Summary
Здесь мы покажем процедуры нокдауна FAM83A ; анализы для выявления его влияния на пролиферацию, миграцию и инвазию клеток рака шейки матки; и сенсибилизация этих клеток к цисплатину. Это исследование предоставляет многообещающий ген-мишень для рака шейки матки и эталон для дальнейших исследований лекарственных препаратов.
Abstract
Исследование генов-мишеней опухоли имеет первостепенное значение для профилактики и лечения рака шейки матки. В этом исследовании мы описываем этапы, связанные с идентификацией гена-мишени опухоли FAM83A при раке шейки матки. Во-первых, набор данных Атласа генома рака был использован для проверки экспрессии и прогностической значимости FAM83A у женщин. Малая интерферирующая РНК (миРНК) использовалась для нокдауна гена FAM83A в клетках HeLa и C33a . Затем было проведено окрашивание 5-этинил-2'-дезоксиуридином (EdU) для определения влияния на пролиферативные способности опухолевых клеток. Для оценки способности опухолевых клеток к миграции и инвазии были проведены анализы на заживление ран и вставку пористой мембраны.
Вестерн-блоттинг был использован для количественной оценки уровней белка, связанных с апоптозом. Для оценки изменений функции митохондрий использовали окрашивание JC-1. Кроме того, для оценки терапевтического потенциала гена-мишени было использовано вмешательство цисплатина (диаминдихлорплатины, DDP). Для дальнейшей валидации противоопухолевых характеристик гена были проведены проточная цитометрия и анализ образования колоний. В результате было показано, что нокдаун FAM83A ингибирует пролиферацию, миграцию и инвазию клеток рака шейки матки и сенсибилизирует эти клетки к цисплатину. Эти комплексные методики в совокупности подтверждают, что FAM83A является геном-мишенью, ассоциированным с опухолью, перспективным в качестве потенциальной терапевтической мишени в профилактике и лечении рака шейки матки.
Introduction
Рак шейки матки является глобальной проблемой, поскольку он является одним из ведущих видов гинекологических злокачественных новообразований во всем мире и основной причиной смертности от рака у женщин1. Радикальная хирургия и химиолучевая терапия связаны с высокими показателями излечения на первичной стадии. Однако результаты лечения пациенток на поздней стадии рака шейки матки, у которых развивается метастатическое заболевание, весьма неблагоприятны2. Поэтому крайне важно глубже понять биологические механизмы, лежащие в основе миграции и инвазии клеток рака шейки матки, и определить потенциальные терапевтические мишени для профилактики и лечения этого заболевания.
Идентификация генов-мишеней, участвующих в прогрессировании рака, и поиск способов ингибирования их экспрессии или действия представляют собой многообещающие варианты лечения. В этом исследовании мы идентифицировали FAM83 как ген, вызывающий рак, и дополнительно изучили его ингибирующее воздействие на клетки C33a и HeLa. Онкогены семейства FAM83 (FAM83A-H) широко известны при раке человека 3,4. Недавно сообщалось о повышенной регуляции FAM83A при раке легких5, молочной железы6, яичников7 и поджелудочной железы8, что указывает на то, что FAM83A играет важную роль в прогрессировании рака, способствуя пролиферации, инвазии, признакам, подобным стволовым клеткам, и лекарственной устойчивости опухолевых клеток. Важно отметить, что FAM83A был идентифицирован как один из новых генов-кандидатов, связанных с прогрессированием поражения шейки матки и канцерогенезом9. Несмотря на подтверждение повышенной экспрессии FAM83A в клетках рака шейки матки человека, специфическое влияние и лежащие в его основе механизмы FAM83A при раке шейки матки остаются неясными.
В этом исследовании мы описываем протоколы, участвующие в идентификации FAM83A в качестве гена-мишени опухоли при раке шейки матки, и используем небольшую интерферирующую РНК (миРНК) для нокдауна гена FAM83A в клетках HeLa и C33a . Для определения влияния на пролиферацию опухолевых клеток было проведено окрашивание 5-этинил-2'-дезоксиуридином (EdU), в то время как ранозаживление и анализ вставки пористой мембраны помогли оценить миграцию опухолевых клеток и способность к инвазии.
Для определения уровней белков, связанных с апоптозом, проводили вестерн-блоттинг, а для оценки изменений митохондриальной функции использовали окрашивание JC-1. Таким образом, мы сообщили, что FAM83A играет решающую роль в пролиферации, метастазировании и инвазии клеток при раке шейки матки. Через митохондриальную дисфункцию и апоптоз, ассоциированный с PI3K/AKT, FAM83A нокдаун сенсибилизировал клетки рака шейки матки к цисплатину (диаминдихлорплатине, DDP). Это исследование предоставляет новую мишень для рака шейки матки и, возможно, других видов рака, а также ориентир для разработки стратегий преодоления резистентности раковых клеток к определенным химиотерапевтическим препаратам.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Исследование полностью соответствовало рекомендациям по публикациям, предоставленным TCGA (https://cancergenome.nih.gov/publications/publicationguidelines). См. Таблицу материалов для получения подробной информации, связанной со всеми материалами, реагентами и инструментами, используемыми в этом протоколе.
1. Анализ источников данных и биоинформатики
- Получение данных секвенирования РНК из базы данных Атласа генома рака (TCGA) (https://cancergenome.nih.gov) для кластерного анализа. Используйте GEPIA (http://gepia.cancer-pku.cn/), веб-инструмент для повторного вычисления необработанных данных РНК-секвенирования образцов из проектов TCGA, для скрининга потенциальных мишеней для лекарств от рака с помощью стандартного конвейера обработки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Веб-сайт GEPIA находится в свободном доступе для всех пользователей. - Зайдите на главную страницу веб-сайта GEPIA и нажмите « Анализ типа рака», выберите опцию «Дифференциальный анализ генов » и установите следующие параметры: Название рака = CESE (определяется как плоскоклеточная карцинома шейки матки и эндоцервикальная аденокарцинома на этой веб-странице), |Лог2ФК| Cutoff = 1, q-value Cutoff = 0.01, Differential Methods = ANOVA и Chromosomal Distribution = оба. Затем нажмите на Список, чтобы получить список генов, показывающий дифференциальную экспрессию между опухолевыми и нормальными группами.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для выявления дифференциально экспрессируемых генов-кандидатов требуется обширный обзор литературы. В этом исследовании, принимая во внимание имеющуюся литературу, мы сосредоточимся на интересующем нас опухолевом гене FAM83A. - Затем изучите экспрессию FAM83A в раке шейки матки и нормальных тканях с помощью EPIA, перейдя к опции «Выражение своими руками » на веб-сайте и выберите «Блочная диаграмма » в качестве типа диаграммы. Введите FAM83A в поле параметра гена и установите следующие параметры: |Лог2ФК| Значение отсечения = 1; q-значение Cutoff = 0.01. Выберите CESE в качестве названия рака и Сопоставить нормальные данные TCGA для поля данных Matched Normal , оставив все остальные настройки по умолчанию. Нажмите на Plot (График ) и разрешите веб-сайту создать ящичковую диаграмму, представляющую дифференциальную экспрессию гена FAM83A ; Сохраните блочную диаграмму для дальнейшего использования и анализа.
- Наконец, проанализируйте общую выживаемость пациенток с опухолями с различными уровнями экспрессии FAM83A при раке шейки матки. Перейдите к опции Survival Plots на веб-сайте, установите Gene на FAM83A и выберите Overall Survival в качестве типа анализа. Добавьте имя опухоли CESE, выберите Months (Месяцы) в поле Axis Units (Единицы измерения оси) и оставьте для всех остальных параметров значения по умолчанию. Нажмите кнопку Построить график и позвольте веб-сайту создать диаграмму кривой выживаемости; Сохраните эту диаграмму для дальнейшего использования и анализа.
- Учитывайте как дифференциальную экспрессию FAM83A в опухолях, так и ее корреляцию с анализом выживаемости пациентов, чтобы идентифицировать FAM83A как потенциальный терапевтический ген-мишень при раке шейки матки.
2. Клеточные эксперименты
- Клеточная культура
- Культивирование линий опухолевых клеток человека в модифицированной среде при 37 °С в увлажненной атмосфере 5%СО2 .
ПРИМЕЧАНИЕ: Информацию о клеточной линии и компонентах питательной среды см. в таблице материалов .
- Культивирование линий опухолевых клеток человека в модифицированной среде при 37 °С в увлажненной атмосфере 5%СО2 .
- Трансфекция клеток
- Используйте миРНК, чтобы подавить экспрессию FAM83A в клетках.
ПРИМЕЧАНИЕ: Конкретная последовательность миРНК приведена в таблице 1 . - Клетки помещают в 6-луночные планшеты и инкубируют со смесью 50 нМ si-FAM83A или миРНК-NC и 8 мкл трансфекционного агента или только 8 мкл трансфекционного агента в течение 4-6 ч после достижения 50%-70% слияния. Добавляйте в отрицательный контроль только безсывороточный DMEM.
- После инкубации замените среду, содержащую трансфекционный агент, на ДМЕМ + 10% фетальную телячью сыворотку. Далее, через 48 ч после трансфекции, обработать 5 мкМ цисплатином (DDP) в течение 24 ч по назначению и собрать все клетки для экстракции общей РНК и анализа qRT-PCR.
- Используйте миРНК, чтобы подавить экспрессию FAM83A в клетках.
3. Обнаружение EdU для анализа пролиферации клеток
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте набор для пролиферации клеток EdU для оценки пролиферации клеток in vitro в соответствии с инструкциями производителя.
- Высевают клетки в 6-луночные планшеты и инкубируют их с 10 мкМ раствором EdU в течение 2 ч. Фиксируют клетки 4% параформальдегидом в течение 15 мин при комнатной температуре (RT) и пермеабилизируют 0,3% Triton X-100 в PBS в течение 10 мин при RT.
- Удалите буфер пермеабилизации и добавьте 500 мкл 1-кратного реакционного раствора. Затем инкубируют в течение 30 мин при РТ в темноте для ядерного окрашивания.
- Окрасьте клетки 4',6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI) и визуализируйте их под флуоресцентным микроскопом при 200-кратном увеличении. Окрасьте ядра пролиферирующих клеток EdU и исследуйте их на красную флуоресценцию.
- Наконец, используйте программное обеспечение для количественной оценки результатов, подсчитав не менее 10 случайных полей, и рассчитайте скорость пролиферации, используя отношение флуоресцентно-положительных клеток к общему количеству клеток.
4. Ранозаживляющий анализ
- Затравочные ячейки в 6-луночные планшеты при плотности 2 × 105 ячеек на лунку.
- Когда клетки достигнут 90% слияния, используйте стерильный наконечник микропипетки объемом 10 мкл, чтобы аккуратно создать линейную царапину в монослое клетки. Осторожно промойте лунки стерильным PBS, чтобы удалить все отслоившиеся клетки и мусор, вызванные царапинами.
- Далее инкубируют клетки в среде, содержащей 1% ФБС. Затем наблюдайте и делайте снимки с помощью инвертированного микроскопа для заживления раненой области через 12, 24 и 48 часов.
5. Анализ пористой мембранной вставки
- Готовят клеточную суспензию в питательной среде с нужной концентрацией клеток (содержащей 4 × 104 клеток), включая трансфицированные или контрольные клетки С33а и HeLa. Добавьте клеточную суспензию в верхнюю камеру мембранных вставок, обеспечивая равномерное распределение. Добавьте полную среду в нижнюю камеру.
- После инкубации в течение 24 ч используют метиловый спирт и 0,1% кристаллический фиолетовый для фиксации и окрашивания клеток, мигрирующих в нижние камеры соответственно.
- Используйте инвертированный микроскоп для получения изображений, а затем проанализируйте количество мигрирующих клеток, подсчитав не менее 10 случайных полей с помощью ImageJ.
- Для анализа чисел с помощью ImageJ откройте изображение в программе ImageJ, перейдите на вкладку Image в меню инструментов, выберите Adjust, а затем нажмите Threshold. При необходимости отрегулируйте пороговые значения до тех пор, пока на белом фоне не будут видны только ячейки.
- Нажмите « Применить » в окне «Порог », чтобы применить эти настройки к изображению. Теперь выберите инструмент « Палочка (трассировка)» на панели инструментов (расположенной в верхней части окна).
- Щелкните по области изображения, где расположены ячейки, чтобы выбрать все ячейки в пороговом изображении. После того, как ячейки будут выделены, перейдите в раздел «Анализ» в меню «Инструменты», а затем нажмите «Анализ частиц». В окне "Анализ частиц" введите желаемый размер (например, 0 - бесконечность) и значения округлости (например, 0,00 - 1,00) в соответствии с экспериментальными требованиями, чтобы включить все ячейки в подсчет.
- Нажмите кнопку ОК и подождите, пока программа подсчитает ячейки и появится новое окно с результатами анализа.
6. Анализ формирования колоний
- Высевают 2 × 105 клеток на лунку групп Si-NC и Si-FAM83A в 6-луночном планшете с обработкой цисплатином 5 мкМ (DDP) или без нее в течение 24 ч.
- После 24-часового периода медикаментозного лечения отделяют клетки с помощью 0,25% трипсина и ресуспендируют их в модифицированной среде Eagle (DMEM) Dulbecco, содержащей 10% FBS. Высевают ресуспендированные клетки в 6-луночную тарелку при плотности 1 × 103 клетки на лунку, а затем инкубируют в 5%-ном инкубатореСО2 при температуре 37 °С.
- После инкубации в течение ~7-10 дней, когда будут видны колонии, зафиксируйте клетки 4% полиоксиметиленом и окрасьте их раствором для окрашивания Гимза в течение 20 мин.
- Слегка промойте ячейки и дайте пластинам высохнуть на воздухе. Сделайте снимки кластеров колоний под микроскопом и подсчитайте количество колоний, содержащих более 50 клеток.
7. Анализ деполяризации митохондриальной мембраны (ММП) с использованием красителя JC-1
- Посев 1,2 × 106 опухолевых клеток из групп Si-NC и Si-FAM83A в шестилуночный планшет и культивирование в течение 24 ч с обработкой 5 мкМ цисплатином (DDP) или без нее.
- Инкубируют с 1x раствором окрашивания JC-1 в течение 15-20 мин при 5%CO2 при 37 °C, используя набор для анализа потенциала митохондриальной мембраны в соответствии с инструкциями производителя.
- Промывают клетки и исследуют их под флуоресцентным микроскопом при 200-кратном увеличении с использованием длин волн возбуждения и излучения для JC-1 на длинах волн ~490 нм и 590 нм соответственно. Для визуализации флуоресценции JC-1 используйте соответствующие фильтры, такие как синий фильтр возбуждения (450-490 нм) и красный эмиссионный фильтр (длиннопроходный > 590 нм) для избирательного захвата излучаемого флуоресцентного сигнала.
8. Проточный цитометрический анализ mPTP
- Посев 1,2 × 106 опухолевых клеток из групп Si-NC и Si-FAM83A в шестилуночный планшет и культивирование в течение 24 ч с обработкой 5 мкМ цисплатином (DDP) или без нее.
- Удалите питательную среду из клеток, повторно суспендируйте клетки в PBS и добавьте по 300 мкл (1x объем) раствора для окрашивания кальцеина AM и рабочего раствора для тушения флуоресценции, чтобы равномерно покрыть клетки. Инкубируют клетки при 37 °C в защищенном от света помещении в течение 30-45 мин и заменяют среду свежей предварительно нагретой питательной средой при 37 °C. Инкубируют клетки при 37 °C в защищенной от света среде в течение дополнительных 30 мин, чтобы обеспечить полный гидролиз кальцеина AM внутриклеточными эстеразами, в результате чего образуется внутриклеточный зеленый флуоресцентный кальцеин.
- Удалите питательную среду, промойте клетки 2-3 раза PBS и добавьте буфер обнаружения. Детектирование клеточного mPTP с помощью проточной цитометрии и длины волны возбуждения 488 нм.
9. Проточная цитометрия
- Посев 1,2 × 106 опухолевых клеток из групп Si-NC и Si-FAM83A в шестилуночный планшет и культивирование в течение 24 ч с обработкой 5 мкМ цисплатином (DDP) или без нее.
- После 24 ч обработки препаратом повторно суспендируют клетки в 200 мкл связывающего буферного раствора и осторожно смешивают 10 мкл аннексина V-FITC и 5 мкл йодида пропидия (PI) с клеточной суспензией. Инкубируйте смесь в течение 15 мин, избегая света, и добавьте к клеткам 300 мкл связывающего буферного раствора. Обнаружение апоптоза клеток с помощью проточной цитометрии при длине волны возбуждения 488 нм.
10. ОТ-ПЦР-анализ
- Посев 1,2 × 106 опухолевых клеток из групп Si-NC и Si-FAM83A в шестилуночный планшет и культивирование в течение 24 ч с обработкой 5 мкМ цисплатином (DDP) или без нее.
- Извлеките общую РНК из опухолевых клеток с помощью реагента для экстракции РНК и превратите извлеченную РНК в комплементарную ДНК (кДНК) с помощью смеси для синтеза кДНК путем инкубации при 42 °C в течение 45 мин, а затем при 95 °C в течение 5 мин.
- Приготовьте реакционную смесь для ПЦР, содержащую ДНК-полимеразу, нуклеотиды, буфер и разработанные геноспецифические праймеры. Добавьте матрицу кДНК в реакционную смесь для реакции ПЦР в реальном времени и выполните ПЦР на приборе для количественной ПЦР в реальном времени со следующими условиями термоциклирования: денатурация при 95 °C в течение 30 с, затем 40 циклов при 95 °C в течение 5 с и 60 °C в течение 30 с и стадия кривой плавления при 95 °C в течение 15 с, 60 °C в течение 1 мин и 95 °C в течение 15 с. Количественная оценка уровней мРНК с помощью метода 2−ΔΔCq с использованием GAPDH в качестве внутреннего контроля.
ПРИМЕЧАНИЕ: Реакционная система ОТ-ПЦР показана в таблице 1, а последовательности праймеров — в таблице 1.- Чтобы вычислить значение 2−ΔΔCq , измерьте значения Cq для целевого гена и референсного гена (GAPDH) в образцах. Вычислите ΔCq, вычитая значение Cq эталонного гена из значения Cq целевого гена для каждого образца. Вычислите ΔΔCq, вычитая ΔCq контрольного образца из ΔCq каждого экспериментального образца. Наконец, вычислите значение 2−ΔΔCq , возведя 2 в степень значения ΔΔCq.
ПРИМЕЧАНИЕ: Значение Cq представляет собой номер цикла, при котором сигнал флуоресценции достигает установленного порога.
- Чтобы вычислить значение 2−ΔΔCq , измерьте значения Cq для целевого гена и референсного гена (GAPDH) в образцах. Вычислите ΔCq, вычитая значение Cq эталонного гена из значения Cq целевого гена для каждого образца. Вычислите ΔΔCq, вычитая ΔCq контрольного образца из ΔCq каждого экспериментального образца. Наконец, вычислите значение 2−ΔΔCq , возведя 2 в степень значения ΔΔCq.
11. Вестерн-блоттинг
- Посев 1,2 × 106 опухолевых клеток из групп Si-NC и Si-FAM83A в шестилуночный планшет и культивирование в течение 24 ч с обработкой 5 мкМ цисплатином (DDP) или без нее.
- Соберите культивируемые клетки и промойте их ледяным фосфатно-солевым буфером (PBS), чтобы удалить остатки питательной среды или сыворотки. Лизируйте клетки с помощью лизисного буфера RIPA, содержащего фенилметилсульфонилфторид (PMSF), для высвобождения клеточных белков. Инкубируют клетки на льду в течение нескольких минут, чтобы обеспечить полный лизис, и центрифугируют при 4 °C, 12 000 × g в течение 15 минут. Соберите надосадочную жидкость, чтобы определить ее концентрацию белка.
- Определите концентрацию белка в клеточном лизате с помощью набора для анализа белка BCA в соответствии с инструкциями производителя. Смешайте клеточный лизат с загрузочным буфером и нагрейте смесь при температуре 95-100 °C в течение 5-10 мин для денатурации белков и обеспечения равномерного разделения на геле.
- Из каждого образца загрузите 30 мкг общего белка в гель SDS-PAGE и запустите SDS-PAGE под постоянным напряжением 80 В. Прекратите электрофорез, когда бромфеноловый синий достигнет дна разделительного геля.
- Отделенные белки из геля переносят на поливинилдифторидную мембрану с помощью системы мокрого переноса на ледяной бане током 200 мА в течение 1,5 ч.
- Заблокируйте мембрану 5%-ным обезжиренным молоком в трис-буферном солевом растворе с 0,05%-ным буфером Tween-20 (TBST) в течение 1 ч при RT и инкубируйте в течение ночи при 4 °C с соответствующими антителами, указанными в таблице материалов.
- Мембрану промывают несколько раз TBST и инкубируют со вторичными антителами (таблица материалов) в течение 1 ч при RT с последующей промывкой TBST. Визуализируйте белковые полосы с помощью усовершенствованного набора для обнаружения хемилюминесценции и системы визуализации.
12. Статистический анализ
- Поскольку все экспериментальные данные будут независимыми, представьте данные в виде среднего значения ± SD. Выполните статистический анализ.
- Используйте односторонний дисперсионный анализ (ANOVA) для множественных сравнений и критерий Даннета для сравнения каждой группы с контрольной группой. Использовать t-критерий Стьюдента (непарный двусторонний) для сравнения двух групп; считать P < 0,05 значимым.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Анализ базы данных TCGA и проверка ПЦР
На основе анализа базы данных TCGA мы провели сравнительный анализ уровней экспрессии мРНК в 306 образцах клеток рака шейки матки и 13 образцах нормальных клеток для изучения дифференциальной экспрессии FAM83A. FAM83A был повышен при раке шейки матки, в то время как его экспрессия в нормальной ткани шейки матки была незначительной (рис. 1A). Чтобы получить более глубокое представление о прогностических последствиях выражения FAM83A , мы провели анализ кривой Каплана-Мейера. Поразительно, что пациенты с более высокой экспрессией FAM83A показали заметно худшую общую выживаемость (рис. 1B). Чтобы определить роль FAM83A в развитии рака шейки матки, мы исследовали уровни экспрессии FAM83A в двух клеточных линиях рака шейки матки, HeLa и C33a, а также в иммортализированной клеточной линии шейки матки End1/E6E7. С помощью кОТ-ПЦР мы наблюдали значительную гиперэкспрессию FAM83A в клеточных линиях HeLa и C33a по сравнению с клеточной линией End1/E6E7 (рис. 1C). Эти результаты подчеркивают важность FAM83A в контексте рака шейки матки.
Эксперименты по пролиферации и апоптозу для проверки биологической функции FAM83A при раке шейки матки
Для изучения функциональной роли FAM83A при раке шейки матки мы использовали миРНК-опосредованный нокдаун FAM83A в клетках C33a и HeLa (рис. 2A,B). Затем мы оценили влияние подавления FAM83A на пролиферацию клеток. Окрашивание EdU показало, что снижение экспрессии FAM83A значительно ингибирует пролиферацию клеток как в клетках C33a, так и в клетках HeLa (рис. 2C-F). Бессмертные злокачественные клетки ассоциированы с чрезвычайно низкой скоростью апоптоза10. Таким образом, уровни анти- и проапоптотических белков оценивали в контрольных клетках рака шейки матки, обработанных si-FAM83A. Вестерн-блоттинг-анализ показал, что подавленная экспрессия FAM83A увеличивает экспрессию Bax и расщепляет белки каспазы3 (проапоптотические белки), снижает экспрессию Bcl-2 (антиапоптотический белок) и увеличивает высвобождение Cytc (рис. 2C-E), что согласуется с наблюдением, что антиапоптотические белки регулируют апоптоз, блокируя митохондриальное высвобождение Cytc (рис. 2G-J)10. В совокупности эти данные свидетельствуют о том, что FAM83A играет важную роль в регуляции пролиферации и апоптоза клеток рака шейки матки.
Ранозаживляющие и пористые мембранные анализы для проверки биологической функции FAM83A при раке шейки матки
Для изучения влияния подавления FAM83A на миграцию и инвазию клеток рака шейки матки были проведены ранозаживляющие и мембранные анализы. Результаты показали, что клетки рака шейки матки с подавленной экспрессией FAM83A мигрировали (рис. 3A-D) и проникали (рис. 3E-H) менее эффективно, чем контрольные клетки.
Влияние на функцию митохондрий и сигнальный путь PI3K/AKT
Учитывая роль PI3K/AKT в индукции клеточного апоптоза, мы стремились определить, будет ли подавление экспрессии FAM83A ингибировать конститутивное фосфорилирование пути PI3K/Akt/mTOR при раке шейки матки. Подавление FAM83A значительно ингибировало ключевые уровни фосфорилированного белка в пути PI3K/Akt/mTOR, включая p-PI3K, p-Akt и p-mTOR в клетках c333a и HeLa (рис. 4A-D). Митохондрии – это органеллы, отвечающие за клеточный метаболизм и индукцию клеточного апоптоза. Накопленные данные указывают на то, что апоптоз раковых клеток включает митохондриальную дисфункцию через внутренний митохондриальный путь из-за повышенной проницаемости митохондрий и высвобождения проапоптотических молекул, таких как Cytc, в цитоплазму10. Путь PI3K/AKT может регулировать транслокацию Bax в митохондрии, индуцируя высвобождение Cytc в ответ на апоптотические стимулы. Таким образом, можно предположить, что онкогенные компоненты сигнального пути PI3K-AKT регулируют апоптоз клеток напрямую, влияя на поведение митохондрий. Таким образом, для определения митохондриального статуса был проведен анализ митохондриальной проницаемости (mPTP) живых клеток. Открытие мПТФ связано с апоптотической и некротической гибелью клеток11. В этом анализе зеленый флуоресцентный краситель (кальцеин AM) удерживается в цитоплазме и митохондриях при закрытии mPTP, в то время как краситель в цитоплазме гасится CoCl2, оставляя только интенсивную флуоресценцию в митохондриях. Результаты показали, что клеточные популяции с интенсивной зеленой флуоресценцией в митохондриях значительно уменьшились после подавления FAM83A, что указывает на открытый mPTP (рис. 4E, F). Далее мы изучили изменения мембранного потенциала митохондрий (ΔΨm) с помощью окрашивания JC-1. JC-1 образует агрегаты (красная флуоресценция) в живых клетках, содержащих интактные митохондрии с высоким мембранным потенциалом и мономера (зеленая флуоресценция) при низком ММР в апоптотических клетках. Подавление FAM83A постепенно снижало MMP (рис. 4G).
Анализ чувствительности к лекарственным препаратам на предмет пролиферации и инвазии
Химиотерапия на основе цисплатина (DDP) является стандартной стратегией лечения рака шейки матки. Тем не менее, химиорезистентность остается проблемой. Мы исследовали роль FAM83A в лечении рака шейки матки с помощью цисплатина. Контрольные, обработанные si-NC и si-FAM83A клетки HeLa обрабатывали 5 мкМ цисплатином12 или без него. Кроме того, было оценено влияние подавления FAM83A на жизнеспособность клеток. DDP индуцировал более выраженный ингибирующий эффект на пролиферацию клеток HeLa после подавления FAM83A , по сравнению только с лечением DDP (рис. 5A и рис. 5C). После обработки клеток рака шейки матки 5 мкМ цисплатином подавление FAM83A также ингибировало клеточную инвазию (рис. 5B и рис. 5D).
Анализ чувствительности к лекарственным препаратам для митохондриальной функции
Обрабатывая обработанные Si-NC и si-FAM83A клетки HeLa с 5 мкМ цисплатином (DDP) или без него, мы оценили мембранный потенциал митохондрий (MMP) и оценили митохондриальное повреждение, вызванное гибелью клеток, с помощью окрашивания JC-1. DDP индуцировал большее повреждение митохондрий, о чем свидетельствует снижение процентного содержания мономера JC-1 после нокдауна FAM83A по сравнению с лечением только DDP (рис. 6A и рис. 6D). После обработки клеток рака шейки матки цисплатином 5 мкМ нокдаун FAM83A также ингибировал образование колоний (Рисунок 6B и Рисунок 6E) и усиливал апоптоз клеток (Рисунок 6C и Рисунок 6F). Кроме того, нокдаун FAM83A в присутствии DDP заметно увеличивал экспрессию проапоптотических белков, Bax и расщепленной каспазы3, способствовал высвобождению Cytc и снижал экспрессию Bcl-2 (рис. 6G, H). Эти результаты показали, что нокдаун FAM83A сенсибилизирует клетки рака шейки матки к DDP посредством индукции апоптоза.
Рисунок 1: Гиперэкспрессия FAM83A в клетках рака шейки матки и корреляция с худшим прогнозом. (A) Анализ уровней мРНК FAM83A в образцах рака шейки матки. (B) Анализ экспрессии FAM83A по методу Каплана-Мейера для определения общей выживаемости у пациенток с раком шейки матки. (C) Относительные уровни мРНК FAM83A в клеточных линиях рака шейки матки HeLa и C33a и иммортализированной клеточной линии шейки матки человека End1/E6E7. Данные представлены в виде среднего ± УР для трех независимых экспериментов. *P < 0,05 по сравнению с ячейками End1/E6E7, использующими одностороннюю ANOVA. Сокращения: CESE = Плоскоклеточный рак шейки матки и эндоцервикальная аденокарцинома; ЧСС = отношение рисков. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Влияние подавления FAM83A на пролиферацию и апоптоз рака шейки матки. Клетки C33a и HeLa трансфицировали FAM83A-специфичными миРНК. (A,B) уровни мРНК FAM83A оценивали в клеточных линиях рака шейки матки с помощью qRT-PCR.Пролиферацию клеток в клетках (C) C33a и (D) HeLa определяли с помощью анализа EdU. (Д,Ж) Флуоресцентные изображения клеток C33a и Hela. (Г-Ж) Вестерн-блоттинг-анализ для изучения уровней белков, связанных с апоптозом, включая Cytc, Bcl-2, Bax, caspase3 и расщепленную каспазу-3; В качестве регулятора погрузки использовался GAPDH. Данные представлены в виде среднего ± УР для трех независимых экспериментов. *P < 0,05; **P < 0,01; **P < 0,001 по сравнению с контрольными клетками, использующими одностороннюю ANOVA. Сокращения: NC = отрицательный контроль; EdU = 5-этинил-2'-дезоксиуридин; CytC = цитохром C. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Влияние FAM83A на миграцию и инвазию клеток рака шейки матки in vitro. (A-D) Для оценки миграции клеток был проведен ранозаживляющий анализ. Изображения были сделаны через 0, 24 и 48 ч. Для изучения клеточной инвазии были проведены анализы Transwell (E-H). Масштабные линейки = 100 мкм (E,F). Данные представлены в виде среднего ± УР для трех независимых экспериментов. *P < 0,05; **P < 0,01; **P < 0,001 по сравнению с контрольными клетками, использующими одностороннюю ANOVA. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Влияние подавления FAM83A на путь PI3K/AKT/mTOR и функцию митохондрий. (А-Д) Вестерн-блоттинг-анализ для определения уровней белков из пути PI3K/AKT/mTOR в клетках C33a и HeLa после подавления FAM83A. (Э-Н) Анализ потенциала митохондриальной мембраны с помощью окрашивания JC-1. Агрегаты JC-1 были окрашены в красный цвет, а мономеры JC-1 — в зеленый, что указывает на более низкий MMP. (Я,Дж) Митохондриальную проницаемость оценивали с помощью набора mPTP и проточной цитометрии. Масштабные линейки = 50 мкм (E, F). Данные представлены в виде среднего ± УР для трех независимых экспериментов. *P < 0,05; **P < 0,01; P < 0,001 по сравнению с контрольными клетками, использующими одностороннюю ANOVA. Сокращения: ММР = мембранный потенциал митохондрий; mPTP = переходная пора митохондриальной проницаемости. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Влияние подавления FAM83A на ингибирование DDP на пролиферацию клеток и инвазию клеток рака шейки матки. Клетки HeLa трансфицировали si-NC или si-FAM83A и лечили с 5 мкМ DDP или без него. (А,В) Влияние DDP на пролиферацию клеток в контрольных, обработанных si-NC и si-FAM83 клетках HeLa. (Б,У) Влияние DDP на клеточную инвазию в контрольных, обработанных si-NC и si-FAM83 клетках HeLa. Данные представлены в виде среднего ± УР для трех независимых экспериментов. *P < 0,05; **P < 0,01; P < 0,001 по сравнению с контрольными клетками. &&P < 0,01; &&&P < 0,001 по сравнению с DDP с использованием одностороннего ANOVA. Сокращения: DDP = диаминдихлорплатина; EdU = 5-этинил-2'-дезоксиуридин; DAPI = 4',6-диамидино-2-фенилиндол. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Влияние подавления FAM83A на влияние DDP на апоптоз в клетках рака шейки матки. Клетки HeLa трансфицировали si-NC или si-FAM83A и лечили с 5 мкМ DDP или без него. (А,Г) ММР-анализ методом окрашивания JC-1. (Б,Д) Результаты клонирования пластин. (С,Ж) Проточная цитометрия, выявляющая скорость апоптоза в разных группах лечения. (Г,Н) Вестерн-блоттинг-анализ митохондриальных апоптотических белков, включая Bcl-2, Bax, Cytc и расщепленную каспазу-3. В качестве регулятора погрузки использовался GAPDH. Данные представлены в виде среднего ± УР для трех независимых экспериментов. *P < 0,05; **P < 0,01; P < 0,001 по сравнению с контрольными клетками. &P < 0,05; &&P < 0,01; &&&P < 0,001 по сравнению с DDP с использованием одностороннего ANOVA. Сокращения: DDP = диаминдихлорплатина; EdU = 5-этинил-2'-дезоксиуридин; DAPI = 4',6-диамидино-2-фенилиндол. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Таблица 1: миРНК, праймеры для кРТПЦР и установка реакции кРТ-ПЦР, использованные в данном исследовании. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Исследование генов-мишеней опухоли имеет первостепенное значение как для профилактики, так и для лечения рака шейки матки. Понимание конкретных генов, которые играют значительную роль в развитии и прогрессировании рака шейки матки, дает ценную информацию о лежащих в основе молекулярных механизмов заболевания. Кроме того, идентификация этих генов-мишеней может привести к разработке новых терапевтических стратегий и таргетной терапии. В этом исследовании мы описываем использование анализа набора данных TCGA для идентификации FAM83A в качестве гена-мишени и изучения его механистической роли при раке шейки матки. Мы наблюдаем достоверно высокую экспрессию FAM83A в клетках рака шейки матки, что связано с неблагоприятным прогнозом пациенток с раком шейки матки. Серия клеточных экспериментов выявила высокую экспрессию FAM83A в клетках рака шейки матки, которая играет решающую роль в регуляции пролиферации, миграции и инвазии клеток. Подавление экспрессии FAM83A ингибировало пролиферацию и миграцию и способствовало апоптозу в клетках рака шейки матки.
Построение клеточных линий рака шейки матки с нокдауном FAM83A является наиболее важным шагом в этом исследовании. МиРНК разрабатываются и валидируются в соответствии с последовательностями генов-мишеней для обеспечения их эффективности. Далее клеточные линии рака шейки матки трансфицируются с помощью миРНК. Успешность трансфекции плазмид имеет решающее значение для последующих экспериментов, которые требуют строгого контроля плотности клеток и плотности плазмид. Кроме того, эффективность трансфекции наблюдают под флуоресцентным микроскопом, чтобы обеспечить возможность проведения последующих экспериментов. Результаты вестерн-блоттинга и ОТ-ПЦР подтверждают, что ингибирование FAM83A подавляет путь PI3K/AKT и индуцирует митохондриальную дисфункцию. Мы предполагаем, что механизм включает ингибирование транслокации Bax из цитоплазмы в митохондрии с помощью PI3K/AKT, что способствует выживанию клеток13.
Достижения в лечении рака шейки матки позволили разработать новые молекулы-мишени. Идентификация нового онкогена может быть применена в терапевтических целях для улучшения клинического прогноза злокачественных опухолей шейки матки14,15. В этом исследовании мы успешно построили систему нокдауна FAM83A в клетках HeLa и C33a и проверили влияние нокдауна FAM83A на клетки рака шейки матки на клеточном уровне. Мы предполагаем, что ингибирование FAM83A может быть использовано для лечения рака шейки матки.
Однако это исследование имеет некоторые ограничения. Во-первых, в этом исследовании проводится только генетический скрининг по базе данных и отсутствуют патологические данные клинических пациентов. Во-вторых, это исследование подтвердило эффект только in vitro, и для проверки результатов понадобились дальнейшие исследования in vivo . Тем не менее, методы идентификации генов-мишеней, нокаута генов и клеточной валидации для идентификации таргетных терапевтических локусов, разработанные в этом исследовании, могут предоставить исследовательские идеи для открытия и валидации генов-мишеней для других заболеваний.
Таким образом, FAM83A был гиперэкспрессирован и коррелировал с худшим прогнозом при раке шейки матки. FAM83A регулирует пролиферацию, миграцию и инвазию клеток рака шейки матки. Подавление митохондриальной дисфункции и апоптоза, индуцированного FAM83A, сенсибилизируя клетки рака шейки матки к цисплатину. Эти результаты показали, что FAM83A является подходящей мишенью для исследований для лечения рака шейки матки. Это исследование способствовало прогрессу в адъювантной химиотерапии, направленной на улучшение прогноза пациенток с раком шейки матки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы сообщают об отсутствии конфликта интересов в данной работе.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Фондом Научно-технического бюро Цзинчжоу (No 2020HC06).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells and Medium Formulation | |||
| C33a | American Type Culture Collection | ||
| Hela | American Type Culture Collection | ||
| Modified medium | 10% fetal bovine serum and + antibiotics (100 U/mL penicillin and 100 U/mL streptomycin) | ||
| Antibody Information | |||
| AKT | 4691, Cell Signaling Technology Inc. | ‘1:1,000 | |
| Bcl2 | 26593-1-AP, Proteintech Group, Inc | ‘1:1,000 | |
| Caspase 3 | 19677-1-AP, Proteintech Group, Inc | ‘1:2,000 | |
| cleaved-caspase3 | abs132005; Absin Bioscience Inc. | ‘1:1,000 | |
| Cytc | 10993-1-AP; Proteintech Group | ‘1:1,000 | |
| GAPDH | 10494-1-AP, Proteintech Group, Inc. | ‘1:8,000 | |
| mTOR | 2983, Cell Signaling Technology Inc. | ‘1:1,000 | |
| PI3K | 4292, Cell Signaling Technology Inc | ‘1:1,000 | |
| p-AKT | 4060, Cell Signaling Technology Inc. | ‘1:1,000 | |
| p-mTOR (Ser2448) | #5536, Cell Signaling Technology Inc. | ‘1:1,000 | |
| p-PI3K p85 subunit | 17366, Cell Signaling Technology Inc. | ‘1:1,000 | |
| Secondary antibodies | GB23303, Servicebio | ‘1:2,000 | |
| Materials | |||
| 6-well plate | Corning, NPY | ||
| Alexa Fluor 555 | Beyotime | ||
| BCA Protein assay kit | Beyotime, China | P0011 | |
| ChemiDoc XRS Imager System | BioRad | ||
| Enhanced chemiluminescence detection kit | Servicebio, Inc.,China | cat. no. G2014 | |
| Fluorescence microscope | Olympus Corporation, Tokyo, Japan | ||
| Hifair II 1st Strand cDNA Synthesis Super Mix | 11123ES60, Yeasen Biotech o., Ltd., China | ||
| Inverted microscope | Olympus, Tokyo, Japan; | ||
| Millicell transwell inserts | Millipore,Bedford, MA, USA | ||
| Mitochondrial membrane potential assay kit | Beyotime, China | ||
| PMSF | ST506, Beyotime Biotech, Jiangsu, China | #ST506 | |
| Real-time quantitative PCR instrument | Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific. China. | ||
| RIPA Lysis Buffer | Beyotime Biotech, Jiangsu, China | ||
| TRIzol reagent | Invitrogen | 15596026 | |
| TRIzol reagent | Takara Bio Inc., Otsu, Japan | ||
| Software | |||
| Image-Pro | plus 6.0 |
References
- Arbyn, M., et al. Estimates of incidence and mortality of cervical cancer in 2018: a worldwide analysis. Lancet Global Health. 8 (2), e191-e203 (2020).
- Cohen, P. A., Jhingran, A., Oaknin, A., Denny, L.
- Cipriano, R., et al. Conserved oncogenic behavior of the fam83 family regulates mapk signaling in human cancer. Molecular Cancer Research. 12 (8), 1156-1165 (2014).
- Snijders, A. M., et al. FAM83 family oncogenes are broadly involved in human cancers: an integrative multi-omics approach. Molecular Oncology. 11 (2), 167-179 (2017).
- Gan, J., Meng, Q., Li, Y. Corrigendum: systematic analysis of expression profiles and prognostic significance for fam83 family in non-small-cell lung cancer. Frontiers In Molecular Biosciences. 8, 653454 (2021).
- Jin, Y., et al. Comprehensive analysis of the expression, prognostic significance, and function of fam83 family members in breast cancer. World Journal of Surgical Oncology. 20 (1), 172 (2022).
- Lin, S., et al. Identification of prognostic biomarkers among fam83 family genes in human ovarian cancer through bioinformatic analysis and experimental verification. Cancer Management and Research. 13, 8611-8627 (2021).
- Ma, Z., et al. Identification of prognostic and therapeutic biomarkers among fam83 family members for pancreatic ductal adenocarcinoma. Disease Markers. 2021, 6682697 (2021).
- Xu, J., et al. Genome-wide profiling of cervical RNA-binding proteins identifies human papillomavirus regulation of rnaseh2a expression by viral e7 and e2f1. mBio. 10 (1), e02687-e02618 (2019).
- Wong, R. S. Apoptosis in cancer: from pathogenesis to treatment. Journal Of Experimental & Clinical Cancer Research. 30 (1), 87 (2011).
- Bonora, M., Pinton, P. The mitochondrial permeability transition pore and cancer: molecular mechanisms involved in cell death. Frontiers In Oncology. 4, 302 (2014).
- Wang, N., Hou, M. S., Zhan, Y., Shen, X. B., Xue, H. Y. MALAT1 promotes cisplatin resistance in cervical cancer by activating the pi3k/akt pathway. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 22 (22), 7653-7659 (2018).
- Tsuruta, F., Masuyama, N., Gotoh, Y. The phosphatidylinositol 3-kinase (pi3k)-akt pathway suppresses bax translocation to mitochondria. Journal Of Biological Chemistry. 277 (16), 14040-14047 (2002).
- Guerra, F., Arbini, A. A., Moro, L.
- Pustylnikov, S., Costabile, F., Beghi, S., Facciabene, A. Targeting mitochondria in cancer: current concepts and immunotherapy approaches. Translational Research. 202, 35-51 (2018).
