Summary
単離された末梢血単核細胞は、免疫機能や免疫障害、代謝性疾患、またはミトコンドリア機能の解析に使用できます。この研究では、全血からのPBMCの調製とその後の凍結保存のための標準化された方法について説明します。凍結保存は、この時間と場所を独立させます。
Abstract
真核細胞の生理機能は、主にミトコンドリアが提供するエネルギーに依存しています。ミトコンドリアの機能不全は、代謝性疾患や老化に関連しています。酸化的リン酸化は、エネルギー的な恒常性の維持に不可欠であるため、決定的な役割を果たします。PBMCは、ミトコンドリア機能を測定するための低侵襲サンプルとして同定されており、疾患状態を反映することが示されています。しかし、ミトコンドリアの生体エネルギー機能の測定は、ヒトサンプル中のいくつかの要因によって制限される可能性があります。制限は、採取するサンプルの量、サンプリング時間 (多くの場合、数日間に分散)、および場所です。採取したサンプルを凍結保存することで、サンプルの一貫した収集と測定が可能になります。測定されたパラメータが、凍結保存された細胞と新たに調製された細胞の間で同等であることを確認するように注意する必要があります。ここでは、ヒト血液サンプルからPBMCを単離・凍結保存し、これらの細胞におけるミトコンドリアの生体エネルギー機能を解析する方法について述べる。ここに記載されているプロトコールに従って凍結保存されたPBMCは、新たに採取した細胞と比較して、細胞数と生存率、アデノシン三リン酸レベル、および測定された呼吸鎖活性にわずかな違いしか示しません。記載された調製物に必要なヒト血液はわずか8〜24mLであり、臨床試験中にサンプルを多中心的に収集し、その場で生体エネルギーを決定することを可能にします。
Introduction
ヒト末梢血単核球(PBMC)は、老化プロセスや変性疾患に関連する問題など、免疫学的および生体エネルギー学的問題の研究を含む、多くの科学分野でさまざまな用途に使用されています1,2。PBMCは組成が不均一で、リンパ球(B細胞、T細胞、NK細胞)、単球、樹状細胞で構成されています。細胞は被験者内で大きな個体差やばらつきを示すことがあるため、これらの細胞を処理するための標準化された手順が必要です。単離の生存率や純度などの重要なパラメータは、その取り扱いの基本的な要件であり、収集時間、メラトニンレベル、被験者が絶食しているかどうかなどの環境要因によってさらに影響を受けます3,4。
ここでは、PBMCの生体エネルギーに関する研究に基づいて、他の方法にも適したPBMCの単離、凍結保存、培養方法について説明します。筋生検はミトコンドリアのエネルギー代謝のゴールドスタンダードと考えられていますが5、血球の検査は迅速で低侵襲な手順です。これに加えて、老化やアルツハイマー病(AD)におけるミトコンドリア機能の変化は、脳だけでなく末梢にも起こることを示唆する研究がますます増えています6,7,8,9,10。この方法では、糖尿病や肥満など、他の状態や病気の調査も可能です11,12,13。多発性硬化症患者における遺伝子発現パターン、または免疫機能およびそれに対する一般的な影響を分析することができます14,15,16。
PBMCは一般に、酸化的リン酸化(OXPHOS)に依存してアデノシン三リン酸(ATP)を生成します17,18。したがって、PBMCはサロゲートとして幅広い用途をカバーしています。これまでの報告では、PBMCのエネルギー代謝は、早期心不全19、敗血症性ショック20、ミトコンドリア機能の性差4などの臓器機能障害に対処するために用いられてきた。PBMCの凍結保存、単離、培養の一般的な方法は、異なる施設で得られた結果の比較可能性において利点があります。各ステップ21,22のプロトコルには大きなばらつきがあり、この方法の目標は、PBMCにおける生体エネルギー測定のガイドラインを提供することである。
本稿では、PBMCの生体エネルギーパラメータを測定する方法について説明します。ヒトの血液からPBMCの生体エネルギーを単離、凍結保存、測定する方法を説明します。この方法は、患者の生体エネルギーパラメータを決定し、臨床状況でそれらを評価するために使用できます。これらの測定を適用するには、研究者は新鮮な血液サンプルを採取できる患者集団にアクセスする必要があります。
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Protocol
採血、分離、分析に関するこの原稿に記載されているすべてのプロトコルは、ドイツのギーセン大学の治験審査委員会によってレビューおよび承認されています。研究にサンプルを含めることについて、患者の同意が得られました。単離と細胞培養のすべてのステップは、生物学的安全キャビネットの下で行われます。
1.静脈穿刺
- 消毒スプレー、滅菌綿棒、80mmチューブとマルチアダプター付き採血カニューレ、止血帯/血圧カフ、モノベット9mLリチウムヘパリンなど、採血に必要なすべての機器を準備します。
注:抗凝固剤としてのEDTAも効果的です。 - 最も適切な腕の静脈、通常は正中大静脈または頭静脈から血液を採取します。
- 止血帯/血圧カフを約80 mm / Hgの軽い圧力で適用します。
