Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Kryopræservering og bioenergetisk evaluering af humane mononukleære celler i perifert blod

Published: October 20, 2023 doi: 10.3791/65730
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Biomedical Research Center, Institute of Nutritional Sciences, Justus-Liebig-University of Giessen

Summary

Isolerede mononukleære celler i perifert blod kan anvendes til analyse af immunfunktioner og lidelser, stofskiftesygdomme eller mitokondriefunktioner. I dette arbejde beskriver vi en standardiseret metode til fremstilling af PBMC'er fra fuldblod og den efterfølgende kryopræservering. Kryopræservering gør denne tid og dette sted uafhængigt.

Abstract

De fysiologiske funktioner i eukaryote celler er afhængige af energi, der hovedsageligt leveres af mitokondrier. Mitokondriel dysfunktion er forbundet med metaboliske sygdomme og aldring. Oxidativ fosforylering spiller en afgørende rolle, da det er afgørende for opretholdelsen af energisk homeostase. PBMC'er er blevet identificeret som en minimalt invasiv prøve til måling af mitokondriefunktion og har vist sig at afspejle sygdomstilstande. Imidlertid kan måling af mitokondriel bioenergetisk funktion begrænses af flere faktorer i humane prøver. Begrænsninger er mængden af udtagne prøver, prøvetagningstiden, som ofte er spredt over flere dage, og steder. Kryopræservering af de indsamlede prøver kan sikre ensartet indsamling og måling af prøver. Det bør sikres, at de målte parametre er sammenlignelige mellem kryopræserverede og frisklavede celler. Her beskriver vi metoder til isolering og kryokonservering af PBMC'er fra humane blodprøver for at analysere mitokondriernes bioenergetiske funktion i disse celler. PBMC kryopræserveret i henhold til protokollen beskrevet her viser kun mindre forskelle i celleantal og levedygtighed, adenosintrifosfatniveauer og målt respiratorisk kædeaktivitet sammenlignet med nyhøstede celler. Der kræves kun 8-24 ml humant blod til de beskrevne præparater, hvilket gør det muligt at indsamle prøver under kliniske undersøgelser multicentralt og bestemme deres bioenergetik på stedet.

Introduction

Humane mononukleære celler i perifert blod (PBMC'er) anvendes til forskellige anvendelser inden for mange videnskabelige områder, herunder undersøgelse af immunologiske og bioenergetiske spørgsmål, såsom dem, der er relateret til aldringsprocesser eller degenerative sygdomme 1,2. PBMC'er er heterogene i sammensætning og består af lymfocytter (B-celler, T-celler og NK-celler), monocytter og dendritiske celler. Cellerne viser undertiden store individuelle forskelle og variationer inden for et emne, så standardiserede procedurer til håndtering af disse celler er påkrævet. Vigtige parametre som isolationens levedygtighed og renhed er de grundlæggende krav til dens håndtering og påvirkes desuden af miljøfaktorer som indsamlingstidspunktet, melatoninniveauet, om emnet faster og andre 3,4.

Baseret på undersøgelser af PBMC'ers bioenergetik beskriver vi her en metode til isolering, kryopræservering og dyrkning af PBMC'er, der også er egnet til andre metoder. Mens muskelbiopsi betragtes som guldstandarden for mitokondriel energimetabolisme5, er undersøgelsen af blodlegemer en hurtig, minimalt invasiv procedure. Derudover tyder flere og flere undersøgelser på, at ændringerne i mitokondriefunktionen i aldring og Alzheimers sygdom (AD) forekommer ikke kun i hjernen, men også i periferien 6,7,8,9,10. Metoden tillader også undersøgelser af andre tilstande og sygdomme, herunder diabetes mellitus og fedme 11,12,13. Genekspressionsmønstre hos patienter med multipel sklerose kan analyseres, eller immunfunktion og påvirkninger på det generelt 14,15,16.

PBMC'er er generelt afhængige af oxidativ phosphorylering (OXPHOS) for at generere adenosintrifosfat (ATP)17,18. Derfor dækker PBMC'er en bred vifte af applikationer som surrogater. I tidligere rapporter er PBMC'ernes energimetabolisme blevet brugt til at behandle organdysfunktioner, såsom ved tidlig hjertesvigt19, septisk chok20 eller kønsrelaterede forskelle4 i mitokondriefunktion. En generaliseret metode til kryopræservering, isolering og dyrkning af PBMC'er ville have fordele ved sammenligneligheden af resultater opnået på forskellige institutter. Der er stor variation i protokollerne for hvert trin21,22, målet med denne metode er at give en retningslinje for bioenergetiske målinger i PBMC'er.

I denne artikel beskriver vi en metode til måling af bioenergetiske parametre i PBMC'er. Vi forklarer metoderne til isolering, kryokonservering og måling af bioenergetik af PBMC'er fra humant blod. Denne metode kan bruges til at bestemme bioenergetiske parametre hos patienter og evaluere dem i en klinisk sammenhæng. For at anvende disse målinger har forskere brug for adgang til en patientpopulation, hvorfra friske blodprøver kan fås.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle protokoller beskrevet i dette manuskript for tapning, isolering og analyse af blod er blevet gennemgået og godkendt af Institutional Review Board ved universitetet i Giessen, Tyskland. Patienternes samtykke til at inkludere deres prøver i undersøgelsen blev opnået. Alle trin til isolering og cellekultur udføres under et biologisk sikkerhedsskab.

1. Venipunktur

  1. Forbered alt nødvendigt udstyr til blodindsamling, herunder desinfektionsspray, steril vatpind, blodopsamlingskanyle med 80 mm rør og multiadapter, tourniquet / blodtryksmanchet, Monovette 9 ml lithium-heparin.
    BEMÆRK: EDTA som antikoagulant er også effektiv.
  2. Opsaml blod fra den mest passende armvene, normalt vena mediana cubiti eller vena cephalica.
  3. Påfør en tourniquet / blodtryksmanchet med let tryk, omkring 80 mm / Hg.
  4. Desinficer handsker og punkteringssted med desinfektionsspray indeholdende alkohol. Lad det desinficerede punkteringssted lufttørre.
  5. Venerne stikker ud på grund af trykket fra trykmanchetten. Indsæt nålen (kanyle diameter (ydre) 21G / 0,8 mm, længde 19 mm) i en 15 ° -20 ° vinkel på venen forsøger at undgå traumer og minimere sondering.
  6. Tag blod med passende system, 4 rør indeholdende 9 ml blod (mere end 7-8 rør er problematiske for en eksperimentator at isolere ordentligt).
  7. Efter blodindsamling placeres opsamlingsrørene i mørke i 5 minutter for at sikre ensartet antikoagulation.

2. PBMC-isolering

  1. Forbered alle nødvendige løsninger som beskrevet nedenfor.
  2. Bring Dulbeccos afbalancerede saltopløsning (DPBS; koncentration 1x) og lymfocytisolationsmedium (1,077 g/ml) til stuetemperatur (20-25 °C).
  3. Forbered føtalt bovin serum (FBS) ved stuetemperatur og hold et sterilt 50 ml konisk rør med FBS på is. For hver blodprøve kræves 2 ml FBS.
  4. Opbevar frysebeholderen ved 4 °C og forkøle kryotuberne ved 4 °C.
  5. Varmt cellekulturmedium til 37 °C, mediet består af RPMI 1640 med 50 ml FBS og penicillin 50 E / ml streptomycin 50 E / ml. Denne opløsning kan opbevares ved 3 °C i op til 2 måneder.
  6. Tilsæt 8 ml DPBS i sterile 50 ml koniske rør. Tilsæt 15 ml lymfocytisolationsmedium i sterilt 50 ml konisk rør (Medium er lysfølsomt, tilsæt det, før isolationen påbegyndes).
  7. Tilsæt 8 ml blod til 8 ml DPBS, og bland forsigtigt yderligere med en 3 ml plast Pasteur-pipette.
  8. Lag blodet/DPBS-blandingen forsigtigt med en 3 ml Pasteur-pipette af plast oven på lymfocytisolationsmediet. For at påføre det første lag på mediet skal du vippe røret 20 ° -30 °, hvilket vil resultere i mindre penetration af blod-PBS-blandingen i mellemlaget.
  9. Lag blod-PBS-blandingen forsigtigt over rørets sidevæg på lymfocytisoleringsmediet. Brug en jævn hastighed for at holde blodgennemstrømningen konstant.
  10. I det næste trin bringes røret langsomt i opretstående stilling, det resterende blod lægges omhyggeligt over rørets sidevæg på blodlaget.
  11. Centrifuger i 10 min ved 1000 x g ved stuetemperatur i en centrifuge med en svingende skovlrotor med bremserne slukket. Efter centrifugering adskilles blod/PBMC-blandingen i fire lag. Det øverste lag består af plasma og blodplader, det andet lag er PBMC-laget efterfulgt af et lymfocytisoleringsmediumlag og endelig erytrocytter og granulocytter i bundlaget. De forskellige lag er vist i figur 1.
  12. Fjern 2/3rd af plasmalaget med en plastik Pasteur-pipette.
  13. Brug en 1 ml pipette til at samle PBMC'erne på lymfocytisolationsmellemlaget, og pas på ikke at få noget medium i prøven.
  14. Placer spidsen 1 mm over PBMC-laget. PBMC-laget bør ikke punkteres, ellers vil mediet strømme over cellerne. Suget af pipetten trækker PBMC'erne til dette punkt, så de kan opsamles flere gange på dette tidspunkt.
    BEMÆRK: For at maksimere antallet af indsamlede PBMC'er skal du ved afslutningen af proceduren søge efter resten på overfladen og forsøge at indsamle cellerne der også. For at stabilisere proceduren kan røret placeres på en overflade.
  15. Overfør PBMC'erne trin for trin til et nyt 50 ml rør, indtil laget er helt høstet. Tilsæt DPBS op til 25 ml mærket, vask lymfocytisolationsmedium og andre rester væk.
  16. Centrifuger i 10 min ved 100 x g ved stuetemperatur med bremserne slået til. Supernatanten fjernes med en vakuumpumpe eller lignende, og pas på ikke at beskadige cellepellet.
  17. Resuspender pellet i 1 ml DPBS og tilføj DPBS til 25 ml mærket. Gentag vasken igen, og opslæm derefter igen i medium, der passer til de næste trin.

Figure 1
Figur 1: Skematisk gengivelse af en densitetsgradientcentrifugering for at illustrere de forskellige lag. Klik her for at se en større version af denne figur.

3. Kryopræservering

  1. Afkøl en frysebeholder til 4 °C, afkøl FBS på is.
  2. Resuspender PBMC-pellet i 1 ml FBS med en 1 ml pipette, FBS skal være ved stuetemperatur.
  3. Bland DMSO med forkølet FBS på is 1:5, endelig koncentration 20% DMSO, og sæt derefter FBS: DMSO-blandingen tilbage på is. Forbered altid opløsningen frisk.
  4. Overfør PBMC-cellesuspensionen i FBS til velmærkede 2 ml kryotuber. Brug ét kryorør pr. opsamlingsrør. Juster antallet af celler mellem 1 x 107 og 5 x 107 pr. ml. Brug en automatiseret celletæller til at bestemme celleantal og levedygtighed.
  5. Tilsæt 1 ml FBS: DMSO-blanding dråbevis med en 1 ml pipette, ca. 1-2 dråber pr. S, i røret. Den dråbevise tilsætning fører til kontinuerlig og ensartet blanding.
  6. Anbring rør i den forkølede frysebeholder. Frysebeholderen anbringes i fryser til -80 °C i 24 timer. Frysebeholderen giver en kontrolleret afkøling på -1 °C pr. min.
  7. Tag rørene ud af fryseren -80 °C. Efter fjernelse fra fryseren opbevares rørene i gasfasen af flydende nitrogen. Dokumentér stedet for hver prøve.

