Murine Chimeric Antigen Receptor (CAR)-T cell의 효율적인 생성

키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 입양 T 세포 치료제는 적응 면역 체계의 힘을 활용하여 항원 양성 암세포를 특이적으로 표적으로 삼고 제거함으로써 암 면역 요법 분야에 혁명을 일으켰습니다¹. B세포 악성종양을 표적으로 하는 CAR-T 세포 치료제의 성공은 임상적으로 검증되었지만, 동물 모델에서 수행된 전임상 연구는 고형 종양을 표적으로 하는 새로운 CAR의 개발에 여전히 중요합니다. 그러나 지금까지 고형 종양 적응증에서 제한적인 임상적 효능이 입증되었으며, 개별 전임상 모델이 살아있는 의약품의 약력학 및 임상적 효능을 정확하게 예측하지 못한다는 것이 점점 더 분명해지고 있습니다 ^2,3. 따라서 연구자들은 CAR-T 세포 제품의 전임상 연구를 확대하여 인간 및 쥐 암의 이종이식 및 합성 유전자 모델에서 각각 병행 평가를 포함하기 시작했습니다.

인간 종양과 T 세포를 면역 결핍 마우스에 생착하는 이종이식 모델과 달리, 합성 유전자 모델은 기능적 면역 체계의 맥락에서 CAR-T 세포 반응을 검사할 수 있습니다. 특히, 합성 종양을 보유한 면역 유능한 마우스는 종양 미세환경(TME)에서 T 세포 기능을 억제하는 것으로 알려진 종양 관련 대식세포(TAM) 및 조절 T 세포(Tregs)를 포함하여 입양 전이된 T 세포와 맥락 특이적 환경 간의 상호 작용을 연구할 수 있는 시스템을 제공합니다.^4,5,6. 또한, 합성유전자 모델은 사이토카인 방출 증후군(cytokine release syndrome)을 포함한 추가 독성을 유발할 수 있는 숙주 인자와의 표적 독성, 종양 외 독성 및 CAR-T 세포 상호작용을 평가할 수 있는 추가 플랫폼을 제공한다⁷.

이러한 장점에도 불구하고 합성유전자 CAR-T 세포 연구의 수는 여전히 제한적입니다. 특히, syngeneic 모델은 동일한 마우스 균주에서 CAR-T 세포의 자가 엔지니어링을 필요로 하므로 효율적인 쥐 T 세포 transduction 및 ex vivo 확장을 위한 방법론이 부족하기 때문에 추가적인 문제가 발생합니다 ^2,8. 이 프로토콜은 레트로바이러스 벡터 생산과 최적화된 T 세포 transduction을 통해 안정적인 CAR 발현을 달성하는 방법을 설명합니다. 전체 공정의 개략도는 그림 1에 나와 있습니다. 이 접근법을 사용하면 쥐 CAR-T 세포의 효율적인 레트로바이러스 transduction과 초원심분리를 통해 바이러스 농도 없이 높은 CAR 발현을 달성할 수 있습니다. CAR 구조체의 항원 특이성을 변화시키기 위한 전략은 추가적인 전이유전자의 동시 발현과 함께 논의된다.

모든 동물 시술은 20-25g의 6-8주 된 암컷 BALB/c 또는 CF57BL/6 마우스를 사용하여 기관 동물 관리 및 사용 위원회(Columbia University, 프로토콜 AC-AABQ5551 및 AC-AAAZ4470)의 승인을 받아 수행되었습니다. 동물은 상업적 출처에서 얻었다( 자료표 참조). 이 프로토콜은 쥐 T 세포의 '활성화 후 며칠'을 중심으로 구성되며, 바이러스 생산은 -2일째에 시작됩니다. 레트로바이러스는 초기 생산 후 -80°C에서 보관할 수 있으며, 이 프로토콜의 향후 사용을 위해 2단계, T 세포 분리 및 0일째 활성화로 시작할 수 있습니다.

1. 레트로바이러스 벡터 생산

참고: 바이러스 산물은 패키징 유전자를 두 개의 개별 플라스미드로 분리하여 복제 결함을 만들었으며( 재료 표 참조), 재조합 이벤트 및 복제 가능 바이러스의 우발적인 생산 가능성을 크게 줄였습니다.

1. transfection(-2일차 절차) 하루 전에 Phoenix Eco 세포를 준비합니다.
   1. 30mL의 배양 배지(표 1에 자세히 설명된 Phoenix Eco 배양 배지)를 사용하여 15cm TC 처리된 플레이트 또는 T150 배양 플라스크에 약 1 x 10⁷ 세포를 플레이트합니다.
   2. 37 °C에서 밤새 배양합니다. 18-24시간 후, 세포는 약 70% 합류하고 균일하게 분포되어 과증식 없이 높은 바이러스 수율을 보장해야 합니다.
      참고: 최적의 결과를 얻으려면 통로가 낮은 세포를 사용하고 바이러스 생성을 위해 플레이팅 전날 통과시킵니다. 일상적인 배양 중에 Phoenix Eco 세포가 과도하게 증식하지 않도록 하십시오.
2. 환원 혈청 배지(재료 표 참조)에서 lipofection 및 enhancer 시약, pCL-Eco(Gag/Pol) 및 pMSCV 발현 플라스미드(pMSCV_PGK_mGFP28z)를 포함하는 transfection 혼합물을 준비합니다(-1일 절차).
   참고: co-transfection은 pMSCV와 pCL-Eco의 1:1 비율로 수행해야 합니다.
   1. 튜브 A 준비: 15cm 플레이트당 3.75mL의 환원 혈청 배지에 transfection 시약 105μL를 희석하고 위아래로 볼텍싱 또는 피펫팅하여 완전히 혼합합니다.
   2. 튜브 B 준비: pMSCV 발현 플라스미드(21μg) 및 pCL-Eco(21μg)를 90μL의 인핸서 시약으로 희석하여 15cm 플레이트당 3.75mL의 환원 혈청 배지에 희석합니다. 위아래로 피펫팅하여 잘 섞습니다.
      참고: 여러 바이러스 제품을 생성하는 경우 pCL-Eco와 인핸서 시약을 포함하는 마스터 믹스를 설정합니다.
   3. 튜브 A를 튜브 B에 추가하고 피펫팅으로 완전히 혼합합니다. 실온에서 10-20분 동안 배양하면 총 부피가 약 7.5mL가 됩니다.
   4. Phoenix Eco 플레이트에서 세포 배양 배지 10mL를 조심스럽게 제거하고 플레이트를 기울이고 피펫팅하여 transfection mix의 전체 부피를 나머지 배지에 추가합니다. 세포를 37°C 인큐베이터로 되돌립니다.
3. transfection 후 16-20시간 후에 transfection된 Phoenix Eco 세포의 배지를 교체합니다(Day 0 절차).
   1. 혈청 및 β-메르캅토에탄올(2-ME, 재료 표 참조)-free murine T cell 배지(mTCM-viral harvest, 표 1에 열거된 바와 같이)를 물 또는 비드 배스를 사용하여 37°C로 사전 예열한다.
   2. 가능한 경우 진공 청소기를 사용하여 플레이트를 기울이고 피펫 팁을 하단 모서리에 놓아 Phoenix Eco 배양 배지를 조심스럽게 제거합니다. 세포를 과도하게 건조시키지 마십시오.
   3. 가장 느린 설정에서 30mL를 피펫팅하여 가열된 mTCM-viral 수확 배지를 기울어진 플레이트의 측면에 부드럽게 추가합니다. 세포를 37°C 인큐베이터로 되돌립니다.
      참고: 이 단계를 통해 Phoenix Eco 세포가 플레이트에서 분리되어 바이러스 역가가 감소할 수 있습니다. 미리 예열된 매체와 부드러운 피펫팅으로 중단을 최소화할 수 있습니다.
4. 형질주입 후 48시간 후에 바이러스 상등액을 수확합니다(1일차 절차).
   1. 바이러스 상층액을 채취하고 0.45μm PVDF 필터( 재료 표 참조)를 통해 여과하여 세포와 파편을 제거합니다. 바이러스를 분주하여 -80°C에서 동결시키거나 신선한 바이러스를 사용하는 경우 3단계 1일차로 바로 진행합니다.
   2. 앞서 설명한 바와 같이 유세포 분석으로 바이러스 역가(transducing units/mL)를 측정합니다⁹. 이 단계는 선택 사항입니다.
      1. 레트로넥틴(재료 표 참조)으로 사전 코팅되고 100μL의 mTCM-바이러스 수확 배지의 최종 부피에 레트로바이러스 상층액의 3중 연속 희석액을 로드한 비조직 배양(TC) 처리된 96웰 플레이트에서 1 x 10⁵ 활성 쥐 T 세포의 소규모 transduction을 통해 바이러스 역가를 측정합니다.
         참고: T 세포 분리, 활성화 및 transduction에 대한 자세한 지침은 아래의 2단계 및 3단계를 참조하십시오.
      2. 형질도입 후 4-5일 후에 유세포 분석을 통해 CAR 표면 발현을 측정합니다.
      3. 식¹⁰에 따라 바이러스 역가를 계산합니다: (N x F x D)/V, 여기서 N은 형질도입된 세포의 수, F는 CAR 양성 세포의 빈도, D는 희석 인자, V는 형질도입 부피(mL)로 형질도입 단위(TU)/mL를 구합니다.
         알림: 바이러스 역가는 동결/해동 시 감소할 수 있습니다. 따라서 바이러스 역가는 냉동 및 해동된 바이러스에서 이상적으로 측정됩니다.

2. 쥐 T 세포 분리

1. 쥐 T 세포를 분리하고 활성화합니다(Day 0 절차).
   알림: 이 단계는 실온(RT) 또는 4°C에서 수행할 수 있으며 멸균 환경에서 수행해야 합니다.
   1. 앞서 기술한 바와 같이 관심의 마우스 균주(예를 들어, Balb/c, C57BL/6)로부터 비장(들)을 수확하고,¹¹ 을 통해 단세포 현탁액을 수득한다.
   2. 멸균 주사기 뒷면을 사용하여 70-100μm 세포 여과기를 통해 비장을 50mL 원뿔형 튜브로 분쇄합니다.
   3. 주사기를 따로 보관한 후 5mL의 T 세포 분리 완충액(인산염 완충 식염수, PBS, 2% 소 태아 혈청, FBS 보충)으로 여과기를 세척합니다.
   4. 으깬 단계를 반복하고 5mL의 T 세포 분리 완충액으로 여과기를 한 번 더 세척합니다. T 세포 분리 완충액을 사용하여 최종 부피를 50mL로 만듭니다.
   5. 수동 혈구계 또는 자동 세포 계수기를 사용하여 1:20 비율로 희석한 다음 트리판 블루와 1:1로 혼합하여 살아있는 세포를 계수합니다.
   6. 4°C(또는 RT)에서 450 x g에서 10분 동안 원심분리를 통해 세포를 펠렛화하고, 권장되는 T 세포 분리 키트를 사용하는 경우 1 x 10⁸/mL에서 비장 세포를 다시 현탁시킵니다( 재료 표 참조).
      참고: 이 단계에서 40-70μm 스트레이너를 통해 비장 세포를 다시 변형하여 덩어리를 제거할 수 있습니다.
2. 제조업체의 지침에 따라 negative selection으로 CD3⁺ T 세포를 분리합니다( 재료 표 참조). 자기 분리 후 분리물을 15mL 코니컬 튜브로 옮기고 최종 살아있는 세포 계수를 수행합니다.
3. 분리된 T 세포를 4°C(또는 RT)에서 450 x g에서 10분 동안 원심분리하여 펠렛화하고 mTCM 활성화 배지에서 1 x 10⁶/mL로 다시 현탁시킵니다(표 1).
4. murine anti-CD3/anti-CD28 monoclonal anti-anti-cell-coated magnetic beads( 재료 표 참조)를 25 μL/1 x 10⁶ T cell 및 100 U/mL IL-2의 비율로 첨가하여 T cell을 활성화합니다.
5. 세포를 37°C의 인큐베이터에 넣고 하룻밤 동안 그대로 둡니다.
   참고: T 세포의 크기가 작기 때문에 1:10-1:20 비율로 희석하고 혈구계를 사용하여 수동 계수를 위해 트리판 블루와 1:1로 혼합하여 보다 정확한 살아있는 T 세포 수를 얻을 수 있습니다. 순도는 형광 접합 αCD3 항체로 세포를 염색하여 유세포 분석으로 측정할 수 있습니다. 각 비장은 쥐의 나이와 변형에 따라 7-10 x 10⁶ T 세포를 생성합니다.

3. 쥐 T 세포 형질 도입

1. 형질도입을 위한 플레이트를 준비합니다(Day 0 절차).
   1. 처리되지 않은 멸균 24웰 플레이트를 0.5mL의 인간 피브로넥틴 형질 도입 인핸서 시약( 재료 표 참조)을 멸균 PBS에 희석하여 최종 농도 20-40μg/mL로 사전 코팅하고 4°C에서 밤새 보관합니다.
      참고: 이 단계는 처리되지 않은 24웰 플레이트를 형질도입 시약으로 코팅하고 실온에서 2시간 동안 배양하여 1일차에 수행할 수도 있습니다.
2. T 세포 형질도입을 수행합니다(1일차 절차).
   1. 형질주입을 위해 사전 코팅된 플레이트를 준비합니다. 사전 코팅된 24웰 플레이트의 각 웰에서 transduction 시약을 제거하고 동일한 부피의 멸균 여과된 PBS + 2% 소 혈청 알부민(BSA)(0.5mL)으로 RT에서 30분 동안 블록합니다.
   2. 0.5-1mL의 PBS로 한 번 씻으십시오.
3. 1단계에서 0.5-1mL의 순수 레트로바이러스를 추가하거나 바이러스 역가를 기준으로 희석하여 사전 코팅된 각 웰과 원심분리기에 2,000 x g 및 32°C에서 90분 동안 추가합니다.
4. 1mL의 활성화된 T 세포를 바이러스가 로딩된 각 웰에 추가하고 450 x g 및 32°C에서 10분 동안 원심분리합니다. 밤새 세포를 37°C 인큐베이터로 되돌립니다.
5. 형질도입 24시간 후 1-1.5mL의 세포 배양 배지를 제거하고 1-1.5mL의 mTCM-complete와 10ng/mL의 재조합 인간 IL-7 및 IL-15로 교체합니다( 재료 표 참조). 세포를 37°C 인큐베이터로 되돌립니다(2일차 절차).
   참고: 체외 배양 중에는 48시간마다 10ng/mL의 사이토카인을 배양액에 추가해야 하며, T 세포는 1 x 10⁶/mL 이상으로 희석해서는 안 됩니다.
6. 형질도입 후 48시간 후, 형질주입 플레이트에서 새로운 24웰 또는 6웰 플레이트로 세포를 옮기고 세포를 37°C 인큐베이터로 되돌립니다(3일차 절차).
   참고: T 세포 생존율은 시작 T 세포 생존율과 바이러스 역가에 따라 형질도입 후 24시간에서 2일 후에 세포를 이식함으로써 개선될 수 있습니다.
7. T 세포를 비드(de-bead)하고 CAR 발현을 확인합니다(5-6일 절차).
   1. αCD3/CD28 코팅된 비드에서 활성화된 T 세포를 분리하기 위해 세포를 완전히 다시 현탁시키고( 재료 표 참조) 세포 현탁액을 자석에 30초 동안 놓습니다. 세포 현탁액을 원하는 체외 배양 용기로 옮기고 37°C 인큐베이터로 되돌립니다.
      참고: T 세포는 배양 플라스크 또는 딥웰 배양 플레이트에서 배양할 수 있습니다. 6-웰 형식 플레이트의 깊은 웰에서 웰당 30mL의 mTCM-complete 배지에 최소 5 x 10⁶ T 세포를 도금하는 것이 좋습니다( 재료 표 참조).
   2. 유세포 분석으로 CAR 발현 확인⁸.
      참고: GFP-CAR 발현은 정제된 GFP 100ng/mL로 배양하여 결정되었습니다. N-말단 에피토프 태그의 통합은 대체 CAR 구조의 검출을 용이하게 할 것입니다.
8. CAR-T 세포의 체외 배양을 수행합니다(7-10일 절차).
   1. 체외 배양 중에는 배양 배지의 50%를 제거하고 48시간마다 신선한 mTCM-complete + 2x 10ng/mL의 IL-7 및 IL-15로 교체하여 세포를 유지합니다.
      참고: Murine CAR-T 세포는 활성화 후 7일이 지나면 다운스트림 응용 분야에서 사용할 준비가 되어 있으며 해동 후 생존력이 좋지 않기 때문에 냉동 보존해서는 안 됩니다.

여기에 설명된 프로토콜은 마우스 CAR-T 세포 생성을 위한 쥐 T 세포 형질도입 과정을 표준화하는 것을 목표로 합니다. 그림 1 은 관련된 단계에 대한 자세한 설명을 제공합니다. 이 공정은 바이러스 성분을 Phoenix Eco 세포로 동시 transfection 하여 레트로바이러스 벡터를 생성하는 것으로 시작됩니다. 그림 2 는 transfection 당일 Phoenix Eco 세포의 최적 밀도 이미지를 제공합니다. 그런 다음 분리된 T 세포는 transfection 24시간 후 또는 이 프로토콜의 'Day 0'에 활성화되어 1일차에 transduction을 준비합니다. 형질도입 후, CAR-T 세포는 재조합 인간 IL-7 및 IL-15가 있는 상태에서 배양하여 줄기세포 기억 집단을 보존하면서 충분한 배드 확장을 달성합니다.

이 프로토콜과 함께 권장되는 murine T cell 분리 키트(재료 표 참조)를 사용하면 유세포 분석으로 측정한 대로 transduction 전에 <98%의 T 세포 순도를 얻을 수 있습니다(그림 3A). 또한, 65%-75%의 재현 가능한 CAR 발현률은 이 프로토콜과 PGK 프로모터로부터 CAR 구조를 발현하도록 변형된 pMSCV 레트로바이러스 벡터를 사용하여 달성할 수 있습니다(그림 3B,C). 레트로바이러스 역가를 측정하면 pMSCV와 pCL-Eco의 동시 형질주입 후 수거된 바이러스 상등액의 1/3에서 최대 ~2 x 107TU/mL의 역가와 74%의 CAR 발현이 나타납니다(보충 그림 1).

마지막으로, 10ng/mL의 IL-7 및 IL-15를 사용한 체외 배양은 약 15배 확장을 유도하여 단일 비장에서 활성화 후 10일차까지 ~150 x 106 T 세포를 생성합니다(그림 3D). IL-7 및 IL-15를 사용한 배양은 유사한 CD8+ 및 CD4+ T 세포 빈도(그림 3E)와 10일간의 체외 배양 후 CD62L+CD44- 발현에 의해 결정된 보존된 줄기 세포 기억 집단으로 이어집니다(그림 3F).

그림 1: 프로토콜 개요. 상단 패널: 프로토콜 타임라인의 개략적인 개요입니다. 하단 패널: 레트로바이러스 벡터 생산 및 마우스 T 세포 transduction에 대한 단계별 지침. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: transfection을 위한 최적의 세포 밀도. pMSCV 및 pCL-Eco를 사용한 transfection을 사용한 transfection 전 최적의 밀도에서 Phoenix Eco 세포의 명시야 현미경 이미지. 10x 대물 렌즈를 사용하여 캡처했습니다. 스케일 바 = 200 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 쥐 CAR-T 세포 생산 및 생체 외 배양. (A) 쥐 T 세포 분리 후 BALB/c CD3+ 세포의 빈도를 보여주는 유세포 분석 플롯. (B) 쥐 T 세포에서 GFP-CAR 발현에 사용되는 pMSCV 레트로바이러스 벡터의 개략도. (C) 정제된 sfGFP로 배양한 후 마우스 T 세포에서 CAR 표면 발현을 보여주는 유세포 분석 히스토그램. UT, 트랜스듀싱되지 않음. (D) 활성화 후 10일까지 CAR-T 세포의 배형 증식 및 재조합 인간 IL-17 및 IL-15로 배양. 대략 8 x 106 쥐 T 세포는 형질도입 전에 활성화되었고, 활성화 후 10일째에 대략 1.28 x 108에 도달하였다. (E) 활성화 후 10일째에 CD8+ 및 CD4+ CAR-T 세포의 빈도를 보여주는 유세포 분석 플롯. (F) CD62L 및 CD44 표면 발현에 의해 결정된 CD8+ T 세포 기억 집단의 빈도를 보여주는 유세포 분석 플롯. 줄기세포 기억(TSCM)은 CD62L+CD44-, 중추기억(TCM)은 CD62L+CD44+, 이펙터 기억(TEM)은 CD62L-CD44+를 특징으로 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1: 세포 배양 배지 제형. 프로토콜에 사용되는 세포 배양 배지에 대한 제형 세부 정보. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 1: CAR 표면 발현 및 레트로바이러스 역가. (A) 정제된 sfGFP로 배양한 후 BALB/c T 세포에서 CAR 표면 발현을 보여주는 유세포 분석 히스토그램. 레트로바이러스는 pCL-Eco 및 pMD2.G(I), pCL-Eco(II) 또는 단독(III)과 함께 pMSCV_PGK_mGFP28z Phoenix Eco 세포를 transfection하여 생성되었습니다. T 세포는 지시된 바와 같이 희석된 레트로바이러스로 형질주입하였다. (B) 형질도입된 T 세포의 CAR 표면 발현에 의해 결정된 레트로바이러스 역가. 형질도입 단위(TU)/mL는 (N∙F∙D)/V 공식을 사용하여 계산되었으며, 여기서 N은 형질도입된 세포의 수(1 x 105), F는 CAR+ 세포의 빈도, D는 희석 인자, V는 형질도입 부피(mL)(0.2mL)입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 1: pMSCV 발현 벡터 시퀀스. GFP28z CAR의 염기서열과 pMSCV 발현 벡터의 측면 염기서열(기울임꼴)은 NotI 및 BamHI 효소 부위가 파란색으로 강조 표시되어 있습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

이해 상충이 선언되지 않았습니다.