Summary
Hier gebruiken we HD-MEA om ons te verdiepen in de computationele dynamica van grootschalige neuronale ensembles, met name in hippocampussen, olfactoriusbolcircuits en menselijke neuronale netwerken. Het vastleggen van spatiotemporele activiteit, gecombineerd met computationele tools, geeft inzicht in de complexiteit van neuronale ensembles. De methode verbetert het begrip van hersenfuncties en identificeert mogelijk biomarkers en behandelingen voor neurologische aandoeningen.
Abstract
Grootschalige neuronale netwerken en hun complexe gedistribueerde microcircuits zijn essentieel om perceptie, cognitie en gedrag te genereren die voortkomen uit patronen van spatiotemporele neuronale activiteit. Deze dynamische patronen die voortkomen uit functionele groepen van onderling verbonden neuronale ensembles vergemakkelijken nauwkeurige berekeningen voor het verwerken en coderen van multiscale neurale informatie, waardoor hogere hersenfuncties worden aangestuurd. Om de computationele principes van neurale dynamica die ten grondslag liggen aan deze complexiteit te onderzoeken en de multiscale impact van biologische processen op gezondheid en ziekte te onderzoeken, zijn grootschalige gelijktijdige opnames instrumenteel geworden. Hier wordt een high-density micro-elektrode array (HD-MEA) gebruikt om twee modaliteiten van neurale dynamica te bestuderen - hippocampus- en olfactoriusbolcircuits van ex-vivo hersenplakjes van muizen en neuronale netwerken van in-vitro celculturen van door mensen geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's). Het HD-MEA-platform, met 4096 micro-elektroden, maakt niet-invasieve, multi-site, labelvrije opnames mogelijk van extracellulaire vuurpatronen van duizenden neuronale ensembles tegelijkertijd met een hoge spatiotemporele resolutie. Deze benadering maakt de karakterisering mogelijk van verschillende elektrofysiologische netwerkbrede kenmerken, waaronder single/multi-unit spiking-activiteitspatronen en lokale veldpotentiaaloscillaties. Om deze multidimensionale neurale gegevens onder de loep te nemen, hebben we verschillende computationele tools ontwikkeld met machine learning-algoritmen, automatische detectie en classificatie van gebeurtenissen, grafentheorie en andere geavanceerde analyses. Door deze computationele pijplijnen aan te vullen met dit platform, bieden we een methodologie voor het bestuderen van de grote, multiscale en multimodale dynamiek van celassemblages tot netwerken. Dit kan mogelijk ons begrip van complexe hersenfuncties en cognitieve processen in gezondheid en ziekte vergroten. Toewijding aan open wetenschap en inzichten in grootschalige computationele neurale dynamiek zou op de hersenen geïnspireerde modellering, neuromorfisch computergebruik en neurale leeralgoritmen kunnen verbeteren. Bovendien zou het begrijpen van de onderliggende mechanismen van verstoorde grootschalige neurale berekeningen en hun onderling verbonden dynamiek van microcircuits kunnen leiden tot de identificatie van specifieke biomarkers, wat de weg vrijmaakt voor nauwkeurigere diagnostische hulpmiddelen en gerichte therapieën voor neurologische aandoeningen.
Introduction
Neuronale ensembles, vaak celassemblages genoemd, zijn cruciaal in neurale codering en vergemakkelijken ingewikkelde berekeningen voor het verwerken van multiscale neurale informatie 1,2,3. Deze ensembles ondersteunen de vorming van uitgebreide neuronale netwerken en hun genuanceerde microcircuits4. Dergelijke netwerken en hun oscillerende patronen drijven geavanceerde hersenfuncties aan, waaronder perceptie en cognitie. Hoewel uitgebreid onderzoek specifieke neuronale typen en synaptische paden heeft onderzocht, blijft een dieper begrip van hoe neuronen samen celassemblages vormen en de spatiotemporele informatieverwerking over circuits en netwerken beïnvloedenongrijpbaar.
Acute, ex-vivo hersenplakjes zijn cruciale elektrofysiologische hulpmiddelen voor het bestuderen van intacte neurale circuits en bieden een gecontroleerde omgeving om oscillerende activiteitspatronen van neurale functie, synaptische transmissie en connectiviteit te onderzoeken, met implicaties voor farmacologische tests en ziektemodellering 6,7,8. Dit onderzoeksprotocol belicht twee belangrijke hersencircuits - de hippocampus-corticale (HC) die betrokken is bij leer- en geheugenprocessen 9,10, en de bulbus olfactorius (OB) die verantwoordelijk is voor geurdiscriminatie 11,12,13. In deze twee regio's worden gedurende het hele leven in de hersenen van zoogdieren continu nieuwe functionele neuronen gegenereerd door neurogenese bijvolwassenen14. Beide circuits vertonen multidimensionale dynamische neurale activiteitspatronen en inherente plasticiteit die deelnemen aan het opnieuw bedraden van het bestaande neurale netwerk en indien nodig alternatieve informatieverwerkingsstrategieën vergemakkelijken15,16.
Acute, ex-vivo hersenplakmodellen zijn onmisbaar om de hersenfunctionaliteit te onderzoeken en ziektemechanismen op microcircuitniveau te begrijpen. In-vitrocelculturen die zijn afgeleid van neuronale netwerken van door mensen geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) bieden echter een veelbelovende weg van translationeel onderzoek, waarbij bevindingen van dierproeven naadloos worden gekoppeld aan mogelijke klinische behandeling bij mensen17,18. Deze mensgerichte in-vitrotests dienen als een betrouwbaar platform voor het beoordelen van farmacologische toxiciteit, het mogelijk maken van nauwkeurige screening van geneesmiddelen en het bevorderen van onderzoek naar innovatieve, op cellen gebaseerde therapeutische strategieën19,20. Omdat we de cruciale rol van het iPSC-neuronale model erkennen, hebben we de derde module van deze protocolstudie gewijd aan het grondig onderzoeken van de functionele kenmerken van de afgeleide netwerken en het verfijnen van de bijbehorende celkweekprotocollen.
Deze elektrogene neurale modules zijn vaak bestudeerd met behulp van technieken zoals calcium (Ca2+ beeldvorming), patch-clamp opnames en low-density micro-elektrode arrays (LD-MEA). Hoewel Ca2+-beeldvorming het in kaart brengen van de activiteit van één cel biedt, is het een op cellabeling gebaseerde methode die wordt gehinderd door de lage temporele resolutie en uitdagingen bij langetermijnopnames. LD-MEA's missen ruimtelijke precisie, terwijl patch-clamp, een invasieve techniek op één locatie en arbeidsintensief, vaak een laag slagingspercentage oplevert 21,22,23. Om deze uitdagingen aan te pakken en netwerkbrede activiteit effectief te onderzoeken, zijn grootschalige gelijktijdige neurale opnames naar voren gekomen als een cruciale benadering voor het begrijpen van de computationele principes van neurale dynamiek die ten grondslag liggen aan de complexiteit van de hersenen en hun implicaties voor gezondheid en ziekte24,25.
In dit JoVE-protocol demonstreren we een grootschalige neurale opnamemethode op basis van de high-density MEA (HD-MEA) voor het vastleggen van spatiotemporele neuronale activiteit in verschillende hersenmodaliteiten, waaronder hippocampus- en olfactoriusbolcircuits van ex-vivo acute plakjes muizenhersenen (Figuren 1A-C) en in-vitro menselijke iPSC-afgeleide neuronale netwerken (Figuren 1D-E), eerder gerapporteerd door onze groep en andere collega's26,27,28,29,30,31,32,33,34,35. De HD-MEA, gebouwd op complementaire-metaaloxide-halfgeleidertechnologie (CMOS), beschikt over on-chip circuits en versterking, waardoor opnames van minder dan een milliseconde mogelijk zijn over een 7 mm2 array vangrootte 36. Deze niet-invasieve benadering vangt multi-site, labelvrije extracellulaire vuurpatronen van duizenden neuronale ensembles tegelijkertijd op met behulp van 4096 micro-elektroden met een hoge spatiotemporele resolutie, waardoor de ingewikkelde dynamiek van lokale veldpotentialen (LFP's) en multi-unit spiking-activiteit (MUA) wordt onthuld26,29.
Gezien de omvang van de gegevens die door deze methodologie worden gegenereerd, is een geavanceerd analytisch kader essentieel, maar brengt het uitdagingen met zich mee37. We hebben computationele tools ontwikkeld die automatische gebeurtenisdetectie, classificatie, grafentheorie, machine learning en andere geavanceerde technieken omvatten (Figuur 1F)26,29,38,39. Door de ZvH-MEA te integreren met deze analytische instrumenten, wordt een holistische benadering bedacht om de ingewikkelde dynamiek van individuele celassemblages tot bredere neurale netwerken in verschillende neurale modaliteiten te onderzoeken. Deze gecombineerde benadering verdiept ons begrip van de computationele dynamiek in normale hersenfuncties en biedt inzicht in anomalieën die aanwezig zijn in pathologische aandoeningen28. Bovendien kunnen inzichten uit deze benadering de vooruitgang stimuleren op het gebied van op de hersenen geïnspireerde modellering, neuromorfische computing en neurale leeralgoritmen. Uiteindelijk is deze methode veelbelovend bij het blootleggen van de kernmechanismen achter verstoringen van neurale netwerken, het mogelijk identificeren van biomarkers en het begeleiden van het creëren van nauwkeurige diagnostische hulpmiddelen en gerichte behandelingen voor neurologische aandoeningen.
Protocol
Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de geldende Europese en nationale regelgeving (Tierschutzgesetz) en werden goedgekeurd door de lokale overheid (Landesdirektion Sachsen; 25-5131/476/14).
1. Ex-vivo hersenplakjes van hippocampus-corticale en olfactorische bolcircuits op HD-MEA
- Bereiding van experimentele snij- en registratieoplossingen (figuur 2A)
- Bereid op de experimentele dag 0,5 l snijoplossing met een hoog sucrosegehalte en 1 l registratieoplossing van kunstmatig cerebrospinaal vocht (aCSF) (tabel 1A,B).
- Voeg alle vaste chemicaliën toe aan een droge maatkolf en vul een deel van de weg met dubbel gedestilleerd (dd) water.
- Voeg MgCl2 en CaCl2 uit 1 M voorraadoplossingen toe en vul de rest met dd-water. Begin constant te roeren met een magnetische roerder totdat de zichtbare vaste stoffen ~5 minuten zijn opgelost.
- Gebruik een vriespuntosmometer om de osmolariteit te valideren tussen 350-360 mOsm voor de snijoplossing met een hoog sucrosegehalte en 315-325 mOsm voor de aCSF-opnameoplossing.
- Gebruik een pH-meter om de pH tussen 7,3-7,4 te valideren voor de snijoplossing met een hoog sucrosegehalte en 7,25-7,35 voor de aCSF-opnameoplossing. Begin continu te borrelen met 95% O2 en 5% CO2 .
- Plaats de snijoplossing met een hoog sucrosegehalte ten minste 30 minuten op ijs voordat u gaat snijden en begin continu te borrelen met 95%O2 en 5% CO2.
- Vul na 10 minuten carbogareren een bekerglas van 50 ml met 30 ml snijoplossing en bewaar het in de vriezer (-20 °C) gedurende 20-30 minuten of tot het gedeeltelijk bevroren is.
OPMERKING: Alle oplossingen moeten voor elk experiment vers worden bereid. Het dd-water dat hier wordt gebruikt, is geautoclaveerd ultrapuur water dat bij kamertemperatuur (RT) wordt opgeslagen. De hoeveelheid oplossing die wordt bereid, moet worden afgestemd op de specifieke onderzoeksvraag.
- Bereid op de experimentele dag 0,5 l snijoplossing met een hoog sucrosegehalte en 1 l registratieoplossing van kunstmatig cerebrospinaal vocht (aCSF) (tabel 1A,B).
- Voorbereiding van hersenschijfwerkruimten (Figuur 2A)
- Breng het dier naar de proefruimte.
OPMERKING: In dit protocol werden C57BL/J6 vrouwelijke muizen in de leeftijd van 8-16 weken gebruikt zoals eerder beschreven 26,29,32. Het dier moet na het vervoer ten minste 30 minuten kunnen acclimatiseren. Overdrachten over lange afstanden (d.w.z. inter-instituut) moeten op dezelfde dag als het experiment worden vermeden. De leeftijd, het geslacht en de stam van het dier moeten worden bepaald op basis van de specifieke onderzoeksvraag. - Terwijl het dier acclimatiseert en de oplossing met een hoog sucrosegehalte afkoelt, plaatst u het benodigde gereedschap in elke aangewezen werkruimte (zie Materiaaltabel).
- Bereid de werkruimte voor herstel en onderhoud van hersenplakjes voor. Vul de snijherstelkamer met gecarbogeneerde aCSF-opnameoplossing en plaats de kamer in het waterbad dat is ingesteld op 32 °C. Zorg voor een continue carbogenatie tijdens het experiment.
- Bereid de werkruimte voor de voorbereiding van hersenplakjes voor. Stel de vibratoom in - plaats het mes in de vibratome-meshouder en kalibreer het vibratoom volgens de juiste instellingen (mesverplaatsingssnelheid: 0,20 mm/s, hoogteamplitude: 95 μm, meshoek: 45°). Vul de vibratome-ijslade met ijs en de bufferlade met een snijoplossing met een hoog sucrosegehalte en begin met het carbogeneren van de oplossing in de bufferbak.
- Bereid de werkruimte voor hersenvoorbereiding voor. Vul de glazen petrischaal van 150 mm met ijs en plaats er een plastic kweekschaal van 90 mm met filtreerpapier in. Vul de plastic kweekschaal met een snijoplossing met een hoog sucrosegehalte en begin met carbogeen. Voeg een druppel superlijm toe aan de gekoelde preparaatplaat en bevestig de agarosevorm.
OPMERKING: Agarose-schimmel wordt ten minste de dag ervoor bereid met 3% agarose in water in een aangepaste muizenhersenvorm. - Bereid ten slotte de werkruimte voor hersenextractie voor. Dek aluminiumfolie af met tissuepapier, neem een bekerglas van 50 ml met snijvloeistof met een hoog sucrosegehalte en voeg isofluraan toe aan de anesthesiekamer.
NOTITIE: Anesthesie wordt ~1 minuut voorafgaand aan het plaatsen van het dier aan de anesthesiekamer toegevoegd. Een bekerglas van 50 ml met 30 ml slush met een hoog sucrosegehalte wordt ~2 minuten voor de onthoofding uit de vriezer van -20 °C gehaald.
- Breng het dier naar de proefruimte.
- Extractie en snijden van muizenhersenen
OPMERKING: Deze hele procedure moet zo snel mogelijk worden uitgevoerd om een gebrek aan zuurstoftoevoer naar de hersenen te voorkomen. Het verwijderen van de hersenen duurt slechts 1-2 minuten vanaf de onthoofding tot onderdompeling in de sucrose-snijoplossing slush.- Verdoof het dier met de juiste dosering isofluraan (0,5 ml/1 l anesthesiekamer). Bepaal de diepte van de anesthesie door een pootknijp; Bevestig het ontbreken van een terugtrekkingsreflex voor de poot voordat u verder gaat.
- Breng het dier over naar het vloeipapier in de hersenextractiewerkruimte en onthoofd het met een chirurgische schaar.
- Steek een irisschaar in de hersenstam en houd de onderste schaar gelijk met de calvaria. Knip langs de sagittale hechting totdat de coronale hechting is bereikt. Plaats een irisschaar in de oogkassen en knip de metopische hechting door. Gebruik een gebogen pincet om de zijkanten van de calvaria naar beneden te bewegen, waardoor de hele hersenen bloot komen te liggen.
OPMERKING: Wees voorzichtig met zowel de irisschaar als de pincet om de hersenen niet te doorboren tijdens het doorknippen van de hechtingen. - Schuif de hersenen met de stompe rand van de gebogen pincet in het bekerglas van 50 ml met 30 ml snijvloeistof met een hoog sucrosegehalte. Laat het 1 minuut intrekken.
- Breng de hersenen over naar de 90 mm plastic kweekschaal met gekoelde gecarbogeneerde snijoplossing in de hersenvoorbereidingswerkruimte. Oriënteer de hersenen voor positionering in de agarosevorm.
- Voeg een klein puntje superlijm toe aan het rostrale uiteinde van de agarosevorm. Plaats de hersenen in de mal met de spatel. Zorg ervoor dat de hersenen met de dorsale kant naar beneden worden geplaatst voor horizontaal snijden.
NOTITIE: De locatie van lijm in de mal verandert afhankelijk van het interessegebied (ROI). Zorg er voor plakjes hippocampus-corticale (HC) en bulbus olfactorius (OB) voor dat de OB gestabiliseerd is en dat de zijkanten van de hersenen vrij blijven van lijm. Te veel lijm heeft invloed op de snijkwaliteit en veroorzaakt scheuren tijdens het trillen. - Verplaats de preparaatplaat in de bufferbak, verplaats het mes in de juiste hoek en vergroot de hoogte van de bufferlade om het mes zo dicht mogelijk bij de hersenen te brengen.
- Snijd met een snelheid van 0,20 mm/s intervallen van 300 μm HC- en OB-weefsels en verzamel ze na elke snijronde met een glazen pasteurpipet.
- Laat de plakjes 45 minuten in de met aCSF gevulde herstelkamer in een waterbad van 32 °C staan, gevolgd door 1 uur bij RT. Zorg ervoor dat de plakjes elkaar niet overlappen en volledig worden blootgesteld aan de koolhydraatoplossing.
NOTITIE: Zorg ervoor dat u alle oplossingen en alle genoemde kamers die de oplossing bevatten, continu carbogeneren. Een drukregelaar kan worden gebruikt om een consistente carbogenatie te behouden.
2. In-vitro humaan iPSC-gebaseerd neuronaal netwerk op HD-MEA
OPMERKING: Alle iPSC-neuronen die in dit onderzoek worden gebruikt, zijn commercieel verkregen (zie Materiaaltabel). Deze menselijke cellen differentieerden van stabiele iPS-cellijnen die waren afgeleid van menselijk perifeer bloed of fibroblasten.
- Coating van HD-MEA-chips voor in-vitro humane iPSC-celculturen (Figuur 2B)
- Plaats de HD-MEA-chip op het opnameplatform, vul het reservoir met PBS en test de chip voordat u gaat coaten. Start de Brainwave-software. Selecteer Bestand > nieuwe opnamesessie. Stel de opnameparameters in op een opnamefrequentie van 50 Hz en een bemonsteringsfrequentie van 18 kHz/elektrode. Verander de Amplifier Offset om de chip te kalibreren. Zie Tabel 2 voor tips voor het oplossen van problemen.
OPMERKING: De parameters voor de opnamefrequentie en de bemonsteringsfrequentie zijn afhankelijk van het gegevenstype en de individuele systeemvereisten. - Steriliseer en conditioneer HD-MEA's.
- Veeg de chip en de glazen ring onder de motorkap schoon met een tissue die is bevochtigd met 96% ethanol (EtOH), plaats vervolgens elk apparaat in een steriele petrischaal van 100 mm x 20 mm en vul het MEA-reservoir gedurende 20 minuten met 70% EtOH.
- Zuig de EtOH op en was het reservoir 3 keer met steriel, gefilterd dd-water. Voeg 1 ml preconditioneringsmedia toe en incubeer een nacht bij 37 °C en 5% CO2.
OPMERKING: Pre-conditioning media moeten een oplossing op basis van zout zijn om het HD-MEA-oppervlak meer hydrofiel te maken. Dit kunnen eerder geprepareerde BrainPhys (BP) complete media zijn (niet >3 maanden oud) (Tabel 1C).
- Smeer HD-MEA's in. De volgende dag de pre-conditioneringsmedia opzuigen. Voeg 1 ml 0,1 mg/ml poly-dl-ornithine (PDLO) toe om het hele actieve gebied te bedekken. Incubeer bij 37 °C 's nachts in een broedmachine.
- Bereid media voor en warm ze op voor RT. De protocollen hier maken gebruik van functionele menselijke iPSC-neuronen uit twee commerciële bronnen; Mediacomponenten verschillen dus per leverancier. Eén protocol wordt beschreven in (tabellen 1C, D) .
- Zuig PDLO op, was 3 keer met dd-water en laat de chips 10 min drogen onder de motorkap.
- Vul een petrischaaltje van 35 mm x 10 mm met steriel, gefilterd dd-water en plaats het naast de chip om de juiste luchtvochtigheid te behouden en verdamping van de zaadcellen in de volgende stappen te voorkomen.
- Plaats de HD-MEA-chip op het opnameplatform, vul het reservoir met PBS en test de chip voordat u gaat coaten. Start de Brainwave-software. Selecteer Bestand > nieuwe opnamesessie. Stel de opnameparameters in op een opnamefrequentie van 50 Hz en een bemonsteringsfrequentie van 18 kHz/elektrode. Verander de Amplifier Offset om de chip te kalibreren. Zie Tabel 2 voor tips voor het oplossen van problemen.
- Plateren en onderhouden van menselijke iPSC-neuronen in HD-MEA's (Figuur 2B)
- Ontdooi en verdun cellen tot de gewenste cellen per microliterconcentratie (d.w.z. 1000 cellen/μL om een celdichtheid van 50.000 cellen te verkrijgen in een daling van 50 μL op de HD-MEA) (Tabel 1C).
- Pipetteer de celsuspensie op het oppervlak van het actieve gebied van de chip met behulp van dottingmedia met een hoog lamininegehalte (tabel 1D).
- Incubeer bij 37 °C met 5% CO2 gedurende 45-60 min.
- Vul voorzichtig 2 ml media in het HD-MEA-reservoir (tabel 1C).
- Voer 100% mediawissel uit op dag 1 (DIV1) na het zaaien met behulp van RT-media (tabel 1C). Vervang 50% van de media elke 3-4 dagen. Houd HD-MEA's geïncubeerd bij 37 °C met 5% CO2 gedurende het hele experiment.
OPMERKING: Pipetteer voorzichtig om te voorkomen dat de cellen losraken. Controleer de kleur van de media op eventuele vervuiling. Het interval en de hoeveelheid mediawissel kunnen worden bepaald aan de hand van individuele studievragen of celbehoeften/specificaties. - Optioneel: Controleer de voortgang van de celkweekgroei tussen DIV4-DIV8 onder een rechtopstaande DIC-microscoop (Differential Interference Contrast) na het reinigen van de tafel met >70% EtOH.
3. Ex-vivo en in-vitro grootschalige neurale opnames met HD-MEA's
- Voorbereiding van de werkruimte voor het opnemen van hersenplakjes (Figuur 2A)
- Terwijl de hersenplakjes aan het herstellen zijn, plaatst u de benodigde gereedschappen in elke aangewezen werkruimte (zie Tabel met materialen).
OPMERKING: De hoofdsysteemconfiguratie moet ruim voor de experimentele dag van de hersenplak worden geoptimaliseerd en getest. Het perfusiesysteem (inlaatleidingen, pompuitlaatleidingen, slangen en aarding) moet worden getest met PBS of aCSF en een HD-MEA op het opnameplatform om een schoon signaal, een verhoogde signaal-ruisverhouding en afwezigheid van perfusieruis te garanderen. - Smeer de HD-MEA-chip in met 0,1 mg/ml PDLO om de weefsel-chipkoppeling te verbeteren en incubeer gedurende 20 minuten bij 37 °C.
- Vul tijdens de chipincubatie het op zwaartekracht gebaseerde perfusiesysteem en de lijnen met opname-aCSF. Zorg voor continue carbogenatie van het perfusiesysteem. Stel een debiet in van 4,5 ml/min en een temperatuur van 37 °C.
- Plaats de HD-MEA-chip op het opnameplatform voor acquisitie, vul het reservoir met aCSF, test het perfusiesysteem en los eventuele resterende systeemruis op.
- Start de Brainwave-software. Selecteer Bestand > nieuwe opnamesessie. Stel de opnameparameters in op een opnamefrequentie van 1 Hz en een bemonsteringsfrequentie van 14 kHz/elektrode. Verander de Amplifier Offset om de chip te kalibreren. Zie Tabel 2 voor tips voor het oplossen van problemen.
OPMERKING: De parameters voor de opnamefrequentie en de bemonsteringsfrequentie zijn afhankelijk van het gegevenstype en de individuele systeemvereisten.
- Start de Brainwave-software. Selecteer Bestand > nieuwe opnamesessie. Stel de opnameparameters in op een opnamefrequentie van 1 Hz en een bemonsteringsfrequentie van 14 kHz/elektrode. Verander de Amplifier Offset om de chip te kalibreren. Zie Tabel 2 voor tips voor het oplossen van problemen.
- Zorg ervoor dat het opnamegebied donker is door middel van een kamerverlichtingssysteem of een schaduwrijke kooi op de optische tafel.
- Lijn de stereomicroscoop uit met het HD-MEA-chipreservoir en het actieve gebied voor beeldacquisitie.
- Plaats het anker in het spaanreservoir om in evenwicht te komen.
OPMERKING: Anchor is een op maat gemaakte platina harp met minimale draden om de zuurstofvoorziening te bevorderen; Er zijn echter enkele commerciële beschikbaar. - Voeg farmacologische verbindingen toe aan de juiste perfusiebuisjes.
OPMERKING: In dit protocol werden zowel spontane als 100 μM 4-aminopyridine (4-AP) farmacologisch geïnduceerde opnames verkregen zoals eerder beschreven. Farmacologische verbindingen kunnen worden afgestemd op de specifieke onderzoeksvraag. - Plaats in de werkruimte voor het bereiden van hersenplakjes een nieuwe plastic kweekschaal van 90 mm in een glazen petrischaal van 150 mm. Voeg aCSF toe en begin met carbogeneren.
- Terwijl de hersenplakjes aan het herstellen zijn, plaatst u de benodigde gereedschappen in elke aangewezen werkruimte (zie Tabel met materialen).
- Circuitbrede opnames van HC- en OB-segmenten met behulp van HD-MEA's
NOTITIE: De schijfkoppeling moet zo snel mogelijk worden uitgevoerd om een gebrek aan zuurstoftoevoer naar de plak te voorkomen. De koppeling duurt slechts ~1 minuut vanaf de eerste plaatsing van de micro-ontlede plak op het actieve gebied van de chip tot het uiteindelijke opstarten van het perfusiesysteem.- Haal het plakje met een glazen pipet uit de herstelkamer van de hersenplak en plaats het in een plastic kweekschaal van 90 mm met continue carbogenatie. Isoleer met behulp van een microdissectie-instrument de HC of OB van het omringende hersenplakweefsel.
- Verplaats de geïsoleerde HC- of OB-acute plakjes met een glazen pipet in het HD-MEA-reservoir. Lijn de plak voorzichtig uit op het actieve MEA-gebied met een fijne borstel. Zuig alle oplossingen goed uit de HD-MEA-chip met een aspiratiesysteem.
- Plaats het anker voorzichtig op de plak met een pincet.
NOTITIE: Het anker moet worden geplaatst zonder schijfbeweging om verlies van koppeling te voorkomen. - Voeg voorzichtig de oplossing toe aan het spaanreservoir en start het perfusiesysteem.
NOTITIE: Zorg voor laminaire stroming van de perfusie-inlaat en pompuitlaat voor optimale opnameparameters. - Zorg ervoor dat het opnamegebied voldoende wordt gedimd via het kamerverlichtingssysteem of met een schaduwrijke kooi op een optische tafelopstelling.
- Laat de plak 10 minuten acclimatiseren voordat u begint met opnames of aanvullende farmacologische modulatie.
- Start de Brainwave-software. Selecteer Bestand > nieuwe opnamesessie. Stel de opnameparameters in op een opnamefrequentie van 1 Hz en een bemonsteringsfrequentie van 14 kHz/elektrode. Verander de Amplifier Offset om de chip te kalibreren.
OPMERKING: Zoals eerder aangegeven in paragraaf 3.1.4.1, moet u er bij het uitvoeren van systeemtests voor zorgen dat u dezelfde opnameparameters toepast. - Druk op Record om de acquisitie te starten met de vooraf ingestelde experimentele omstandigheden.
- Leg onmiddellijk na de laatste opname lichtbeeldvorming vast van het acute hersensegment. Verplaats de plak terug naar de snijherstelkamer, verwijder al het organische materiaal dat aan de chip is gekoppeld met een borstel en ga verder met de volgende plak. Reinig de HD-MEA's zoals beschreven in paragraaf 3.4.
- Voorbereiding van menselijke iPSC-opnamewerkruimte en netwerkbrede opnamen op HD-MEA (Figuur 2B)
OPMERKING: Verander het medium de dag voor de opname of onmiddellijk na de opname van menselijke iPSC (tabel 1C). In onderzoeken met behulp van de functionele neuronen werd het medium om de 4 dagen verwisseld, en bij 4, 8, 16 en 24 DIV werden de media onmiddellijk na iPSC-opnames veranderd.- Zorg voor een steriele werkomgeving door het HD-MEA-acquisitieplatform te reinigen met >70% EtOH.
- Plaats voorzichtig een polydimethylsiloxaan (PDMS)-basisdop met referentie op de HD-MEA-ring onder de motorkap. Verplaats de HD-MEA-chip naar de iPSC-opnamewerkruimte en sluit de HD-MEA-chip aan op het acquisitieplatform.
- Zorg ervoor dat het opnamegebied voldoende wordt gedimd door middel van een kamerverlichtingssysteem of een schaduwrijke kooi op een optische tafel.
- Laat de HD-MEA-chip 10 minuten in evenwicht zijn voordat u begint met opnames of aanvullende farmacologische modulatie.
- Start de Brainwave-software. Selecteer Bestand > nieuwe opnamesessie. Stel de opnameparameters in op een opnamefrequentie van 50 Hz en een bemonsteringsfrequentie van 18 kHz/elektrode. Verander de Amplifier Offset om de chip te kalibreren.
OPMERKING: Zoals eerder aangegeven in paragraaf 2.1.1, moet u bij het uitvoeren van een systeemtest voorafgaand aan het coaten en plateren ervoor zorgen dat u dezelfde opnameparameters toepast. - Noteer de spontane vuuractiviteit of farmacologisch geïnduceerde reacties van het humane iPSC-netwerk op elke dag van het experimentele plan (d.w.z. 4, 8, 16, 24 DIV's).
NOTITIE: Laat de chip niet gedurende >30 minuten buiten de incubator blijven om een stabiele temperatuur en vochtigheid te behouden en een temperatuurschok voor cellen te voorkomen. - Incubeer HD-MEA's bij 37 °C met 5% CO2 in de loop van het experiment.
- Na voltooiing van het experiment fixeert u het neuronale netwerk op chips en kleurt u het voor verdere optische beeldvorming of reinigt u de HD-MEA's direct, zoals beschreven in stap 3.4.
- Reiniging van HD-MEA-chips
- Gooi na het experiment de oplossing weg volgens de juiste afvalverwijdering en spoel af met dd-water.
- Voeg het wasmiddel naar keuze toe, reinig het actieve gebied en het hele reservoir met een wattenstaafje en gooi het wasmiddel weg. Vul opnieuw met afwasmiddel, incubeer gedurende 20 minuten en gooi het wasmiddel dan weg.
- Grondig spoelen met water van laboratoriumkwaliteit. Spoel vervolgens 3-4 keer met dd-water.
- Gebruik luchtdruk om de HD-MEA-chip goed te drogen.
4. Analyse van grootschalige neurale opnames van HD-MEA's
OPMERKING: Hoewel stap 4.1 specifiek is voor Brainwave-software, kan stap 4.2 worden aangepast op basis van het in de handel verkrijgbare HD-MEA-apparaattype van elke gebruiker.
- Voorverwerking van onbewerkte gegevens en detectie van gebeurtenissen
- Open een opgenomen onbewerkt gegevensbestand (.brw) in de Brainwave-software. Selecteer Analyse > LFP-detectie of Spikedetectie.
OPMERKING: LFP-detectie maakt gebruik van IIR-filtering met een laagdoorlaatfilter van de 4eorde Butterworth (1-100 Hz). Algoritmen voor harde drempels omvatten een hoge drempel van 150 μV, een lage drempel van -150 μV, een energievenster tussen 70-120 ms, een refractaire periode van 10 ms en een maximale gebeurtenisduur van 1 s. Single en MUA Spike Detection maakt gebruik van IIR-filtering met een hoogdoorlaatfilter van de 4eorde Butterworth (300-3500 Hz). Een PTSS-algoritme wordt toegepast met een standaarddeviatiefactor van 8, een pieklevensduur van 2 ms en een refractaire periode van 1 ms. - Voor HC- en OB-circuitopnamen voegt u de optie Geavanceerde werkruimte toe aan het gedetecteerde gebeurtenisbestand (.bxr) om het structurele lichtbeeld dat met de stereomicroscoop is vastgelegd, te importeren. Maak bij het onderzoeken van grootschalige HC-circuits structurele lagen met de gyrus dentatus (DG), hilus, Cornu Ammonis 1 (CA1), Cornu Ammonis 3 (CA3), entorhinale cortex (EC) en perirhinale cortex (PC). Maak bij het onderzoeken van grootschalige OB-circuits structurele lagen met de olfactorische zenuwlaag (ONL), glomerulaire laag (GL), externe plexiforme laag (EPL), mitraliscellaag (MCL) en granulaatcellaag (GCL). Beschouw de EPL en de MCL als de projectielaag (PL), inclusief de olfactorische cortex (OCx).
- Open een opgenomen onbewerkt gegevensbestand (.brw) in de Brainwave-software. Selecteer Analyse > LFP-detectie of Spikedetectie.
- Gegevensverwerking met een aangepaste Python-computationele pijplijn
- Ruisonderdrukking verwijderen
- Lees het .bxr-bestand met behulp van een op maat geschreven Python-script 26,29,32 en h5py 3.6.0 python-pakket.
- Extraheer spike-treinen met betrekking tot de iPSC-netwerkopnames en LFP-gebeurtenistreinen met betrekking tot de HC- en OB-hersensegmentcircuitopnames.
- Karakteriseer gebeurtenissen met een totaal aantal actieve elektroden van minder dan 0,1% of 10% van het gemiddelde aantal actieve elektroden per gemiddelde gebeurtenis of gedetecteerde gebeurtenissen die buiten een statistisch redelijk vuursnelheidsbereik vallen als willekeurige gebeurtenissen en verwijder ze. Pas daarnaast drempelwaarden voor amplitude en gebeurtenisduur toe.
NOTITIE: Voor het vuursnelheidsbereik worden 0.1-15 pieken/s en 0.1-60 LFP-gebeurtenissen/min in aanmerking genomen. Dit zijn voorbeelden van drempelwaarden voor tarieven die worden gebruikt voor de geanalyseerde gegevenssets. De drempels voor snelheid, amplitude en duur zijn afhankelijk van individuele gegevens. - Sla de resulterende gebeurtenistreingegevens met de bijbehorende spatiotemporele informatie op in .npy-bestandsindeling.
- Rastergrammen
- Lees gefilterde .npy- en .bxr-bestanden en genereer een rasterplot met behulp van de Matplotlib pyplot-functie (https://matplotlib.org/3.5.3/api/_as_gen/matplotlib.pyplot.html).
- Voor hersenschijfopnames met laagspecificiteit sorteert en groepeert u bovendien de elektrode-ID's op basis van de lagen die in stap 4.1.2 zijn geproduceerd.
- Gemiddelde vuuractiviteit
- Verwerk de tijdreeksgegevens uit het .bxr-bestand en bereken de gemiddelde vuursnelheid van elke elektrode (aantal gebeurtenissen/opnametijd).
- Construeer een datamatrix waarbij de rijen en kolommen de coördinaten van elektroden in de HD-MEA 64 x 64-array vertegenwoordigen, waarbij elke matrixwaarde de gemiddelde vuursnelheid aangeeft.
- Gebruik een plotbibliotheek zoals de imshow van Matplotlib of de heatmap-functies van Seaborn in Python.
- Gebruik hier de 'hete' kleurenkaart en creëer een informatieve heatmap die de ruimtelijke verdeling van de gemiddelde vuursnelheden over de elektrode-array visueel inkapselt.
- Representatieve golfvormsporen
- Lees tijdreeksgegevens uit het .brw-bestand en genereer een golfvormtracering met behulp van de Matplotlib pyplot-functie. (https://matplotlib.org/3.5.3/api/_as_gen/matplotlib.pyplot.html).
- Voer de gewenste elektrode-ID, tijdbak en frequentieband in voor een representatief golfvormspoor. Frequentiebanden die in deze analyses zijn gedefinieerd, zijn onder meer laagfrequente LFP-oscillaties (1-100 Hz) met banddoorlaatgefilterde δ-, θ-, β- en γ-frequentiebanden; scherpe golfrimpelingen (SWR) (140-220 Hz); en hoogfrequent enkelvoudig en MUA (300-3500 Hz). De frequentiebanden δ, θ, β en γ zijn respectievelijk 1-4 Hz, 5-12 Hz, 13-35 Hz en 35-100 Hz.
- Spectrale dichtheid van het vermogen
- Lees tijdreeksgegevens uit het .brw-bestand en bereken de periodogrammen om de dominante frequenties te onderscheiden die ten grondslag liggen aan de oscillerende activiteit binnen elke tijdreeks.
- Construeer pseudo-kleurenspectrogrammen van de frequentie-tijddynamiek.
OPMERKING: Spectra worden berekend met behulp van de methode van Welch door gebruik te maken van de Fast Fourier Transform van opgenomen LFP's om de spectrale vermogensdichtheid41 te schatten. - Voer de gewenste elektrode-ID, tijdbak en frequentieband in voor een spectrale dichtheidskaart. Tot de frequentiebanden die in deze analyses worden gedefinieerd, behoren de frequentiebanden die in stap 4.2.4 zijn beschreven.
- Functionele connectiviteit
- Volg de stappen 4.2.6.2-4.2.6.4 voor het opnemen van hersensegmentcircuits.
- Lees tijdreeksgegevens uit het .brw-bestand en bereken de kruiscovariantie tussen paren actieve elektroden in de 64 x 64-array met behulp van de correlatiecoëfficiënt (PCC) van Pearson42.
- Pas een vector autoregressief model toe aan de tijdreeks met behulp van Multivariate Granger-causaliteit om de invloed van de ene tijdreeks op de andere te kwantificeren.
- Pas de DTF-functie (Directed Transfer) toe om de directionele informatiestroom binnen de gecorreleerde links te beoordelen.
OPMERKING: Functionele connectiviteit in het meerlagige netwerk wordt tot stand gebracht door een correlatiewaardedrempel in te stellen op basis van die boven het gemiddelde en twee standaarddeviaties van alle kruiscovariantiewaarden43,44. - Volg de stappen 4.2.6.6-4.2.6.8 voor iPSC-opnamen.
- Lees spiketrains-gegevens uit het .bxr-bestand en bereken een 64x64-matrix van de PCC-correlatiecoëfficiënten tussen alle combinaties van binned spike-treinen met behulp van spike_train_correlation functies (https://elephant.readthedocs.io/en/v0.7.0/reference/spike_train_correlation.html).
OPMERKING: Functionele connectiviteit in het meerlagige netwerk wordt tot stand gebracht door een correlatiewaardedrempel in te stellen op basis van die boven het gemiddelde en twee standaarddeviaties van alle kruiscovariantiewaarden. - Implementeer bovendien ruimtelijk-temporele filters (STF) en afstandsafhankelijke latentiedrempels (DdLT) filterprocedures op de connectiviteitsmatrix om potentiële gepaarde verbindingen te elimineren die de maximale voortplantingssnelheid (ingesteld op 400 mm/s)45 overschrijden.
- Extraheer negatieve pieken uit resulterende kruiscorrelatiematrices met filter- en drempelbewerkingen om de remmende verbindingen te identificeren met behulp van gefilterd en genormaliseerd kruiscorrelatiehistogram (FNCCH)-algoritme45.
- Transformeer elke connectiviteitsmatrix in een dynamisch grafiekbestand (.gexf).
- Kaarten voor netwerkconnectiviteit
- Open datalaboratorium in Gephi-programma 9.2 versie (https://gephi.org) voor de dynamische grafiek om specifieke tijdvakken uit te zetten.
- Pas Geolay-out toe in het lay-outvenster voor ruimtelijke toewijzing.
- Plaats parameterbeperkingen op Degree Range en Edge Weight ter vergelijking.
- Wijs knooppuntkleur, randgrootte en graadgrootte toe voor een betere visualisatie.
- Ruisonderdrukking verwijderen
Representative Results
Multimodel spatiotemporele mapping en extractie van oscillerende vuurfuncties
Om netwerkbrede LFP- en spike-gebeurtenissen te kwantificeren die voortkwamen uit dynamische neuronale ensembles, onderzochten we synchrone grootschalige vuurpatronen in HC- en OB-circuits en menselijke iPSC-netwerken. Opgenomen hersensegmentcircuits uit stap 3.2 en opgenomen iPSC-netwerken uit stap 3.3 werden geanalyseerd volgens stappen 4.1-4.2 van het protocol. Eerst werden gebeurtenisdetectie en ruisonderdrukking uitgevoerd voor alle opgenomen datasets en regionaal opgelost volgens circuitspecificaties. Vervolgens werden topografische pseudo-kleuren ruimtelijke kaarten van gemiddelde grootschalige LFP- en spike-vuurpatronen, rastergrammen van gedetecteerde gebeurtenissen en representatieve 5-s-sporen van gefilterde golfvormen uitgezet (figuren 3 A-I). Topografische pseudo-kleurenkaarten van grootschalige LFP- en spike-vuursnelheidspatronen werden over de respectievelijke met microscoop vastgelegde optische beelden van HC (Figuur 3A), OB (Figuur 3B) en menselijk iPSC-neuronale netwerk (Figuur 3C) gelegd. Dit maakt het mogelijk om individuele circuit- en netwerkgebaseerde oscillerende patronen en reacties te onderzoeken. HC- en OB-rastergrammen bevatten gedetecteerde LFP-gebeurtenistellingen gesorteerd over de DG-, Hilus-, CA3-, CA1-, EC- en PC-lagen van het HC-circuit en ONL-, OCx-, GL-, PL- en GCL-lagen van het OB-netwerk gedurende een tijdvak van 60 seconden (Afbeeldingen 3D,E). Het menselijke iPSC-rastergram geeft synchroon gedetecteerde piekgebeurtenissen van het onderling verbonden gekweekte netwerk weer gedurende een tijdvak van 20 s (Figuur 3G). Vervolgens tonen 5s representatieve gebeurtenissporen van grootschalige HD-MEA-opnamelocaties een reeks geregistreerde oscillerende frequenties in de HC (d.w.z. geselecteerde elektrode in CA3) (Figuur 3G) en OB (d.w.z. geselecteerde elektrode in GL) (Figuur 3H) circuits en multi-unit spike-bursting-activiteit in het menselijke iPSC-netwerk van vier geselecteerde actieve elektroden in de array (Figuur 3I). Deze voorbeeldsignalen vertonen biosignaalhandtekeningen, waaronder laagfrequente LFP-oscillaties (1-100 Hz) met banddoorlaatgefilterde δ-, θ-, β- en γ-frequentiebanden; scherpe golfrimpelingen (SWR) (140-220 Hz); en hoogfrequent enkelvoudig en MUA (300-3500 Hz). Ten slotte werd de analyse van de vermogensspectrale dichtheid (PSD) gebruikt om tegelijkertijd de vermogensgrootte van een specifieke oscillerende band te kwantificeren in het onderling verbonden HC- en OB-circuit dat werd geregistreerd door HD-MEA (figuren 3J,K).
Multimodaal netwerkbreed functioneel connectoom
Om de grootschalige connectiviteit van meerlagige neurale netwerken af te leiden uit gelijktijdig vurende patronen van gelijktijdig actieve neuronale ensembles, werd de kruiscovariantie tussen paren actieve elektroden in gedetecteerde gebeurtenissen berekend volgens stap 4.2.6 van het protocol. Hier werd de correlatiecoëfficiënt gesorteerd op basis van lagen in het HC- en OB-circuit of ongesorteerd in het iPSC-netwerk en vervolgens opgeslagen in een symmetrische matrix. Functionele connectomen van HC- en OB-circuits werden gegenereerd door Multivariate Granger-causaliteit en gerichte overdrachtsfunctie (DTF) toe te passen om de invloed van de ene tijdreeks op de andere te kwantificeren en de directionele informatiestroom binnen de gecorreleerde verbindingen in de verschillende netwerken te beoordelen. Connectoommapping van HC (Figuur 4A) en OB (Figuur 4B) en netwerkvisualisatie werden uitgevoerd met behulp van het Gephi-programma 9.2 versie (https://gephi.org). Vergelijkbare parameterbeperkingen werden opgelegd aan de functionele links om de HC- en OB-hersensegmentcircuits te vergelijken en illustreerden 100 s van de functionele connectiviteit van gedetecteerde LFP-gebeurtenissen. Knooppunten worden geschaald op basis van graadsterkte, waarbij de knoopkleur de laag- en linkkleur aangeeft die de verbindingen binnen en tussen de lagen identificeert. Functionele connectomen van menselijke iPSC-netwerken werden gegenereerd door ruimtelijk-temporele filters (STF) en afstandsafhankelijke latentiedrempels (DdLT) toe te passen om de selectie van significante links te verbeteren en de identificatie van betekenisvolle verbindingen te verfijnen door gefilterde en genormaliseerde cross-correlatiehistogram (FNCCH)-analyse toe te passen. Connectoommapping van menselijke iPSC-netwerken op de volledige visualisatie van de HD-MEA-chip (Figuur 4C) uitgevoerd met behulp van Gephi. De kleur van de knooppunten geeft exciterende of remmende input aan en de kleur van de link identificeert verbindingen.
Figuur 1: Overzicht van het experimentele en computationele platform op grote schaal HD-MEA. (A) Isometrische schematische weergave van onze multimodale biohybride neuro-elektronische platforms gerealiseerd met CMOS-gebaseerde HD-MEA om neurale dynamiek van HC, OB en menselijke iPSC neuronale circuits en netwerken vast te leggen. (B) Schematische workflow voor het snijden van de hersenen van muizen en het werklandschap om HC- en OB-plakjes te verkrijgen. (C) Topografische voorstellingen van de grootschalige vuurpatronen die gelijktijdig zijn geregistreerd door de gehele HC- en OB-plakjes die met de geëxtraheerde extracellulaire golfvormen zijn gesuperponeerd op de optische beelden van de plak. (D) Schematische weergave van het iPSC-neuronale netwerk verkregen van mensen. (E) Fluorescentiemicrofoto's die cellulaire c-fos en somatische/dendritische MAP-2 van het gehele menselijke neuronale netwerk op de HD-MEA-chip (links) laten zien, overeenkomend met de volledige gemiddelde vuuractiviteitskaart (rechts). (F) Computationeel raamwerk inclusief geavanceerde data-analyse, connectiviteitsmapping en AI-machine learning-tools om multidimensionale neurale gegevens te analyseren die zijn verkregen uit grootschalige opnames op HD-MEA's. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Lay-outs voor ex-vivo hersenplakjes en in-vitro menselijke iPSC-kweekvoorbereidings- en opnamewerkruimten. (A) Schematische workflow die de opstelling illustreert voor het bereiden van HC- en OB-plakjes, met de vereiste gereedschappen en apparatuur in elke werkruimte. (B) Schematische weergave voor de voorbereiding van de menselijke iPSC-kweek, met inbegrip van de nodige hulpmiddelen en apparaten. Een volledige lijst van materialen is opgenomen in de stappen 1.2.2, 2.1, 2.2, 3.1.1, 3.3 en de Tabel met materialen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: In kaart brengen en extraheren van spatiotemporele patronen van netwerkdynamiek. (A-C) Gemiddelde LFP en spike rate ruimtelijke kaarten, berekend over opnames van vijf minuten, gesuperponeerd op het microscooplichtbeeld. (D-F) Rasterplots met gedetecteerde, ruisloze LFP-gebeurtenissen in een gegevenssubsteekproef van 60 seconden en pieken in een gegevenssubsteekproef van 20 seconden. (G-I) Representatieve extractie van golfvormsporen uit een segment van 5 seconden van de substeekproef van de rasterplotgegevens (rood gemarkeerd in de rasterplot), weergegeven als ruwe LFP-oscillerende banden (1-100 Hz); δ (1-4 Hz), θ (5-12 Hz), β (13-35 Hz) en γ (35-100 Hz) frequentiebanden; SK (140-220 Hz); en hoogfrequente enkelvoudige en MUA-pieken (300-3500 Hz). (J,K) Vermogensspectrale dichtheidskaarten van snelle en langzame oscillerende LFP's (1-100 Hz) en SWR (140-220 Hz). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Organisatie van multimodale netwerkbrede functionele connectomen. (A-C) Gephi-kaarten die de functionele connectiviteit van knooppunten illustreren, waarbij knooppunten overeenkomen met een van de voorbeeldlegenda's van de kleurenbalk (hieronder), terwijl de links (of randen) zijn gearceerd om overeen te komen met de verbindingsknooppunten. Voorbeeldlegenda's voor (A) HC-, (B) OB- en (C) iPSC-lagen worden weergegeven op een array van 64 x 64. HC- en OB-lagen worden uitgezet over een tijdvak van 100 seconden om het aantal zichtbare knooppunten en links voor visualisatiedoeleinden effectief te verminderen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel 1: Oplossingen voor de voorbereiding van hersenplakjes en media voor iPSC-neuronale culturen. (A) Snijoplossing met een hoog sucrosegehalte voor de ex-vivo bereiding van hersenschijfjes. (B) aCSF-opnameoplossing voor ex-vivo voorbereiding en registratie van hersenplakjes. (C-D) Human neurnaal iPSC Media Protocol, waarbij (C) BrainPhys complete media zijn die worden gebruikt voor het ontdooien van cellen, HD-MEA-chipcoating en gekweekt HD-MEA-onderhoud, en (D) de dotting media die worden gebruikt voor HD-MEA-celplating. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 2: Veelvoorkomende problemen met het verwerven van HD-MEA-opnamen oplossen. Een lijst met veelvoorkomende problemen, hun mogelijke oorzaken en oplossingen voor probleemoplossing met betrekking tot HD-MEA-chips, opnameplatform, systeemruis en software. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Discussion
De ingewikkelde dynamiek van spatiotemporele neuronale activiteit, voortkomend uit onderling verbonden neuronale ensembles, is al lang een onderwerp van intriges in de neurowetenschappen. Traditionele methodologieën, zoals patch-clamp, standaard MEA en Ca2+ beeldvorming, hebben waardevolle inzichten opgeleverd in de complexiteit van de hersenen. Ze schieten echter vaak tekort in het vastleggen van de uitgebreide netwerkbrede computationele dynamiek 21,22,23. Het technische protocol van het HD-MEA-platform, zoals beschreven in deze JoVE-studie, vertegenwoordigt een belangrijke sprong voorwaarts en biedt een panoramisch beeld van neurale dynamiek in verschillende modaliteiten, van celassemblages tot uitgebreide netwerken (d.w.z. acute, ex-vivo hersenplakjes van muizen en in-vitro menselijke iPSC-netwerken)26,29,30,32.
Acute, ex-vivo hersenplakjes van muizen zijn een fundamenteel hulpmiddel geweest in neuronaal onderzoek, waardoor onderzoek op moleculair en circuitniveau mogelijk is 6,7. De uitdaging om de levensvatbaarheid van weefsels te handhaven is echter een hardnekkig knelpunt geweest. Het protocol dat in deze studie wordt beschreven, introduceert cruciale wijzigingen om de kwaliteit en levensduur van deze plakjes te optimaliseren om hun voordelen op het HD-MEA-platform te benutten. Dit protocol onderstreept het belang van - i) Het bereiken van plakuniformiteit, waarvoor het gebruik van een vibratoom de voorkeur heeft boven een weefselhakmolen vanwege de precisie en minimale weefselschade, ondanks de afweging van langere snijtijden. ii) Zorgen voor constante carbogenatie gedurende het hele proces, van extractie tot opname, om de levensvatbaarheid van het weefsel te behouden. iii) Het regelen van de temperatuur en het toestaan van voldoende hersteltijd voordat u opneemt. iv) Het gebruik van een agaroseblok of mal om de hersenen te stabiliseren, scheuren te voorkomen en lijmcontact te minimaliseren. v) Het handhaven van optimale stroomsnelheden van gecarbogeneerd aCSF in het HD-MEA-reservoir om de gezondheid van de plakjes te garanderen en tegelijkertijd problemen zoals ontkoppeling, ruis en drift te vermijden (tabel 2).
Voor zowel hersenplakjes van muizen als menselijke iPSC-preparaten is het verbeteren van de koppeling van de elektrode-weefselinterface van het grootste belang 30,46,47. Ons protocol onderstreept het belang van het gebruik van het adhesiebevorderende molecuul Poly-dl-ornithine (PDLO). Dit molecuul vergroot niet alleen het oppervlak voor het detecteren van elektrische signalen, maar verhoogt ook de elektrische geleidbaarheid46. Door dit te doen, bevordert het cellulaire adhesie, groei en de ontwikkeling van functionele netwerkeigenschappen. Een dergelijke optimalisatie speelt een cruciale rol bij het verbeteren van de werkzaamheid van het HD-MEA-platform. Dit zorgt op zijn beurt voor een nauwkeurige en consistente analyse van ex-vivo- en in-vitro-connectomen op microschaal en hun spatiotemporele vuursequenties. Het is met name aangetoond dat PDLO beter presteert dan andere substraten zoals polyethyleenimine (PEI) en poly-l-ornithine (PLO) bij het bevorderen van spontane vuuractiviteit en responsiviteit op elektrische stimuli in neuronale culturen. Bovendien is PDLO gebruikt voor oppervlaktefunctionalisatie op de HD-MEA en is aangetoond dat het de interface van de elektrode-schijfkoppeling verbetert en de signaal-ruisverhouding in zowel OB- als HC-plakjesverhoogt 26,29. De toevoeging van een op maat gemaakt platina-anker vergroot de koppeling van de elektrode-plak-interface verder, wat leidt tot opnames met een hogere signaal-ruisverhouding.
Het gebruik van HD-MEA voor zowel ex-vivo hersenplakjes van muizen als in-vitro humane iPSC-netwerken introduceert een methode die bedreven is in het verkennen van uitgebreide, multiscale en multimodale dynamiek. Deze innovatieve aanpak brengt echter aanzienlijke uitdagingen met zich mee, vooral op het gebied van gegevensbeheer 48,49,50,51. Een enkele HD-MEA-opname met een bemonsteringsfrequentie van 18 kHz/elektrode genereert maar liefst 155 MB/s aan gegevens. Het gegevensvolume escaleert snel wanneer rekening wordt gehouden met meerdere segmenten, diverse farmacologische aandoeningen of langere opnameperioden. Een dergelijke toestroom van informatie vraagt om robuuste opslaginfrastructuren en geavanceerde rekentools voor een gestroomlijnde verwerking. Het vermogen van het HD-MEA-platform om tegelijkertijd gegevens te verzamelen van duizenden neuronale ensembles is zowel een zegen als een hindernis. Het biedt superieure inzichten in de computationele dynamiek van hersenfuncties, maar het vereist ook een verfijnd analytisch kader. In dit JoVE-protocol hebben we voorbeelden gegeven van computationele strategieën, waaronder grootschalige gebeurtenisdetectie, classificatie, grafentheorie, frequentieanalyse en machine learning. Deze methoden onderstrepen de intensieve inspanningen die zijn geleverd om de uitdagingen van het analyseren van complexe neurale gegevens aan te pakken. Desalniettemin is er nog veel ruimte voor de ontwikkeling van meer geavanceerde computationele tools om deze multidimensionale neurale datasets te analyseren. Gewapend met de juiste tools en methodologieën wordt het potentieel van het HD-MEA-platform vergroot en biedt het diepgaande inzichten in de fijne kneepjes van hersenfuncties in zowel gezonde als pathologische omstandigheden.
In wezen biedt het HD-MEA-platform, wanneer het wordt geïntegreerd met de gedetailleerde protocollen en computationele tools die worden besproken, een transformatieve benadering om de ingewikkelde werking van de hersenen te begrijpen. Door grootschalige, multiscale en multimodale dynamiek vast te leggen, biedt het onschatbare inzichten in processen zoals leren, geheugen en informatieverwerking. Bovendien heeft de toepassing ervan in in-vitro humane iPSC-netwerken het potentieel om een revolutie teweeg te brengen in het screenen van geneesmiddelen en gepersonaliseerde geneeskunde. Hoewel dit platform een aanzienlijke vooruitgang betekent in neurowetenschappelijk onderzoek, is het van cruciaal belang om de inherente technische uitdagingen te erkennen en aan te pakken. Met voortdurende verfijning en de integratie van geavanceerde computationele tools, staat het HD-MEA-platform klaar om een nieuw tijdperk in te luiden van nauwkeurige diagnostische hulpmiddelen, de identificatie van specifieke biomarkers en gerichte therapieën voor neurologische aandoeningen.
Disclosures
De auteurs verklaren geen concurrerende of financiële belangen te hebben.
Acknowledgments
Deze studie werd ondersteund door institutionele fondsen (DZNE), de Helmholtz Association binnen het Helmholtz Validation Fund (HVF-0102) en de Dresden International Graduate School for Biomedicine and Bioengineering (DIGS-BB). We willen ook het platform voor gedragsdierproeven van de DZNE-Dresden (Alexander Garthe, Anne Karasinsky, Sandra Günther en Jens Bergmann) bedanken voor hun steun. We willen graag erkennen dat een deel van figuur 1 is gemaakt met behulp van het platform BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 150 mm Glass Petri Dish | generic | generic | Brain Preparation Workspace, Brain Slice Recording Workspace |
| 0.22 μm Sterile Filter Unit | Assorted | Assorted | Assorted |
| 90 mm Plastic Culture Dish | TPP | 93100 | Brain Preparation Workspace, Brain Slice Recording Workspace |
| Agarose | Roth | 6351.5 | Brain Preparation Workspace |
| Agarose Mold | CUSTOM | CUSTOM | Brain Preparation Workspace; Custom designed 3D Printer Design, available upon request |
| Aluminum Foil | generic | generic | Brain Extraction Workspace |
| Anesthesia chamber | generic | generic | Brain Extraction Workspace; Assorted Beaker, Bedding etc |
| Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A4544-25G | Solution Preparation Workspace |
| Assorted Beakers | generic | generic | Solution Preparation Workspace; 50 mL |
| Assorted Luers | Cole Parmer | 45511-00 | Brain Slice Recording Workspace |
| Assorted Volumetric flasks | generic | generic | Solution Preparation Workspace; 500 mL, 1 L |
| B27 Supplement | Life Technologies | 17504-044 | BrainXell Commercial Supplier Protocol |
| BDNF | Peprotech | 450-02 | BrainXell Commercial Supplier Protocol |
| Biological Safety Cabinet with UV Lamp | Assorted | Assorted | HD-MEA Coating, Plating, Mainainance Workspace |
| BrainPhys Neuronal Medium | STEMCELL Technologies | 05790 | CDI, and BrainXell Commerical Supplier Protocol |
| Brainwave Software | 3Brain AG | Version 4 | Brain Slice and Human iPSC Recording Workspace |
| BrainXell Glutamatergic Neuron Assay | BrainXell | BX-0300 | BrainXell Commercial Supplier Protocol |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | 21115-100ML | Solution Preparation Workspace |
| Carbogen | generic | generic | All Workspaces; 95%/5% O2 and CO2 mixture |
| Cell Culture Incubator | Assorted | Assorted | Assorted |
| CMOS-based HD-MEA chip | 3Brain AG | CUSTOM | Brain Slice and Human iPSC Recording Workspace |
| Conical Tubes, 50 mL, Falcon (Centrifuge Tubes) | STEMCELL Technologies | 38010 | CDI Commerical Supplier Protocol |
| Crocodile Clip Grounding Cables | JWQIDI | B06WGZG17W | Brain Slice Recording Workspace |
| Curved Forceps | FST | 11052-10 | Brain Extraction Workspace |
| DMEM/F12 Medium | Life Technologies | 11330-032 | BrainXell Commercial Supplier Protocol |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline without Ca2+ and Mg2+ (D-PBS) | STEMCELL Technologies | 37350 | CDI Commerical Supplier Protocol |
| Filter Paper | Macherey-Nagel | 531 011 | Brain Preparation Workspace |
| Fine Brush | Leonhardy | 773 | Brain Slice Preparation Workspace, Brain Slice Recording Workspace |
| Forceps | VITLAB | 67895 | Brain Slice Recording Workspace |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | BrainXell Commercial Supplier Protocol |
| Geltrex | Life Technologies | A1413201 | BrainXell Commercial Supplier Protocol |
| Glass pasteur pipette | Roth | 4518 | Brain Slice Preparation Workspace, Brain Slice Recording Workspace |
| Glucose | Sigma Aldrich | G7021-1KG | Solution Preparation Workspace |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050-061 | BrainXell Commercial Supplier Protocol |
| Gravity-based Perfusion System | ALA | VC3-8xG | Brain Slice Recording Workspace |
| HD-MEA Recording platform | 3Brain AG | CUSTOM | Brain Slice and Human iPSC Recording Workspace |
| Heater | Warner Instruments | TC-324C | Brain Slice Recording Workspace |
| Hemocytometer or Automated Cell Counter | Assorted | Assorted | HD-MEA Coating, Plating, Mainainance Workspace |
| Hypo Needles | Warner Instruments | 641489 | Brain Slice Recording Workspace |
| iCell GlutaNeurons Kit, 01279 | CDI | R1061 | CDI Commerical Supplier Protocol |
| Iris Scissors | Vantage | V95-304 | Brain Extraction Workspace |
| Isoflurane | Baxter | HDG9623 | Brain Extraction Workspace |
| KCl | Sigma Aldrich | P5405-250G | Solution Preparation Workspace |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | CDI Commerical Supplier Protocol |
| Liquid Nitrogen Storage Unit | Assorted | Assorted | HD-MEA Coating, Plating, Mainainance Workspace |
| Magnetic Stirrer | generic | generic | Solution Preparation Workspace |
| Metal Screws | Thorlabs | HW-KIT2/M | Brain Slice Recording Workspace |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M1028-100ML | Solution Preparation Workspace |
| MgSO4 | Sigma Aldrich | 63138-250G | Solution Preparation Workspace |
| Microdissection Tool Holder | Braun | 4606108V | Brain Slice Preparation Workspace, Brain Slice Recording Workspace |
| Microdissection Tool Needle | Braun | 9186166 | Brain Slice Preparation Workspace, Brain Slice Recording Workspace |
| Modular Stereomicroscope | Leica | CUSTOM | Brain Slice Recording Workspace; custom specifications and modifications |
| N2 Supplement | Life Technologies | 17502-048 | CDI, and BrainXell Commercial Supplier Protocol |
| NaCl | Sigma Aldrich | S3014-1KG | Solution Preparation Workspace |
| NaH2PO4 | Sigma Aldrich | S0751-100G | Solution Preparation Workspace |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761-500G | Solution Preparation Workspace |
| Neurobasal Medium | Life Technologies | 21103-049 | BrainXell Commercial Supplier Protocol |
| Optical Cage System | Thorlabs | Assorted | Brain Slice Recording Workspace |
| Optical Table w/Breadboard | Thorlabs | SDA7590 | Brain Slice Recording Workspace |
| PDLO | Sigma Aldrich | P0671 | HD-MEA Coating, Brain Slice Recording Workspace |
| Penicillin-streptomycin, 100x | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | CDI Commerical Supplier Protocol |
| Pipette tips | TipONE | S1120-8810 | Brain Slice Recording Workspace |
| Pipettors | Assorted | Assorted | Assorted |
| Platinum Anchor | CUSTOM | CUSTOM | Brain Slice Recording Workspace |
| Polyethylene Tubing | Assorted | Assorted | Brain Slice Recording Workspace |
| Pump | MasterFlex | 78018-22 | Brain Slice Recording Workspace |
| Razor Blade | Apollo | 10179960 | Brain Preparation Workspace |
| Reference Electrode Cell Culture Cap | CUSTOM | CUSTOM | Human iPSC Recording Workspace; Custom designed 3D Printer Design, available upon request |
| Rubber Pipette Bulb | Duran Wheaton Kimble | 292000205 | Brain Slice Preparation Workspace, Brain Slice Recording Workspace |
| Serological Pipettes, 1 mL, 2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL | Assorted | Assorted | Assorted |
| Slice Recovery Chamber | CUSTOM | CUSTOM | Brain Slice Recovery Workspace; Custom designed 3D Printer Design, available upon request |
| Spatula | ISOLAB | 047.06.150 | Brain Preparation Workspace |
| Sucrose | Sigma Aldrich | 84100-1KG | Solution Preparation Workspace |
| Super Glue | UHU | 358221 | Brain Slice Preparation Workspace |
| Surgical Scissors | Peters Instruments | BC 344 | Brain Extraction Workspace |
| Tabletop Centrifuge | Assorted | Assorted | Assorted |
| TGF-β1 | Peprotech | 100-21C | BrainXell Commercial Supplier Protocol |
| Tissue Paper | generic | generic | Brain Extraction Workspace |
| Trypan Blue | STEMCELL Technologies | 07050 | CDI Commerical Supplier Protocol |
| Upright Microscope | Olympus | CUSTOM | Imaging Workspace; Custom specifications and modifications |
| Vacusip | Integra | 159010 | Brain Slice Recording Workspace |
| Vibratome | Leica | VT1200s | Brain Slice Preparation Workspace; Includes: Specimen plate, buffer tray, ice tray, specimen plate holding tool, vibratome blade adjusting tool |
| Vibratome Blade | Personna | N/A | Brain Slice Preparation Workspace |
| Water Bath | Lauda | L000595 | Brain Slice Recovery Workspace |
References
- Hebb, D. O. The Organization of Behavior; A Neuropsychological Theory. , Wiley. New York. (1949).
- Cossart, R., Garel, S. Step by step: cells with multiple functions in cortical circuit assembly. Nat Rev Neurosci. 23, 395-410 (2022).
- Carrillo-Reid, L., Yuste, R. Playing the piano with the cortex: role of neuronal ensembles and pattern completion in perception and behavior. Curr Opin Neurobiol. 64, 89-95 (2020).
- Buzsáki, G.
- Buzsáki, G. Neural Syntax: Cell assemblies, synapsembles, and readers. Neuron. 68 (3), 362-385 (2010).
- Huang, Y., Williams, J. C., Johnson, S. M. Brain slice on a chip: opportunities and challenges of applying microfluidic technology to intact tissues. Lab Chip. 12 (12), 2103-2117 (2012).
- Cho, S., Wood, A., Bowlby, M. Brain slices as models for neurodegenerative disease and screening platforms to identify novel therapeutics. Curr Neuropharmacol. 5 (1), 19-33 (2007).
- Bliss, T. V. P., Collingridge, G. L. A synaptic model of memory: long-term potentiation in the hippocampus. Nature. 361, 31-39 (1993).
- Anderson, P., Morris, R., Amaral, D., Bliss, T., O'Keefe, L. The Hippocampus Book. , Oxford University Press. New York. (2006).
- Lisman, J., et al. Viewpoints: how the hippocampus contributes to memory, navigation and cognition. Nat Neurosci. 20, 1434-1447 (2017).
- Mori, K., Nagao, H., Yoshihara, Y. The olfactory bulb: Coding and processing of odor molecule information. Science. 286 (5440), 711-715 (1999).
- Buck, L., Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: A molecular basis for odor recognition. Cell. 65 (1), 175-187 (1991).
- Bushdid, C., Magnasco, M. O., Vosshall, L. B., Keller, A. Humans can discriminate more than 1 trillion olfactory stimuli. Science. 343 (6177), 1370-1372 (2014).
- Kempermann, G. Why new neurons? Possible functions for adult hippocampal neurogenesis. J Neurosci. 23 (3), 635-638 (2003).
- Aimone, J. B., Wiles, J., Gage, F. H. Computational influence of adult neurogenesis on memory encoding. Neuron. 61 (2), 187-202 (2009).
- Nithianantharajah, J., Hannan, A. J. Enriched environments, experience-dependent plasticity and disorders of the nervous system. Nat Rev Neurosci. 7, 697-709 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Espuny-Camacho, I., et al. Pyramidal neurons derived from human pluripotent stem cells integrate efficiently into mouse brain circuits in vivo. Neuron. 77 (3), 440-456 (2013).
- Rajamohan, D., et al. Current status of drug screening and disease modelling in human pluripotent stem cells. Bioessays. 35 (3), 281-298 (2013).
- Heilker, R., Traub, S., Reinhardt, P., Schöler, H. R., Sterneckert, J. iPS cell derived neuronal cells for drug discovery. Trends Pharmacol Sci. 35 (10), 510-519 (2014).
- Zhao, S. R., Mondéjar-Parreño, G., Li, D., Shen, M., Wu, J. C. Technical applications of microelectrode array and patch clamp recordings on human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. J Vis Exp. (186), e64265 (2022).
- Hamill, O. P., McBride, D. W. Induced membrane hypo/hyper-mechanosensitivity: A limitation of patch-clamp recording. Annu Rev Physiol. 59, 621-631 (1997).
- Manz, K. M., Siemann, J. K., McMahon, D. G., Grueter, B. A. Patch-clamp and multi-electrode array electrophysiological analysis in acute mouse brain slices. STAR Protoc. 2 (2), 100442 (2021).
- Lee, C. H., Park, Y. K., Lee, K. Recent strategies for neural dynamics observation at a larger scale and wider scope. Biosens Bioelectron. 240, 115638 (2023).
- Urai, A. E., Doiron, B., Leifer, A. M., Churchland, A. K. Large-scale neural recordings call for new insights to link brain and behavior. Nat Neurosci. 25 (1), 11-19 (2022).
- Hu, X., Khanzada, S., Klütsch, D., Calegari, F., Amin, H. Implementation of biohybrid olfactory bulb on a high-density CMOS-chip to reveal large-scale spatiotemporal circuit information. Biosens Bioelectron. 198, 113834 (2022).
- Amin, H., Marinaro, F., Tonelli, D. D. P., Berdondini, L. Developmental excitatory-to-inhibitory GABA-polarity switch is disrupted in 22q11.2 deletion syndrome: A potential target for clinical therapeutics. Sci Rep. 7 (1), 15752 (2017).
- Amin, H., Nieus, T., Lonardoni, D., Maccione, A., Berdondini, L. High-resolution bioelectrical imaging of Aβ-induced network dysfunction on CMOS-MEAs for neurotoxicity and rescue studies. Sci Rep. 7 (1), 2460 (2017).
- Emery, B. A., Hu, X., Khanzada, S., Kempermann, G., Amin, H. High-resolution CMOS-based biosensor for assessing hippocampal circuit dynamics in experience-dependent plasticity. Biosens Bioelectron. 237, 115471 (2023).
- Amin, H., et al. Electrical responses and spontaneous activity of human iPS-derived neuronal networks characterized for 3-month culture with 4096-electrode arrays. Front Neurosci. 10, 121 (2016).
- Lonardoni, D., et al. Recurrently connected and localized neuronal communities initiate coordinated spontaneous activity in neuronal networks. PLoS Comput Biol. 13 (7), e1005672 (2017).
- Emery, B. A., et al. Large-scale multimodal recordings on a high-density neurochip: Olfactory bulb and hippocampal networks. 2022 44th Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine & Biology Society (EMBC). , Glasgow, Scotland, United Kingdom. 3111-3114 (2022).
- Rossi, L., Emery, B. A., Khanzada, S., Hu, X., Amin, H. Pharmacologically and electrically-induced network-wide activation of olfactory bulb with large-scale biosensor. 2023 IEEE BioSensors Conference (BioSensors). , London, United Kingdom. 1-4 (2023).
- Emery, B. A., et al. Recording network-based synaptic transmission and LTP in the hippocampal network on a large-scale biosensor. 2023 IEEE BioSensors Conference (BioSensors). , London, United Kingdom. 1-4 (2023).
- Hierlemann, A., Frey, U., Hafizovic, S., Heer, F. Growing cells atop microelectronic chips: Interfacing electrogenic cells in vitro with CMOS-based microelectrode arrays). Proceedings of the IEEE. 99 (2), 252-284 (2011).
- Berdondini, L., et al. Active pixel sensor array for high spatio-temporal resolution electrophysiological recordings from single cell to large scale neuronal networks. Lab Chip. 9, 2644-2651 (2009).
- Siegle, J. H., Hale, G. J., Newman, J. P., Voigts, J. Neural ensemble communities: open-source approaches to hardware for large-scale electrophysiology. Curr Opin Neurobiol. 32, 53-59 (2015).
- Amin, H., Maccione, A., Zordan, S., Nieus, T., Berdondini, L. High-density MEAs reveal lognormal firing patterns in neuronal networks for short and long term recordings. 2015 7th International IEEE/EMBS Conference on Neural Engineering (NER). , Montpellier, France. 1000-1003 (2015).
- Altuntac, E., et al.
- Maccione, A., et al. A novel algorithm for precise identification of spikes in extracellularly recorded neuronal signals. J Neurosci Methods. 177 (1), 241-249 (2009).
- Welch, P. D. The use of fast Fourier transform for the estimation of power spectra: A method based on time averaging over short, modified periodograms. IEEE Transactions on Audio and Electroacoustics. 15 (2), 70-73 (1967).
- Eggermont, J. J., Munguia, R., Pienkowski, M., Shaw, G. Comparison of LFP-based and spike-based spectro-temporal receptive fields and cross-correlation in cat primary auditory cortex. PLoS One. 6 (5), e20046 (2011).
- Damos, P. Using multivariate cross correlations, Granger causality and graphical models to quantify spatiotemporal synchronization and causality between pest populations. BMC Ecol. 16, 33 (2016).
- Kaminski, M. J., Blinowska, K. J. A new method of the description of the information flow in the brain structures. Biol Cybern. 65, 203-210 (1991).
- Pastore, V. P., Massobrio, P., Godjoski, A., Martinoia, S. Identification of excitatory-inhibitory links and network topology in large-scale neuronal assemblies from multi-electrode recordings. PLoS Comput Biol. 14 (8), e1006381 (2018).
- Amin, H., Dipalo, M., De Angelis, F., Berdondini, L. Biofunctionalized 3D nanopillar arrays fostering cell guidance and promoting synapse stability and neuronal activity in networks. ACS Appl Mater Interfaces. 10 (17), 15207-15215 (2018).
- Woeppel, K., Yang, Q., Cui, X. T. Recent advances in neural electrode-tissue interfaces. Curr Opin Biomed Eng. 4, 21-31 (2017).
- Steinmetz, N. A., Koch, C., Harris, K. D., Carandini, M. Challenges and opportunities for large-scale electrophysiology with Neuropixels probes. Curr Opin Neurobiol. 50, 92-100 (2018).
- Siegle, J. H., Hale, G. J., Newman, J. P., Voigts, J. Neural ensemble communities: open-source approaches to hardware for large-scale electrophysiology. Curr Opin Neurobiol. 32, 53-59 (2015).
- Freeman, J. Open source tools for large-scale neuroscience. Curr Opin Neurobiol. 32, 156-163 (2015).
- Stevenson, I. H., Kording, K. P. How advances in neural recording affect data analysis. Nat Neurosci. 14 (2), 139-142 (2011).
