Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Neurotoxicitetsbedömning hos vuxna Danio rerio med hjälp av ett batteri av beteendetester i en enda tank

Published: November 3, 2023 doi: 10.3791/65869
Automatic Translation
1, 2, 1
1Institute for Environmental Assessment and Water Research (IDAEA-CSIC), 2Research and Development Center (CID-CSIC)

Summary

Här presenterar vi ett omfattande beteendetestbatteri, inklusive den nya tanken, Shoaling och sociala preferenstester, för att effektivt bestämma de potentiella neurotoxiska effekterna av kemikalier (t.ex. metamfetamin och glyfosat) på vuxna zebrafiskar med hjälp av en enda tank. Denna metod är relevant för neurotoxicitet och miljöforskning.

Abstract

Förekomsten av neuropatologiska effekter visade sig under många år vara det viktigaste effektmåttet för att bedöma neurotoxiciteten hos en kemisk substans. Under de senaste 50 åren har dock kemikaliernas effekter på modellarternas beteende undersökts aktivt. Successivt införlivades beteendemässiga slutpunkter i neurotoxikologiska screeningprotokoll, och dessa funktionella resultat används nu rutinmässigt för att identifiera och bestämma kemikaliers potentiella neurotoxicitet. Beteendeanalyser hos vuxna zebrafiskar ger ett standardiserat och tillförlitligt sätt att studera ett brett spektrum av beteenden, inklusive ångest, social interaktion, inlärning, minne och missbruk. Beteendeanalyser hos vuxna zebrafiskar innebär vanligtvis att fisken placeras på en experimentell arena och att man registrerar och analyserar deras beteende med hjälp av programvara för videospårning. Fiskar kan utsättas för olika stimuli, och deras beteende kan kvantifieras med hjälp av en mängd olika mätvärden. Det nya tanktestet är ett av de mest accepterade och mest använda testerna för att studera ångestliknande beteende hos fiskar. Testerna för stim och social preferens är användbara för att studera zebrafiskars sociala beteende. Denna analys är särskilt intressant eftersom beteendet hos hela stimmet studeras. Dessa analyser har visat sig vara mycket reproducerbara och känsliga för farmakologiska och genetiska manipulationer, vilket gör dem till värdefulla verktyg för att studera de neurala kretsar och molekylära mekanismer som ligger till grund för beteende. Dessutom kan dessa analyser användas vid läkemedelsscreening för att identifiera föreningar som kan vara potentiella beteendemodulatorer.

Vi kommer i detta arbete att visa hur man kan tillämpa beteendemässiga verktyg inom fiskneurotoxikologi, analysera effekten av metamfetamin, en rekreationsdrog, och glyfosat, en miljöförorening. Resultaten visar det betydande bidraget från beteendeanalyser hos vuxna zebrafiskar till förståelsen av de neurotoxikologiska effekterna av miljöföroreningar och läkemedel, förutom att ge insikter i de molekylära mekanismer som kan förändra neuronal funktion.

Introduction

Zebrafisken (Danio rerio) är en populär modellryggradsdjur för ekotoxikologi, läkemedelsupptäckt och säkerhetsfarmakologiska studier. Dess låga kostnad, väletablerade molekylärgenetiska verktyg och bevarande av viktiga fysiologiska processer som är involverade i morfogenesen och underhållet av nervsystemet gör zebrafiskar till en idealisk djurmodell för neurovetenskaplig forskning, inklusive neurobeteendetoxikologi 1,2. Det huvudsakliga effektmåttet för att utvärdera neurotoxiciteten hos en kemikalie var, tills nyligen, förekomsten av neuropatologiska effekter. På senare tid har dock beteendemässiga slutpunkter införlivats i neurotoxikologiska screeningprotokoll, och dessa funktionella resultat används nu ofta för att identifiera och bestämma den potentiella neurotoxiciteten hos kemikalier 3,4. Dessutom är beteendemässiga slutpunkter mycket relevanta ur ekologisk synvinkel, eftersom även en mycket liten beteendeförändring hos fiskar kan äventyra djurets överlevnad under naturliga förhållanden.

En av de mest använda beteendeanalyserna inom forskning om vuxna zebrafiskar är det nya tanktestet (NTT), som mäter ångestliknande beteende 6,7. I denna analys utsätts fiskarna för nyheter (fiskarna placeras i ett okänt akvarium), en mild aversiv stimulans och deras beteendemässiga reaktioner observeras. NTT används främst för att bedöma basal rörelseaktivitet, geotaxis, frysning och oregelbundna rörelser hos fisk. Oberäknelig8 kännetecknas av plötsliga riktningsförändringar (sicksackande) och upprepade episoder av accelerationer (pilning). Det är en larmreaktion och observeras vanligtvis före eller efter frysningsepisoder. Frysbeteende motsvarar ett fullständigt upphörande av fiskens rörelser (med undantag för operkulära och okulära rörelser) när den befinner sig på botten av akvariet, till skillnad från orörlighet orsakad av sedering, vilket orsakar hypolokomotion, akinesi och sjunkning8. Frysning är vanligtvis relaterat till ett högt tillstånd av stress och ångest och är också en del av undergivet beteende. Komplexa beteenden är utmärkta indikatorer på djurs ångesttillstånd. NTT har visat sig vara känsligt för farmakologisk och genetisk manipulation9, vilket gör det till ett värdefullt verktyg för att studera den neurala grunden för ångest och relaterade störningar.

Zebrafiskar är en mycket social art, så vi kan mäta ett brett spektrum av sociala beteenden. Stimtestet (ST) och testet för social preferens (SPT) är de mest använda analyserna för att bedöma socialt beteende10. ST mäter fiskens tendens att grupperaihop 11 genom att kvantifiera deras rumsliga beteende och rörelsemönster. ST är användbart för att studera gruppdynamik, ledarskap, social inlärning och för att förstå det sociala beteendet hos mångafiskarter. SPT i vuxna zebrafiskar anpassades från Crawleys preferens för socialt nyhetstest för möss13 och blev snabbt en populär beteendeanalys för studier av social interaktion hos denna modellart14. Dessa två tester har också anpassats för användning i drogscreeningsanalyser och har visat sig lovande för att identifiera nya föreningar som modulerar socialt beteende15,16.