4. Optøning

  1. Forbered alle nødvendige opløsninger: Cellekulturmedium RPMI 1640 med 50 ml FBS og penicillin 50 E / ml, streptomycin 50 E / ml. Denne opløsning kan opbevares ved 3 °C i op til 2 måneder.
  2. Forvarm cellekultur medium til 37 °C. Tilsæt 3 ml forvarmt cellekulturmedium i sterile 50 ml koniske rør.
  3. Fjern prøven fra flydende nitrogentank. Optø prøver i vandbad ved 37 °C i ca. 3,5 min, tag dem ud af vandbadet, så snart den sidste is smelter. Et stykke is på størrelse med et knappenålshoved skal stadig være synligt i røret.
    BEMÆRK: DMSO er skadeligt for PBMCs arbejde så hurtigt som muligt.
  4. Fjern cell:FBS:DMSO-blandingen med en 1 ml pipette fra kryorøret. PBMC-prøverne blandes med cellekulturmediet i de fremstillede 50 ml rør. Vask glassene ud med 5 ml dyrkningsmedium i tre trin på 2 ml, 2 ml og 1 ml.
  5. Overfør mediet til rørene. Dette udføres for at overføre mulige cellerester. Centrifuger i 10 min ved 100 x g ved stuetemperatur.
  6. Supernatanten kasseres, og der tilsættes 1 ml medium, der er egnet til planlagt anvendelse. Cellerne er klar til efterfølgende forsøg.
    BEMÆRK: Men med funktionelle tests på friske eller frosne celler anbefales en hvileperiode i en inkubator (typisk natten over) ofte efter lymfocytisolering medium baseret isolering eller celleoptøning.

5. Cellekultur

  1. Efter isolering eller optøning af kulturceller natten over ved 37 °C i 5% CO2/95% luft.
  2. Resuspender cellerne i 1 ml RPMI-medium suppleret med 10% FBS, penicilin 50 E/ml, streptomycin 50 E/ml. Til videre brug er der mange muligheder, behandle celler efter behov til analyserne.
  3. Til generel opbevaring anvendes sterile 6 brøndcellekulturplader og høstceller efter hvileperiode. Overfør 1 ml cellesuspension med en 1 ml pipette til et hul, og tilsæt 4 ml cellekulturmedium.
    BEMÆRK: Mængden af isolerede PBMC'er varierer meget mellem individer, en brønd med 5 ml cellekulturmedium er tilstrækkelig for hver 8 ml isoleret blod. Ved isolering af PBMC'er fra buffy coats er mængden af PBMC'er imidlertid signifikant højere end i fuldblodsprøver, og cellerne bør derfor opdeles i flere huller.
  4. Cellerne lader hvile 24 timer i en befugtet atmosfære suppleret med 5% CO2 ved 37 °C. Denne inkubation udføres for frisk isolerede celler såvel som for kryopræserverede celler.

6. ATP-analyse

  1. Resuspendere optøede PBMC'er i 1 ml RPMI-medium suppleret med 10% FBS, penicillin 50 E/ml, streptomycin 50 E/ml.
  2. Tag en prøve og bestem celleantallet, og udfør derefter en levende død diskrimination med trypanblå. Der udtages 10 μL fra de resuspenderede celler og blandes med 90 μL cellekulturmedium. Tag derefter 10 μL og bland med 10 μL trypanblåt. Placer cellerne enten i et celletællingskammer eller en automatisk celletæller og bestem antallet af levende / døde celler.
  3. Plade 100 μL celler med en densitet på 1 x 105 celler/100 μL pr. brønd i en 96-brønds hvid polystyrenplade.
  4. Lad cellerne hvile i 24 timer i en befugtet atmosfære suppleret med 5% CO2 ved 37 °C.
  5. Bestem ATP-koncentrationerne med et ATP-assay.
    1. Brug lysudsendelse, der opstår, når ATP kombineres med luciferin. Det udsendte lys kan evalueres med en pladelæser. Fjern pladerne, så inkubatoren kan køle ned til stuetemperatur i 15 min. Lys cellerne og lad dem stå i 5 min. Anvend derefter overvågningsreagens på cellerne og mål i henhold til producentens anvisninger. En intern standard bruges til at bestemme ATP-niveauet.

7. Respirometri i høj opløsning

  1. Tænd for oxygrafen med høj opløsning, og lad den varme op i 30 minutter.
  2. Behandl celler i henhold til en protokol beskrevet i figur 1. Forbered alle nødvendige lagre som i tabel 1.
  3. Der pipetteres 2,1 ml respirationsbuffer (tabel 1) ind i begge oxygrafkamre med høj opløsning, og bufferen omrøres kontinuerligt ved hjælp af en magnetisk omrøringsstang, der findes i kamrene (750 omdr./min.) ved 37 °C i 30 minutter, indtil der opnås et stabilt iltfluxsignal fra den polarografiske iltføler.
    BEMÆRK: I oxygrafens kamre måles iltforbruget i realtid (flux) og kammerets iltmætning ved hjælp af polarografiske iltelektroder. Baggrundskalibrering skal udføres for at undgå baggrundsstøj og for at sikre pålidelige resultater.
  4. Udfør en luftkalibrering af den polarografiske iltføler i henhold til producentens protokoller23.
  5. Resuspender isolerede PBMC'er i 1 ml mitokondrierespirationsmedium (MIR05, sammensætningen er vist i tabel 1) og fortyndes til 8 x 106 celler/ml.
  6. Efter luftkalibrering aspireres respirationsmediet fra oxygrafkammeret, og der tilsættes 2,1 ml cellesuspension i hvert camber i respirometeret. Hvis det er nødvendigt under målingen at reoxygenere kamrene (se Åbn i punkt h i figur 2), bør kamrenes iltmætning ikke falde til under 100 μM.
  7. Luk kamrene ved at indsætte propperne, kamrene er designet til at holde 2,0 ml volumen. Opsug den nye cellesuspension.
  8. Cellesuspensionen blandes kontinuerligt ved 37 °C med en magnetomrører (750 omdr./min.) i kammeret. Vent i ca. 20 minutter, indtil der opnås et stabilt signal. Bestem endogen respiration ((a) i figur 2).
  9. For at bestemme de forskellige komplekse aktiviteter i respirationskæden injiceres substraterne og hæmmerne til mitokondriel respiration gennem proppernes titaninjektionsporte. Brug følgende slutkoncentration i kammeret.
  10. For at forstyrre cellemembraner tilsættes 5 μL 8,1 mM digitonin gennem titaniumindsprøjtningsporten på kammerproppen for at fjerne naive substrater (b) i figur 2 , mens mitokondriemembranerne forbliver intakte.
  11. Der tilsættes substrater 2 M glutamat og 800 mM malat gennem indsprøjtningsporten på kammerproppen, og optag respirationen, indtil der opnås et stabilt signal. Signalet stabiliseres efter 2-4 min.
    BEMÆRK: Det er også muligt at bruge yderligere substrater som pyruvat.
  12. Der tilsættes 8 μL 500 mM adenosindiphosphat (ADP) gennem indsprøjtningsporten på kammerproppen, og respirationen registreres, indtil der opnås et stabilt signal. Signalet stabiliseres efter 2-4 min (d) i figur 2.
  13. Der tilsættes 20 μL 1 M succinat gennem indsprøjtningsporten på kammerproppen, og optag respirationen, indtil der opnås et stabilt signal. Signalet stabiliseres efter 2-4 min (e) i figur 2.
  14. 1 M carbonylcyanid p-trifluoromethoxyphenylhydrazon (FCCP) titreres trinvis ved 0,5 μL indtil det punkt, hvor der ikke forekommer yderligere stigning. Vent 2-4 minutter, indtil signalet stabiliserer sig (f) i figur 2. Når der ikke er nogen yderligere stigning i åndedrættet, fortsæt med næste trin.
    FORSIGTIG: Vær forsigtig, når du håndterer FCCP, da det har sundhedsrisici for mennesker.
  15. Der tilsættes 5 μL 0,1 mM rotenon gennem indsprøjtningsporten på kammerproppen, og respirationen registreres, indtil der opnås et stabilt signal. Signalet stabiliseres efter 2-4 min (g) i figur 2.
    FORSIGTIG: Vær forsigtig, når du håndterer rotenon, da det har sundhedsrisici for mennesker.
  16. Der tilsættes 1 μL 4 mg/ml oligomycin gennem indsprøjtningsporten på kammerproppen, og respirationen registreres, indtil der opnås et stabilt signal. Signalet stabiliseres efter 2-4 min (h) i figur 2.
    FORSIGTIG: Vær forsigtig, når du håndterer oligomycin, da det er en gift, der udgør sundhedsrisici for mennesker.
  17. Der tilsættes 1 μL 5 mM antimycin A gennem indsprøjtningsporten på kammerproppen, og respirationen registreres, indtil der opnås et stabilt signal. Signalet stabiliseres efter 2-4 min (i) i figur 2.
    FORSIGTIG: Vær forsigtig, når du håndterer antimycin A, da det er en gift, der udgør sundhedsrisici for mennesker.
  18. Når du evaluerer kørslen for at udelukke iltforbruget af enzymer, der ikke er involveret i oxidativ phosphorylering, trækkes antimycin A-værdierne fra alle andre målte værdier.
  19. Der tilsættes 200 mM N,N,N',N'-tetramethyl-p-phenylendiamindihydrochlorid (TMPD; elektrondonor) og 800 mM ascorbat for at holde TMPD i reduceret tilstand. Injicer substraterne gennem indsprøjtningsporten på kammerproppen, og registrer åndedrættet, indtil der opnås et stabilt signal. Signalet stabiliseres efter 2-4 min (j) i figur 2.
  20. TMPD er underlagt autooxidation, så træk det resulterende iltforbrug fra den målte værdi ved kompleks IV.
  21. Der tilsættes NaN3 ≥ 100 mM gennem indsprøjtningsporten på kammerproppen, og optag respirationen, indtil der opnås et stabilt signal. Signalet stabiliseres efter 2-4 min for at hæmme kompleks IV-aktivitet, kun TMPD-autooxidation er tilbage.
    FORSIGTIG: Vær forsigtig, når du håndterer natriumazid, da det er en gift, der udgør sundhedsrisici for mennesker.

Figure 2
Figur 2: Skematisk forløb afO2-fluxen . Det skematiske forløb af iltfluxen vises. Kurven er opdelt i de forskellige faser efter tilsætning af inhibitorer og substrater fra a-k. A: endogen respiration; b: permeabiliserede celler; c: ukoblet kompleks I åndedræt; d: koblet kompleks I åndedræt; e: OXPHOS ; f: maksimal ukoblet aktivitet af CI og CII g: ukoblet respiration af kompleks II h: lækage åndedræt; i: resterende åndedræt; j: CIV (U) ukoblet respiration og autooxidation af TMPD; k: autooxidation af TMPD. Klik her for at se en større version af denne figur.