- 手袋や穿刺部位をアルコール入りの消毒スプレーで消毒してください。消毒した穿刺部位を風乾させます。
- 圧迫カフの圧力により静脈が突き出ています。針(カニューレ直径(外側)21G / 0.8 mm、長さ19 mm)を静脈の15°〜20°の角度で挿入し、外傷を回避し、プロービングを最小限に抑えます。
- 適切なシステムで血液を採取し、9 mLの血液を含む4本のチューブを使用します(7〜8本を超えるチューブは、1人の実験者が適切に分離するのに問題があります)。
- 採血後、採血チューブを暗所に5分間置き、均一な抗凝固療法を確保します。
2. PBMC絶縁
- 以下で説明するように、必要なすべてのソリューションを準備します。
- ダルベッコ平衡塩溶液(DPBS;濃度1倍)とリンパ球分離培地(1.077 g / mL)を室温(20〜25°C)に戻します。
- ウシ胎児血清(FBS)を室温で調製し、FBSを含む滅菌50 mLコニカルチューブ1本を氷上に保管します。血液サンプルごとに、2 mL の FBS が必要です。
- 冷凍容器は4°Cで保管し、クライオチューブは4°Cで予冷します。
- 細胞培養培地を37°Cに温めると、培地は50 mLのFBSとペニシリン50 U/mLのストレプトマイシン50 U/mLを含むRPMI 1640で構成されています。この溶液は、3°Cで最大2か月間保存できます。
- 滅菌済みの 50 mL コニカルチューブに 8 mL の DPBS を加えます。滅菌した50 mLのコニカルチューブに15 mLのリンパ球分離培地を加えます(培地は光に敏感であるため、単離を開始する前に添加してください)。
- 8 mLのDPBSに8 mLの血液を加え、3 mLのプラスチック製パスツールピペットでさらに慎重に混合します。
- リンパ球分離培地の上に、3 mLのプラスチック製パスツールピペットで血液/DPBSミックスを穏やかに重ねます。最初の層を培地に塗布するには、チューブを20°〜30°傾けると、血中PBS混合物が培地層に浸透しにくくなります。
- 血中PBS混合物をチューブの側壁を越えてリンパ球分離培地に慎重に重ねます。一定の速度を使用して、血流を一定に保ちます。
- 次のステップでは、チューブをゆっくりと直立させ、残りの血液をチューブの側壁から血液層に慎重に層状にします。
- ブレーキをオフにしたスイングバケットローターを備えた遠心分離機で、室温で1000 x g で10分間遠心分離します。遠心分離後、血液とPBMCの混合液を4層に分けます。最上層は血漿と血小板で構成され、第二層はPBMC層、続いてリンパ球分離中層、そして最後に最下層の赤血球と顆粒球で構成されています。図 1 に、さまざまなレイヤーを示します。
- プラスチック製のパスツールピペットでプラズマ層の2 /3を取り除きます。
- 1 mLのピペットを使用して、サンプルに培地が混入しないように注意しながら、リンパ球単離培地層上のPBMCを回収します。
- チップをPBMC層から1mm上に置きます。PBMC層に穴をあけてはならず、そうでなければ培地が細胞上を流れてしまいます。ピペットの吸引によりPBMCがここまで引っ張られ、この時点で数回回収することができます。
メモ:収集するPBMCの数を最大化するには、手順の最後に表面上の残りの細胞を検索し、そこでも細胞を収集してみてください。手順を安定させるために、チューブを表面に置くことができます。 - 層が完全に収穫されるまで、PBMC を新しい 50 mL チューブに段階的に移します。DPBSを25 mLまで添加し、リンパ球単離培地およびその他の残留物を洗い流します。
- ブレーキをかけたまま、室温で100 x g で10分間遠心分離します。真空ポンプ等で上澄み液を除去し、細胞ペレットを傷つけないように注意する。
- ペレットを 1 mL の DPBS に再懸濁し、DPBS を 25 mL のマークに加算します。もう一度洗浄を繰り返してから、次のステップに適した培地に再懸濁します。
図1:密度勾配遠心分離の模式図で、さまざまな層を説明しています。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
3. 凍結保存
- 冷凍容器を4°Cまで冷却し、氷上でFBSを冷却します。
- PBMCペレットを1 mLのピペットで1 mLのFBSに再懸濁し、FBSは室温に戻します。
- DMSOと予冷したFBSを氷上で1:5、最終濃度20%DMSOで混合し、FBS:DMSO混合物を氷に戻します。常に新鮮な溶液を準備します。
- PBMC細胞懸濁液をFBSに移し、十分に標識された2 mLクライオチューブに移します。採取チューブ1本につきクライオチューブを1本使用してください。細胞数を mL あたり 1 x 107 から 5 x 107 の間で調整します。自動セルカウンターを使用して、細胞数と生存率を判断します。
- FBS:DMSO混合物1 mLを1 mLピペットで、1秒あたり約1〜2滴ずつチューブに滴下します。滴下により、連続的かつ一貫した混合が可能になります。
- 予冷した冷凍容器にチューブを入れます。冷凍容器を-80°Cの冷凍庫に24時間入れます。冷凍容器は、毎分-1°Cの制御された冷却を提供します。
- -80°Cの冷凍庫からチューブを取り出します。冷凍庫から取り出した後、チューブを液体窒素の気相に保管します。各サンプルの場所を文書化します。
4. 解凍
- 必要なすべての溶液を調製します:50 mLのFBSおよびペニシリン50 U/mL、ストレプトマイシン50 U/mLを含む細胞培養培地RPMI 1640。この溶液は、3°Cで最大2か月間保存できます。
- 細胞培養培地を37°Cに予熱します。 予熱した細胞培養培地3 mLを滅菌50 mLコニカルチューブに加えます。
- 液体窒素タンクからサンプルを取り出します。サンプルを37°Cのウォーターバスで約3.5分間解凍し、最後の氷が溶けたらすぐにウォーターバスから取り出します。ピンヘッドサイズの氷のかけらがチューブの中にまだ見えるはずです。
注:DMSOはPBMCの作業に有害です。 - cell:FBS:DMSO mixを1 mLピペットでクライオチューブから取り出します。PBMCサンプルを、調製した50 mLチューブ内の細胞培養培地と混合します。5 mLの培地で、2 mL、2 mL、1 mLの3段階でチューブを洗い流します。
- 培地をチューブに移します。これは、可能な細胞残基を転写するために行われます。室温で100 x g で10分間遠心分離します。
- 上清を廃棄し、計画された使用に適した培地を1 mL添加します。細胞はその後の実験の準備ができています。
注:ただし、新鮮細胞または凍結細胞の機能試験では、リンパ球単離培地ベースの単離または細胞融解後に、インキュベーターでの休止期間(通常は一晩)が推奨されることがよくあります。
5. 細胞培養
- 培養細胞を単離または融解した後、5% CO2/95%空気中で37°Cで一晩。
- 10% FBS、ペニシリン 50 U/mL、ストレプトマイシン 50 U/mL を添加した 1 mL の RPMI 培地に細胞を再懸濁します。さらなる使用には多くの可能性があり、アッセイの必要に応じて細胞を処理します。
- 一般的な保存には、滅菌済みの6ウェル細胞培養プレートを使用し、休止期間後に細胞を回収します。1 mLのピペットで1 mLの細胞懸濁液をウェルに移し、4 mLの細胞培養培地を加えます。
注:単離されたPBMCの量は個人によって大きく異なり、分離された血液8 mLごとに5 mLの細胞培養培地が入った1つのウェルで十分です。ただし、バフィーコートからPBMCを単離する場合、PBMCの量は全血サンプルよりも大幅に多いため、細胞をいくつかのウェルに分割する必要があります。 - 37°Cで5%CO2 を添加した加湿雰囲気中で細胞を24時間休ませます。 このインキュベーションは、凍結保存された細胞だけでなく、新たに単離された細胞に対しても行われます。
6. ATPアッセイ
- 融解したPBMCを、10%FBS、ペニシリン50 U/mL、ストレプトマイシン50 U/mLを添加したRPMI培地1 mLに再懸濁します。
- サンプルを採取して細胞数を決定し、トリパンブルーで生死識別を行います。再懸濁した細胞から10 μLを取り出し、90 μLの細胞培養培地と混合します。次に、10 μLを摂取し、10 μLのトリパンブルーと混合します。細胞を細胞計数チャンバーまたは自動セルカウンターのいずれかに入れ、生細胞/死細胞の数を決定します。
- 100 μL の細胞を 1 x 105 cells/ 100 μL の密度で 96 ウェル白色ポリスチレンプレートに播種します。
- 37°Cで5%CO2 を添加した加湿雰囲気中で細胞を24時間休ませます。
- ATPアッセイでATP濃度を測定します。
- ATPがルシフェリンと組み合わされたときに発生する発光を使用してください。放出された光は、プレートリーダーで評価できます。インキュベーターのプレートを取り外して、室温まで15分間冷却します。細胞を溶解し、5分間放置します。次に、細胞にモニタリング試薬を塗布し、メーカーの指示に従って測定します。内部標準を使用してATPレベルを決定します。
7. 高分解能のrespirometry
- 高解像度オキシグラフをオンにし、30分間ウォームアップします。
- 図1に記載のプロトコールに従って細胞を処理します。表1のように、必要なすべてのストックを準備します。
- 2.1 mL の呼吸緩衝液(表 1)を両方の高分解能酸素グラフチャンバーにピペットで移し、チャンバー内にある磁気攪拌バー(750 rpm)を使用して、ポーラログラフ式酸素センサーの安定した酸素フラックス信号が得られるまで 37 °C で 30 分間、緩衝液を連続的に撹拌します。
注:オキシグラフのチャンバーでは、リアルタイムの酸素消費量(フラックス)とチャンバーの酸素飽和度がポーラログラフ式酸素電極を使用して測定されます。バックグラウンドキャリブレーションは、バックグラウンドノイズを回避し、信頼性の高い結果を得るために実行する必要があります。 - ポーラログラフ式酸素センサーの空気校正を、製造元のプロトコル23に従って実行します。
- 単離されたPBMCを1 mLのミトコンドリア呼吸培地(MIR05、組成を 表1に示す)に再懸濁し、8 x 106 細胞/mLに希釈する。
- 空気キャリブレーション後、オキシグラフチャンバーから呼吸媒体を吸引し、呼吸計の各キャンバーに2.1 mLの細胞懸濁液を加えます。測定中にチャンバーを再酸素化する必要がある場合は( 図2のポイントhで開くを参照)、チャンバーの酸素飽和度が100μMを下回らないようにしてください。
- 栓を挿入してチャンバーを閉じると、チャンバーは2.0 mLの容量を保持するように設計されています。出現した細胞懸濁液を吸引します。
- 細胞懸濁液をチャンバー内のマグネチックスターラー(750 rpm)で37°Cで連続的に混合します。安定した信号が得られるまで約20分間待ちます。内因性呼吸( 図2の(a))を決定します。
- 呼吸鎖のさまざまな複雑な活動を決定するには、ストッパーのチタン注入ポートからミトコンドリア呼吸用の基質と阻害剤を注入します。チャンバー内では、以下の最終濃度を使用してください。
- 細胞膜を破壊するには、チャンバーストッパーのチタン注入ポートから 5 μL の 8.1 mM ジギトニンを添加し、ミトコンドリア膜をそのままにしたまま、 図 2 のナイーブ基質(b)を除去します。
- 基質 2 M グルタミン酸と 800 mM リンゴ酸をチャンバーストッパーの注入ポートに添加し、安定した信号が得られるまで呼吸を記録します。信号は2〜4分後に安定します。
注:ピルビン酸塩のような追加の基質を使用することも可能です。 - チャンバーストッパーの注入ポートから 8 μL の 500 mM アデノシン二リン酸(ADP)を添加し、安定した信号が得られるまで呼吸を記録します。 図2の2〜4分後に信号が安定します(d)。
- チャンバーストッパーの注入ポートから 20 μL の 1 M コハク酸塩を添加し、安定したシグナルが得られるまで呼吸を記録します。 図2では、2〜4分後に信号が安定します(e)。
- 1 M シアン化カルボニル p-トリフルオロメトキシフェニルヒドラゾン(FCCP)を 0.5 μL で段階的に、それ以上の増加が起こらないまで滴定します。 図2の信号(f)が安定するまで、2〜4分待ちます。呼吸がこれ以上増加しなくなったら、次のステップに進みます。
注意: FCCPは人体に健康上のリスクがあるため、取り扱いには注意してください。 - チャンバーストッパーの注入ポートから 0.1 mM ロテノン 5 μL を添加し、安定した信号が得られるまで呼吸を記録します。 図2では、信号は2〜4分(g)後に安定します。
注意:ロテノンは人間に健康上のリスクがあるため、取り扱いには注意してください。 - チャンバーストッパーの注入ポートから 4 mg/mL のオリゴマイシン 1 μL を添加し、安定したシグナルが得られるまで呼吸を記録します。 図2では、信号は2〜4分(h)後に安定します。
注意:オリゴマイシンは人間に健康上のリスクをもたらす毒物であるため、取り扱いには注意してください。 - チャンバーストッパーの注入ポートから 5 mM 抗マイシン A 1 μL を添加し、安定したシグナルが得られるまで呼吸を記録します。図 2の2〜4分後に信号が安定します(i)。
注意: 抗マイシンAは人間に健康上のリスクをもたらす毒物であるため、取り扱いには注意してください。 - 酸化的リン酸化に関与しない酵素の酸素消費量を除外するランを評価する場合は、他のすべての測定値から抗マイシンA値を差し引きます。
- 200 mM N,N,N',N'-テトラメチル-p-フェニレンジアミン二塩酸塩(TMPD;電子供与体)と800 mMアスコルビン酸塩を添加して、TMPDを還元状態に保ちます。チャンバーストッパーの注入ポートから基板を注入し、安定した信号が得られるまで呼吸を記録します。 図2では、信号は2〜4分後(j)に安定します。
- TMPDは自己酸化を受けるため、複合体IVでの測定値から結果として生じる酸素消費量を差し引きます。
- チャンバーストッパーの注入ポートからNaN3≥100 mMを添加し、安定した信号が得られるまで呼吸を記録します。シグナルは2〜4分後に安定して複雑なIV活性を阻害し、TMPDの自己酸化のみが残ります。
注意: アジ化ナトリウムは人間に健康上のリスクをもたらす毒物であるため、取り扱いには注意してください。
図2:O2 フラックスの概略コース。 酸素フラックスの概略的なコースが示されています。曲線は、a-kからの阻害剤および基質の添加後に異なる相に分けられる。A:内因性呼吸;b:透過処理された細胞;c:非共役複合体I呼吸;d:複合体I呼吸の結合;e:オックスフォス;f:CIとCIIの最大非結合活性。g:複合体IIの非共役呼吸;h:漏れ呼吸;i:残留呼吸;j:CIV(U) 非共役呼吸とTMPDの自己酸化;k:TMPDの自己酸化。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
8.クエン酸合成酵素活性
- クエン酸合成酵素活性を別のパラメータとして測定し、それを使用して高分解能オキシグラフの測定値を正規化します。
- 単離したPBMCを1 mLのミトコンドリア呼吸培地(MIR05)に再懸濁し、8 x 106 細胞/mLに希釈します。
- 液体窒素で凍結し、実験が行われるまで、または新鮮な細胞を測定するまで、-80°Cで保存します。
- 必要なすべての溶液を調製します:0.1 M トリエタノールアミン HCl バッファー pH 8.0、1.0 M トリス-HCl バッファー pH=8.1、10% Triton X-100、10 mM シュウ酢酸 0.1 M トリエタノールアミン HCl バッファー pH 8.0、1.01 mM DTNB 1.0 M Tris-HCl バッファー pH=8.1、アセチル CoA 12.2 mM の二重蒸留 H2O 溶液。
- 5,5'-ジチオ-ビス-(2-ニトロベゾ酸)(DTNB;0.1 mM)、アセチル補酵素A(0.31 mM)、EDTA(50 μM)、トリエタノールアミンHCl(5 mM)およびトリスHCl(0.1 M)を含む反応培地(表1)を調製します。
- 2回蒸留したH2Oに溶解した0.5mMのオキサロ酢酸で出発試薬(表1)を調製する。
- 解凍が早すぎるとクエン酸合成酵素が不安定になるため、サンプルを氷上で解凍します。
- 40 μLのサンプルを氷上の96ウェルプレートに添加してから、マルチピペットで110 μLの反応媒体を添加します。
- 反応培地を温め、インキュベーターで30°Cで5分間サンプルを採取します。開始試薬をウォーターバスで30°Cに5分間温めます。
- 50 μLの出発試薬をマルチピペットで各ウェルに加えます。プレートリーダーを介して、波長412nmで30°Cで20分間吸光度を測定します。
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Representative Results
細胞生存率と細胞数
単離と凍結保存を成功させるには、細胞数と生存率をできるだけ高くする必要があります。凍結保存の前後に細胞をカウントし、細胞の健康と品質を確保するためにそれらの生存率を決定します。 図3 は、凍結保存前後のPBMCの代表的な説明図であり、細胞数および生存率はほとんど変わらない。これは、PBMC の分離と保存が成功したことを示します。
図3:凍結保存が細胞数と生存率に及ぼす影響。 試験群は、新たに単離されたPBMCを持つ対照群と、1ヶ月凍結保存後のPBMCに分けられます。細胞の計数およびそれらの生存率の決定は、自動セルカウンターを用いて行った。トリパンブルーを使用して生存率を測定しました。各測定は、個々の測定結果から平均値の3倍を算出するように実施した。(A)新鮮単離後および1ヶ月凍結保存後のPBMCの細胞生存率の決定。値はSEM±平均値として与えられます。 有意性は対応のあるt検定で決定されました。(B)新鮮単離後および1ヶ月凍結保存後のPBMCの細胞数の決定。値はSEM±平均値として与えられます。 有意性は対応のあるt検定で決定されました。同じ形状と色は、1か月の凍結保存の前後で同じサンプルを示しています。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
ATPは、真核細胞の主要なエネルギー源です。ATPは発光アッセイシステムを介して測定されます。凍結保存が成功した場合、新たに単離された細胞と凍結保存された細胞の間でATPに違いはありません。 図4 は、凍結保存前後のPBMCの代表的な図です。ATPレベルも同様です。これは、PBMC の分離と保存が成功したことを示します。
図4:異なる凍結保存期間のATP濃度の比較。 PBMC中のATP濃度(μM / 100,000細胞)。試験群は、新たに単離されたPBMCを持つ対照群と、1ヶ月凍結保存後のPBMCに分けられます。サンプルは同時に収集され、凍結保存または単離後に測定されました。対応のあるt検定は、有意差を検定するために実行されました。結果は、差は有意ではないことを示しました。値はSEM±平均値(N = 13)として与えられます。同じ形状と色は、1か月の凍結保存の前後で同じサンプルを示しています。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
クエン酸合成酵素(CS)は、ミトコンドリアにあるクエン酸サイクルの重要な酵素です。したがって、CS活性はミトコンドリア質量の堅牢なマーカーです。CS 活性は、DTNB から TNB への変換に基づいて決定されます。 図5 は、凍結保存前と凍結保存後では、PBMCでCS値に差がないことを示しています。繰り返しになりますが、これはPBMCの分離と保存が成功したことを示しています。
図5:クエン酸合成酵素活性に対する凍結保存の効果。 新たに測定した対照と比較した1か月の凍結保存後のPBMCのクエン酸合成酵素活性。サンプルは同時に収集され、凍結保存または単離後に測定されました。値は平均±SEMで表されます(N = 8)。有意性は対応のあるt検定で決定されました。同じ形状と色は、1か月の凍結保存の前後で同じサンプルを示しています。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
PBMCの生体エネルギープロファイルは、高分解能オキシグラフなどのポーラログラフ式酸素センサーを使用して決定できます。細胞の酸素消費量は、無傷の透過処理された細胞、組織、単離されたミトコンドリアなどの生体サンプルにおいて、非常に高い分解能と感度を備えた密閉チャンバーシステムで測定されます。高解像度酸素写真装置には2つのチャンバーが装備されており、ポーラログラフ式酸素センサーを使用して酸素濃度を測定し、各チャンバー内の酸素消費量を計算します。酸素消費率は、ソフトウェアを使用して計算され、セル数あたりのピコモル/秒として表されます24。各オキシグラフチャンバー内では、ポーラログラフ用酸素電極が酸素濃度を測定し、各チャンバー内の酸素消費量(フラックス)を計算します。チャンバー内の酸素消費量と濃度がリアルタイムで表示されます(図6)。特異的な阻害剤および基質を添加することにより、呼吸鎖の個々の複合体を標的とし、それらの活性を測定する。アッセイ後、データはソフトウェアで分析されます。フラックス値は、クエン酸合成酵素活性に正規化されました。オキシグラフィーは、部分的に酸化されたTMPDのために複雑なIVのより低い値を提供しました。一連のテストでは、使用されたTMPDが1.8倍ずれていることがわかりました。この係数を使用して、 図 6 の値を正規化しました。
図6:凍結保存後のPBMCSにおけるミトコンドリア呼吸と新たに測定された対照との比較。 1.6 x 107 cells/mL を含む溶液を使用して、オキシグラフ内の細胞の酸素消費量を測定しました。凍結保存の1ヶ月後に呼吸を測定した。呼吸鎖における複合体の活性を調べるために、いくつかの阻害剤、基質および脱共役剤を添加した。物質の添加は次のように行われた:CI(L) =複合体Iの漏れ呼吸;CI(P) = 複合体 I の結合呼吸;CI&CII(P) = 生理的呼吸;CI&CII(U) = 複合体IおよびIIの最大活動を示す非結合呼吸;CII(U) = 複合体IIの非共役呼吸;CII(L) = 複合体IIの漏出呼吸;CIV(U) = 非結合呼吸。係数 1.8 を使用して値を正規化しました。この因子は、本設定について実験的に決定した。データはSEM±手段として表示されます(N=10)。統計的有意性は、スチューデントのt検定(*p < 0.05)によって検定されました。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
内因性呼吸は、2 mLの細胞懸濁液をチャンバーに加えることによって決定されます。内因性基質のフラックスを測定します。さらに複合体を区別するために、ジギトニンが添加される。ジギトニンは原形質膜を透過処理しますが、ミトコンドリア膜は無傷のままです。膜からのプロトン漏れを補うために、基質のグルタミン酸とリンゴ酸が添加されます。この時点での呼吸数は、結合呼吸がない場合の複雑なI駆動呼吸を示しています。複合体I ADPの酸化的リン酸化(OXPHOS)容量を検出するために、呼吸は結合状態になります。CIとCIIの結合呼吸は、コハク酸の添加によって達成されます。これで、呼吸チェーンが最大容量で機能します。シアン化カルボニル、p-トリフルオロメトキシフェニルヒドラゾン(FCCP)の滴定により、電子伝達鎖(ETC)は脱共役します。この連結解除により、CIとCIIの最大非結合活性が決定される。CIとCIIを区別するために、複合体I特異的阻害剤ロテノンが添加される。オリゴマイシンの添加により、CIIの漏出呼吸が決定される。酸化的リン酸化に関与しない発生源による酸素消費を除外するために、抗生物質抗マイシンAを添加し、この残留酸素消費量を実験で得られたすべての測定値から差し引く。電子供与体N,N,N',N'-テトラメチル-p-フェニレンジアミン二塩酸塩(TMPD;0.5 mM)は、CIVの人工基質です。TMPDを還元状態に保つために、アスコルビン酸が使用されます。アスコルビン酸とTMPDは、CIVの最大非共役呼吸を測定するために使用されます。TMPDは自己酸化を受けるため、フラックスの安定化後にNaN3 を添加してCIVを阻害します。残りの酸素消費量は、生のCIV値から差し引かれます。 図2 は、標準的な測定曲線を示しています。
示されているパラメータは、この手法の成功を示しています。この技術は、凍結保存後に生体エネルギー測定を行うために開発されました。測定前後の細胞を比較した結果では、統計学的に有意な差は見られないことから、この保存方法は1ヶ月以上の保存に適していると考えられます。
表1:溶液、緩衝液、消耗品。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルは生体エネルギー分析のために適した方法で人間の血から末梢血の単核細胞(PBMC)を隔離し、cryopreserveする手段を提供する。記載されている方法は、PBMCを穏やかかつ大量に分離する可能性を提供し、高い生存率と生体エネルギー測定のための十分な細胞を備えています。中断が最小限であっても、長時間の単離が発生するという欠点がありますが、その後の凍結保存により、生体エネルギーの時間に依存しない測定が可能になります。この方法では、サンプルを採取し、後の時点で測定することができます。また、多施設試験でサンプルを収集し、中央で同時にパラメータを測定するのにも適しています。
凍結保存は、細胞を長期間保存し、その後測定する可能性を提供します。PBMCの単離は、約2〜3時間の時間のかかるプロセスであり、一度に採取できるサンプル数は少なくなります。1人の実験者が、品質を損なうことなく、2人以上の個体から同時に新鮮なPBMCを分離することは不可能です。新鮮な細胞で追跡実験を行う必要があるため、手順が複雑になり、追加のストレスと時間のトラブルが発生します。分離と実験のパフォーマンスを分離することで、研究を簡素化し、テストをより標準化することができます。具体的には、採血、単離、サンプル集団の凍結保存、それに続く特定の実験の実施。サンプルは、異なる場所から異なる時間に収集し、同じ場所で同時に測定することができます。
生体エネルギーは細胞代謝に不可欠な役割を果たし、ミトコンドリアの機能不全につながる生体エネルギーの乱れは、老化、その後の神経変性やその他の疾患において重要な役割を果たす可能性があります25,26。上記の方法は、新たに単離および凍結保存されたPBMCで変化をモニターするために使用できます。これらの生体エネルギー測定は、臨床研究および研究の基礎として使用することができます。
この手法にはいくつかの制限要因があり、凍結保存後の測定と新鮮な測定の長所と短所を比較検討する必要があります。凍結保存は一般的にPBMCにとって非常に厳しいものです。そのため、ストレッサーの数をできるだけ少なくすることが重要です。細胞はPBMCに有毒なDMSOにできるだけ時間を費やさないようにする必要があるため、DMSOで細胞を融解または凍結する前に各ステップを準備する必要があります。また、生体エネルギー測定では、-80°Cの冷凍庫での保存は効果がないことが判明し、サンプルは24時間後に液体窒素に移す必要があります。冷却が速すぎると、細胞内に残った水分が凍結して結晶を形成し、細胞膜や区画に損傷を与える場合は、凍結速度を制御する必要があります。冷却速度が遅すぎると、有毒なDMSOとの接触が長くなります。イソプロパノールを使用したセルフリーザーは、-80°Cのフリーザーで1°C/minの凍結速度を達成できます。PBMCの融解と再凍結は避けてください。
このプロトコルでは、PBMCの単離と凍結保存について説明します。生体エネルギー測定のための保存後のPBMCの機能性を確認するために、生体エネルギーの例示的な測定が実施された。このプロトコルは、生体エネルギー因子の測定に最適化されています。生体エネルギー因子は凍結保存後に決定できますが、凍結保存後に測定が可能かどうかは他のプロトコルについても決定できます。
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Disclosures
著者らは、利益相反がないことを宣言します。
Acknowledgments
採血をしてくださったギーセン・マールブルク大学病院の臨床チームに感謝します。この研究はユストゥス・リービッヒ大学から資金提供を受けた。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 M Triethanolamine-HCl-Buffer (pH = 8,0) | Self-prepared | - | |
| 0.5 M Triethanolamine-HCl-Buffer | Self-prepared | - | |
| 1.0 M Tris-HCl-Buffer (pH = 8,1) | Self-prepared | - | |
| 1.01 mM DTBB | Self-prepared | - | |
| 10 % Triton X-100 | Self-prepared | - | |
| 10 mM Oxalacetat | Self-prepared | - | |
| 14–20 G sterile blood draw needles Multi Adapter Sarstedt Safety-Multifly | Sarstedt | 156353_v | |
| 37% HCl | Carl Roth GmbH & Co. KG | - | |
| 70% Ethanol (EtOH) | Self-prepared | - | |
| Acetyl-CoA | Pancreac Applichem | A3753 | |
| ADP | Sigma-Aldrich | A5285 | |
| Alcohol wipes | (70% isopropyl alcohol) | ||
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| Aqua (bidest.) | With MilliQ Academic (self-made) | - | |
| Ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | |
| ATP-Standard | Sigma-Aldrich | 6016949 | |
| Biocoll Seperating Solution | Biochrom | 6115 | |
| Biological safty cabinet MSC Advantage | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| Carbonylcyanid-p-trifluoromethoxy-phenylhydrazon (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| Cell counter TC20 Automated Cell Counter | Bio-Rad | ||
| Centrifuge Heraeus Megafuge 16 R | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| Counting slides, dual chamber for cell counter | Bio-Rad | 1450016 | |
| Cryotube Cryo.S | Grainer Bio-One | 126263-2DG | |
| Digitonin | Sigma-Aldrich | 37008 | |
| Dimethylsulfoxid (DMSO) | Merck | 102952 | |
| Disinfection spray | |||
| Disposable gloves latex, rubber, or vinyl. | |||
| Distrips (12.5 ml) DistriTips | Gilson | F164150 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS; 10x) | Gibco (Thermo Scientific) | 15217168 | |
| Ethanol (EtOH 100%) | Carl ROTH GmbH & Co. KG | 9065.3 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F9665 | |
| Frezer (-80°C) | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| Glutamate | Sigma-Aldrich | G1626 | |
| Holder/adapter | |||
| Incubator Midi 40 CO2 | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| Injection syringe | Hamilton | ||
| Malate | Sigma-Aldrich | M-1000 | |
| MIR05 | Self-prepared | - | |
| Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific Inc. | 10110051 | |
| Multireader CLARIOstar | BMG Labtech | ||
| Nitrogen tank Locator 6 plus | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | O4876 | |
| Oxalacetate | Sigma-Aldrich | - | |
| Oxygraph-2k | Orobororus Instruments | ||
| Penicillin-Streptomycin | PAA | 15140122 | |
| Pipettes Performance Pipettor 10 μL, 100 μL, 1000 μL | VWR | ||
| Roswell-Park. Memorial-Institute-Medium (RPMI-1640) | Gibco (Thermo Scientific) | 11530586 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Saccharose | Carl ROTH GmbH & Co. KG | 9286.2 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Succinate | Sigma-Aldrich | S2378 | |
| Tetramethylphenylendiamin (TMPD) | Sigma-Aldrich | T3134 | |
| Tourniquet/ Blood pressure cuff | |||
| Tris(hydroxymethyl)amino-methane | Sigma-Aldrich | 108382 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 108643 | |
| Trypanblau | Biochrom | T6146 | |
| Vacuum pump | Vaccubrand GmbH & Co. | ||
| ViewPlate-96 | Perkin Elmer | 6005181 | |
| Water bath WNB22 | Memmert GmbH & Co. KG |
References
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