I allmänhet är beteendeanalyser hos vuxna zebrafiskar kraftfulla verktyg som kan ge värdefull information om beteendemekanismerna eller neurofenotyperna hos aktiva föreningar och missbrukade läkemedel17. Detta protokoll beskriver hur man implementerar dessa beteendeverktyg7 med grundläggande materiella resurser och hur man tillämpar dem i toxicitetsanalyser för att karakterisera effekterna av ett brett spektrum av neuroaktiva föreningar. Dessutom kommer vi att se att samma tester kan tillämpas för att bedöma de neurobeteendemässiga effekterna av akut exponering för en neuroaktiv förening (metamfetamin) men också för att karakterisera dessa effekter efter kronisk exponering för miljökoncentrationer av ett bekämpningsmedel (glyfosat).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Strikt efterlevnad av etiska normer garanterar välbefinnande och korrekt behandling av zebrafiskar som används för experiment. Alla försök utfördes enligt de riktlinjer som fastställts av Institutional Animal Care and Use Committees (CID-CSIC). Protokollen och resultaten som presenteras nedan utfördes under den licens som beviljats av den lokala regeringen (avtalsnummer 11336).

1. Djurstallar för beteendetestning

  1. Utför alla tester (visas i figur 1) i ett isolerat beteenderum vid 27-28 °C mellan 10:00 och 17:00.
  2. Tvätta både kontrollfisken och den exponerade fisken flera gånger i rent fiskvatten [vatten renat med omvänd osmos innehållande 90 mg/L salt från akvariesystem, 0,58 mM CaSO4·2H2O och 0,59 mM NaHCO3] innan försöken påbörjas för att undvika eventuell kontaminering av försöksbassängen.
  3. Acklimatisera djuren till beteenderummet 1 timme innan försöken påbörjas.
  4. Se till att djuren (förhållandet ≈50:50 hane/hona) är experimentellt naiva och utför alla beteendetester på ett blint sätt med observatörer som inte känner till experimentgruppen.
  5. För att få meningsfulla resultat i beteendeanalyser, ha totalt 18 försökspersoner per tillstånd (n = 18), helst erhållna mellan två eller flera oberoende experiment. Till exempel, i enskilda tester, analysera beteendet hos 9 djur per tillstånd, per replikat. I grupptester, analysera beteendet hos ett stim på 6 till 9 djur per tillstånd, per replikat.
  6. Utför alla tester enligt en batteritestmetod (se planeringsförslag i figur 2). Denna metod är etiskt mer lämplig och gör det möjligt att minska antalet djur som behövs för studien, i enlighet med 3R-reduktionsprincipen7.
  7. För det mesta är beteendeanalyser kopplade till biologiska analyser, så offra djuren enligt riktlinjerna för avlivning18 innan du samlar in och analyserar prover (OMICs eller kemikalier). Om endpointen inte visar sig vara provtagning ska kontrollgruppen stabiliseras på nytt i slutet av försöket. Återanvänd kontrolldjuren för avels- eller försöksändamål efter några dagar.

Figure 1
Bild 1: Experimentella uppställningar. Tre konfigurationer av det fyrkantiga akvariet för att studera ett brett spektrum av beteenden hos vuxna zebrafiskar. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Bild 2: Experimentell tidslinje. Två planeringsförslag för registrering av beteendeanalyser. Klicka här för att se en större version av denna figur.

2. Experimentella konfigurationer av tanken

  1. Ångestliknande beteende: Det nya tanktestet (NTT)
    1. Justera experimentuppställningen (antal akvarier, kameror och datorer) för att registrera maximalt antal fiskar samtidigt. Individuella beteendeanalyser är tidskrävande, så optimera tid, material och utrymme.
    2. Förbered experimenttankarna för NTT: Fyrkantig tank (20 cm längd, 20 cm bredd, 25 cm höjd) täckt med akrylpaneler på sidoväggar och botten för att undvika reflektion och störningar mellan försökspersonerna.
    3. Fyll försökstankarna med 7 L (vattenpelarens höjd: 20 cm höjd) väl syresatt fiskvatten vid 28 °C.
    4. Justera tankens position framför kameran för att undvika förvrängd bild.
    5. Kontrollera belysningsinställningen. LED-bakgrundsbelysning (10000 lux) ger en homogen belysning på hela tanken för videoinspelning under goda förhållanden.
    6. Slå på kamerorna och justera dem enligt avsnitt 3.
    7. Introducera försökspersonerna, en efter en, i botten av experimenttankarna innan du börjar spela in så snabbt som möjligt.
      OBS: Det är viktigt att börja spela in med djuret i botten av tanken.
    8. Var försiktig så att du inte stör djuren under inspelningen. Användning av en gardin eller panel för att begränsa visuell interaktion inte bara mellan tankar utan också mellan stödet och utsidan.
    9. I slutet av registreringen (standardinspelningstiden är 6 minuter) överför du de djur som redan har genomgått testet till en annan tank för att inte blanda dem med de naiva djuren.
    10. Upprepa proceduren med alla tillgängliga motiv. Det är tillrådligt att ha totalt 18 försökspersoner per tillstånd för att få meningsfulla resultat i enskilda prövningar (från två eller flera oberoende replikat).
    11. Randomisera experimentgruppen som tilldelats varje tank mellan försöken för att undvika eventuella tankeffekter (om du registrerar flera tillstånd samtidigt).
  2. Socialt grupperat beteende: Shoaling-testet (ST)
    1. Den experimentella konfigurationen av ST är densamma som för NTT (samma tankar kan återanvändas direkt).
    2. Följ stegen 2.1.1-2.1.6. för att ställa in ST.
    3. Introducera stimmet (6 till 9 försökspersoner samtidigt) i botten av experimenttankarna innan du börjar spela in så snabbt som möjligt.
      OBS: Det är viktigt att börja spela in med djuret i botten av tanken.
    4. Följ stegen 2.1.8-2.1.11. för att utföra ST.
    5. Upprepa proceduren med alla tillgängliga motiv. För att få meningsfulla resultat i denna analys, gör minst två oberoende replikat med samma bankstorlek i varje replikat.
    6. Se till att storleken på stimmet är konsekvent för alla experimentgrupper och replikerar i samma experiment.
  3. Socialt individuellt beteende: Testet för social preferens (SPT)
    1. Justera experimentuppställningen för att optimera experimentutrymmet och inspelningstiden.
    2. Förbered experimenttankarna för SPT: Fyrkantig tank (20 cm lång, 20 cm bredd, 25 cm höjd) transparent (glas eller plast) för att ge synlighet i sidled. Den enskilda fokala fisken är fri att interagera med en virtuell zon med artfrände - ett fiskstim som placeras i den ensidiga externa inhysningstanken, eller med den ospecifika virtuella zonen - en ensidig extern tom inhysningstank.
    3. Fyll försökstankarna med 5 L (vattenpelarens höjd: 15 cm, samma höjd som vattenpelaren i de externa hustankarna) rent fiskvatten vid 28 °C.
    4. Justera tankens position framför kameran för att undvika förvrängd bild.
    5. Kontrollera att systemet får homogen belysning.
    6. Introducera försökspersonerna, en efter en, i botten av experimenttankarna innan du omedelbart börjar spela in med djuret nere i mitten.
    7. Undvik visuell interaktion mellan observatörer och djur under inspelning.
    8. I slutet av den 6 minuter långa inspelningen överför du de nuvarande djuren till ett annat akvarium för att inte blanda dem med de naiva djuren.
    9. Upprepa proceduren med alla tillgängliga motiv. Ha totalt 18 försökspersoner per tillstånd för att få meningsfulla resultat i enskilda prövningar (från två eller flera oberoende replikat).