8. Citratsyntase aktivitet

  1. Mål citratsyntaseaktivitet som en separat parameter, og brug den til at normalisere målingerne af oxygrafen med høj opløsning.
  2. Resuspender isoleret PBMC i 1 ml mitokondrierespirationsmedium (MIR05) og fortynd til 8 x 106 celler/ml.
  3. Der fryses i flydende nitrogen og opbevares ved -80 °C, indtil forsøgene er udført, eller til måling af friske celler.
  4. Forbered alle nødvendige opløsninger: 0,1 M triethanolamin HCl buffer pH 8,0, 1,0 M Tris-HCl buffer pH = 8,1, 10% Triton X-100, 10 mM oxalacetat i 0,1 M triethanolamin HCl buffer pH 8,0, 1,01 mM DTNB i 1,0 M Tris-HCl buffer pH = 8,1, acetyl-CoA 12,2 mM i dobbeltdestilleret H2O.
  5. Der fremstilles reaktionssubstrat (tabel 1) indeholdende 5,5'-dithio-bis-(2-nitrobezosyre) (DTNB; 0,1 mM), acetylcoenzym A (0,31 mM), EDTA (50 μM), triethanolamin HCl (5 mM) og Tris HCl (0,1 M).
  6. Startreagens (tabel 1) fremstilles med 0,5 mM oxaloacetat opløst i dobbeltdestilleretH2O.
  7. Optø prøverne på is, da citratsyntase er ustabil, hvis den optøes for hurtigt.
  8. Der tilsættes 40 μL af prøverne til en plade med 96 brønde på is, inden der tilsættes 110 μL reaktionsmedium med en multipipette.
  9. Varmt reaktionsmedium og prøve i en inkubator til 30 °C i 5 minutter. Varmt startreagens i vandbad til 30 °C i 5 min.
  10. Der tilsættes 50 μL af startreagenset med en multipipette til hvert hul. Absorbansen måles ved 30 °C ved en bølgelængde på 412 nm i 20 min via pladelæser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Celle levedygtighed og antal
For at opnå vellykket isolering og kryopræservering bør celletal og levedygtighed være så høj som muligt. Før og efter kryopræservering tælles cellerne, og deres levedygtighed bestemmes for at sikre cellernes sundhed og kvalitet. Figur 3 er en repræsentativ illustration af PBMC'er før og efter kryopræservering, celletal og levedygtighed adskiller sig næppe. Dette indikerer vellykket isolering og bevarelse af PBMC'er.

Figure 3
Figur 3: Kryopræserverings effekt på celleantal og levedygtighed. Testgrupperne opdeles i kontrolgruppen med frisk isolerede PBMC'er og PBMC'er efter 1 måneds kryopræservering. Tællingen af cellerne og bestemmelsen af deres levedygtighed blev udført med en automatiseret celletæller. Trypanblå blev brugt til at bestemme levedygtigheden. Hver måling blev udført som en tredobbelt af middelværdien blev beregnet ud fra resultaterne af de enkelte målinger. (A) Bestemmelse af PBMC'ers cellelevedygtighed efter frisk isolation og efter 1 måneds kryopræservering. Værdier er angivet som gennemsnit ± SEM. Signifikanser blev bestemt med en parret t-test. (B) Bestemmelse af celleantal PBMC'er efter frisk isolation og efter 1 måneds kryopræservering. Værdier er angivet som middel ± SEM. Signifikanser blev bestemt med en parret t-test. Den samme form og farve viser den samme prøve før og efter en måneds kryopræservering. Klik her for at se en større version af denne figur.

ATP repræsenterer den vigtigste energikilde for eukaryote celler. ATP bestemmes via et luminescensanalysesystem. Hvis kryopræservering er vellykket, bør ATP mellem nyligt isolerede celler og kryopræserverede celler ikke være forskellige. Figur 4 er en repræsentativ illustration af PBMC'er før og efter kryopræservering; ATP-niveauer er ens. Dette indikerer vellykket isolering og bevarelse af PBMC'er.

Figure 4
Figur 4: Sammenligning af ATP-koncentration af forskellige kryopræserveringsperioder. ATP-koncentration (μM / 100.000 celler) i PBMC'er. Testgrupperne opdeles i kontrolgruppen med frisk isolerede PBMC'er og PBMC'er efter 1 måneds kryopræservering. Prøverne blev indsamlet samtidig og derefter enten kryoopbevaret eller målt efter isolation. En parret t-test blev udført for at teste signifikante forskelle; Resultatet viste, at forskellene ikke var signifikante. Værdierne er angivet som middelværdier ± SEM (N = 13). Den samme form og farve viser den samme prøve før og efter en måneds kryopræservering. Klik her for at se en større version af denne figur.

Citratsyntase (CS) er et nøgleenzym i citratcyklussen, der ligger i mitokondrier. Derfor repræsenterer CS-aktivitet en robust markør for mitokondriemasse. CS-aktivitet bestemmes på grundlag af konvertering fra DTNB til TNB. Figur 5 viser, at CS-værdierne før og efter kryopræservering ikke adskiller sig i PBMC'er. Igen indikerer dette en vellykket isolering og bevarelse af PBMC'er.

Figure 5
Figur 5: Effekt af kryopræservering på citratsyntaseaktivitet. Citratsyntaseaktivitet i PBMC'er efter 1 måneds kryopræservering sammenlignet med den nyligt målte kontrol. Prøverne blev indsamlet samtidig og derefter enten kryoopbevaret eller målt efter isolation. Værdier udtrykkes som gennemsnit ± SEM (N = 8). Signifikanser blev bestemt med en parret t-test. Den samme form og farve viser den samme prøve før og efter en måneds kryopræservering. Klik her for at se en større version af denne figur.

PBMC'ernes bioenergetiske profiler kan bestemmes ved hjælp af polarografiske iltsensorer, f.eks. i oxygraf med høj opløsning. Cellulært iltforbrug måles i et lukket kammersystem med meget høj opløsning og følsomhed i biologiske prøver, fx intakte og permeabiliserede celler, væv eller isolerede mitokondrier. Højopløsningsoxygrafenheden er udstyret med to kamre og bruger polarografiske iltsensorer til at måle iltkoncentration og beregne iltforbrug i hvert kammer. Oxygenforbrugshastigheder beregnes ved hjælp af software og udtrykkes som picomoler pr. S pr. Antal celler24. Inden for hvert oxygrafkammer måler polarografiske iltelektroder iltkoncentrationen og beregner iltforbruget (flux) i hvert kammer. Iltforbrug og koncentration i kammeret vises i realtid (figur 6). Med tilsætning af specifikke hæmmere og substrater målrettes de enkelte komplekser i respirationskæden for at måle deres aktivitet. Efter analysen analyseres dataene med softwaren. Fluxværdierne blev normaliseret for at citere syntaseaktivitet. Oxygrafien gav lavere værdier for kompleks IV på grund af delvist oxideret TMPD. I en række tests fandt vi, at TMPD afveg med en faktor på 1,8. Denne faktor blev brugt til at normalisere værdierne i figur 6.

Figure 6
Figur 6: Mitokondriel respiration i PBMCS efter kryopræservering sammenlignet med frisk målt kontrol. En opløsning indeholdende 1,6 x 107 celler/ml blev brugt til at måle iltforbruget af celler i en oxygraf. Respiration blev målt 1 måned efter kryopræservering. For at undersøge aktiviteten af komplekserne i respirationskæden blev der tilsat flere hæmmere, substrater og afkoblinger. Tilsætningen af et stof blev udført som følger: CI (L) = lækagerespiration af kompleks I; CI (P) = koblet respiration af kompleks I; CI&CII(P) = fysiologisk åndedræt; CI&CII(U) = ukoblet respiration, der viser maksimal aktivitet af komplekserne I og II; CII(U) = ukoblet respiration af kompleks II; CII(L) = lækagerespiration af kompleks II; CIV(U) = ukoblet åndedræt. En faktor på 1,8 blev brugt til at normalisere værdierne. Denne faktor blev bestemt eksperimentelt for den nuværende opsætning. Data vises som middel ± SEM (N = 10). Statistisk signifikans blev testet via Student's t-test (*p < 0,05). Klik her for at se en større version af denne figur.

Endogen respiration bestemmes ved at tilsætte 2 ml cellesuspension i kamrene. Fluxen med endogene substrater måles. For yderligere at skelne mellem komplekser tilføjes digitonin. Digitonin permeabiliserer plasmamembranen, mens mitokondriemembranerne forbliver intakte. For at kompensere for protonlækage gennem membranen tilsættes substrater glutamat og malat. Respirationshastighederne på dette tidspunkt illustrerer kompleks I-drevet respiration i fravær af koblet respiration. For at detektere den oxidative phosphorylering (OXPHOS) kapacitet af kompleks I ADP tilsættes, er respirationen nu i koblet tilstand. Den koblede respiration af CI og CII opnås ved tilsætning af succinat. Nu fungerer åndedrætskæden med maksimal kapacitet. Ved titrering af carbonylcyanid p-trifluoromethoxyphenylhydrazon (FCCP) er elektrontransportkæden (ETC) ukoblet. Med denne afkobling bestemmes den maksimale afkoblede aktivitet af CI og CII. For at skelne mellem CI og CII tilsættes den komplekse I-specifikke hæmmer rotenon. Ved tilsætning af oligomycin bestemmes lækagerespirationen af CII. For at udelukke iltforbrug fra kilder, der ikke er involveret i oxidativ phosphorylering, tilsættes antibiotikumet antimycin A, og dette resterende iltforbrug trækkes fra alle aflæsninger opnået i eksperimentet. Elektrondonoren N,N,N',N'-tetramethyl-p-phenylendiamindihydrochlorid (TMPD; 0,5 mM) er et kunstigt substrat for CIV. For at holde TMPD i reduceret tilstand anvendes ascorbat. Ascorbat og TMPD anvendes til at måle CIV's maksimale ukoblede respiration. Da TMPD udsættes for autooxidation, tilsættesNaN3 efter stabilisering af fluxen for at hæmme CIV. Det resterende iltforbrug trækkes fra de rå CIV-værdier. Figur 2 viser en typisk målekurve.

De viste parametre viser teknikkens succes. Teknikken blev udviklet til at udføre bioenergetiske målinger efter kryopræservering. De viste resultater sammenligner cellerne før og efter målingen, da der ikke kan ses statistisk signifikante forskelle, kan det antages, at denne konserveringsmetode er egnet til opbevaring over 1 måned.

Tabel 1: Opløsninger, buffere og forbrugsvarer. Klik her for at downloade denne tabel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokol giver mulighed for at isolere og kryobevare mononukleære celler i perifert blod (PBMC'er) fra humant blod på en måde, der er egnet til bioenergetiske analyser. Den beskrevne metode giver mulighed for at isolere PBMC'er forsigtigt og i store mængder med høj levedygtighed og tilstrækkelige celler til bioenergetiske målinger. Det har den ulempe, at selv med minimale afbrydelser forekommer lange isolationer, men efterfølgende kryopræservering muliggør en tidsuafhængig måling af bioenergetik. Med denne metode kan prøver indsamles og måles på senere tidspunkter. Det er også velegnet til at indsamle prøver i multicenterforsøg og måle parametre på samme tid på et centralt sted.

Kryopræservering giver mulighed for at opbevare celler i lang tid og måle dem bagefter. Isolering af PBMC'er er en tidskrævende proces på ca. 2-3 timer og tillader kun, at der tages et lille antal prøver på én gang. Det er ikke muligt for en enkelt eksperimentator at isolere friske PBMC'er fra mere end 2 individer samtidigt uden tab af kvalitet. Behovet for at udføre opfølgende eksperimenter med friske celler komplicerer proceduren og er således forbundet med yderligere stress og tidsproblemer. Adskillelse af isolation fra udførelsen af eksperimenterne kan forenkle undersøgelser og gøre test mere standardiserede. Specifikt blodindsamling, isolering, kryopræservering af et prøvekollektiv efterfulgt af udførelse af specifikke eksperimenter. Prøver kan indsamles fra forskellige steder og på forskellige tidspunkter og derefter måles på samme tid på samme sted.

Bioenergetik spiller en væsentlig rolle i cellemetabolisme, forstyrret bioenergetik, der fører til mitokondriel dysfunktion, vil sandsynligvis spille en vigtig rolle i aldring og efterfølgende i neurodegeneration og andre sygdomme25,26. De ovenfor beskrevne metoder kan anvendes i nyligt isolerede og kryopræserverede PBMC'er til overvågning af ændringer. Disse bioenergetiske målinger kan bruges som grundlag for kliniske undersøgelser og forskning.

Der er flere begrænsende faktorer for denne teknik, og fordele og ulemper ved frisk måling versus måling efter kryopræservering skal vejes. Kryopræservering er generelt meget krævende for PBMC'er; Derfor er det vigtigt at holde antallet af stressorer så lavt som muligt. Tid er af afgørende betydning, da cellerne skal bruge så lidt tid som muligt i DMSO, som er giftigt for PBMC'er, skal hvert trin forberedes, før de optøes eller fryses celler med DMSO. Også til bioenergetiske målinger viste opbevaring i en -80 °C fryser sig at være ineffektiv - prøverne skal overføres til flydende nitrogen efter 24 timer. En kontrolleret frysehastighed er obligatorisk, hvis afkøling er for hurtig, fryser det resterende vand i cellerne og danner krystaller, der beskadiger cellemembraner og rum. For langsom afkølingshastighed fører til langvarig kontakt med den giftige DMSO. Cellefrysere, der bruger isopropanol, kan opnå en frysehastighed på 1 °C/min i en fryser med -80 °C. Optøning og genfrysning af PBMC'er bør undgås.

Denne protokol beskriver isolering og kryopræservering af PBMC'er. For at bekræfte PBMC'ernes funktionalitet efter konservering til bioenergetiske målinger blev der udført eksemplariske målinger af bioenergetik. Denne protokol er optimeret til måling af bioenergetiske faktorer. Bioenergetiske faktorer kan bestemmes efter kryopræservering, men det kan også bestemmes for andre protokoller, om målinger er mulige efter kryopræservering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.

Acknowledgments

Vi vil gerne takke det kliniske team på universitetshospitalet Giessen-Marburg for blodindsamlingen. Dette arbejde blev finansieret af Justus Liebig-universitetet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1 M Triethanolamine-HCl-Buffer (pH = 8,0) Self-prepared -
0.5 M Triethanolamine-HCl-Buffer Self-prepared -
1.0 M Tris-HCl-Buffer (pH = 8,1) Self-prepared -
1.01 mM DTBB Self-prepared -
10 % Triton X-100 Self-prepared -
10 mM Oxalacetat Self-prepared -
14–20 G sterile blood draw needles Multi Adapter Sarstedt Safety-Multifly Sarstedt 156353_v
37% HCl Carl Roth GmbH & Co. KG -
70% Ethanol (EtOH) Self-prepared -
Acetyl-CoA Pancreac Applichem A3753
ADP Sigma-Aldrich A5285
Alcohol wipes  (70% isopropyl alcohol)
Antimycin A Sigma-Aldrich A8674
Aqua (bidest.) With MilliQ Academic (self-made) -
Ascorbate Sigma-Aldrich A4034
ATP-Standard Sigma-Aldrich 6016949
Biocoll Seperating Solution Biochrom 6115
Biological safty cabinet MSC Advantage Thermo Fisher Scientific Inc.
Carbonylcyanid-p-trifluoromethoxy-phenylhydrazon (FCCP) Sigma-Aldrich C2920
Cell counter TC20 Automated Cell Counter Bio-Rad
Centrifuge Heraeus Megafuge 16 R Thermo Fisher Scientific Inc.
Counting slides, dual chamber for cell counter Bio-Rad 1450016
Cryotube Cryo.S Grainer Bio-One 126263-2DG
Digitonin Sigma-Aldrich 37008
Dimethylsulfoxid (DMSO) Merck 102952
Disinfection spray
Disposable gloves latex, rubber, or vinyl.
Distrips (12.5 ml) DistriTips Gilson F164150
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS; 10x) Gibco (Thermo Scientific) 15217168
Ethanol (EtOH 100%) Carl ROTH GmbH & Co. KG 9065.3
Fetal bovine serum (FBS) Sigma-Aldrich F9665
Frezer (-80°C) Thermo Fisher Scientific Inc.
Glutamate Sigma-Aldrich G1626
Holder/adapter 
Incubator Midi 40 CO2 Thermo Fisher Scientific Inc.
Injection syringe Hamilton
Malate Sigma-Aldrich M-1000
MIR05 Self-prepared -
Mr. Frosty Freezing Container Thermo Fisher Scientific Inc. 10110051
Multireader CLARIOstar BMG Labtech
Nitrogen tank Locator 6 plus Thermo Fisher Scientific Inc.
Oligomycin Sigma-Aldrich O4876
Oxalacetate Sigma-Aldrich -
Oxygraph-2k Orobororus Instruments
Penicillin-Streptomycin PAA 15140122
Pipettes Performance Pipettor 10 μL, 100 μL, 1000 μL VWR
Roswell-Park. Memorial-Institute-Medium (RPMI-1640) Gibco (Thermo Scientific) 11530586
Rotenone Sigma-Aldrich R8875
Saccharose Carl ROTH GmbH & Co. KG 9286.2
Sodium azide Sigma-Aldrich S2002
Succinate Sigma-Aldrich S2378
Tetramethylphenylendiamin (TMPD) Sigma-Aldrich T3134
Tourniquet/ Blood pressure cuff
Tris(hydroxymethyl)amino-methane Sigma-Aldrich 108382
Triton X-100 Sigma-Aldrich 108643
Trypanblau Biochrom T6146
Vacuum pump Vaccubrand GmbH & Co.
ViewPlate-96 Perkin Elmer 6005181
Water bath WNB22 Memmert GmbH & Co. KG

