Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

تسجيل وتحليل ديناميكيات المجموعة العصبية متعددة الوسائط واسعة النطاق على صفيف الأقطاب الكهربائية الدقيقة عالية الكثافة المدمجة CMOS

Published: March 8, 2024 doi: 10.3791/66473
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1, 1,2,3
1Group of "Biohybrid Neuroelectronics (BIONICS)", German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE), 2Faculty of Medicine Carl Gustav Carus, Technical University Dresden, 3Dresden Center for Intelligent Materials (DCIM), Technical University Dresden
* These authors contributed equally

Summary

هنا ، نستخدم HD-MEA للتعمق في الديناميات الحسابية للمجموعات العصبية واسعة النطاق ، لا سيما في الحصين ، ودوائر البصلة الشمية ، والشبكات العصبية البشرية. يوفر التقاط النشاط الزماني المكاني ، جنبا إلى جنب مع الأدوات الحسابية ، نظرة ثاقبة لتعقيد المجموعة العصبية. تعزز هذه الطريقة فهم وظائف الدماغ ، ويحتمل أن تحدد المؤشرات الحيوية وعلاجات الاضطرابات العصبية.

Abstract

تعد الشبكات العصبية واسعة النطاق ودوائرها الدقيقة الموزعة المعقدة ضرورية لتوليد الإدراك والإدراك والسلوك الذي ينشأ من أنماط النشاط العصبي الزماني المكاني. هذه الأنماط الديناميكية الناشئة عن مجموعات وظيفية من المجموعات العصبية المترابطة تسهل الحسابات الدقيقة لمعالجة وتشفير المعلومات العصبية متعددة النطاقات ، وبالتالي دفع وظائف الدماغ العليا. لاستكشاف المبادئ الحسابية للديناميكيات العصبية الكامنة وراء هذا التعقيد والتحقيق في التأثير متعدد النطاقات للعمليات البيولوجية في الصحة والمرض ، أصبحت التسجيلات المتزامنة واسعة النطاق مفيدة. هنا ، يتم استخدام مصفوفة أقطاب كهربائية دقيقة عالية الكثافة (HD-MEA) لدراسة طريقتين للديناميكيات العصبية - دوائر الحصين والبصلة الشمية من شرائح دماغ الفأر خارج الجسم الحي والشبكات العصبية من مزارع الخلايا في المختبر للخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (iPSCs). تتيح منصة HD-MEA ، مع 4096 قطبا كهربائيا دقيقا ، تسجيلات غير جراحية ومتعددة المواقع وخالية من الملصقات لأنماط إطلاق خارج الخلية من آلاف المجموعات العصبية في وقت واحد بدقة مكانية زمانية عالية. يسمح هذا النهج بتوصيف العديد من السمات الفيزيولوجية الكهربية على مستوى الشبكة ، بما في ذلك أنماط نشاط الارتفاع الفردي / متعدد الوحدات وتذبذبات إمكانات المجال المحلي. للتدقيق في هذه البيانات العصبية متعددة الأبعاد ، قمنا بتطوير العديد من الأدوات الحسابية التي تتضمن خوارزميات التعلم الآلي ، والكشف التلقائي عن الأحداث وتصنيفها ، ونظرية الرسم البياني ، وغيرها من التحليلات المتقدمة. من خلال استكمال خطوط الأنابيب الحسابية هذه بهذه المنصة ، نقدم منهجية لدراسة الديناميكيات الكبيرة والمتعددة المقاييس ومتعددة الوسائط من تجميعات الخلايا إلى الشبكات. هذا يمكن أن يعزز فهمنا لوظائف الدماغ المعقدة والعمليات المعرفية في الصحة والمرض. يمكن أن يؤدي الالتزام بالعلوم المفتوحة والرؤى حول الديناميات العصبية الحسابية واسعة النطاق إلى تعزيز النمذجة المستوحاة من الدماغ والحوسبة العصبية وخوارزميات التعلم العصبي. علاوة على ذلك ، فإن فهم الآليات الأساسية لضعف الحسابات العصبية واسعة النطاق وديناميكيات الدوائر الدقيقة المترابطة يمكن أن يؤدي إلى تحديد مؤشرات حيوية محددة ، مما يمهد الطريق لأدوات تشخيص أكثر دقة وعلاجات مستهدفة للاضطرابات العصبية.

Introduction

تعتبر المجموعات العصبية ، التي يطلق عليها غالبا تجميعات الخلايا ، محورية في الترميز العصبي ، مما يسهل الحسابات المعقدة لمعالجة المعلومات العصبية متعددة المقاييس1،2،3. تدعم هذه المجموعات تكوين الشبكات العصبية الموسعة ودوائرها الدقيقةالدقيقة 4. هذه الشبكات وأنماطها التذبذبية تقود وظائف الدماغ المتقدمة ، بما في ذلك الإدراك والإدراك. بينما استكشفت الأبحاث المكثفة أنواعا معينة من الخلايا العصبية والمسارات المشبكية ، فإن الفهم الأعمق لكيفية تكوين الخلايا العصبية بشكل تعاوني لمجموعات الخلايا والتأثير على معالجة المعلومات الزمانية المكانية عبر الدوائر والشبكات لا يزال بعيد المنال5.

تعد شرائح الدماغ الحادة خارج الجسم الحي أدوات فسيولوجية كهربية محورية لدراسة الدوائر العصبية السليمة ، مما يوفر إعدادا مضبوطا لاستكشاف أنماط النشاط التذبذبي للوظيفة العصبية ، والانتقال المشبكي ، والاتصال ، مع الآثار المترتبة على الاختبارات الدوائية ونمذجة المرض6،7،8. يسلط بروتوكول الدراسة هذا الضوء على دائرتين رئيسيتين للدماغ - الحصين القشري (HC) المشاركة في عمليات التعلم والذاكرة9،10 ، والبصلة الشمية (OB) المسؤولة عن تمييز الرائحة11،12،13. في هاتين المنطقتين ، يتم إنشاء خلايا عصبية وظيفية جديدة باستمرار عن طريق تكوين الخلايا العصبية للبالغين طوال الحياة في أدمغة الثدييات14. تظهر كلتا الدائرتين أنماط النشاط العصبي الديناميكي متعدد الأبعاد واللدونة المتأصلة التي تشارك في إعادة توصيل الشبكة العصبية الحالية وتسهيل استراتيجيات معالجة المعلومات البديلة عند الحاجة15,16.

لا غنى عن نماذج شرائح الدماغ الحادة خارج الجسم الحي للتعمق في وظائف الدماغ وفهم آليات المرض على مستوى الدائرة الدقيقة. ومع ذلك ، فإن مزارع الخلايا في المختبر المشتقة من الشبكات العصبية للخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (iPSCs) توفر وسيلة واعدة للبحث الانتقالي ، وتربط بسلاسة النتائج من التجارب على بالعلاج السريري البشري المحتمل17،18. تعمل هذه المقايسات المختبرية التي تركز على الإنسان كمنصة موثوقة لتقييم السمية الدوائية ، وتمكين الفحص الدقيق للأدوية ، وتعزيز البحث في الاستراتيجيات العلاجية المبتكرة القائمة على الخلايا19،20. إدراكا للدور المحوري لنموذج الخلايا العصبية iPSC ، خصصنا الوحدة الثالثة من دراسة البروتوكول هذه للتحقيق الشامل في الخصائص الوظيفية لشبكاتها المشتقة وضبط بروتوكولات زراعة الخلايا المرتبطة بها.

تمت دراسة هذه الوحدات العصبية الكهروجينية بشكل شائع باستخدام تقنيات مثل الكالسيوم (تصوير Ca2+ ) ، وتسجيلات المشبك التصحيحي ، ومصفوفات الأقطاب الكهربائية الدقيقة منخفضة الكثافة (LD-MEA). بينما يوفر تصوير Ca2+ تخطيطا لنشاط الخلية الواحدة ، إلا أنه طريقة قائمة على تسمية الخلايا يعوقها دقتها الزمنية المنخفضة والتحديات في التسجيلات طويلة المدى. تفتقر LD-MEAs إلى الدقة المكانية ، في حين أن مشبك التصحيح ، كونه تقنية غازية في موقع واحد وشاقة ، غالبا ما ينتج عنه معدل نجاح منخفض21،22،23. لمواجهة هذه التحديات والتحقيق الفعال في النشاط على مستوى الشبكة ، ظهرت التسجيلات العصبية المتزامنة واسعة النطاق كنهج محوري لفهم المبادئ الحسابية للديناميكيات العصبية الكامنة وراء تعقيد الدماغ وآثارها على الصحة والمرض24،25.

في بروتوكول JoVE هذا ، نوضح طريقة تسجيل عصبي واسعة النطاق تعتمد على MEA (HD-MEA) عالية الكثافة لالتقاط النشاط العصبي الزماني المكاني عبر طرائق الدماغ المختلفة ، بما في ذلك دوائر الحصين والبصلة الشمية من الشرائح الحادة لدماغ الفأر خارج الجسم الحي (الأشكال 1A-C) والشبكات العصبية البشرية المشتقة من iPSC في المختبر (الأشكال 1D-E) ، التي أبلغت عنها مجموعتنا وزملاؤنا الآخرونسابقا 26، 27،28،29،30،31،32،33،34،35. يتميز HD-MEA ، المبني على تقنية أشباه الموصلات التكميلية لأكسيد المعادن (CMOS) ، بدوائر على الرقاقة وتضخيم ، مما يسمح بتسجيلات أقل من مللي ثانية عبر صفيف 7 مم2 بحجم36. يلتقط هذا النهج غير الجراحي أنماط إطلاق خارج الخلية متعددة المواقع وخالية من الملصقات من آلاف المجموعات العصبية في وقت واحد باستخدام 4096 قطبا كهربائيا دقيقا بدقة زمانية مكانية عالية ، مما يكشف عن الديناميكيات المعقدة لإمكانات المجال المحلي (LFPs) ونشاط الارتفاع متعدد الوحدات (MUA)26,29.

ونظرا لاتساع نطاق البيانات الناتجة عن هذه المنهجية، من الضروري وجود إطار تحليلي متطور، ولكنه يطرح تحديات37. لقد طورنا أدوات حسابية تشمل الكشف التلقائي عن الأحداث والتصنيف ونظرية الرسم البياني والتعلم الآلي والتقنيات المتقدمة الأخرى (الشكل 1F)26،29،38،39. من خلال دمج HD-MEA مع هذه الأدوات التحليلية ، تم تصميم نهج شامل لاستكشاف الديناميكيات المعقدة من تجميعات الخلايا الفردية إلى الشبكات العصبية الأوسع عبر طرائق عصبية متنوعة. هذا النهج المشترك يعمق فهمنا للديناميكيات الحسابية في وظائف الدماغ الطبيعية ويقدم نظرة ثاقبة على الحالات الشاذة الموجودة في الحالات المرضية28. علاوة على ذلك ، يمكن للرؤى من هذا النهج أن تدفع التقدم في النمذجة المستوحاة من الدماغ ، والحوسبة العصبية ، وخوارزميات التعلم العصبي. في نهاية المطاف ، تبشر هذه الطريقة بالكشف عن الآليات الأساسية وراء اضطرابات الشبكة العصبية ، وربما تحديد المؤشرات الحيوية ، وتوجيه إنشاء أدوات تشخيصية دقيقة وعلاجات مستهدفة للحالات العصبية.

Protocol

تم إجراء جميع التجارب وفقا للوائح الأوروبية والوطنية المعمول بها (Tierschutzgesetz) وتمت الموافقة عليها من قبل السلطة المحلية (Landesdirektion Sachsen ؛ 25-5131 / 476/14).

1. شرائح الدماغ خارج الجسم الحي من دوائر الحصين القشرية والبصلة الشمية على HD-MEA

  1. إعداد حلول القطع والتسجيل التجريبية (الشكل 2 أ)
    1. في اليوم التجريبي ، قم بإعداد 0.5 لتر من محلول القطع عالي السكروز و 1 لتر من محلول تسجيل السائل النخاعي الاصطناعي (aCSF) (الجدول 1A ، B).
      1. أضف جميع المواد الكيميائية الصلبة إلى دورق حجمي جاف ، ثم املأ جزءا من الطريق بالماء المقطر المزدوج (dd).
      2. أضف MgCl2 و CaCl2 من محاليل مخزون 1 متر ، ثم املأ الباقي بماء dd. ابدأ بالتحريك باستمرار باستخدام محرك مغناطيسي حتى تذوب المواد الصلبة المرئية ~ 5 دقائق.
    2. استخدم مقياس تناضح نقطة التجمد للتحقق من صحة الأسمولية بين 350-360 mOsm لمحلول القطع عالي السكروز و 315-325 mOsm لمحلول تسجيل aCSF.
    3. استخدم مقياس الأس الهيدروجيني للتحقق من صحة الأس الهيدروجيني بين 7.3-7.4 لمحلول القطع عالي السكروز و 7.25-7.35 لمحلول تسجيل aCSF. ابدأ الفقاعات باستمرار بنسبة 95٪ O2 و 5٪ CO2.
    4. ضع محلول القطع عالي السكروز على الثلج لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل التقطيع وابدأ في الغليان باستمرار بنسبة 95٪ O2 و 5٪ CO2.
    5. بعد 10 دقائق من الكربوجين، املأ دورق سعة 50 مل بمحلول تقطيع سعة 30 مل واحفظه في الفريزر (-20 درجة مئوية) لمدة 20-30 دقيقة أو حتى يتجمد جزئيا.
      ملاحظة: يجب إعداد جميع الحلول طازجة لكل تجربة. مياه dd المستخدمة هنا هي مياه عالية النقاء معقمة مخزنة في درجة حرارة الغرفة (RT). يجب أن يكون مقدار الحل المعد مصمما وفقا لسؤال الدراسة المحدد.
  2. تحضير مناطق مساحة عمل شريحة الدماغ (الشكل 2 أ)
    1. جلب إلى غرفة التجارب.
      ملاحظة: في هذا البروتوكول ، تم استخدام إناث الفئران C57BL / J6 الذين تتراوح أعمارهم بين 8-16 أسبوعا كما هو موضح سابقا26،29،32. يجب السماح للحيوان بالتأقلم لمدة 30 دقيقة على الأقل بعد النقل. يجب تجنب عمليات النقل لمسافات طويلة (أي بين المعاهد) في نفس يوم التجربة. يجب تحديد عمر وجنسه وسلالته بناء على سؤال الدراسة المحدد.
    2. أثناء تأقلم وتبريد المحلول عالي السكروز ، ضع الأدوات المطلوبة في كل مساحة عمل مخصصة (انظر جدول المواد).
    3. إعداد مساحة عمل استعادة شريحة الدماغ وصيانتها. املأ غرفة استعادة الشرائح بمحلول تسجيل aCSF الكربوجيني وضع الحجرة في حمام مائي مضبوط على 32 درجة مئوية. الحفاظ على الكربوجين المستمر طوال التجربة.
    4. إعداد مساحة عمل إعداد شريحة الدماغ. قم بإعداد الاهتزاز - ضع الشفرة في حامل شفرة الاهتزاز وقم بمعايرة الاهتزاز إلى الإعدادات الصحيحة (سرعة انتقال الشفرة: 0.20 مم / ثانية ، سعة الارتفاع: 95 ميكرومتر ، زاوية الشفرة: 45 درجة). املأ صينية الثلج الاهتزازية بالثلج وصينية العازلة بمحلول قطع عالي السكروز وابدأ في كربنة المحلول في الدرج العازل.
    5. إعداد مساحة عمل إعداد الدماغ. املأ طبق بتري الزجاجي مقاس 150 مم بالثلج وضع طبق ثقافة بلاستيكية مقاس 90 مم بداخله ورق ترشيح. املأ طبق الثقافة البلاستيكية بمحلول قطع عالي السكروز وابدأ في الكربوجين. أضف قطرة من الغراء الفائق إلى لوحة العينة المبردة وأرفق قالب الأغاروز.
      ملاحظة: يتم تحضير قالب الأغاروز في اليوم السابق على الأقل مع 3٪ من الأغاروز في الماء في قالب دماغ فأر مخصص.
    6. أخيرا ، قم بإعداد مساحة عمل استخراج الدماغ. قم بتغطية ورق الألمنيوم بالمناديل الورقية ، واسترجاع دورق سعة 50 مل يحتوي على محلول قطع عالي السكروز ، وأضف الأيزوفلوران إلى غرفة التخدير.
      ملاحظة: سيتم إضافة التخدير إلى غرفة التخدير ~ 1 دقيقة قبل وضع. ستتم إزالة دورق سعة 50 مل مع 30 مل من محلول القطع عالي السكروز من الفريزر -20 درجة مئوية ~ 2 دقيقة قبل قطع الرأس.
  3. استخراج وتقطيع دماغ الفأر
    ملاحظة: يجب تنفيذ هذا الإجراء بأكمله في أسرع وقت ممكن لتجنب نقص الأوكسجين في الدماغ. يجب أن تستغرق إزالة الدماغ 1-2 دقيقة فقط من قطع الرأس إلى الغمر في محلول القطع عالي السكروز.
    1. تخدير بالجرعة المناسبة من الأيزوفلوران (0.5 مل / 1 لتر غرفة التخدير). تحديد عمق التخدير من خلال قرصة مخلب. تأكد من عدم وجود منعكس انسحاب مخلب قبل المتابعة.
    2. نقل إلى المناديل الورقية في مساحة عمل استخراج الدماغ وقطع رأسه بمقص جراحي.
    3. أدخل مقص القزحية في جذع الدماغ وحافظ على المقص السفلي متدفقا مع الكالفاريا. قطع على طول خياطة السهمي حتى يتم الوصول إلى خياطة الإكليل. ضع مقص القزحية في مآخذ العين واقطع الخيط الميتوبي. استخدم ملقط منحني لتحريك جوانب الكالفاريا لأسفل ، مما يؤدي إلى تعريض الدماغ بالكامل.
      ملاحظة: كن حذرا مع كل من مقص القزحية والملقط لعدم ثقب الدماغ أثناء قطع الغرز.
    4. حرك الدماغ بالحافة الحادة للملقط المنحني في دورق سعة 50 مل مع 30 مل من محلول القطع عالي السكروز. دعها تبقى لمدة 1 دقيقة.
    5. انقل الدماغ إلى طبق الاستزراع البلاستيكي 90 مم بمحلول قطع كربوجيني مبرد في مساحة عمل تحضير الدماغ. توجيه الدماغ لتحديد المواقع في قالب الأغاروز.
    6. أضف نقطة صغيرة من الغراء الفائق إلى الطرف المنقاري لقالب الأغاروز. ضع الدماغ في القالب باستخدام الملعقة. تأكد من وضع الدماغ مع الجانب الظهري لأسفل للتقطيع الأفقي.
      ملاحظة: سيتغير موقع الغراء في القالب اعتمادا على منطقة الاهتمام (ROI). بالنسبة لشرائح الحصين القشرية (HC) والبصلة الشمية (OB) ، تأكد من استقرار OB وبقاء جوانب الدماغ خالية من الغراء. سيؤثر الكثير من الغراء على جودة التقطيع ويسبب التمزقات أثناء التقطيع بالاهتزاز.
    7. انقل لوحة العينة إلى الدرج العازل ، وانقل الشفرة إلى موضعها بالزاوية الصحيحة ، وقم بزيادة ارتفاع الدرج العازل لتقريب الشفرة قدر الإمكان من الدماغ.
    8. قطعيها بسرعة 0.20 مم / ثانية على فترات 300 ميكرومتر من أنسجة HC و OB ، ثم اجمعها بعد كل جولة تقطيع باستخدام ماصة باستور زجاجية.
    9. اترك الشرائح في غرفة الاسترداد المملوءة بالسائل الدماغي الشوكي في حمام مائي بدرجة حرارة 32 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة ، تليها 1 ساعة في RT. تأكد من عدم تداخل الشرائح وتعرضها بالكامل للمحلول الكربوجيني.
      ملاحظة: تأكد من الحفاظ على الكربوجين المستمر لجميع المحاليل وأي غرف مذكورة تحتوي على المحلول. يمكن استخدام منظم الضغط للحفاظ على الكربوجين المتسق.

2. شبكة عصبية بشرية قائمة على iPSC في المختبر على HD-MEA

ملاحظة: يتم الحصول على جميع الخلايا العصبية iPSC المستخدمة في هذه الدراسة تجاريا (انظر جدول المواد). تمايزت هذه الخلايا البشرية عن خطوط الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات المستقرة المشتقة من الدم المحيطي البشري أو الخلايا الليفية.

  1. طلاء رقائق HD-MEA لمزارع خلايا iPSC البشرية في المختبر (الشكل 2B)
    1. ضع شريحة HD-MEA على منصة تسجيل الاستحواذ ، واملأ الخزان ب PBS ، واختبر الشريحة قبل الطلاء. بدء تشغيل برنامج الموجات الدماغية. حدد ملف > جلسة تسجيل جديدة. اضبط معلمات التسجيل على تردد تسجيل يبلغ 50 هرتز وتردد أخذ عينات يبلغ 18 كيلو هرتز / قطب كهربائي. قم بتغيير إزاحة مكبر الصوت لمعايرة الشريحة. انظر الجدول 2 للحصول على تلميحات حول استكشاف الأخطاء وإصلاحها.
      ملاحظة: ستعتمد معلمات تردد التسجيل وتردد أخذ العينات على نوع البيانات ومتطلبات النظام الفردية.
    2. تعقيم وتكييف HD-MEAs مسبقا.
      1. تحت الغطاء ، امسح الشريحة والحلقة الزجاجية بمنديل مبلل بنسبة 96٪ إيثانول (EtOH) ، ثم ضع كل جهاز في طبق بتري معقم 100 مم × 20 مم واملأ خزان MEA بنسبة 70٪ EtOH لمدة 20 دقيقة.
      2. نضح EtOH وغسل الخزان بماء dd معقم ومفلتر 3 مرات. أضف 1 مل من وسائط التكييف المسبق واحتضانها طوال الليل عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
        ملاحظة: يجب أن تكون وسائط التكييف المسبق محلولا قائما على الملح لجعل سطح HD-MEA أكثر محبة للماء. يمكن أن يشمل ذلك الوسائط الكاملة BrainPhys (BP) المعدة مسبقا (ليس عمرها >3 أشهر) (الجداول 1C).
    3. معطف HD-MEAs. في اليوم التالي ، نضح وسائط التكييف المسبق. أضف 1 مل من 0.1 مجم / مل بولي دل-أورنيثين (PDLO) لتغطية المنطقة النشطة بأكملها. احتضان في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها في حاضنة.
    4. إعداد وتدفئة وسائل الإعلام ل RT. تستغل البروتوكولات هنا الخلايا العصبية البشرية الوظيفية iPSC من مصدرين تجاريين. وبالتالي ، تختلف مكونات الوسائط لكل مورد. تم وصف بروتوكول واحد في (الجداول 1C ، D).
    5. نضح PDLO ، اغسله 3 مرات بماء dd واترك الرقائق تجف تحت الغطاء لمدة 10 دقائق.
    6. املأ طبق بتري 35 مم × 10 مم بماء dd معقم ومفلتر وضعه بجانب الشريحة للحفاظ على الرطوبة المناسبة وتجنب تبخر الخلايا المصنفة في الخطوات التالية.
  2. طلاء وصيانة الخلايا العصبية البشرية iPSC في HD-MEAs (الشكل 2B)
    1. إذابة الخلايا وتخفيفها إلى الخلايا المرغوبة لكل ميكرولتر تركيز (أي 1000 خلية / ميكرولتر للحصول على كثافة 50000 خلية في قطرة 50 ميكرولتر على HD-MEA) (الجدول 1C).
    2. ماصة تعليق الخلية على سطح المنطقة النشطة للرقاقة باستخدام وسائط تنقيط عالية من الصفيحة (الجدول 1 د).
    3. احتضان في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 لمدة 45-60 دقيقة.
    4. املأ 2 مل من الوسائط برفق في خزان HD-MEA (الجدول 1C).
    5. قم بإجراء تغيير الوسائط بنسبة 100٪ في اليوم الأول (DIV1) بعد البذر باستخدام وسائط RT (الجدول 1C). قم بتغيير 50٪ من الوسائط كل 3-4 أيام. حافظ على HD-MEAs محتضنة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 طوال التجربة.
      ملاحظة: ماصة بلطف لتجنب إزاحة الخلايا. تحقق من لون الوسائط بحثا عن أي تلوث. يمكن تحديد الفاصل الزمني ومقدار تغيير الوسائط من خلال أسئلة الدراسة الفردية أو احتياجات / مواصفات الخلية.
    6. اختياري: تحقق من تقدم نمو زراعة الخلايا بين DIV4-DIV8 تحت مجهر تباين التداخل التفاضلي (DIC) المستقيم بعد تنظيف المسرح باستخدام >70٪ EtOH.

3. تسجيلات عصبية واسعة النطاق خارج الجسم الحي وفي المختبر مع HD-MEAs

  1. إعداد مساحة عمل تسجيل شريحة الدماغ (الشكل 2 أ)
    1. أثناء تعافي شرائح الدماغ ، ضع الأدوات المطلوبة في كل مساحة عمل مخصصة (انظر جدول المواد).
      ملاحظة: يجب تحسين إعداد النظام الرئيسي واختباره جيدا قبل اليوم التجريبي لشريحة الدماغ. يجب اختبار نظام الإرواء (خطوط المدخل وخطوط مخرج المضخة والأنابيب والتأريض) باستخدام PBS أو aCSF و HD-MEA على منصة التسجيل لضمان إشارة نظيفة وزيادة نسبة ضوضاء الإشارة ونقص ضوضاء التروية.
    2. قم بتغطية شريحة HD-MEA ب 0.1 مجم / مل من PDLO لتعزيز اقتران رقاقة الأنسجة واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
    3. أثناء حضانة الرقاقة ، املأ نظام التروية القائم على الجاذبية والخطوط بتسجيل aCSF. ضمان الكربنة المستمرة لنظام التروية. اضبط معدل تدفق 4.5 مل / دقيقة ودرجة حرارة 37 درجة مئوية.
    4. ضع شريحة HD-MEA على منصة تسجيل الاستحواذ ، واملأ الخزان ب aCSF ، واختبر نظام التروية ، واستكشف أي ضوضاء متبقية في النظام وإصلاحها.
      1. بدء تشغيل برنامج الموجات الدماغية. حدد ملف > جلسة تسجيل جديدة. اضبط معلمات التسجيل بحيث يكون تردد التسجيل 1 هرتز وتردد أخذ العينات 14 كيلو هرتز / قطب كهربائي. قم بتغيير إزاحة مكبر الصوت لمعايرة الشريحة. انظر الجدول 2 للحصول على تلميحات حول استكشاف الأخطاء وإصلاحها.
        ملاحظة: ستعتمد معلمات تردد التسجيل وتردد أخذ العينات على نوع البيانات ومتطلبات النظام الفردية.
    5. تأكد من أن منطقة التسجيل مظلمة من خلال نظام إضاءة الغرفة أو قفص مظلل على الطاولة البصرية.
    6. قم بمحاذاة المجهر المجسم مع خزان رقاقة HD-MEA والمنطقة النشطة للحصول على الصور.
    7. ضع المرساة في خزان الرقاقة لتحقيق التوازن.
      ملاحظة: المرساة عبارة عن قيثارة بلاتينية مصنوعة خصيصا مع الحد الأدنى من الأسلاك لتعزيز الأكسجين. ومع ذلك ، تتوفر بعض التجارية منها.
    8. أضف المركبات الدوائية إلى أنابيب التروية المناسبة.
      ملاحظة: في هذا البروتوكول ، تم الحصول على كل من التسجيلات التلقائية و 100 ميكرومتر 4-أمينوبيريدين (4-AP) المستحثة دوائيا كما هو موضح سابقا. يمكن تصميم المركبات الدوائية وفقا لسؤال الدراسة المحدد.
    9. في مساحة عمل تحضير شريحة الدماغ ، ضع طبقا جديدا للثقافة البلاستيكية مقاس 90 مم في طبق بتري زجاجي مقاس 150 مم. أضف السائل الدماغي الشوكي وابدأ في الكربوجين.
  2. تسجيلات على مستوى الدائرة من شرائح HC وOB باستخدام HD-MEAs
    ملاحظة: يجب إجراء اقتران الشريحة في أسرع وقت ممكن لتجنب نقص الأوكسجين في الشريحة. يجب أن يستغرق الاقتران ~ 1 دقيقة فقط من الموضع الأولي للشريحة الدقيقة على المنطقة النشطة للرقاقة إلى بدء تشغيل نظام التروية النهائي.
    1. قم بإزالة الشريحة من غرفة استعادة شريحة الدماغ باستخدام ماصة زجاجية وضعها في طبق استزراع بلاستيكي 90 مم مع كربوجين مستمر. باستخدام أداة التشريح المجهري ، اعزل HC أو OB عن أنسجة شريحة الدماغ المحيطة.
    2. انقل شرائح HC أو OB الحادة المعزولة باستخدام ماصة زجاجية إلى خزان HD-MEA. قم بمحاذاة الشريحة برفق على المنطقة النشطة في الشرق الأوسط وأفريقيا بفرشاة ناعمة. قم بامتصاص جميع الحلول من شريحة HD-MEA جيدا باستخدام نظام الشفط.
    3. ضع المرساة برفق فوق الشريحة باستخدام الملقط.
      ملاحظة: يجب وضع المرساة بدون حركة شريحة لتجنب فقدان أداة التوصيل.
    4. أضف المحلول برفق إلى خزان الرقاقة وابدأ نظام التروية.
      ملاحظة: تأكد من التدفق الصفحي من مدخل التروية ومخرج المضخة للحصول على معلمات التسجيل المثلى.
    5. تأكد من تعتيم منطقة التسجيل بشكل كاف من خلال نظام إضاءة الغرفة أو باستخدام قفص مظلل على إعداد طاولة بصرية.
    6. اترك الشريحة تتأقلم لمدة 10 دقائق قبل بدء التسجيلات أو التعديل الدوائي الإضافي.
    7. بدء تشغيل برنامج الموجات الدماغية. حدد ملف > جلسة تسجيل جديدة. اضبط معلمات التسجيل بحيث يكون تردد التسجيل 1 هرتز وتردد أخذ العينات 14 كيلو هرتز / قطب كهربائي. قم بتغيير إزاحة مكبر الصوت لمعايرة الشريحة.
      ملاحظة: كما هو موضح سابقا في القسم 3.1.4.1 ، أثناء إجراء اختبارات النظام ، تأكد من تطبيق معلمات التسجيل نفسها هذه.
    8. اضغط على تسجيل لبدء الاستحواذ بالشروط التجريبية المحددة مسبقا.
    9. مباشرة بعد التسجيل النهائي ، التقط تصويرا ضوئيا لشريحة الدماغ الحادة. حرك الشريحة مرة أخرى إلى غرفة استعادة الشريحة ، وقم بإزالة أي مادة عضوية مقترنة بالشريحة بفرشاة ، واستمر في الشريحة التالية. قم بتنظيف HD-MEAs كما هو موضح في القسم 3.4.
  3. إعداد مساحة عمل تسجيل iPSC البشرية والتسجيلات على مستوى الشبكة على HD-MEA (الشكل 2B)
    ملاحظة: قم بتغيير الوسائط إما في اليوم السابق للتسجيل أو بعد تسجيل iPSC البشري مباشرة (الجدول 1C). في الدراسات التي تستخدم الخلايا العصبية الوظيفية ، تم تغيير الوسائط كل 4 أيام ، وفي وسائط 4 و 8 و 16 و 24 DIV يتم تغييرها مباشرة بعد تسجيلات iPSC.
    1. ضمان بيئة عمل معقمة من خلال تنظيف منصة الاستحواذ HD-MEA بنسبة >70٪ EtOH.
    2. ضع غطاء قاعدة بوليديميثيل سيلوكسان (PDMS) برفق مع الإشارة إلى حلقة HD-MEA أسفل الغطاء. انقل شريحة HD-MEA إلى مساحة عمل تسجيل iPSC وقم بتوصيل شريحة HD-MEA بمنصة الاستحواذ.
    3. تأكد من تعتيم منطقة التسجيل بشكل كاف من خلال نظام إضاءة الغرفة أو قفص مظلل على طاولة بصرية.
    4. اسمح لشريحة HD-MEA بالتوازن لمدة 10 دقائق قبل بدء التسجيلات أو التعديل الدوائي الإضافي.
    5. بدء تشغيل برنامج الموجات الدماغية. حدد ملف > جلسة تسجيل جديدة. اضبط معلمات التسجيل على تردد تسجيل يبلغ 50 هرتز وتردد أخذ عينات يبلغ 18 كيلو هرتز / قطب كهربائي. قم بتغيير إزاحة مكبر الصوت لمعايرة الشريحة.
      ملاحظة: كما هو موضح سابقا في القسم 2.1.1 ، أثناء إجراء اختبار النظام قبل الطلاء والطلاء ، تأكد من تطبيق معلمات التسجيل نفسها هذه.
    6. سجل نشاط الإطلاق التلقائي أو الاستجابات المستحثة دوائيا من شبكة iPSC البشرية في كل يوم من أيام الخطة التجريبية (أي 4 ، 8 ، 16 ، 24 DIVs).
      ملاحظة: لا تدع الشريحة تبقى خارج الحاضنة لمدة >30 دقيقة للحفاظ على درجة حرارة ورطوبة ثابتة ومنع أي صدمة في درجة الحرارة للخلايا.
    7. احتضان HD-MEAs عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 على مدار التجربة.
    8. بعد الانتهاء من التجربة ، قم بإصلاح الشبكة العصبية على الرقائق والبقع لمزيد من التصوير البصري أو قم بتنظيف HD-MEAs مباشرة ، كما هو موضح في الخطوة 3.4.
  4. تنظيف رقائق HD-MEA
    1. بعد التجربة ، تخلص من المحلول وفقا للتخلص السليم من النفايات واشطفه بماء dd.
    2. أضف المنظف الذي تختاره ، ونظف المنطقة النشطة والخزان بالكامل باستخدام Q-tip ، وتخلص من المنظف. أعد ملء المنظف ، واحتضانه لمدة 20 دقيقة ، ثم تخلص من المنظفات.
    3. شطف جيدا بالماء من الدرجة المختبرية. ثم ، شطف 3-4 مرات مع الماء dd.
    4. استخدم ضغط الهواء لتجفيف شريحة HD-MEA جيدا.

4. تحليل التسجيلات العصبية واسعة النطاق من HD-MEAs

ملاحظة: على الرغم من أن الخطوة 4.1 خاصة ببرنامج Brainwave، إلا أنه يمكن تعديل الخطوة 4.2 استنادا إلى نوع جهاز HD-MEA المتاح تجاريا لكل مستخدم.

  1. المعالجة المسبقة للبيانات الأولية واكتشاف الأحداث
    1. افتح ملف بيانات أولية مسجل (.brw) في برنامج Brainwave. حدد التحليل > اكتشاف LFP أو اكتشاف الارتفاع.
      ملاحظة: يستخدم LFP Detection ترشيح IIR مع مرشح Butterworthمنخفض التمرير من الدرجة 4 (1-100 هرتز). تتضمن خوارزميات العتبة الصلبة عتبة عالية تبلغ 150 ميكروفولت ، وعتبة منخفضة تبلغ -150 ميكروفولت ، ونافذة طاقة بين 70-120 مللي ثانية ، وفترة حرارية تبلغ 10 مللي ثانية ، ومدة حدث قصوى تبلغ 1 ثانية. يستخدم Spike Detection الفردي و MUA ترشيح IIR مع مرشح Butterworthعالي التمرير من الدرجة 4 (300-3500 هرتز). يتم تطبيق خوارزمية اضطراب ما بعد الصدمة بعامل انحراف معياري يبلغ 8 ، وفترة عمر ذروة تبلغ 2 مللي ثانية ، وفترة مقاومة للحرارة تبلغ 1 مللي ثانية.
    2. بالنسبة لتسجيلات دوائر HC وOB ، أضف خيار مساحة العمل المتقدمة في ملف الحدث المكتشف (.bxr) لاستيراد صورة الضوء الهيكلية الملتقطة من المجهر المجسم. عند فحص دوائر HC واسعة النطاق ، قم بإنشاء طبقات هيكلية تحتوي على التلفيف المسنن (DG) ، و hilus ، و Cornu Ammonis 1 (CA1) ، و Cornu Ammonis 3 (CA3) ، والقشرة المخية الداخلية (EC) ، والقشرة المحيطة بالأنف (PC). عند فحص دوائر OB واسعة النطاق ، قم بإنشاء طبقات هيكلية تحتوي على طبقة العصب الشمي (ONL) ، والطبقة الكبيبية (GL) ، والطبقة الضفيرية الخارجية (EPL) ، وطبقة الخلايا التاجية (MCL) ، وطبقة الخلايا الحبيبية (GCL). ضع في اعتبارك EPL و MCL كطبقة إسقاط (PL) ، بما في ذلك القشرة الشمية (OCx).
  2. معالجة البيانات باستخدام خط أنابيب حسابي مخصص ل Python
    1. تقليل التشويش
      1. اقرأ ملف .bxr باستخدام برنامج نصي Python مكتوب خصيصا26،29،32 وحزمة python h5py 3.6.0.
      2. استخراج قطارات سبايك المتعلقة بتسجيلات شبكة iPSC وقطارات أحداث LFP المتعلقة بتسجيلات دائرة شريحة الدماغ HC و OB.
      3. قم بتوصيف الأحداث التي يقل فيها إجمالي عدد الأقطاب الكهربائية النشطة عن 0.1٪ أو 10٪ من متوسط الأقطاب الكهربائية النشطة لكل حدث متوسط أو الأحداث المكتشفة التي تقع خارج نطاق معدل إطلاق معقول إحصائيا كأحداث عشوائية وإزالتها. بالإضافة إلى ذلك، قم بتطبيق قيم عتبة السعة ومدة الحدث.
        ملاحظة: بالنسبة لنطاق معدل إطلاق النار ، يتم النظر في 0.1-15 طفرات / ثانية و 0.1-60 أحداث LFP / دقيقة. هذه أمثلة على قيم عتبة المعدل المستخدمة لمجموعات البيانات التي تم تحليلها. ستعتمد عتبات المعدل والسعة والمدة على البيانات الفردية.
      4. احفظ بيانات قطار الحدث الناتج مع المعلومات الزمانية المكانية المرفقة بتنسيق ملف .npy.
    2. الخطوط النقطية
      1. اقرأ ملفات .npy و .bxr للحدث المصفى وقم بإنشاء مخطط نقطي باستخدام وظيفة Matplotlib pyplot (https://matplotlib.org/3.5.3/api/_as_gen/matplotlib.pyplot.html).
      2. بالإضافة إلى ذلك ، بالنسبة لتسجيلات شرائح الدماغ ذات خصوصية الطبقة ، قم بفرز وتجميع معرفات الأقطاب الكهربائية بناء على الطبقات المنتجة في الخطوة 4.1.2.
    3. يعني نشاط إطلاق النار
      1. معالجة بيانات السلاسل الزمنية من ملف .bxr ، وحساب متوسط معدل إطلاق كل قطب كهربائي (عدد الأحداث / وقت التسجيل).
      2. قم بإنشاء مصفوفة بيانات حيث تمثل الصفوف والأعمدة إحداثيات الأقطاب الكهربائية في صفيف HD-MEA 64 x 64 ، حيث تشير كل قيمة مصفوفة إلى متوسط معدل الإطلاق.
      3. استخدم مكتبة تخطيط مثل عرض Matplotlib أو وظائف خريطة الحرارة في Seaborn في Python.
      4. استخدم خريطة الألوان "الساخنة" هنا ، وإنشاء خريطة حرارية إعلامية تلخص بصريا التوزيع المكاني لمتوسط معدلات إطلاق النار عبر مجموعة الأقطاب الكهربائية.
    4. آثار الموجي التمثيلية
      1. اقرأ بيانات السلاسل الزمنية من ملف .brw وقم بإنشاء تتبع شكل موجي باستخدام وظيفة Matplotlib pyplot. (https://matplotlib.org/3.5.3/api/_as_gen/matplotlib.pyplot.html).
      2. إدخال معرف القطب المطلوب ، وحاوية الوقت ، ونطاق التردد لتتبع شكل الموجة التمثيلي. وتشمل نطاقات التردد المحددة في هذه التحليلات تذبذبات LFP منخفضة التردد (1-100 هرتز) مع نطاقات تردد مرشحة من δ وθ و β و γ؛ تموجات موجة حادة (SWR) (140-220 هرتز) ؛ وعالية التردد واحد و MUA (300-3500 هرتز). نطاقات التردد δ وθ و β و γ هي 1-4 هرتز و 5-12 هرتز و 13-35 هرتز و 35-100 هرتز على التوالي.
    5. الكثافة الطيفية للطاقة
      1. اقرأ بيانات السلاسل الزمنية من ملف .brw واحسب الدوامات لتمييز الترددات السائدة الكامنة وراء النشاط التذبذبي داخل كل سلسلة زمنية.
      2. بناء مخططات طيفية للألوان الزائفة لديناميكيات التردد والوقت.
        ملاحظة: يتم حساب الأطياف باستخدام طريقة ويلش من خلال استخدام تحويل فورييه السريع ل LFPs المسجلة لتقدير كثافة القدرة الطيفية41.
      3. أدخل معرف القطب المطلوب وحاوية الوقت ونطاق التردد لخريطة الكثافة الطيفية. وتشمل نطاقات التردد المحددة في هذه التحليلات تلك الموصوفة في الخطوة 4.2.4.
    6. اتصال وظيفي
      1. بالنسبة لتسجيلات دائرة شريحة الدماغ ، اتبع الخطوات 4.2.6.2-4.2.6.4.
      2. اقرأ بيانات السلاسل الزمنية من ملف .brw واحسب التباين المتبادل بين أزواج الأقطاب الكهربائية النشطة في الصفيف 64 × 64 باستخدام معامل ارتباط بيرسون (PCC)42.
      3. قم بملاءمة نموذج الانحدار الذاتي المتجه للسلسلة الزمنية باستخدام سببية جرانجر متعددة المتغيرات لتحديد تأثير سلسلة زمنية على أخرى.
      4. تطبيق وظيفة النقل الموجه (DTF) لتقييم تدفق المعلومات الاتجاهية داخل الروابط المترابطة.
        ملاحظة: يتم إنشاء الاتصال الوظيفي في الشبكة متعددة الطبقات من خلال تعيين عتبة قيمة الارتباط بناء على تلك التي تزيد عن المتوسط والانحرافين المعياريين لجميع قيم التغايرالمتبادل 43,44.
      5. لتسجيل iPSC ، اتبع الخطوات 4.2.6.6-4.2.6.8.
      6. اقرأ بيانات spiketrains من ملف .bxr واحسب مصفوفة 64 × 64 لمعاملات ارتباط PCC بين جميع مجموعات قطارات السنبلة المثبتة باستخدام وظائف spike_train_correlation (https://elephant.readthedocs.io/en/v0.7.0/reference/spike_train_correlation.html).
        ملاحظة: يتم إنشاء التوصيلية الوظيفية في الشبكة متعددة الطبقات عن طريق تعيين عتبة قيمة الارتباط بناء على تلك التي تزيد عن المتوسط وانحرافين معياريين لجميع قيم التغاير المتقاطع.
      7. وعلاوة على ذلك، تنفيذ إجراءات ترشيح المرشحات المكانية والزمانية (STF) وعتبات الكمون المعتمدة على المسافة (DdLT) على مصفوفة التوصيلية للتخلص من التوصيلات المزدوجة المحتملة التي تتجاوز سرعة الانتشار القصوى (المحددة عند 400 مم/ثانية)45.
      8. استخرج القمم السالبة من مصفوفات الارتباط المتبادل الناتجة مع عمليات التصفية والعتبة لتحديد الاتصالات المثبطة باستخدام خوارزمية الرسم البياني للارتباط المتقاطع (FNCCH) المفلترة والمعيارية45.
      9. قم بتحويل كل مصفوفة اتصال إلى ملف رسم بياني ديناميكي (.gexf).
    7. خرائط اتصال الشبكة
      1. افتح مختبر البيانات في برنامج Gephi الإصدار 9.2 (https://gephi.org) للرسم البياني الديناميكي لرسم صناديق زمنية محددة.
      2. تطبيق التخطيط الجغرافي في نافذة التخطيط للتعيين المكاني.
      3. ضع قيود المعلمات على نطاق الدرجة ووزن الحافة للمقارنة.
      4. قم بتعيين اللون العقدي وحجم الحافة وحجم الدرجة للحصول على تصور أفضل.

Representative Results

رسم الخرائط الزمانية المكانية متعددة النماذج واستخراج ميزات إطلاق التذبذب
لتحديد LFP على مستوى الشبكة وأحداث الارتفاع التي ظهرت من المجموعات العصبية الديناميكية ، قمنا بالتحقيق في أنماط إطلاق متزامنة واسعة النطاق في دوائر HC و OB وشبكات iPSC البشرية. تم تحليل دوائر شرائح الدماغ المسجلة من الخطوة 3.2 وشبكات iPSC المسجلة من الخطوة 3.3 وفقا للخطوات 4.1-4.2 من البروتوكول. أولا ، تم الكشف عن الأحداث وتقليل الضوضاء لجميع مجموعات البيانات المسجلة وتم حلها إقليميا وفقا لمواصفات الدائرة. بعد ذلك ، تم رسم الخرائط المكانية الطبوغرافية بالألوان الزائفة لمتوسط LFP واسع النطاق وأنماط إطلاق السنبلة ، والخطوط النقطية للأحداث المكتشفة ، وآثار 5-s التمثيلية لأشكال الموجات المفلترة (الأشكال 3 A-I). تم تراكب رسم الخرائط الطبوغرافية للألوان الزائفة لأنماط LFP ومعدل إطلاق السنبلة على الصور البصرية الملتقطة بالمجهر ل HC (الشكل 3A) و OB (الشكل 3B) والشبكة العصبية البشرية iPSC (الشكل 3C). وهذا يسمح بالتحقيق في أنماط واستجابات التذبذب الفردية القائمة على الدوائر والشبكة. تحتوي المخططات النقطية HC وOB على عدد أحداث LFP المكتشفة مرتبة عبر طبقات DG و Hilus و CA3 و CA1 و EC و PC لدائرة HC وطبقات ONL و OCx و GL و PL و GCL لشبكة OB عبر حاوية زمنية مدتها 60 ثانية (الأشكال 3D ، E). يعرض المخطط النقطي iPSC البشري أحداث ارتفاع متزامنة مكتشفة للشبكة المستزرعة المترابطة عبر حاوية زمنية مدتها 20 ثانية (الشكل 3G). بعد ذلك ، تظهر آثار الأحداث التمثيلية 5s من مواقع تسجيل HD-MEA واسعة النطاق مجموعة من الترددات التذبذبية المسجلة في دوائر HC (أي القطب المختار في CA3) (الشكل 3G) و OB (أي القطب المختار في GL) (الشكل 3H) ونشاط انفجار السنبلة متعدد الوحدات في شبكة iPSC البشرية من أربعة أقطاب نشطة مختارة في الصفيف (الشكل 3I). تظهر هذه الإشارات النموذجية توقيعات الإشارات الحيوية ، بما في ذلك تذبذبات LFP منخفضة التردد (1-100 هرتز) مع نطاقات تردد δ و θ و β و γ مرشحة ؛ تموجات موجة حادة (SWR) (140-220 هرتز) ؛ وعالية التردد واحد و MUA (300-3500 هرتز). وأخيرا، استخدم تحليل الكثافة الطيفية للقدرة (PSD) لتحديد حجم قدرة نطاق تذبذبي معين في نفس الوقت في دائرة HC وOB المترابطة المسجلة من HD-MEA (الشكلان 3J، K).

الشبكة العصبية الوظيفية متعددة الوسائط على مستوى الشبكة
لاستنتاج الاتصال واسع النطاق للشبكات العصبية متعددة الطبقات من أنماط إطلاق متزامنة للمجموعات العصبية النشطة بشكل متزامن ، تم حساب التباين المتبادل بين أزواج الأقطاب النشطة في الأحداث المكتشفة وفقا للخطوة 4.2.6 من البروتوكول. هنا ، تم فرز معامل الارتباط بناء على طبقات في دائرة HC و OB أو غير مصنف في شبكة iPSC ثم تم تخزينه في مصفوفة متماثلة. تم إنشاء الشبكات العصبية الوظيفية لدوائر HC و OB من خلال تطبيق سببية جرانجر متعددة المتغيرات ووظيفة النقل الموجه (DTF) لتحديد تأثير سلسلة زمنية واحدة على أخرى وتقييم تدفق المعلومات الاتجاهية داخل الروابط المترابطة في الشبكات المتميزة. تم إجراء رسم خرائط الشبكة العصبية ل HC (الشكل 4A) و OB (الشكل 4B) وتصور الشبكة باستخدام برنامج Gephi الإصدار 9.2 (https://gephi.org). تم وضع قيود معلمات مماثلة على الروابط الوظيفية لمقارنة دوائر شريحة الدماغ HC و OB وتوضيح 100 ثانية من الاتصال الوظيفي لأحداث LFP المكتشفة. يتم قياس العقد وفقا لقوة الدرجة مع اللون العقدي الذي يشير إلى لون الطبقة والارتباط الذي يحدد الاتصالات داخل الطبقة وفيما بينها. تم إنشاء الشبكات العصبية الوظيفية لشبكات iPSC البشرية من خلال تطبيق المرشحات المكانية والزمانية (STF) وعتبات الكمون المعتمدة على المسافة (DdLT) لتعزيز اختيار الروابط المهمة وتحسين تحديد التوصيلات ذات المغزى من خلال تطبيق تحليل الرسم البياني للارتباط المتبادل (FNCCH) المصفى والطبيعي. رسم خرائط الشبكة العصبية لشبكات iPSC البشرية على شريحة HD-MEA بأكملها (الشكل 4C) التصور الذي يتم إجراؤه باستخدام Gephi. يشير اللون العقدي إلى الإدخال المثير أو المثبط ، ويحدد لون الارتباط الاتصالات.

Figure 1
الشكل 1: نظرة عامة على المنصة التجريبية والحسابية على HD-MEA على نطاق واسع. (أ) تمثيل تخطيطي متساوي القياس لمنصاتنا الإلكترونية العصبية الهجينة الحيوية متعددة الوسائط التي تم تحقيقها باستخدام HD-MEA القائم على CMOS لالتقاط الديناميكيات العصبية من الدوائر والشبكات العصبية HC و OB و iPSC البشرية. (ب) سير عمل تخطيطي لتشريح دماغ الفأر ومخطط عمله للحصول على شرائح HC و OB. (ج) تمثيلات طبوغرافية لأنماط إطلاق النار واسعة النطاق المسجلة في وقت واحد من شرائح HC و OB بأكملها متراكبة مع الأشكال الموجية خارج الخلية المستخرجة إلى الصور البصرية الشرائح. د: التمثيل التخطيطي للشبكة العصبية المستحثة متعددة القدرات (iPSC) التي تم الحصول عليها من البشر. (ه) صور مجهرية مضان تبين c-fos الخلوية و MAP-2 الجسدي / التغصني لكامل الشبكة العصبية البشرية على رقاقة HD-MEA (يسار) متطابقة مع خريطة نشاط إطلاق النار المتوسطة بأكملها (يمين). (و) الإطار الحسابي بما في ذلك تحليل البيانات المتقدم ، ورسم خرائط الاتصال ، وأدوات التعلم الآلي الذكاء الاصطناعي لتحليل البيانات العصبية متعددة الأبعاد التي تم الحصول عليها من التسجيلات واسعة النطاق على HD-MEAs. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: تخطيطات لشريحة الدماغ خارج الجسم الحي وإعداد وتسجيل مساحات عمل ثقافة iPSC البشرية في المختبر . (أ) سير عمل تخطيطي يوضح الإعداد لإعداد شرائح HC و OB ، ويضم الأدوات والمعدات المطلوبة في كل مساحة عمل. (ب) التمثيل التخطيطي لإعداد ثقافة iPSC البشرية ، بما في ذلك الأدوات والأجهزة اللازمة. يتم تضمين قائمة كاملة بالمواد في الخطوات 1.2.2 و 2.1 و 2.2 و 3.1.1 و 3.3 وجدول المواد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: رسم خرائط واستخراج الأنماط الزمانية المكانية لديناميكيات الشبكة. (A-C) متوسط LFP والخرائط المكانية لمعدل الارتفاع ، محسوبة على تسجيلات مدتها خمس دقائق ، متراكبة على صورة ضوء المجهر. (مد-واو) مخططات نقطية تصور أحداث LFP المكتشفة والخالية من الضوضاء في عينة فرعية للبيانات مدتها 60 ثانية وارتفاعات في عينة فرعية للبيانات مدتها 20 ثانية. (ز-ط) استخراج تتبع شكل الموجة التمثيلي من مقطع مدته 5 ثوان من العينة الفرعية لبيانات المخطط النقطي (مظلل باللون الأحمر في الرسم النقطية) ، معروضة كنطاقات تذبذبية LFP خام (1-100 هرتز) ؛ نطاقات التردد δ (4-1-1) وθ (12-5) و β (35-13) و γ (35-100 هرتز) ؛ SWR (140-220 هرتز) ؛ وارتفاع أحادي عالي التردد و MUA (300-3500 هرتز). (ي، ك) خرائط الكثافة الطيفية للطاقة ل LFPs التذبذبية السريعة والبطيئة (1-100 هرتز) و SWR (140-220 هرتز). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: تنظيم الشبكات العصبية الوظيفية على نطاق الشبكة المتعددة الوسائط. (أ-ج) توضح خرائط Gephi الاتصال الوظيفي العقدي ، حيث تتوافق العقد مع أحد أمثلة وسائل إيضاح شريط الألوان (أدناه) ، بينما يتم تظليل الروابط (أو الحواف) لمطابقة العقد المتصلة. يتم عرض أمثلة وسائل إيضاح لطبقات iPSC (A) HC و(B) OB و(C) على صفيف 64 × 64. يتم رسم طبقات HC و OB على حاوية زمنية مدتها 100 ثانية لتقليل عدد العقد والروابط المرئية بشكل فعال لأغراض التصور. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: حلول لإعداد شريحة الدماغ والوسائط للمزارع العصبية iPSC. (أ) محلول تقطيع عالي السكروز لتحضير شريحة الدماغ خارج الجسم الحي. (ب) حل تسجيل aCSF لإعداد وتسجيل شريحة الدماغ خارج الجسم الحي. (ج-د) بروتوكول وسائط iPSC للخلايا العصبية البشرية ، حيث (C) عبارة عن وسائط BrainPhys الكاملة المستخدمة في إذابة الخلايا ، وطلاء رقاقة HD-MEA ، وصيانة HD-MEA المستزرعة ، و (D) وسائط التنقيط المستخدمة في طلاء الخلايا HD-MEA. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 2: استكشاف مشكلات الحصول على تسجيل HD-MEA الشائعة وإصلاحها. قائمة بالمشكلات الشائعة وأسبابها المحتملة وحلول استكشاف الأخطاء وإصلاحها المتعلقة بشرائح HD-MEA ومنصة التسجيل وضوضاء النظام والبرامج. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

Discussion

لطالما كانت الديناميات المعقدة للنشاط العصبي الزماني المكاني ، الناشئة عن مجموعات عصبية مترابطة ، موضوعا للدسيسة في علم الأعصاب. قدمت المنهجيات التقليدية ، مثل التصحيح المشبك ، و MEA القياسي ، والتصوير Ca2+ ، رؤى قيمة حول تعقيد الدماغ. ومع ذلك ، فإنها غالبا ما تقصر في التقاط الديناميات الحسابية الشاملة على مستوى الشبكة21،22،23. يمثل البروتوكول التقني لمنصة HD-MEA ، كما هو مفصل في دراسة JoVE هذه ، قفزة كبيرة إلى الأمام ، حيث يقدم رؤية بانورامية للديناميكيات العصبية عبر طرائق متنوعة ، من تجميعات الخلايا إلى الشبكات الموسعة (أي شرائح دماغ الفأر الحادة خارج الجسم الحي وشبكات iPSC البشرية في المختبر )26،29،30،32.

كانت شرائح دماغ الفأر الحادة خارج الجسم الحي أداة أساسية في الأبحاث العصبية ، مما يسهل التحقيقات الجزيئية وعلى مستوى الدائرة 6,7. ومع ذلك ، فإن التحدي المتمثل في الحفاظ على صلاحية الأنسجة كان عنق الزجاجة المستمر. يقدم البروتوكول المحدد في هذه الدراسة تعديلات مهمة لتحسين جودة وطول عمر هذه الشرائح لاستغلال فوائدها على منصة HD-MEA. يؤكد هذا البروتوكول على أهمية - ط) تحقيق توحيد الشرائح ، حيث يفضل استخدام الاهتزاز على مفرمة الأنسجة نظرا لدقتها وتقليل تلف الأنسجة ، على الرغم من المفاضلة بين أوقات التقطيع الأطول. ب) ضمان الكربوجين المستمر طوال العملية ، من الاستخراج إلى التسجيل ، للحفاظ على صلاحية الأنسجة. ج) تنظيم درجة الحرارة والسماح بوقت استرداد كاف قبل التسجيل. د) استخدام كتلة أو قالب أغاروز لتثبيت الدماغ ، ومنع التمزق ، وتقليل ملامسة الغراء. v) الحفاظ على معدلات التدفق المثلى ل aCSF الكربوجيني داخل خزان HD-MEA لضمان صحة الشريحة مع تجنب مشكلات مثل الفصل والضوضاء والانجراف (الجدول 2).

بالنسبة لكل من شرائح دماغ الفأر ومستحضرات iPSC البشرية ، فإن تعزيز اقتران واجهة القطب والأنسجة أمر بالغ الأهمية30،46،47. يؤكد بروتوكولنا على أهمية استخدام جزيء Poly-dl-ornithine المعزز للالتصاق (PDLO). لا يزيد هذا الجزيء من مساحة السطح للكشف عن الإشارات الكهربائية فحسب ، بل يعزز أيضا التوصيل الكهربائي46. من خلال القيام بذلك ، فإنه يعزز الالتصاق الخلوي والنمو وتطوير خصائص الشبكة الوظيفية. يلعب هذا التحسين دورا محوريا في تعزيز فعالية منصة HD-MEA. وهذا بدوره يضمن تحليلا دقيقا ومتسقا للشبكات العصبية المجهرية خارج الجسم الحي وفي المختبر وتسلسل إطلاقها الزماني المكاني. والجدير بالذكر أن PDLO قد ثبت أنه يتفوق على ركائز أخرى مثل البولي إيثيلين (PEI) وبولي إل أورنيثين (PLO) في تعزيز نشاط إطلاق النار التلقائي والاستجابة للمنبهات الكهربائية في الثقافات العصبية. بالإضافة إلى ذلك ، تم استخدام PDLO لتشغيل السطح على HD-MEA وتبين أنه يعزز واجهة اقتران شريحة القطب الكهربائي ويزيد من نسبة الإشارة إلى الضوضاء في كل من شرائح OB و HC26,29. تعمل إضافة مرساة بلاتينية مصممة خصيصا على زيادة اقتران واجهة شريحة القطب الكهربائي ، مما يؤدي إلى تسجيلات ذات نسبة إشارة إلى ضوضاء أعلى.

يقدم استخدام HD-MEA لكل من شرائح دماغ الفأر خارج الجسم الحي وشبكات iPSC البشرية في المختبر طريقة بارعة في استكشاف ديناميكيات واسعة النطاق ومتعددة المقاييس ومتعددة الوسائط. ومع ذلك ، فإن هذا النهج المبتكر يجلب تحديات كبيرة ، لا سيما في إدارة البيانات48،49،50،51. يولد تسجيل HD-MEA واحد يتم الحصول عليه بتردد أخذ عينات 18 كيلو هرتز / قطب كهربائي 155 ميجابايت / ثانية من البيانات. يتصاعد حجم البيانات بسرعة عند أخذ شرائح متعددة أو ظروف دوائية متنوعة أو فترات تسجيل طويلة. مثل هذا التدفق للمعلومات يتطلب بنى تحتية قوية للتخزين وأدوات حسابية متقدمة للمعالجة المبسطة. إن قدرة منصة HD-MEA على جمع البيانات في وقت واحد من آلاف المجموعات العصبية هي نعمة وعقبة. إنه يوفر رؤى فائقة في الديناميات الحسابية لوظائف الدماغ ، ولكنه يتطلب أيضا إطارا تحليليا دقيقا. في بروتوكول JoVE هذا ، قدمنا أمثلة على الاستراتيجيات الحسابية ، بما في ذلك اكتشاف الأحداث على نطاق واسع ، والتصنيف ، ونظرية الرسم البياني ، وتحليل التردد ، والتعلم الآلي. تؤكد هذه الأساليب على الجهود المكثفة المبذولة لمواجهة تحديات تحليل البيانات العصبية المعقدة. ومع ذلك ، لا يزال هناك مجال كبير لتطوير أدوات حسابية أكثر تقدما لتحليل مجموعات البيانات العصبية متعددة الأبعاد هذه. مسلحين بالأدوات والمنهجيات المناسبة ، يتم تضخيم إمكانات منصة HD-MEA ، مما يوفر رؤى عميقة حول تعقيدات وظائف الدماغ في كل من الظروف الصحية والمرضية.

في جوهرها ، توفر منصة HD-MEA ، عند دمجها مع البروتوكولات التفصيلية والأدوات الحسابية التي تمت مناقشتها ، نهجا تحويليا لفهم الأعمال المعقدة للدماغ. من خلال التقاط ديناميكيات واسعة النطاق ومتعددة المقاييس ومتعددة الوسائط ، فإنه يوفر رؤى لا تقدر بثمن في عمليات مثل التعلم والذاكرة ومعالجة المعلومات. علاوة على ذلك ، فإن تطبيقه في شبكات iPSC البشرية في المختبر لديه القدرة على إحداث ثورة في فحص الأدوية والطب الشخصي. ومع ذلك ، في حين أن هذه المنصة تمثل تقدما كبيرا في أبحاث علم الأعصاب ، فمن الأهمية بمكان الاعتراف بالتحديات التقنية الكامنة ومعالجتها. مع التحسين المستمر ودمج الأدوات الحسابية المتقدمة ، تقف منصة HD-MEA على أهبة الاستعداد للدخول في عصر جديد من أدوات التشخيص الدقيقة ، وتحديد المؤشرات الحيوية المحددة ، والعلاجات المستهدفة للاضطرابات العصبية.

Disclosures

لا يعلن المؤلفون عن أي مصالح منافسة أو مالية.

Acknowledgments

تم دعم هذه الدراسة من قبل الصناديق المؤسسية (DZNE) ، وجمعية هيلمهولتز ضمن صندوق هيلمهولتز للتحقق من الصحة (HVF-0102) ، وكلية دريسدن الدولية للدراسات العليا للطب الحيوي والهندسة الحيوية (DIGS-BB). نود أيضا أن نعرب عن تقديرنا لمنصة اختبار السلوكية في DZNE-Dresden (ألكسندر غارث وآن كاراسينسكي وساندرا غونتر وينس بيرجمان) لدعمهم. نود أن نعترف بأن جزءا من الشكل 1 تم إنشاؤه باستخدام النظام الأساسي BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
150 mm Glass Petri Dish generic generic Brain Preparation Workspace, Brain Slice Recording Workspace
0.22 μm Sterile Filter Unit  Assorted Assorted Assorted
90 mm Plastic Culture Dish TPP 93100 Brain Preparation Workspace, Brain Slice Recording Workspace
Agarose Roth 6351.5 Brain Preparation Workspace
Agarose Mold CUSTOM CUSTOM Brain Preparation Workspace; Custom designed 3D Printer Design, available upon request
Aluminum Foil generic generic Brain Extraction Workspace
Anesthesia chamber generic generic Brain Extraction Workspace; Assorted Beaker, Bedding etc
Ascorbic Acid Sigma Aldrich A4544-25G Solution Preparation Workspace
Assorted Beakers generic generic Solution Preparation Workspace; 50 mL
Assorted Luers Cole Parmer 45511-00 Brain Slice Recording Workspace
Assorted Volumetric flasks generic generic Solution Preparation Workspace; 500 mL, 1 L
B27 Supplement Life Technologies 17504-044 BrainXell Commercial Supplier Protocol
BDNF Peprotech 450-02 BrainXell Commercial Supplier Protocol
Biological Safety Cabinet with UV Lamp Assorted Assorted HD-MEA Coating, Plating, Mainainance Workspace
BrainPhys Neuronal Medium  STEMCELL Technologies  05790  CDI, and BrainXell Commerical Supplier Protocol
Brainwave Software 3Brain AG Version 4 Brain Slice and Human iPSC Recording Workspace
BrainXell Glutamatergic Neuron Assay  BrainXell  BX-0300  BrainXell Commercial Supplier Protocol
CaCl2 Sigma Aldrich 21115-100ML Solution Preparation Workspace
Carbogen generic generic All Workspaces; 95%/5% O2 and CO2 mixture
Cell Culture Incubator  Assorted Assorted Assorted
CMOS-based HD-MEA chip 3Brain AG CUSTOM Brain Slice and Human iPSC Recording Workspace
Conical Tubes, 50 mL, Falcon (Centrifuge Tubes)  STEMCELL Technologies  38010  CDI Commerical Supplier Protocol
Crocodile Clip Grounding Cables JWQIDI B06WGZG17W Brain Slice Recording Workspace
Curved Forceps FST 11052-10 Brain Extraction Workspace
DMEM/F12 Medium Life Technologies  11330-032 BrainXell Commercial Supplier Protocol
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline without Ca2+ and Mg2+ (D-PBS) STEMCELL Technologies  37350  CDI Commerical Supplier Protocol
Filter Paper Macherey-Nagel 531 011 Brain Preparation Workspace
Fine Brush Leonhardy 773 Brain Slice Preparation Workspace, Brain Slice Recording Workspace
Forceps VITLAB 67895 Brain Slice Recording Workspace
GDNF Peprotech 450-10 BrainXell Commercial Supplier Protocol
Geltrex Life Technologies A1413201 BrainXell Commercial Supplier Protocol
Glass pasteur pipette Roth 4518 Brain Slice Preparation Workspace, Brain Slice Recording Workspace
Glucose Sigma Aldrich G7021-1KG Solution Preparation Workspace
GlutaMAX Life Technologies 35050-061 BrainXell Commercial Supplier Protocol
Gravity-based Perfusion System ALA VC3-8xG Brain Slice Recording Workspace
HD-MEA Recording platform 3Brain AG CUSTOM Brain Slice and Human iPSC Recording Workspace
Heater Warner Instruments TC-324C Brain Slice Recording Workspace
Hemocytometer or Automated Cell Counter Assorted Assorted HD-MEA Coating, Plating, Mainainance Workspace
Hypo Needles Warner Instruments 641489 Brain Slice Recording Workspace
iCell GlutaNeurons Kit, 01279  CDI R1061  CDI Commerical Supplier Protocol
Iris Scissors Vantage V95-304 Brain Extraction Workspace
Isoflurane Baxter HDG9623 Brain Extraction Workspace
KCl Sigma Aldrich P5405-250G Solution Preparation Workspace
Laminin  Sigma-Aldrich  L2020  CDI Commerical Supplier Protocol
Liquid Nitrogen Storage Unit  Assorted Assorted HD-MEA Coating, Plating, Mainainance Workspace
Magnetic Stirrer generic generic Solution Preparation Workspace
Metal Screws Thorlabs HW-KIT2/M Brain Slice Recording Workspace
MgCl2 Sigma Aldrich M1028-100ML Solution Preparation Workspace
MgSO4 Sigma Aldrich 63138-250G Solution Preparation Workspace
Microdissection Tool Holder  Braun 4606108V Brain Slice Preparation Workspace, Brain Slice Recording Workspace
Microdissection Tool Needle Braun  9186166 Brain Slice Preparation Workspace, Brain Slice Recording Workspace
Modular Stereomicroscope Leica CUSTOM Brain Slice Recording Workspace; custom specifications and modifications
N2 Supplement Life Technologies 17502-048 CDI, and BrainXell Commercial Supplier Protocol
NaCl Sigma Aldrich S3014-1KG Solution Preparation Workspace
NaH2PO4 Sigma Aldrich S0751-100G Solution Preparation Workspace
NaHCO3 Sigma Aldrich S5761-500G Solution Preparation Workspace
Neurobasal Medium  Life Technologies 21103-049 BrainXell Commercial Supplier Protocol
Optical Cage System Thorlabs Assorted Brain Slice Recording Workspace
Optical Table w/Breadboard Thorlabs SDA7590 Brain Slice Recording Workspace
PDLO Sigma Aldrich P0671 HD-MEA Coating, Brain Slice Recording Workspace
Penicillin-streptomycin, 100x  Thermo Fisher Scientific  15140-122  CDI Commerical Supplier Protocol
Pipette tips TipONE S1120-8810 Brain Slice Recording Workspace
Pipettors  Assorted Assorted Assorted
Platinum Anchor CUSTOM CUSTOM Brain Slice Recording Workspace
Polyethylene Tubing Assorted Assorted Brain Slice Recording Workspace
Pump MasterFlex 78018-22 Brain Slice Recording Workspace
Razor Blade Apollo 10179960 Brain Preparation Workspace
Reference Electrode Cell Culture Cap CUSTOM CUSTOM Human iPSC Recording Workspace; Custom designed 3D Printer Design, available upon request
Rubber Pipette Bulb Duran Wheaton Kimble 292000205 Brain Slice Preparation Workspace, Brain Slice Recording Workspace
Serological Pipettes, 1 mL, 2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL Assorted Assorted Assorted
Slice Recovery Chamber CUSTOM CUSTOM Brain Slice Recovery Workspace; Custom designed 3D Printer Design, available upon request
Spatula ISOLAB 047.06.150 Brain Preparation Workspace
Sucrose Sigma Aldrich 84100-1KG Solution Preparation Workspace
Super Glue UHU 358221 Brain Slice Preparation Workspace
Surgical Scissors Peters Instruments BC 344 Brain Extraction Workspace
Tabletop Centrifuge  Assorted Assorted Assorted
TGF-β1 Peprotech 100-21C BrainXell Commercial Supplier Protocol
Tissue Paper generic generic Brain Extraction Workspace
Trypan Blue STEMCELL Technologies  07050  CDI Commerical Supplier Protocol
Upright Microscope Olympus CUSTOM Imaging Workspace; Custom specifications and modifications
Vacusip Integra 159010 Brain Slice Recording Workspace
Vibratome Leica VT1200s Brain Slice Preparation Workspace; Includes: Specimen plate, buffer tray, ice tray, specimen plate holding tool, vibratome blade adjusting tool
Vibratome Blade Personna N/A Brain Slice Preparation Workspace
Water Bath Lauda L000595 Brain Slice Recovery Workspace

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hebb, D. O. The Organization of Behavior; A Neuropsychological Theory. , Wiley. New York. (1949).
  2. Cossart, R., Garel, S. Step by step: cells with multiple functions in cortical circuit assembly. Nat Rev Neurosci. 23, 395-410 (2022).
  3. Carrillo-Reid, L., Yuste, R. Playing the piano with the cortex: role of neuronal ensembles and pattern completion in perception and behavior. Curr Opin Neurobiol. 64, 89-95 (2020).
  4. Buzsáki, G. Large-scale recording of neuronal ensembles. Nat Neurosci. 7, 446-451 (2004).
  5. Buzsáki, G. Neural Syntax: Cell assemblies, synapsembles, and readers. Neuron. 68 (3), 362-385 (2010).
  6. Huang, Y., Williams, J. C., Johnson, S. M. Brain slice on a chip: opportunities and challenges of applying microfluidic technology to intact tissues. Lab Chip. 12 (12), 2103-2117 (2012).
  7. Cho, S., Wood, A., Bowlby, M. Brain slices as models for neurodegenerative disease and screening platforms to identify novel therapeutics. Curr Neuropharmacol. 5 (1), 19-33 (2007).
  8. Bliss, T. V. P., Collingridge, G. L. A synaptic model of memory: long-term potentiation in the hippocampus. Nature. 361, 31-39 (1993).
  9. Anderson, P., Morris, R., Amaral, D., Bliss, T., O'Keefe, L. The Hippocampus Book. , Oxford University Press. New York. (2006).
  10. Lisman, J., et al. Viewpoints: how the hippocampus contributes to memory, navigation and cognition. Nat Neurosci. 20, 1434-1447 (2017).
  11. Mori, K., Nagao, H., Yoshihara, Y. The olfactory bulb: Coding and processing of odor molecule information. Science. 286 (5440), 711-715 (1999).
  12. Buck, L., Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: A molecular basis for odor recognition. Cell. 65 (1), 175-187 (1991).
  13. Bushdid, C., Magnasco, M. O., Vosshall, L. B., Keller, A. Humans can discriminate more than 1 trillion olfactory stimuli. Science. 343 (6177), 1370-1372 (2014).
  14. Kempermann, G. Why new neurons? Possible functions for adult hippocampal neurogenesis. J Neurosci. 23 (3), 635-638 (2003).
  15. Aimone, J. B., Wiles, J., Gage, F. H. Computational influence of adult neurogenesis on memory encoding. Neuron. 61 (2), 187-202 (2009).
  16. Nithianantharajah, J., Hannan, A. J. Enriched environments, experience-dependent plasticity and disorders of the nervous system. Nat Rev Neurosci. 7, 697-709 (2006).
  17. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  18. Espuny-Camacho, I., et al. Pyramidal neurons derived from human pluripotent stem cells integrate efficiently into mouse brain circuits in vivo. Neuron. 77 (3), 440-456 (2013).
  19. Rajamohan, D., et al. Current status of drug screening and disease modelling in human pluripotent stem cells. Bioessays. 35 (3), 281-298 (2013).
  20. Heilker, R., Traub, S., Reinhardt, P., Schöler, H. R., Sterneckert, J. iPS cell derived neuronal cells for drug discovery. Trends Pharmacol Sci. 35 (10), 510-519 (2014).
  21. Zhao, S. R., Mondéjar-Parreño, G., Li, D., Shen, M., Wu, J. C. Technical applications of microelectrode array and patch clamp recordings on human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. J Vis Exp. (186), e64265 (2022).
  22. Hamill, O. P., McBride, D. W. Induced membrane hypo/hyper-mechanosensitivity: A limitation of patch-clamp recording. Annu Rev Physiol. 59, 621-631 (1997).
  23. Manz, K. M., Siemann, J. K., McMahon, D. G., Grueter, B. A. Patch-clamp and multi-electrode array electrophysiological analysis in acute mouse brain slices. STAR Protoc. 2 (2), 100442 (2021).
  24. Lee, C. H., Park, Y. K., Lee, K. Recent strategies for neural dynamics observation at a larger scale and wider scope. Biosens Bioelectron. 240, 115638 (2023).
  25. Urai, A. E., Doiron, B., Leifer, A. M., Churchland, A. K. Large-scale neural recordings call for new insights to link brain and behavior. Nat Neurosci. 25 (1), 11-19 (2022).
  26. Hu, X., Khanzada, S., Klütsch, D., Calegari, F., Amin, H. Implementation of biohybrid olfactory bulb on a high-density CMOS-chip to reveal large-scale spatiotemporal circuit information. Biosens Bioelectron. 198, 113834 (2022).
  27. Amin, H., Marinaro, F., Tonelli, D. D. P., Berdondini, L. Developmental excitatory-to-inhibitory GABA-polarity switch is disrupted in 22q11.2 deletion syndrome: A potential target for clinical therapeutics. Sci Rep. 7 (1), 15752 (2017).
  28. Amin, H., Nieus, T., Lonardoni, D., Maccione, A., Berdondini, L. High-resolution bioelectrical imaging of Aβ-induced network dysfunction on CMOS-MEAs for neurotoxicity and rescue studies. Sci Rep. 7 (1), 2460 (2017).
  29. Emery, B. A., Hu, X., Khanzada, S., Kempermann, G., Amin, H. High-resolution CMOS-based biosensor for assessing hippocampal circuit dynamics in experience-dependent plasticity. Biosens Bioelectron. 237, 115471 (2023).
  30. Amin, H., et al. Electrical responses and spontaneous activity of human iPS-derived neuronal networks characterized for 3-month culture with 4096-electrode arrays. Front Neurosci. 10, 121 (2016).
  31. Lonardoni, D., et al. Recurrently connected and localized neuronal communities initiate coordinated spontaneous activity in neuronal networks. PLoS Comput Biol. 13 (7), e1005672 (2017).
  32. Emery, B. A., et al. Large-scale multimodal recordings on a high-density neurochip: Olfactory bulb and hippocampal networks. 2022 44th Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine & Biology Society (EMBC). , Glasgow, Scotland, United Kingdom. 3111-3114 (2022).
  33. Rossi, L., Emery, B. A., Khanzada, S., Hu, X., Amin, H. Pharmacologically and electrically-induced network-wide activation of olfactory bulb with large-scale biosensor. 2023 IEEE BioSensors Conference (BioSensors). , London, United Kingdom. 1-4 (2023).
  34. Emery, B. A., et al. Recording network-based synaptic transmission and LTP in the hippocampal network on a large-scale biosensor. 2023 IEEE BioSensors Conference (BioSensors). , London, United Kingdom. 1-4 (2023).
  35. Hierlemann, A., Frey, U., Hafizovic, S., Heer, F. Growing cells atop microelectronic chips: Interfacing electrogenic cells in vitro with CMOS-based microelectrode arrays). Proceedings of the IEEE. 99 (2), 252-284 (2011).
  36. Berdondini, L., et al. Active pixel sensor array for high spatio-temporal resolution electrophysiological recordings from single cell to large scale neuronal networks. Lab Chip. 9, 2644-2651 (2009).
  37. Siegle, J. H., Hale, G. J., Newman, J. P., Voigts, J. Neural ensemble communities: open-source approaches to hardware for large-scale electrophysiology. Curr Opin Neurobiol. 32, 53-59 (2015).
  38. Amin, H., Maccione, A., Zordan, S., Nieus, T., Berdondini, L. High-density MEAs reveal lognormal firing patterns in neuronal networks for short and long term recordings. 2015 7th International IEEE/EMBS Conference on Neural Engineering (NER). , Montpellier, France. 1000-1003 (2015).
  39. Altuntac, E., et al. Bottom-up neurogenic-inspired computational model. 2023 IEEE BioSensors Conference (BioSensors). , London, United Kingdom. 1-4 (2023).
  40. Maccione, A., et al. A novel algorithm for precise identification of spikes in extracellularly recorded neuronal signals. J Neurosci Methods. 177 (1), 241-249 (2009).
  41. Welch, P. D. The use of fast Fourier transform for the estimation of power spectra: A method based on time averaging over short, modified periodograms. IEEE Transactions on Audio and Electroacoustics. 15 (2), 70-73 (1967).
  42. Eggermont, J. J., Munguia, R., Pienkowski, M., Shaw, G. Comparison of LFP-based and spike-based spectro-temporal receptive fields and cross-correlation in cat primary auditory cortex. PLoS One. 6 (5), e20046 (2011).
  43. Damos, P. Using multivariate cross correlations, Granger causality and graphical models to quantify spatiotemporal synchronization and causality between pest populations. BMC Ecol. 16, 33 (2016).
  44. Kaminski, M. J., Blinowska, K. J. A new method of the description of the information flow in the brain structures. Biol Cybern. 65, 203-210 (1991).
  45. Pastore, V. P., Massobrio, P., Godjoski, A., Martinoia, S. Identification of excitatory-inhibitory links and network topology in large-scale neuronal assemblies from multi-electrode recordings. PLoS Comput Biol. 14 (8), e1006381 (2018).
  46. Amin, H., Dipalo, M., De Angelis, F., Berdondini, L. Biofunctionalized 3D nanopillar arrays fostering cell guidance and promoting synapse stability and neuronal activity in networks. ACS Appl Mater Interfaces. 10 (17), 15207-15215 (2018).
  47. Woeppel, K., Yang, Q., Cui, X. T. Recent advances in neural electrode-tissue interfaces. Curr Opin Biomed Eng. 4, 21-31 (2017).
  48. Steinmetz, N. A., Koch, C., Harris, K. D., Carandini, M. Challenges and opportunities for large-scale electrophysiology with Neuropixels probes. Curr Opin Neurobiol. 50, 92-100 (2018).
  49. Siegle, J. H., Hale, G. J., Newman, J. P., Voigts, J. Neural ensemble communities: open-source approaches to hardware for large-scale electrophysiology. Curr Opin Neurobiol. 32, 53-59 (2015).
  50. Freeman, J. Open source tools for large-scale neuroscience. Curr Opin Neurobiol. 32, 156-163 (2015).
  51. Stevenson, I. H., Kording, K. P. How advances in neural recording affect data analysis. Nat Neurosci. 14 (2), 139-142 (2011).

Tags

هذا الشهر في JoVE ، العدد 205 ، HD-MEA ، التسجيلات العصبية واسعة النطاق ، الدوائر / الشبكات العصبية ، شرائح الحصين القشرية ، شرائح البصلة الشمية ، الخلايا العصبية iPSC ، واجهة الأنسجة الكهربائية ، الشبكة العصبية ، نظرية الرسم البياني ، تجميعات الخلايا ، علم الأعصاب الحسابي ، الذكاء الاصطناعي ، التعلم الآلي
تسجيل وتحليل ديناميكيات المجموعة العصبية متعددة الوسائط واسعة النطاق على صفيف الأقطاب الكهربائية الدقيقة عالية الكثافة المدمجة CMOS
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Emery, B. A., Khanzada, S., Hu, X.,… More

Emery, B. A., Khanzada, S., Hu, X., Klütsch, D., Amin, H. Recording and Analyzing Multimodal Large-Scale Neuronal Ensemble Dynamics on CMOS-Integrated High-Density Microelectrode Array. J. Vis. Exp. (205), e66473, doi:10.3791/66473 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter