Summary
マウス肺内気管移植(IPTT)モデルは、肺移植後の閉塞性気道疾患(OAD)の研究に有用です。同種移植後の気道閉塞における肺特異的な免疫学的および血管新生挙動に関する洞察を高い再現性で提供します。ここでは、IPTTの手順と期待される結果について説明します。
Abstract
マウス肺内気管移植(IPTT)は、肺移植後の閉塞性気道疾患(OAD)のモデルとして使用されます。私たちのチームによって最初に報告されたこのモデルは、その高い技術的再現性と免疫学的行動と治療的介入の調査への適合性により、OADの研究に使用されています。
IPTTモデルでは、げっ歯類の気管移植片が胸膜からレシピエントの肺に直接挿入されます。このモデルは、移植片を皮下または大網に移植する異所性気管移植(HTT)モデルや、ドナーの気管がレシピエントの気管を置き換える同所性気管移植(OTT)モデルとは異なります。
IPTTモデルの実装を成功させるには、高度な麻酔および外科的スキルが必要です。麻酔スキルには、レシピエントの気管内挿管、適切な換気パラメータの設定、麻酔からの回復後の適切なタイミングでの抜管が含まれます。手術技術は、肺内に移植片を正確に配置し、空気漏れや出血を防ぐために内臓胸膜を効果的に密閉するために不可欠です。一般的に、学習プロセスには約2か月かかります。
HTTおよびOTTモデルとは対照的に、IPTTモデルでは、同種移植片気道は関連する肺微小環境で気道閉塞を発症します。これにより、研究者は肺特異的な免疫学的および血管新生を研究することができます 肺移植後の気道閉塞に関与するプロセス。さらに、このモデルは、ヒトの肺同種移植片にも見られる第三次リンパ器官(TLO)を示すという点でもユニークです。TLOはT細胞集団とB細胞集団で構成され、免疫細胞の動員を指示する高い内皮細静脈の存在を特徴としています。したがって、それらは移植片の受容と拒絶に重要な役割を果たす可能性があります。IPTTモデルは、肺移植同種移植片における気道閉塞の発症に関与する肺内免疫およびプロフィブロシス経路を研究するための有用なツールであると結論付けています。
Introduction
肺移植は、末期呼吸器疾患の患者に対する有効な治療法として確立されています。しかし、ヒト肺移植レシピエントの生存率中央値は約6年にとどまり、閉塞性気道疾患(OAD)の一種である閉塞性細気管支炎(OB)の発症が移植後1年目以降の主な死因となっています1。
OADの根底にあるメカニズムを調査するために、いくつかの動物モデルが利用されています。そのようなモデルの 1 つが異所性気管移植 (HTT) モデル2 です。このモデルでは、気管移植片がレシピエントの皮下組織または大網に移植されます。虚血による気管移植片上皮細胞の喪失が起こり、その後、ドナー上皮細胞のアロレ活性リンパ球浸潤およびアポトーシスが起こります。線維芽細胞と筋線維芽細胞は気管の周りを移動し、細胞外マトリックスを生成します。最後に、気道内腔の完全な線維性閉塞が起こります。HTTモデルは技術的に単純で、 in vivo 環境を提供し、高い再現性を提供します。
OADを研究するための別のモデルは、ラット同所性気管移植(OTT)モデルであり、気管移植片をレシピエントの気管に挿入して生理学的換気を維持します3。このモデルでは、虚血によってドナー上皮細胞が枯渇すると、気管内のレシピエント上皮細胞に置き換わり、中等度の線維症を伴う閉塞のない気道が形成されます。これらのモデルは、肺移植後の気道閉塞の理解に貢献しているが、肺実質微小環境の再現という点では限界がある。
私たちの研究グループは、レシピエントの肺に気管移植片を移植するラット肺内気管移植(IPTT)モデルを導入しました4(図1)。IPTTモデルは、肺微小環境内で発生する気道内腔の線維性閉塞を示します。さらに、ラットIPTT 5,6,7,8,9,10よりも技術的に困難なマウスへの適用に成功しています。このマウスIPTTモデルの適応により、トランスジェニックマウスを用いた肺移植後のOADの肺免疫環境の複雑な詳細を深く掘り下げることができました。
IPTTモデルにはいくつかのユニークな機能があります。1つは血管新生であり、肺循環によって促進され、気道閉塞に重要な役割を果たします4,10。さらに、IPTTモデルではリンパ球凝集体が見られ、その一部は末梢リンパ節アドレスチンを発現する高額な内皮細静脈を有しており、これらが第三次リンパ性器官(TLO)であることを示しています7,8。TLOはリンパ節に似ており、T細胞、B細胞、および多くの場合、濾胞樹状細胞を伴う胚中心で構成されています11,12。TLOは、気道閉塞を含むさまざまな慢性炎症性疾患で報告されており、IPTTモデルは気道閉塞におけるTLOの役割を調査するのに適しています7,8,11,12,13。この論文では、マウスIPTTモデルの方法論を提示し、研究者にこのモデルに慣れ親しみ、肺移植後の気道閉塞のさらなる調査を促進することを目的としています。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
すべての動物は、カナダ動物管理評議会が「実験動物の飼育と使用に関するガイド」に定めたガイドラインに従って処理されました。実験プロトコルは、トロント総合病院研究所の動物管理委員会、大学ヘルスネットワークによって承認されました。
1.ドナー手術
注:BALB/cマウスは、実験のドナーの例として使用されています。すべての手順は、滅菌技術を利用して実行する必要があります。
- 手順の前に、各マウスの重量を記録します。
- CO2チャンバーを使用してマウスを安楽死させます。
- 死亡が確認されたら、マウスを仰臥位に置き、手足をテープで固定します。
- 70%イソプロピルアルコールで殺菌して手術部位を準備します。
注意: 必要に応じて、地元の動物倫理委員会の推奨に従って、切開部位から毛皮を切り取ります。 - 中腹部から子宮頸部前部まで、皮膚を正中切開します。
- 脂肪パッドを慎重に引っ込め、ストラップの筋肉を横方向に動かし、気管を周囲の結合組織から分離して、気管にアクセスします。鉗子を使用して、気管と食道の間にスペースを作ります。
- 剣状骨を持ち上げ、横隔膜を切断します。
- 胸骨を上げ、止血剤を挿入して胸骨から首の領域への明確な経路を確保します。両側の胸郭をクランプし、胸骨を切断し、首の筋肉を通って上に伸びます。
- 胸腺と気管を塞いでいる脂肪や筋肉を取り除き、気管分岐部を露出させます。
- 主気管支を両方とも切り取り、気道を食道から慎重に分離します。
- 喉頭を切って取り除きます。
- 解剖した気管に滅菌生理食塩水または保存液を噴霧し、滅菌生理食塩水または保存液に浸した滅菌ガーゼを凍結し、氷上に置いて生存率を維持します。
2.レシピエント手術
注:C57BL/6マウスは、実験のレシピエントの例として使用されています。
- 徐放性ブプレノルフィンを手術日の朝に1 mg / kgの用量で皮下投与します。.
- 5%イソフルランを使用して誘導チャンバーで麻酔を誘発します。
- マウスに軽く麻酔をかけたら、(0.1 mg/g)キシラジンと(0.01 mg/g)ケタミンからなるカクテルを腹腔内に注射します。
- マウスを2〜3%のイソフルランを維持したまま誘導チャンバーに戻します。
- 手術部位の毛を剃ります。また、ブピバカインをラインブロックとして、計画された投与部位に沿って7 mg / kgの用量で皮下投与します。.
- 口腔気管挿管の前に、つま先のつまみに対する反射反応がないことを確認します。20 Gの静脈内カテーテルを使用してマウスを口腔気管に挿管し、一回換気量500 μL、呼吸数120 bpm、100%酸素、2%イソフルランの人工呼吸器に接続します。この手順を容易にするために、舌にクランプを取り付けたスタンドを使用し、首を伸ばして動物を垂直位置に保持します。
- 加熱パッドを作動させ、マウスをパッドの上の右横の位置に置き、頭を外科医から離し、尾を外科医に向けます(図2)。手足をテープで固定します。麻酔中の乾燥を防ぐために、動物用軟膏を目に塗ります。
- 7.5%ポビドンヨードで手術部位をこすり、70%イソプロピルアルコールで滅菌し、10%ポビドンヨードで再スクラブします。手術部位を覆うために滅菌手術用ドレープを適用します。
- この間、ドナーの気管を16Gの静脈内カテーテルにロードします(図3C、D)。
- メスを使用してレシピエントの皮膚を切開し、筋肉と結合組織を焼灼します。
- 5番目または6番目の肋間腔を開き、2つのリトラクターを使用して胸郭を開いたままにします。
- 綿棒とハサミを使用して下肺靭帯を解剖します。
- ドナー気管の経路の作成をシミュレートします(図3G、H)。
- 人工呼吸器の流出チューブを三方活栓で部分的に塞いで固定し、左肺の膨張を促進します。
- 20Gの針で左肺に穴を開けて経路を作ります。穿刺深さが気管同種移植片の長さとほぼ同じであることを確認します。肺の端にある穿刺部位を選択し( 図3Iに示されているように)、経路が卓上と平行に走っていることを確認します( 図3Jの青い円でマークされています)。
注:上向きの挿入角度は胸膜層の貫通をもたらし、より深い角度は主要な血管からの出血につながる可能性があります( 図3Jの赤い十字でマークされているように)。 - 16Gの静脈内カテーテルを左肺に挿入し、ドナー気管を左肺に押し出します。気管同種移植片を挿入した後、三方活栓を解放して、排出チューブを通る呼気の流れを妨げないようにします。
- 胸膜注射部位をクリップで閉じます(図3K、L)。クリップを穿刺部位に正確に配置し、その端を肺の端の輪郭に合わせます( 図3Lの青い円で示されています)。
注意: クリッピング部位の位置を間違えると、シーリングが効かなくなったり、空気が漏れたりする可能性がありますが、クリップの深さが不十分な場合、手術後にクリップが外れる可能性があります( 図3Lの赤い十字で示されています)。 - 胸腔を生理食塩水で満たし、生理食塩水をガーゼで吸収します。
- 左肺を再び膨らませ、ランニング縫合法を使用して肋骨を閉じます。
- 断続的な縫合糸で筋肉と皮膚を閉じます。
- 手術終了時にメロキシカム鎮痛薬を5 mg / kgの用量で皮下投与します。.
- 受信者のマウスが目覚めるまで観察します。次に、気管チューブを取り外し、レシピエントマウスをケージに入れます。
注:レシピエントマウスは個別に飼育する必要があります。 - メロキシカム (5 mg/kg) を 1 日 1 回、術後 24 時間から皮下注射で投与し、術後 3 日間継続します。
3. レシピエントマウスからの検体採取
- 5%イソフルランを使用して誘導チャンバーで麻酔を誘発します。
- 口腔気管挿管の前に、つま先のつまみに対する反射反応がないことを確認します。挿管方法と人工呼吸器の設定は、レシピエント手術と同じです。
- マウスを仰臥位に置き、手足を固定します。
- 70%イソプロピルアルコールで殺菌して手術部位を準備します。
- 中腹部から子宮頸部前部まで、皮膚を正中切開します。
- 25Gの針に接続された1mlの注射器を使用して、下大静脈を介してマウスを放血し、安楽死させます。
- 胸部を開き、ドナーマウスと同じ方法で気管にアクセスします。気管を挿管チューブの周りに7-0シルクで結びます。
- 胸腺、脂肪、筋肉を取り除き、心臓を露出させます。
- 左心房、右心房、下大静脈をカットします。右心室から3mLの滅菌生理食塩水で肺を灌流します。
- 組織学的分析では、挿管チューブを介して10%ホルマリンで肺を膨らませます。
- 換気チューブを抜管し、気管を7-0シルクで結びます。
- 喉頭と食道を分けます。それらを下方向に引っ張り、次に心臓と肺のブロックを抽出し、10%ホルマリンに入れます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
私たちの経験に基づくと、このモデルに習熟するには、通常、約 2 か月のトレーニングが必要です。習熟度が達成されると、ドナーの手続きには通常15分かかり、レシピエントの手続きには約30分かかります。訓練を受けたオペレーターの予想死亡率は0%です。
図4Aでは、気管同種移植片は線維芽細胞組織で完全な閉塞を示し、上皮細胞は目に見えて破壊されています。逆に、図4Bでは、気管アイソグラフトは特許のままであり、上皮細胞は保存されています。
図5 は、気管同種移植片が移植された肺を示しており、リンパ凝集体の存在を示しています。
図1:マウス肺内気管移植モデルの図。 気管同種移植片は、ドナーマウスから抽出されます。気管同種移植片はカテーテルに装填されます。気管同種移植片はレシピエントの肺に移植されます。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:手術中のレシピエントの位置。 マウスは右外側褥瘡の位置に配置されます。レシピエントマウスの頭は外科医から離れ、尾は外科医の方を向いています。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:気管挿入用カテーテルと気管グラフトの挿入方向の図。 (A)気管挿入用カテーテル。外側のカテーテルの先端は鋭く(左)、内側のカテーテルは先端が鈍い(右)です。(B)外側と内側のカテーテルの組み合わせ。内側のカテーテルは外側のカテーテルからわずかに突き出ています。(C、D)ドナーの気管をカテーテルに装填します。赤い括弧は気管移植を示します。(E)カテーテル内の気管移植。赤い括弧は気管移植を示します。(F)内側カテーテルを「プッシャー」として使用して、内側気管グラフトを押し出す。赤い括弧は気管移植を示します。(G、H)気管グラフトの留置方向のシミュレーション。(I,J)22Gの針を使用して経路を作成します。深さは、気管同種移植片の長さとほぼ一致する必要があります。針の方向は外科医とは反対で、卓上と平行でなければなりません。正しい穿刺部位は赤い点で示されます。適切な挿入角度は青い円で示されます。角度が正しくない場合は、赤い十字で示されます。(K、L)胸膜注射部位をクリップで閉じます。黒い線はクリップを表します。赤い点は穿刺部位を表します。青い円は、正しいクリッピングポイントを示します。赤い十字は、クリッピングポイントが正しくないことを示します。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図4:肺移植後28日目の病理組織。 (A)気管同種移植片のH&E(左)とMassonのトリクローム(右)染色画像(ドナー:BALB/c、レシピエント:C57BL/6)。同種移植片の内腔は、マッソンのトリクローム(黒い矢じり)によって青く染色されたコラーゲンと線維組織で塞がれています。さらに、上皮細胞が失われています(青い矢印)。(B)H&E(左)とMassonのトリクローム(右)の気管アイソグラフトの染色画像。同種移植とは対照的に、アイソグラフト(ドナー、レシピエント:C57BL / 6)の内腔は開いたままであり、上皮細胞は保存されます。染色された組織は粘液です。スケールバー = 500 μm。 略語:H&E = ヘマトキシリンおよびエオシン。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図5:移植された気管同種移植片による肺のリンパ球凝集 。 (A)その 場で移植された気管同種移植片による肺のH&E染色画像。リンパ凝集体(黒い矢印)が肺組織内に観察されます。スケールバー = 500 μm。 (B)リンパ球凝集体の免疫蛍光画像で、B細胞(B220、赤)、T細胞(CD3、緑)、核(DAPI、青)の存在を強調しています。スケールバー = 100 μm。 略語:H&E = ヘマトキシリンおよびエオシン;DAPI = 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
マウスのIPTT手順には、重要なステップが含まれています。麻酔に関しては、最初の重要なステップは気管内挿管です。マウスを適切な高さに保持し、足をテーブルの上に置いて声帯を視覚化し、即時挿管を容易にすることが不可欠です。さらに、慎重な呼吸量と呼気終末陽圧(PEEP)の調整が必要です。典型的には、500μLの呼吸量および2cmH2OのPEEPは、体重25〜30gのマウスに十分である。しかし、より大きなレシピエントマウスは、酸素欠乏症を示す「しゃっくり」エピソードを経験する可能性があります。このような場合、呼吸量、PEEPを増やし、一時的に呼気管をクランプして肺を動員する必要がある場合があります。しゃっくりが続く場合は、気管チューブの深さを調整する必要があります。最後に、気管チューブ抜管のタイミングは重要であり、十分な回復を確実にするためにはレシピエントの呼吸数の確認が不可欠です。そうしないと、抜管後の死亡率につながる可能性があります。
外科的処置に関しては、移植された気管の適切な配置が重要です。気管移植片を正確に配置するには、適切な針の方向をシミュレートする必要があります(図3G)。経路が浅すぎると、気管移植片が胸膜を貫通する可能性があり、深く挿入しすぎると、肺血管穿孔や重度の出血につながる可能性があります。もう1つの重要なステップは、気管同種移植片を挿入した胸膜切開部をステンレス製のクリップでしっかりと固定することにより、挿入点を正確に密閉することです(図3H)。密閉が不十分な場合、空気漏れが発生し、胸部閉鎖後にレシピエントが死亡する可能性があります。
IPTTモデルには、比較的単純であること、再現性が高いこと、肺移植に見られるものと同様の免疫学的環境など、いくつかの利点がありますが、いくつかの制限があります。IPTTモデルの気管同種移植片は、産婦人科が小気道で発生する臨床状況とは異なります。さらに、この主要組織適合遺伝子複合体(MHC)ミスマッチIPTTモデルでは、気管同種移植片は線維芽細胞組織で完全に閉塞されており、線維芽細胞組織閉塞が通常部分的である臨床OADとは対照的です。この問題に対処するために、BALB/c-to-C57BL/6の組み合わせと比較して、より穏やかな同種免疫反応と軽度の線維芽細胞性組織閉塞をもたらす可能性があるため、IPTTには別の菌株の組み合わせ(マイナーまたは異なるメジャーミスマッチ)が使用される可能性があります(意図する研究によって異なります)。異なる菌株の組み合わせを調べた研究が発表されていないため、この可能性は経験的に検証する必要があります。
最後に、HTTおよびOTTモデルと同様に、非血管新生移植片です。この制限に対処するために、同所性肺移植(OLT)を利用することができます14。しかしながら、OAD様病理学の発達は、マウスOLTモデル15,16,17において変動している。IPTTモデルはOLTと比較して比較的単純で再現性が高いため、移植関連のOADのメカニズムを研究するのに妥当なモデルであることに変わりはない。結論として、IPTTモデルは、肺移植後の気道閉塞の発症に関与する肺内免疫およびプロフィブロシス経路を研究するための有用な研究モデルとして機能します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
この原稿の著者には、開示すべき利益相反はありません。
Acknowledgments
著者は、この原稿を編集してくれたJerome Valeroに感謝します。 図1 と 図3I,J,L は BioRender.com で作成しました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BALB/cJ | The Jackson Laboratory | 8-10 weeks 25-30 g | Male, Donor |
| BD 1 mL Syringe | Becton Dickinson | 309659 | |
| BD PrecisionGlide Needle Aiguile BD PrecisionGlide |
Becton Dickinson | 305122 | |
| Bovie Change-A-Tip Deluxe High-Temperture | Bovie | DEL1 | |
| C57BL/6J | The Jackson Laboratory | 8-10 weeks 25-30 g | Male, Recipient |
| Dumont #5/45 Forceps | F·S·T | 11251-35 | |
| Ethicon Ligaclip Multiple -Clip Appliers- | Ethicon | LX107 | |
| Extra Fine Graefe Forceps | F·S·T | 11150-10 | |
| Glover Bulldog Clamp | Integra | 320-127 | |
| Halsted-Mosquito Hemostats | F·S·T | 13009-12 | |
| Horizon Titanium Ligating Clips | Teleflex | 001201 | |
| Leica M651 Manual surgical microscope for microsurgical procedures | Leica | ||
| Magnetix Fixator with spring lock | CD+ LABS | ACD-001 | |
| Microsurgical Scissor | Jarit | 277-051 | |
| Mouse and Perinatal Rat Ventilator Model 687 | Harvard | 55-0001 | |
| Perfadex Plus | XVIVO | 19850 | |
| Retractor Tip Blunt - 2.5 mm | CD+ LABS | ACD-011 | |
| small animal table | CD+ LABS | ACD-003 | |
| Surgipro Blue 24" CV-1 Taper, Double Armed | Covidien | VP702X | |
| Systane ointment | Alconn | 1444062 | |
| System Elastomer | CD+ LABS | ACD-007 | |
| Terumo Surflo IV Catheter, 20 G x 1 in | Terumo Medical Corporation | SR-OX2025CA | |
| VMT table Top | benson | 91803300 |
References
- Chambers, D. C., et al. The International Thoracic Organ Transplant Registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: Thirty-fifth adult lung and heart-lung transplant report-2018; Focus theme: Multiorgan Transplantation. J Heart Lung Transplant. 37 (10), 1169-1183 (2018).
- Hertz, M. I., Jessurun, J., King, M. B., Savik, S. K., Murray, J. J. Reproduction of the obliterative bronchiolitis lesion after heterotopic transplantation of mouse airways. American J Pathol. 142 (6), 1945-1951 (1993).
- Ikonen, T. S., Brazelton, T. R., Berry, G. J., Shorthouse, R. S., Morris, R. E. Epithelial re-growth is associated with inhibition of obliterative airway disease in orthotopic tracheal allografts in non-immunosuppressed rats. Transplantation. 70 (6), 857 (2000).
- Dutly, A. E., et al. A novel model for post-transplant obliterative airway disease reveals angiogenesis from the pulmonary circulation. Am J Transplant. 5 (2), 248-254 (2005).
- Wagnetz, D., et al. Rejection of tracheal allograft by intrapulmonary lymphoid neogenesis in the absence of secondary lymphoid organs. Transplantation. 93 (12), 1212-1220 (2012).
- Hirayama, S., et al. Local long-term expression of lentivirally delivered IL-10 in the lung attenuates obliteration of intrapulmonary allograft airways. Hum Gene Ther. 22 (11), 1453-1460 (2011).
- Watanabe, T., et al. Recipient bone marrow-derived IL-17 receptor A-positive cells drive allograft fibrosis in a mouse intrapulmonary tracheal transplantation model. Transpl Immunol. 69, 101467 (2021).
- Matsuda, Y., et al. Spleen tyrosine kinase modulates fibrous airway obliteration and associated lymphoid neogenesis after transplantation. Am J Transplant. 16 (1), 342-352 (2016).
- Suzuki, Y., et al. Effect of CTLA4-Ig on Obliterative bronchiolitis in a mouse intrapulmonary tracheal transplantation model. Ann Thorac Cardiovasc Surg. 27 (6), 355-365 (2021).
- Watanabe, T., et al. A potent anti-angiogenic factor, vasohibin-1, ameliorates experimental bronchiolitis obliterans. Transplant Proc. 44 (4), 1155-1157 (2012).
- Aloisi, F., Pujol-Borrell, R. Lymphoid neogenesis in chronic inflammatory diseases. Nat Rev Immunol. 6 (3), 205-217 (2006).
- Cupedo, T., Jansen, W., Kraal, G., Mebius, R. E. Induction of secondary and tertiary lymphoid structures in the skin. Immunity. 21 (5), 655-667 (2004).
- Sato, M., et al. The role of intrapulmonary de novo lymphoid tissue in obliterative bronchiolitis after lung transplantation. J Immunol. 182 (11), 7307-7316 (2009).
- Okazaki, M., et al. Maintenance of airway epithelium in acutely rejection orthotopic vascularized mouse lung transplants. A J Resp Cell Mol Biol. 37 (6), 625-630 (2007).
- Yamada, Y., et al. Chronic airway fibrosis in orthotopic mouse lung transplantation models-an experimental reappraisal. Transplantation. 102 (2), e49-e58 (2018).
- Watanabe, T., et al. A B cell-dependent pathway drives chronic lung allograft rejection after ischemia-reperfusion injury in mice. Am J Transplant. 19 (12), 3377-3389 (2019).
- Guo, Y., et al. Vendor-specific microbiome controls both acute and chronic murine lung allograft rejection by altering CD4+Foxp3+ regulatory T cell levels. Am J Transplant. 19 (10), 2705-2718 (2019).