3. Videoinspelning för beteendetester

  1. Öppna kamerahanteraren för att kontrollera tillgängligheten för GigE-kameran på varje dator.
  2. Starta programvaran för GigE-kamerastyrning (t.ex. uEye Cockpit, som beskrivs här). Öppna alternativet Kamera , välj Monokromt läge och justera bildstorleken (1:2).
  3. Öppna Kameraegenskaper
    1. Under Kamera ställer du in Pixelklocka på Maximum, ställer in Bildfrekvensen på 30 bilder per sekund (fps) och justerar exponeringen (Auto eller Manuell justering om bilden är för mörk).
    2. Under Bild ställer du in Gain på 0 (Auto) och Black Levels (Auto eller Manuell justering för att få en bra kontrast).
    3. Under Storlek justerar du storleken på fönstret till det område som behöver graveras (Bredd: Bredd-Vänster, Höjd: Höjd-Överkant). Detta steg gör det möjligt att minska storleken på bilden och därmed den slutliga storleken på videon.
    4. Stäng Kameraegenskaper.
  4. Skapa en allmän mapp för experimentsessionen för att spara kamerainställningarna och videorna.
  5. Om du vill spara kamerainställningarna ställer du in Arkiv > Spara parametrar > Till fil och väljer den experimentmapp som nyligen skapats.
    OBS: Kamerainställningsfilen kan alltså laddas om i applikationen för att fortsätta arbeta med samma bildparametrar när som helst (t.ex. när kameran plötsligt stängs av eller för att återanvända samma inställningar, vilket minskar inställningstiden och homogeniserar experimentförhållandena). Om kameran fryser mellan videor på ett ögonblick ska du stoppa inspelningen, avsluta och stänga av kameran. Slå på den igen, ladda om kameraparametrarna genom att gå till File > Load Parameters > To File och starta om inspelningen. Kontrollera om den aktuella videon har förvärvats helt för att kasta eller upprepa fisken (innan du upprepar, ge djuren lite tid att acklimatisera sig igen).
  6. Upprepa denna kamerainställningsprocedur (steg 3.1-3.5) på alla kameror.
  7. När alla kameror är korrekt konfigurerade öppnar du Spela in videosekvens.
  8. Välj Skapa för att spara som en ny videofil, välj den experimentmapp som nyligen skapats och rapportera information om ämnet, typen av experiment och datumet i namnet på videofilen.
  9. Välj Max. Skriv 10800 i ramrutan. Standardvideo spelar in 6 min (video 1) med 30 fps i AVI-format; Därför är 6 min x 60 s x 30 fps = 10800 bilder totalt.
  10. Välj Beräkna bildfrekvens eller ange bildfrekvensen manuellt (inspelningshastighet: 30 fps).
  11. Upprepa proceduren för att skapa videofiler på alla datorer.
  12. Introducera försökspersonerna, en efter en, längst ner i varje experimentbassäng. Alla analyser kommer att köras på en gång.
  13. Starta posterna snabbt genom att klicka på Spela in och vänta tills du får maximalt antal begärda ramar (steg 3.10).
  14. När videorna är inspelade visas en chattruta med meddelandet Maximalt antal bildrutor uppnådda!. Välj Acceptera.
  15. Välj Stäng för att avsluta inspelningen och stänga videofilen.
  16. Ta bort fisken som just har observerats. Var noga med att skilja dem från de naiva fiskarna.
  17. Välj Skapa direkt och upprepa processen för att fortsätta spela in videor.
  18. När alla inspelningar är klara väljer du Avsluta.
  19. Om du vill stänga av kamerorna väljer du Stäng kamera och avslutar programmet.

4. Analys av inspelade videor

  1. Starta analysprogrammet (se Materialförteckning).
  2. Om du vill utveckla en ny mall klickar du på Ny från mall > Tillämpade en fördefinierad mall > Från videofil och väljer en video för att börja konfigurera mallen. Försök att välja en representativ video av experimentet med en försöksperson som uppvisar god rörlighet och goda inspelningsförhållanden.
  3. I Parametrar konfigurerar du parametrarna i följande fönster (1 till 4/7). Välj modellen Fisk > Vuxen Zebrafisk, arenan Open Field Square > One Arena, antalet motiv per arena (för ST krävs ett multispårningspaket [spåra olika ämnen i en arena]), typ av detektering med mittpunkt och justera slutligen bildfrekvensen till 30 fps. I följande fönster (5 till 7/7), ändra inte parametrar; standardkonfigurationen är OK.
  4. Namnge experimentet som en mall och placera det i samma mapp som resten av den lagrade videon. Mallen skapas som en experimentmapp med flera underavdelningar som innehåller all inställningsinformation.
  5. Under Experimentinställningar kontrollerar du den definierade inställningen (från videofil, arena, antal försökspersoner, bildruta per sekund). Här kan systemenheterna modifieras.
  6. Under Arenainställningar högerklickar du i mitten av skärmen och väljer Grab. Från Fil i displayen. Välj en videobild av god kvalitet och Acceptera för att ta den här bilden för bakgrundsinställningarna. Kalibrera först bilden och generera en kalibrerad regel. Använd tankens bredd som en skala (19 cm). Rita sedan arenan. Var noga med att göra kvadraten precis tillräckligt för att undvika reflektioner från djuret när det senare närmar sig ytan eller eventuell förväxling av fiskprogramvaran med de svarta områdena i akvariet. Slutligen ritar du formzonerna med funktionen Ram .
    1. För NTT och ST, dela upp tankens framsida i två lika stora virtuella zoner, topp och botten (se figur 1). Rita två lika stora horisontella rutor. Lådorna täcker en halv arena för var och en. Namnge Topp och Botten för den övre respektive nedre zonen. Var noga med att rutorna har samma bredd (9-10 cm) och längd (8-9 cm), inte överskrider arenans gränser (orange fyrkant) och inte överlappar varandra, kontrollera att varje pilzon anger exakt sina zoner.
    2. För SPT, dela upp den experimentella arenan konceptuellt i tre lika stora zoner: tom, centrerad och artfrände (se figur 1). Rita tre lika stora vertikala rutor. Namnge lådan som är orienterad mot stimtanken som Conart, lådan som är orienterad mot den tomma tanken som Tom och den mellersta som Center. Var noga med att lådorna har samma bredd (6 cm) och längd (18-19 cm), inte överskrider arenans gränser och inte överlappar varandra.
  7. Under Detektionsinställningar kontrollerar du vilken video som ska hanteras i videofilen. Kontrollera sedan detektionskvaliteten (fisk i gul, röd mittpunkt). Klicka på Auto Detect för att justera detekteringen, fokusera om djuret (välj en bild som djuret simmar i profil på den vita bakgrunden, rita bilden genom att ta hela kroppen och validera detekteringen med Ja). Öppna Avancerat för att förbättra detekteringen genom att välja Dynamisk subtraktion, Mörkare motiv, Bakgrundsinställningar, Bakgrundsinlärning, Motivstorlek, Brusreducering, etc.
  8. Under Inställningar för utvärderingsversioner lägger du till en utvärderingsversion och tar bort de andra (högerklicka och ta bort)
  9. Under Datainställningar skapar du dialogrutor för resultat . Parametrisera resultat per tid och per zon. Du kan till exempel skapa ett resultatfönster för utdata efter minuter och ett annat för utdata efter total tid (6 min). Begär datautdata för varje zon (begär det om avståndet i varje zon behövs). Länka de olika resultatfönstren till Start-fönstret med pilar.
  10. Under Analysera inställningar väljer du de parametrar som ska analyseras och typen av statistik för varje parameter. Dessa parametrar kommer att beräknas automatiskt baserat på de data som erhållits från spårningen.
    1. För NTT och SPT väljer du alternativ enligt definitionen nedan:
      1. Välj Flyttad sträcka (välj Totalt) för att få den tillryggalagda sträckan på arenan (cm) och den tillryggalagda sträckan i respektive zon (cm).
      2. Välj I zoner (välj Zoner, Frekvens, Kumulativ och Svarstid till först) för att få tiden som tillbringats i zonerna (s) och svarstiden till första ingången i zonerna (s).
      3. Välj zonövergång (välj tröskel: 0 cm, lägg till zon 1 > zon 2; Zon 2 > Zon 1, i valfri zon, Frekvens) för att få antalet ingångar i zonerna.
      4. Välj Mobilitetsläge (fyll i Hög mobil över 70 %, Immobil under 3 %, minst 150 bildrutor och välj frekvens, kumulativ och latens till först) för att få varaktigheten av hypermobilitet (s), varaktigheten av frysning (s).
        OBS: Se avsnittet Diskussion för mer information om approximationen av frysningsbeteende med hjälp av den automatiska analysen och antalet och varaktigheten/varaktigheterna av frysningsepisoder.
      5. Välj Acceleration och vridvinkel (välj frekvens och kumulativ) för att utvärdera förekomsten av komplexa beteenden som pilning och oregelbundna (snabba accelerationsrörelser).
    2. För ST, förutom ovanstående utforskande parametrar, välj alternativet Avstånd mellan ämnen (välj alla ämnen, medelvärde, maximum, minimum) för att få det genomsnittliga avståndet mellan fisk (cm), det genomsnittliga avståndet mellan närmaste granne (cm) och det genomsnittliga avståndet mellan den mest avlägsna grannen.
  11. Mallen är klar att användas. Spara de senaste ändringarna och stäng mallen utan att hämta några data från videon (behåll mallfilen, den är lätt och enkel att hantera och kopiera). Om det finns flera programvarulicenser analyserar du videorna från samma mall som kopierats till varje dator.
  12. Det finns två alternativ för att kopiera och använda mallen:
    1. Öppna mallfilen med programvaran för beteendeanalys, gå till Arkiv > Spara som för att skapa en ny identisk fil.
    2. I välkomstgränssnittet väljer du Ny från mall > Tillämpat en anpassad mall > Från videofil (välj mall. EthXV-filen). Namnge det nya experimentet och välj dess plats. Det kan ta några minuter för programvaran att kopiera informationen från mallfilen.
  13. Gå till Arenainställningar för att justera mallen igen om videon spelades in med en annan kamera (följ steg 4.6 och 4.7).
  14. Gå till Detektionsinställningar eller Förvärv för att kontrollera vilken video som är vald och ändra videofilen om det behövs.
  15. Under Förvärv väljer du DDS > redo att starta. Det kan ta några minuter för programvaran att bearbeta videon.
  16. När inhämtningen är klar går du till Spårredigeraren. Välj acceleration x16 för att läsa den bearbetade videon snabbare och kontrollera om spårningen är korrekt.
    OBS: Ibland kan det finnas "förluster" i spårningen (på grund av reflektioner eller förvirring av själva programvaran). De kan redigeras manuellt från den här delen om de är få; Annars är det bättre att bearbeta om hela experimentet och förbättra definitionen av arbetsytan och identifieringen.
  17. Under Statistik klickar du på Beräkna > exportera data. Dataexporten finns direkt i experimentmappen.
  18. Under Spårvisualisering eller Värmekartor genererar och exporterar du (högerklicka, exportera bild, välj mappen Exportera filer för experimentet för att spara dessa data med kalkylbladsrapporten) spårningsbilder av djuret.
  19. Gå till Arkiv för att stänga det aktiva experimentet och upprepa den här proceduren för nästa video.

5. Statistisk analys

  1. Analysera normaliteten (Shapiro-Wilk-testet) för data i varje grupp.
  2. Bedöm homoskedasticitet med Levenes test.
  3. Använd envägs ANOVA följt av Dunnetts och Tukeys multipla jämförelsetester för att testa skillnader mellan grupper när kriterier för normalitet och homoskedasticitet inte kan förkastas.
  4. Använd Kruskal-Wallis-testet följt av en parvis jämförelse med Bonferroni-korrigeringen för att testa skillnader mellan grupper när kriterier för normalitet och homoskedasticitet förkastas.
  5. Plotta data med grafisk programvara.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I det här avsnittet kommer vi att titta på några möjliga tillämpningar av dessa beteendeverktyg inom fiskneurotoxikologi. Följande resultat motsvarar karakteriseringen av de akuta effekterna eller berusningseffekterna av metamfetamin (METH), en rekreationsdrog, och de subkroniska effekterna av glyfosat, en av de viktigaste herbiciderna som finns i akvatiska ekosystem.

Karakterisering av en modell för neurotoxicitet hos vuxna zebrafiskar
Vid utvärdering av effekten av 40 mg/l METH på NTT (figur 3) bekräftade Kruskal-Wallis-testet att de exponerade djuren uppvisade en positiv geotaxi, kännetecknad av en minskning av undersökningstiden i den övre zonen av experimenttanken (H(2) = 35,964, P = 1,55 x 10-8), liksom av den tillryggalagda sträckan i denna del (H(2) = 32,272, P = 9,82 x 10-8) och i antalet besök (H(2) = 36,527, P = 1,17 x 10-8). Vi observerade också en signifikant ökning av latenstiden före det första besöket i den övre zonen (H(2) = 17,264, P = 0,00018). Det är viktigt att notera att de skillnader som observerats i de parametrar som uppmätts i NTT efter MET-exponering är konsekventa över tid, vilket bekräftas av Bonferroni-korrektionen (P > 0,8). En signifikant effekt av exponeringstiden hittades för frysbeteende (H(2) = 13,120, P = 0,0014).

Figure 3
Figur 3: Ångestliknande beteende bedömt i standard 6-minuters nytt akvarietest (NTT) av vuxna zebrafiskar som exponerats för 40 mg/L metamfetamin (METH) i 3 timmar och 48 timmar. Data från varje experiment normaliserades till motsvarande kontrollvärden. Kombinerade data rapporteras som ett spridningsdiagram med medianen (n = 14-15), **p < 0,01, ***p < 0,001; Kruskal Wallis test med Bonferroni-korrigering för NTT-slutpunkter. Data från 2 oberoende experiment. Denna figur har återgetts med tillstånd från Bedrossiantz et al.15. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Frysrörelser kan kvantifieras genom att bedöma frekvensen, latensen, varaktigheten eller platsen för frysningen. Det bästa sättet att poängsätta dem är utan tvekan en erfaren observatörs öga, vilket är ganska mödosamt och komplext, så vi provade ett automatiserat alternativ med hjälp av EthoVision-programvara för att upptäcka frysbeteende19. Vi fann att antalet, latensen och varaktigheten av frysattacker som beräknats av programvaran (tabell 1A) korrelerar med god noggrannhet med de episoder som observatören poängsatte manuellt (tabell 1B). Medan de två metoderna är likvärdiga när det gäller resultat (P = 0,958, Studentens test), använde vi den automatiserade metoden för att bedöma frysningen här. Efter 3 timmars exponering för METH ökade frystiden signifikant (P = 0,0012), medan ingen skillnad sågs med kontrollen efter 48 timmars exponering (P = 0,16). METH hade ingen effekt på oregelbundna rörelser vid någon av tidpunkterna.

Vi använde två experimentella paradigm för att utvärdera effekterna på socialt beteende efter akut exponering för METH. ST (Figur 4) visade att det genomsnittliga avståndet och det längsta avståndet mellan individer var signifikant större för METH-behandlade fiskar (H(2) = 53,261, P = 2,72 x 10-12; H(2)=52,504, P = 3,97 x 10-12 för genomsnittliga respektive längsta avstånd mellan fiskar), vilket pekar på en beteendefenotyp av social isolering. Återigen noterar vi att ingen tidseffekt hittades med Bonferroni post hoc-testet (P > 0,5).

Figure 4
Figur 4: Socialt beteende hos vuxna zebrafiskar som vattenburet exponerats för 40 mg/l metamfetamin (METH) i 3 timmar och 48 timmar. Resultat från stimtest, inklusive genomsnittliga och längsta avstånd mellan fiskarna. Kombinerade data rapporteras som ett spridningsdiagram med medianen (n = 18), *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001; Kruskal Wallis test med Bonferroni-korrigering. Data från 2 oberoende experiment. Denna figur har återgetts med tillstånd från Bedrossiantz et al.15. Klicka här för att se en större version av denna figur.

I SPT (figur 5) visar behandlad fisk en signifikant minskning av den tid som tillbringas och den tillryggalagda sträckan i den artspecifika zonen (F(2,74) = 14,497, P = 4,87 x 10-6; F(2,73) = 13,461, P = 0,00001 för tillbringad tid respektive tillryggalagd sträcka i den artspecifika zonen). Dessa resultat bekräftar den fenotyp av social isolering som TS-resultaten föreslår. Tukeys Honest Significant Difference (HSD) post hoc-test uteslöt inga möjliga skillnader mellan de två analystiderna (P > 0,5).

Figure 5
Figur 5: Socialt beteende hos vuxna zebrafiskar som vattenburet exponerats för 40 mg/l metamfetamin (METH) i 3 timmar och 48 timmar. Resultaten från det sociala preferenstestet (SPT), inklusive tid och avstånd för fisken i var och en av de tre virtuella zonerna i experimentakvariet: tom, centrerad och artfränder. Data från varje experiment normaliserades till motsvarande kontrollvärden. Kombinerade data rapporteras som ett spridningsdiagram med medianen (n = 17-20), *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001; envägs ANOVA med Dunnetts multipla jämförelsetest. Data från 2 oberoende experiment. Denna figur har återgetts med tillstånd från Bedrossiantz et al.15. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Beteendeeffekt av subkronisk exponering för miljönivåer av glyfosat
Beteendeanalys av effekterna av subkronisk exponering för 3 μg/L glyfosat på NTT (figur 6) visar en signifikant minskning av den tid som ägnas åt att utforska toppen (F2,77 = 8,744, P = 0,0004), tillryggalagd sträcka i denna del (F2,77 = 9,118, P = 0,0003) och antal besök (F2,77 = 3,441, P = 0,037). Dessa effekter är karakteristiska för positivt geotaxibeteende, liksom den ökade effekt som observerats på latenstiden före det första besöket på toppen av tanken (H(2) = 9,628, P = 0,008). Uttrycket av oberäkneliga och frysande beteenden hos de exponerade djuren analyserades också i NTT. Varaktigheten (H(2) = 17,261, P = 0,025) och antalet oregelbundna episoder (F2,76 = 10,073, P = 0,0001) ökade signifikant med glyfosat. Däremot hittades inga frysskillnader med kontrollen (Pearson Chi-Square(2) = 2,964, P = 0,253). Tillämpat på ett ekologiskt sammanhang tyder de observationer som gjorts vid NTT på att glyfosat avsevärt kan minska fiskars utforskande beteende, vilket äventyrar deras förmåga att överleva i det vilda.

Figure 6
Figur 6: Ångestliknande beteende bedömt i standard 6-minuters nytt akvarietest (NTT) av vuxna zebrafiskar som exponerats för 0,3 μg/L och 3 μg/L glyfosat under 2 veckor. Beteendeparametrar analyserades, samt en tecknad bild av experimenttanken uppdelad i två lika stora virtuella zoner, topp och botten. Data rapporterade som ett spridningsdiagram med medianen (n = 23-29), *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001; envägs ANOVA med Dunnetts multipla jämförelsetest (Total distans, Distans i toppen, Tid i toppen, Övergångar till toppen, Oberäkneliga anfall, Hög mobilitetsfrekvens) eller Kruskal Wallis-test med Bonferroni-korrigering (Latens till toppen, Oberäknelig varaktighet). Inga skillnader (P > 0,05) kunde påvisas i frysningstid och frysningar. Data från 2-4 oberoende experiment. Denna figur har återgetts med tillstånd från Faria et al.20. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Skolning, icke-polariserade grupper av artfränder som hålls samman av socialt tryck att skydda sig mot rovdjur, är en naturlig tendens hos Danio rerio. Skolan kan "stramas åt" eller "expandera" beroende på djurens nivå av ångest eller rädsla, en särskild visuell effekt som är mycket lätt att identifiera experimentellt (Figur 7). I glyfosatförsöket visade stimtestet en ökning av ångest hos fiskar som exponerats för 3 μg/l, vilket återspeglades av en gruppering av stimmet och därmed en signifikant minskning av det genomsnittliga avståndet och det längsta avståndet mellan individer (F2,56 = 5,664, P = 0,006 och F2,56 = 7,413, P = 0,001, för de genomsnittliga och längsta avstånden mellan fiskarna. respektive) jämfört med kontrollen.

Figure 7
Figur 7: Socialt beteende hos vuxna zebrafiskar som vattenburet exponerats för 0,3 μg/l och 3 μg/l glyfosat under 2 veckor. Data rapporterade som spridningsdiagram med medianen (n = 19-20), *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001; envägs ANOVA med Dunnetts multipla jämförelsetest (genomsnittligt interfishavstånd och längsta avstånd) Data från 2 till 4 oberoende experiment. Denna figur har återgetts med tillstånd från Faria et al.20. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Tabell 1: En uppskattning av frysningsbeteendet med hjälp av en automatiserad analys. Data som rapporteras i den här tabellen kommer från samma inspelning (video 1) som analyserats med två olika metoder. (A) Approximation av frysbeteende genom automatisk beräkning med programvaran EthoVision V13. Den variabla rörligheten beräknas från bytet av ämnesområdet mellan två prover, så det beror på förvärvsfrekvensen för detta område. Vi har satt en mycket låg tröskel för immobilitet (mindre än 3 % mobilitet) samt samplingsfrekvensen till en minsta kontinuerlig tid på 5 s (mer än 150 bilder). (B) Analys av frysningsbeteende med Behavioral Observation Research Interactive Software (BORIS, gratis programvara med öppen källkod). BORIS är en programvara för händelseloggning för videokodning och liveobservationer. Med BORIS kan observatören koda frysepisoden som en tillståndshändelse och definiera start- och slutpunkterna. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Video 1: Kontrollfisk i det nya akvarietestet. Klicka här för att ladda ner den här videon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Karakteristiskt ångestbeteende som observerats vid NTT har varit positivt korrelerat med serotoninnivåer som analyserats i hjärnor21. Till exempel, efter exponering för para-klorfenylalanin (PCPA), en hämmare av 5-HT-biosyntesen, uppvisade fiskar positiva geotaxis samt minskade 5-HT-nivåeri hjärnan 22, resultat som är mycket lika de som erhålls med METH. Därför tyder minskningen av serotoninnivåerna i hjärnan och uppvisandet av positiva geotaxibilar hos METH-exponerade zebrafiskar på att det ångestbeteende som produceras av drogen medieras av den serotonerga vägen. Intressant nog kan en liknande beteendefenotyp, dvs. en ångestframkallande effekt på geotaxis, ses hos vuxna zebrafiskar som exponerats under 2 veckor för 0,3 3 μg/L och 3 μg/L, två miljörelevanta koncentrationer av glyfosat. En ökning av geotaxi har tidigare rapporterats även för vuxna zebrafiskar med det neurotoxiska ämnet akrylamid 6,23. I alla dessa fall var denna beteendefenotyp (en ökning av geotaxi i NTT, karakteristisk för ångestframkallande substans) associerad med minskningen av monoaminerga neurotransmittornivåer. Därför ger NTT-paradigmet i kombination med neurokemisk analys av hjärnan ekologiskt relevant information, utforskande beteende och födosökseffektivitet och kopplar samman beteendeneurofenotyper med neurotransmittormodulationer.

Å andra sidan observerades också en försämring av sociala beteenden i båda analyserna, ST och SPT, hos METH-behandlade fiskar. Resultaten som erhölls i denna studie överensstämmer med flera studier med råttor och apor, där den akuta och kroniska exponeringen av försöksdjuren för METH resulterar i social tillbakadragenhet24. Sociala beteendeförändringar i samband med MET-missbruk har förklarats hos människor med försämringar i socialkognitiv funktion24. En ångestdämpande effekt på stimmets storlek sågs hos zebrafiskar som exponerats för 3 μg/l glyfosat under 2 veckor. Vi observerade en fenokopia av denna effekt hos zebrafiskar som exponerats för 53 mg/L (0,75 mM) akrylamid i 3 dagar 6,23.

NTT-, ST- och SPT-analyserna gör det möjligt att effektivt bestämma de potentiella neurotoxiska effekterna25 av ett brett spektrum av kemikalier, vilket illustreras av studien av modeller för akut metamfetamin och subkronisk glyfosattoxicitet hos vuxna zebrafiskar. Beteende är inom toxikologi ett relevant apikalt effektmått som karakteriserar effekterna på organismnivå av en kemikalie för neurotoxicitet och miljöforskning. Förutom att vara ett subletalt effektmått under laboratorieförhållanden kan förändringar i beteenden, såsom utforskande eller socialt beteende, vara skadliga till sin natur. Dessutom är det föreslagna beteendeanalysbatteriet en lättimplementerad, halvautomatiserad metod11 och därför mycket effektiv om analyserna är medvetet planerade (reduktionsprincipen)26. Att utföra dessa analyser som ett testbatteri med en enda tank minskar antalet djur och experimenttiden och avfallsgenereringen.

Ordningen på analyserna i batteriet är en viktig faktor om vi vill studera en individs svarsprofil i varje försök. För detta ändamål gör genomförandet av de individuella analyserna som följs (se figur 2) det möjligt att hålla djuret identifierat och att relatera dess utforskande beteende till dess sociala preferenser. Dessutom kan djurets beteendemässiga reaktioner relateras till andra biologiska data, t.ex. dess neurotransmittorprofil eller genuttryck, om fisken hålls identifierad fram till provtagningens slutpunkt (figur 2A).

Vanligtvis gör beteendeanalys det möjligt att observera skillnader mellan grupper. Först beräknas individuella svar på grundval av djurspårning27 innan uppgifterna slås samman per grupp. Därefter jämförs medelvärdet och skillnaden i varians med avseende på kontrollgruppen för varje beräknad beteendeparameter. Med stimanalys12 är det viktigt att vara mycket tydlig med att variansenheten är gruppen av testfiskar, inte enskilda fiskar eftersom beteendet hos varje enskild fisk påverkas av de andra fiskarna i stimmet. Detta är det sätt som används i de flesta artiklar för att bearbeta beteendedata28. Det kan dock vara bra att tänka om när det gäller analysen av beteendeparametrar, inte parameter för parameter, utan som ett övergripande svar per försök. Till exempel kan man beräkna kovariansen för varje mätning som görs i en studie och rapportera det som ett annat sätt att mäta samma sak: ängsligt, utforskande eller sällskapligt beteende. Det finns många sätt att beräkna och tolka beteendedata 28,29. Beroende på antalet förhållanden, typ av tester och bildinsamling (2D eller 3D)30,31 kan analysen omprövas helt för att få ut det bästa av data.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att forskningen genomfördes i avsaknad av kommersiella eller finansiella relationer som skulle kunna tolkas som en potentiell intressekonflikt.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av "Agencia Estatal de Investigación" från det spanska ministeriet för vetenskap och innovation (projekt PID2020-113371RB-C21), IDAEA-CSIC, Severo Ochoa Centre of Excellence (CEX2018-000794-S). Juliette Bedrossiantz fick stöd av ett doktorandstipendium (PRE2018-083513) som samfinansierades av den spanska regeringen och Europeiska socialfonden (ESF).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aquarium Cube shape Blau Aquaristic 7782025 Cubic Panoramic 10  (10 L, 20 cm x 20 cm x 25 cm, 5 mm)
Ethovision software Noldus Ethovision XT Version 12.0 or newer
GigE camera Imaging Development Systems UI-5240CP-NIR-GL
GraphPad Prism 9.02 GraphPad software Inc GraphPad Prism 9.02  For Windows
IDS camera manager Imaging Development Systems
LED backlight illumination Quirumed GP-G2
SPSS Software IBM IBM SPSS v26
uEye Cockpit software  Imaging Development Systems version 4.90

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Raldúa, D., Piña, B. In vivo zebrafish assays for analyzing drug toxicity. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 10 (5), 685-697 (2014).
  2. Faria, M., Prats, E., Bellot, M., Gomez-Canela, C., Raldúa, D. Pharmacological modulation of serotonin levels in zebrafish larvae: Lessons for identifying environmental neurotoxicants targeting the serotonergic system. Toxics. 9 (6), 118 (2021).
  3. Faria, M., et al. Zebrafish models for human acute organophosphorus poisoning. Scientific Reports. 5, 15591 (2015).
  4. Faria, M., et al. Glyphosate targets fish monoaminergic systems leading to oxidative stress and anxiety. Environment International. 146, 106253 (2021).
  5. Faria, M., et al. Screening anti-predator behaviour in fish larvae exposed to environmental pollutants. Science of the Total Environment. 714, 136759 (2020).
  6. Faria, M., et al. Acrylamide acute neurotoxicity in adult zebrafish. Scientific Reports. 8 (1), 7918 (2018).
  7. Kalueff, A. V., Stewart, A. M. Zebrafish Protocols for Neurobehavioral Research. Neuromethods. , Springer Prtocols, Humana Totowa, NJ. (2012).
  8. Kalueff, A. V., et al. Towards a comprehensive catalog of zebrafish behavior 1.0 and beyond. Zebrafish. 10 (1), 70-86 (2013).
  9. Egan, R. J., et al. Understanding behavioral and physiological phenotypes of stress and anxiety in zebrafish. Behavioural Brain Research. 205, 38-44 (2009).
  10. Noldus. Social behavior in Zebrafish. , https://www.noldus.com/applications/social-behavior-zebrafish (2012).
  11. Green, J., et al. Automated high-throughput neurophenotyping of zebrafish social behavior. Journal of Neuroscience Methods. 210 (2), 266-271 (2012).
  12. Miller, N., Gerlai, R. Quantification of shoaling behaviour in zebrafish (Danio rerio). Behavioural Brain Research. 184 (2), 157-166 (2007).
  13. Landin, J., et al. Oxytocin receptors regulate social preference in zebrafish. Scientific Reports. 10 (1), 5435 (2020).
  14. Ogi, A., et al. Social preference tests in zebrafish: A systematic review. Frontiers in Veterinary Science. 7, 590057 (2021).
  15. Bedrossiantz, J., et al. A zebrafish model of neurotoxicity by binge-like methamphetamine exposure. Frontiers in Pharmacology. 12, 770319 (2021).
  16. Hamilton, T. J., Krook, J., Szaszkiewicz, J., Burggren, W. Shoaling, boldness, anxiety-like behavior and locomotion in zebrafish (Danio rerio) are altered by acute benzo[a]pyrene exposure. Science of the Total Environment. 774, 145702 (2021).
  17. Kane, A. S., Salierno, J. D., Brewer, S. K. Chapter 32. Fish models in behavioral toxicology: Automated Techniques, Updates, and Perspectives Methods in Aquatic Toxicology. Volume2, Lewis Publishers, Boca Raton, FL. (2005).
  18. Leary, S. L., et al. AVMA guidelines for the euthanasia of animals: 2020 edition. , www.avma.org/sites/default/files/2020-02/Guidelines-on-Euthanasia-2020.pdf (2020).
  19. Grieco, F., Krips, O. Help (PDF version) EthoVision ® XT. , www.noldus.com (2017).
  20. Faria, M., et al. Glyphosate targets fish monoaminergic systems leading to oxidative stress and anxiety. Environment International. 146, 106253 (2021).
  21. Maximino, C., Costa, B., Lima, M. A review of monoaminergic neuropsychopharmacology in zebrafish, 6 years later: Towards paradoxes and their solution. Current Psychopharmacology. 5 (2), 96-138 (2016).
  22. Maximino, C., et al. Role of serotonin in zebrafish (Danio rerio) anxiety: Relationship with serotonin levels and effect of buspirone, WAY 100635, SB 224289, fluoxetine and para-chlorophenylalanine (pCPA) in two behavioral models. Neuropharmacology. 71, 83-97 (2013).
  23. Faria, M., et al. Therapeutic potential of N-acetylcysteine in acrylamide acute neurotoxicity in adult zebrafish. Scientific Reports. 9 (1), 16467 (2019).
  24. Homer, B. D., Solomon, T. M., Moeller, R. W., Mascia, A., DeRaleau, L., Halkitis, P. N. Methamphetamine abuse and impairment of social functioning: A review of the underlying neurophysiological causes and behavioral implications. Psychological Bulletin. 134 (2), 301-310 (2008).
  25. Linker, A., et al. Assessing the maximum predictive validity for neuropharmacological anxiety screening assays using zebrafish. Neuromethods. 51, 181-190 (2011).
  26. Hartung, T. From alternative methods to a new toxicology. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 77 (3), 338-349 (2011).
  27. Cachat, J. M., et al. Video-Aided Analysis of Zebrafish Locomotion and Anxiety-Related Behavioral Responses. Zebrafish Neurobehavioral Protocols. Neuromethods. Kalueff, A., Cachat, J. 51, Humana Press. (2011).
  28. Rosemberg, D. B., et al. Differences in spatio-temporal behavior of zebrafish in the open tank paradigm after a short-period confinement into dark and bright environments. PLoS ONE. 6 (5), e19397 (2011).
  29. Blaser, R., Gerlai, R. Behavioral phenotyping in Zebrafish: Comparison of three behavioral quantification methods. Behavioral Research Methods. 38 (3), 456-469 (2006).
  30. Cachat, J., et al. Three-dimensional neurophenotyping of adult zebrafish behavior. PLoS ONE. 6 (3), e17597 (2011).
  31. Cachat, J. M., et al. Deconstructing adult zebrafish behavior with swim trace visualizations. Neuromethods. 51, 191-201 (2011).

Tags

Denna månad i JoVE Zebrafish neurotoxicitetstestning videoinspelning utforskande aggressiva sociala beteenden applikationer
Neurotoxicitetsbedömning hos vuxna <em>Danio rerio</em> med hjälp av ett batteri av beteendetester i en enda tank
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bedrossiantz, J., Prats, E.,… More

Bedrossiantz, J., Prats, E., Raldúa, D. Neurotoxicity Assessment in Adult Danio rerio using a Battery of Behavioral Tests in a Single Tank. J. Vis. Exp. (201), e65869, doi:10.3791/65869 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter