidrogéis também podem ser biocompatíveis, biodegradáveis e possuir estímulos-respostas por direito próprio. Em conjunto, uma sinergia pode ser alcançada entre a funcionalidade biológica e a ciência dos materiais para criar uma nova classe de materiais bioprogramáveis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Nenhum.
Acknowledgments
Os autores agradecem imensamente o apoio dos prêmios BB/V017551/1 (S.K., T.P.H.) e BB/W01095X/1 (A.L., T.P.H.) e EP/N026683/1 (A.L., T.P.H.) do Conselho de Pesquisa em Engenharia e Ciências Físicas - Laboratórios de Ciência e Tecnologia de Defesa (C.J.W., A.M.B., T.P.H.). Os dados que suportam esta publicação estão disponíveis em: 10.25405/data.ncl.22232452. Para fins de acesso aberto, o autor aplicou uma licença Creative Commons Attribution (CC BY) a qualquer versão do Autor Aceito do Manuscrito que surgir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| 3-PGA | Santa Cruz Biotechnology | sc-214793B | |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Agar | Thermo Fisher Scientific | A10752.22 | |
| Agarose | Severn Biotech | 30-15-50 | |
| Amino Acid Sampler Kit | VWR | BTRABR1401801 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A8937-1G | |
| cAMP | Sigma-Aldrich | A9501-1G | |
| Coenzyme A (CoA) | Sigma-Aldrich | C4282-100MG | |
| CTP | Alfa Aesar | J14121.MC | |
| DTT | Thermo Fisher Scientific | R0862 | |
| Folinic Acid | Sigma-Aldrich | F7878-100MG | |
| GTP | Carbosynth | NG01208 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-25G | |
| K-glutamate | Sigma-Aldrich | G1149-100G | |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876-1G | |
| Mg-glutamate | Sigma-Aldrich | 49605-250G | |
| NAD | Sigma-Aldrich | N6522-250MG | |
| PEG-8000 | Promega | V3011 | |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | 757551-5G | |
| Potassium Phosphate Dibasic (K2HPO4) | Sigma-Aldrich | P3786-500G | |
| Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | RDD037-500G | |
| Protease Inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P2714-1BTL | |
| Qubit Protein concentration kit | Thermo Fisher Scientific | A50668 | |
| Rossetta 2 DE 3 E.coli | Sigma-Aldrich | 71397-3 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888-500G | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | 85558-1G | |
| Tryptone | Thermo Fisher Scientific | 211705 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | GE17-1321-01 | |
| tRNA | Sigma-Aldrich | 10109541001 | |
| UTP | Alfa Aesar | J23160.MC | |
| Yeast Extract | Sigma-Aldrich | Y1625-1KG | |
| Equipment | |||
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Sigma-Aldrich | HS4323-500EA | |
| 10K MWCO dialysis cassettes | Thermo Fisher Scientific | 66381 | |
| 15 mL centrifuge tube | Sarstedt | 62.554.502 | |
| 50 mL centrifuge bottles | Sarstedt | 62.547.254 | |
| 500 mL centrifuge bottles | Thermo Fisher Scientific | 3120-9500 | |
| Alpha 1-2 LD Plus freeze-dryer | Christ | part no. 101521, 101522, 101527 | |
| Benchtop Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | H-X3R | |
| Black 384 well microtitre plates | Fischer Scientific | 66 | |
| Cuvettes | Thermo Fisher Scientific | 222S | |
| Elga Purelab Chorus | Elga | ##### | |
| Eppendorf Microcentrifuge 5425R | Eppendorf | EP00532 | |
| High Speed Centrifuge | Beckman Coulter | B34183 | |
| JMP license | SAS Institute | 15 | |
| Magnetic Stirrer | Fischer Scientific | 15353518 | |
| Parafilm | Amcor | PM-966 | |
| Photospectrometer (Biophotometer) | Eppendorf | 16713 | |
| Pipettes and tips | Gilson | ##### | |
| Precision Balance | Sartorius | 16384738 | |
| Qubit 2.0 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q32866 | |
| Shaking Incubator | Thermo Fisher Scientific | SHKE8000 | |
| Sonic Dismembrator (Sonicator) | Thermo Fisher Scientific | 12893543 | |
| Static Incubator | Sanyo | MIR-162 | |
| Syringe and needles | Thermo Fisher Scientific | 66490 | |
| Thermo max Q8000 (Shaking Incubator) | Thermo Fisher Scientific | SHKE8000 | |
| Varioskan Lux platereader | Thermo Fisher Scientific | VLBL00GD1 | |
| Vortex Genie 2 | Cole-parmer | OU-04724-05 | |
| VWR PHenomenal pH 1100 L, ph/mv/°c meter | VWR | 662-1657 |
References
- Lu, Y. Cell-free synthetic biology: Engineering in an open world. Synthetic and System Biotechnology. 2 (1), 23-27 (2017).
- Perez, J. G., Stark, J. C., Jewett, M. C. Cell-free synthetic biology: Engineering beyond the cell. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8 (12), e023853 (2016).
- Jiang, L., Zhao, J., Lian, J., Xu, Z. Cell-free protein synthesis enabled rapid prototyping for metabolic engineering and synthetic biology. Synthetic and System Biotechnology. 3 (2), 90-96 (2018).
- Kopniczky, M. B., et al. Cell-free protein synthesis as a prototyping platform for mammalian synthetic biology. ACS Synthetic Biology. 9 (1), 144-156 (2020).
- Pandi, A., Grigoras, I., Borkowski, O., Faulon, J. L. Optimizing cell-free biosensors to monitor enzymatic production. ACS Synthetic Biology. 8 (8), 1952-1957 (2019).
- Khambhati, K., Bhattacharjee, G., Gohil, N., Braddick, D., Kulkarni, V. S. V. Exploring the potential of cell-free protein synthesis for extending the abilities of biological systems. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 248 (2019).
- Focke, P. J., et al. Combining in vitro folding with cell free protein synthesis for membrane protein expression. Biochemistry. 55 (30), 4212-4219 (2016).
- Fogeron, M. L., Lecoq, L., Cole, L., Harbers, M., Böckmann, A. Easy synthesis of complex biomolecular assemblies: wheat germ cell-free protein expression in structural biology. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 63958 (2021).
- Bashir, S., et al. Fundamental concepts of hydrogels: synthesis, properties, and their applications. Polymers. 12 (11), 2702 (2020).
- Loo, S. L., Vásquez, L., Athanassiou, A., Fragouli, D. Polymeric hydrogels-A promising platform in enhancing water security for a sustainable future. Advanced Material Interfaces. 8 (24), 2100580 (2021).
- Whitfield, C. J., et al.
- Yao, H., et al. Design strategies for adhesive hydrogels with natural antibacterial agents as wound dressings: Status and trends. Materials Today Bio. 15, 100429 (2022).
- Musgrave, C. S. A., Fang, F. Contact lens materials: A materials science perspective. Materials. 12 (2), 261 (2019).
- Maher, A. J., Rana, A. G., Rawan, A. Recovery of hydrogel from baby diaper wastes and its application for enhancing soil irrigation management. Journal of Environmental Management. 239, 255-261 (2019).
- Vigata, M., Meinert, C., Hutmacher, D. W., Bock, N. Hydrogels as drug delivery systems: A review of current characterization and evaluation techniques. Pharmaceutics. 12 (12), 1188 (2020).
- Jacob, S., et al. Emerging role of hydrogels in drug delivery systems, tissue engineering and wound management. Pharmaceutics. 3 (3), 357 (2021).
- Senapati, S., et al. Controlled drug delivery vehicles for cancer treatment and their performance. Signal Transduction and Targeted Therapy. 3, 7 (2018).
- Chen, Y., et al. A biocompatible, stimuli-responsive, and injectable hydrogel with triple dynamic bonds. Molecules. 25 (13), 3050 (2020).
- Shi, Q., et al. Bioactuators based on stimulus-responsive hydrogels and their emerging biomedical applications. NPG Asia Materials. 11, 64 (2019).
- Fan, M., Tan, H. Biocompatible conjugation for biodegradable hydrogels as drug and cell scaffolds. Cogent Engineering. 7 (1), 1736407 (2020).
- Byun, J. Y., Lee, K. H., Lee, K. Y., Kim, M. G., Kim, D. M. In-gel expression and in situ immobilization of proteins for generation of three-dimensional protein arrays in a hydrogel matrix. Lab on a Chip. 13 (5), 886-891 (2013).
- Zhou, X., Wu, H., Cui, M., Lai, S. N., Zheng, B. Long-lived protein expression in hydrogel particles: Towards artificial cells. Chemical Science. 9 (18), 4275-4279 (2018).
- Huang, A., et al. BiobitsTM explorer: A modular synthetic biology education kit. Science Advances. 4 (8), 5105 (2018).
- Jaramillo-Isaza, S., Alfonso-Rodriguez, C. A., Rios-Rojas, J. F., García-Guzmán, J. A. Dynamic mechanical analysis of agarose-based biopolymers with potential use in regenerative medicine. Materials Today Proceeding. 49, 16-22 (2022).
- Wang, B. X., Xu, W., Yang, Z., Wu, Y. An overview on recent progress of the hydrogels: from material resources, properties to functional applications. Macromolecular Rapid Communications. 43 (6), 2100785 (2022).
- Salati, M. A., et al. Agarose-based biomaterials: Opportunities and challenges in cartilage tissue engineering. Polymers. 12 (5), 1150 (2020).
- Buddingh, B. C., Van Hest, J. C. M. Artificial cells: Synthetic compartments with life-like functionality and adaptivity. Accounts of Chemical Research. 50 (4), 769-777 (2017).
- Kahn, J. S., et al. DNA microgels as a platform for cell-free protein expression and display. Biomacromolecules. 17 (6), 2019-2026 (2016).
- Yang, D., et al. Enhanced transcription and translation in clay hydrogel and implications for early life evolution. Scientific Reports. 3, 3165 (2013).
- Zhou, X., Wu, H., Cui, M., Lai, S. N., Zheng, B. Long-lived protein expression in hydrogel particles: Towards artificial cells. Chemical Science. 9 (18), 4275-4279 (2018).
- Whitfield, C. J., et al. Cell-free genetic devices confer autonomic and adaptive properties to hydrogels. BioRxiv. , (2019).
- Feng, L., Jianpu, T., Jinhui, G. D., Luo, D. Y. Polymeric DNA hydrogel: Design, synthesis and applications. Progress in Polymer Science. 98, 101163 (2019).
- Howard, T., et al. Datasets for Whitfield et al. 2020 Chemical Communications. , Newcastle University. UK. (2020).
- Banks, A. M., et al. Key reaction components affect the kinetics and performance robustness of cell-free protein synthesis reactions. Computational and Structural Biotechnology Journal. 20, 218-229 (2022).
- Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli-based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of Visualized Experiments. (79), e50762 (2013).
- Moore, S. J., et al. EcoFlex: A multifunctional MoClo kit for E. coli synthetic biology. ACS Synthetic Biology. 5 (10), 1059-1069 (2016).
- Benítez-Mateos, A. I., et al. Micro compartmentalized cell-free protein synthesis in hydrogel µ-channels. ACS Synthetic Biology. 9 (11), 2971-2978 (2020).