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mancuso, M., et al. Mitochondria, cognitive impairment, and Alzheimer's disease. Int J Alzheimers Dis. 2009, 951548 (2009).
  2. Haas, R. H. Mitochondrial dysfunction in aging and diseases of aging. Biology. 8 (2), 48 (2019).
  3. Kleiveland, C. R. Peripheral blood mononuclear cells. The Impact of Food Bioactives on Health. In Vitro and Ex Vivo Models. Verhoeckx, K., Cotter, P., Lopez-Exposito, I., et al. , Springer International Publishing AG. Cham. (2015).
  4. Silaidos, C., et al. Sex-associated differences in mitochondrial function in human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and brain. Biol Sex Differ. 9 (1), 34 (2018).
  5. Acin-Perez, R., Benincá, C., Shabane, B., Shirihai, O. S., Stiles, L. Utilization of human samples for assessment of mitochondrial bioenergetics: Gold standards, limitations, and future perspectives. Life. 11 (9), 949 (2021).
  6. Schindowski, K., et al. Impact of aging. NeuroMol Med. 4 (3), 161-177 (2003).
  7. Migliore, L., et al. Searching for the role and the most suitable biomarkers of oxidative stress in Alzheimer's disease and in other neurodegenerative diseases. Neurobiol Aging. 26 (5), 587-595 (2005).
  8. Leutz, S., et al. Reduction of trophic support enhances apoptosis in PC12 cells expressing Alzheimer’s APP mutation and sensitizes cells to staurosporine-induced cell death. J Mol Neurosci. 18 (3), 189-201 (2002).
  9. Leuner, K., et al. Peripheral mitochondrial dysfunction in Alzheimer’s disease: Focus on lymphocytes. Mol Neurobiol. 46 (1), 194-204 (2012).
  10. Leuner, K., et al. Enhanced apoptosis, oxidative stress and mitochondrial dysfunction in lymphocytes as potential biomarkers for Alzheimer’s disease. J Neural Transm Suppl. 2007 (72), 207-215 (2007).
  11. Kartika, R., Wibowo, H., Purnamasari, D., Pradipta, S., Larasati, R. A. Altered Indoleamine 2,3-Dioxygenase production and its association to inflammatory cytokines in peripheral blood mononuclear cells culture of type 2 diabetes mellitus. Int J Tryptophan Res. 13, 1178646920978236 (2020).
  12. Cortez-Espinosa, N., et al. CD39 expression on Treg and Th17 cells is associated with metabolic factors in patients with type 2 diabetes. Hum Immunol. 76 (9), 622-630 (2015).
  13. Mahmoud, F., et al. Effect of Diabetea tea ™ consumption on inflammatory cytokines and metabolic biomarkers in type 2 diabetes patients. J Ethnopharmacol. 194, 1069-1077 (2016).
  14. Volman, J. J., Ramakers, J. D., Plat, J. Dietary modulation of immune function by β-glucans. Physiol Behav. 94 (2), 276-284 (2008).
  15. Reddy, M., Eirikis, E., Davis, C., Davis, H. M., Prabhakar, U. Comparative analysis of lymphocyte activation marker expression and cytokine secretion profile in stimulated human peripheral blood mononuclear cell cultures: an in vitro model to monitor cellular immune function. J Immunol Methods. 293 (1), 127-142 (2004).
  16. Otaegui, D., et al. Differential micro RNA expression in PBMC from multiple sclerosis patients. PLoS One. 4 (7), e6309 (2009).
  17. Geltink, R. I. K., Kyle, R. L., Pearce, E. L. Unraveling the complex interplay between T cell metabolism and function. Annu Rev Immunol. 36, 461-488 (2018).
  18. Fox, C. J., Hammerman, P. S., Thompson, C. B. Fuel feeds function: energy metabolism and the T-cell response. Nat Rev Immunol. 5 (11), 844-852 (2005).
  19. Li, P., et al. Mitochondrial respiratory dysfunctions of blood mononuclear cells link with cardiac disturbance in patients with early-stage heart failure. Sci Rep. 5, 10229 (2015).
  20. Weiss, S. L., et al. Mitochondrial dysfunction in peripheral blood mononuclear cells in pediatric septic shock. Pediatr Crit Care Med. 16 (1), e4-e12 (2015).
  21. Higdon, L. E., Lee, K., Tang, Q., Maltzman, J. S. Virtual global transplant laboratory standard operating procedures for blood collection, PBMC isolation, and storage. Transplant Direct. 2 (9), e101 (2016).
  22. Betsou, F., Gaignaux, A., Ammerlaan, W., Norris, P. J., Stone, M. Biospecimen science of blood for peripheral blood mononuclear cell (PBMC) functional applications. Curr Pathobiol Rep. 7, 17-27 (2019).
  23. Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods Mol Biol. 810, 25-58 (2012).
  24. Djafarzadeh, S., Jakob, S. M. High-resolution respirometry to assess mitochondrial function in permeabilized and intact cells. J Vis Exp. (120), e54985 (2017).
  25. Wang, W., Zhao, F., Ma, X., Perry, G., Zhu, X. Mitochondria dysfunction in the pathogenesis of Alzheimer’s disease: recent advances. Mol Neurodegener. 15 (1), 30 (2020).
  26. Chaturvedi, R. K., Flint Beal, M. Mitochondrial diseases of the brain. Free Radic Biol Med. 63, 1-29 (2013).

Tags

Kryopræservering Bioenergetisk evaluering Mononukleære celler i perifert blod Mitokondrier Mitokondriel dysfunktion Metaboliske sygdomme Aldring Oxidativ phosphorylering Energisk homeostase PBMC'er Mitokondriefunktion Sygdomstilstande Humane prøver Begrænsninger Kryopræserverede prøver Frisklavede celler Isolerende PBMC'er Kryobevarende PBMC'er Bioenergetisk funktion Celleantal og levedygtighed Adenosintrifosfatniveauer Respiratorisk kædeaktivitet Humane blodprøver Klinisk Undersøgelser Multicentral
Kryopræservering og bioenergetisk evaluering af humane mononukleære celler i perifert blod
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dieter, F., Grube, J., Birkenhauer,… More

Dieter, F., Grube, J., Birkenhauer, T., Quentin, A., Eckert, G. P. Cryopreservation and Bioenergetic Evaluation of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells. J. Vis. Exp. (200), e65730, doi:10.3791/65730 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter