Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Opptak og analyse av multimodal storskala nevronal ensembledynamikk på CMOS-integrert mikroelektrode med høy tetthet

Published: March 8, 2024 doi: 10.3791/66473
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1, 1,2,3
1Group of "Biohybrid Neuroelectronics (BIONICS)", German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE), 2Faculty of Medicine Carl Gustav Carus, Technical University Dresden, 3Dresden Center for Intelligent Materials (DCIM), Technical University Dresden
* These authors contributed equally

Summary

Her bruker vi HD-MEA for å fordype oss i beregningsdynamikken til store nevronale ensembler, spesielt i hippocampus, olfaktoriske pærekretser og menneskelige nevronnettverk. Registrering av spatiotemporal aktivitet, kombinert med beregningsverktøy, gir innsikt i nevronal ensemblekompleksitet. Metoden forbedrer forståelsen av hjernens funksjoner, potensielt identifiserer biomarkører og behandlinger for nevrologiske lidelser.

Abstract

Store nevrale nettverk og deres komplekse distribuerte mikrokretser er avgjørende for å generere oppfatning, kognisjon og atferd som kommer fra mønstre av spatiotemporal nevronaktivitet. Disse dynamiske mønstrene som kommer fra funksjonelle grupper av sammenkoblede nevronale ensembler, letter presise beregninger for behandling og koding av multiskala nevral informasjon, og driver dermed høyere hjernefunksjoner. For å undersøke beregningsprinsippene for nevral dynamikk som ligger til grunn for denne kompleksiteten og undersøke multiskala virkningen av biologiske prosesser i helse og sykdom, har storskala samtidige opptak blitt medvirkende. Her brukes en mikroelektrode med høy tetthet (HD-MEA) for å studere to modaliteter av nevral dynamikk - hippocampus og olfaktoriske pærekretser fra ex-vivo musehjerneskiver og nevrale nettverk fra in vitro-cellekulturer av humane induserte pluripotente stamceller (iPSCs). HD-MEA-plattformen, med 4096 mikroelektroder, muliggjør ikke-invasive, etikettfrie opptak på flere steder av ekstracellulære avfyringsmønstre fra tusenvis av nevronale ensembler samtidig med høy spatiotemporal oppløsning. Denne tilnærmingen tillater karakterisering av flere elektrofysiologiske nettverksomfattende funksjoner, inkludert enkelt-/multi-enhet spiking aktivitetsmønstre og lokale feltpotensialsvingninger. For å granske disse flerdimensjonale nevrale dataene har vi utviklet flere beregningsverktøy som omfatter maskinlæringsalgoritmer, automatisk hendelsesdeteksjon og klassifisering, grafteori og andre avanserte analyser. Ved å supplere disse beregningsmessige pipelinene med denne plattformen, tilbyr vi en metodikk for å studere den store, multiskala og multimodale dynamikken fra cellesamlinger til nettverk. Dette kan potensielt fremme vår forståelse av komplekse hjernefunksjoner og kognitive prosesser i helse og sykdom. Forpliktelse til åpen vitenskap og innsikt i storskala beregningsorientert nevral dynamikk kan forbedre hjerneinspirert modellering, nevromorf databehandling og nevrale læringsalgoritmer. Videre kan forståelse av de underliggende mekanismene for svekkede storskala nevrale beregninger og deres sammenkoblede mikrokretsdynamikk føre til identifisering av spesifikke biomarkører, og bane vei for mer nøyaktige diagnostiske verktøy og målrettede terapier for nevrologiske lidelser.

Introduction

Nevrale ensembler, ofte kalt cellesamlinger, er sentrale i nevral koding, og letter intrikate beregninger for behandling av multiskala nevral informasjon 1,2,3. Disse ensemblene underbygger dannelsen av ekspansive nevrale nettverk og deres nyanserte mikrokretser4. Slike nettverk og deres oscillerende mønstre driver avanserte hjernefunksjoner, inkludert oppfatning og kognisjon. Mens omfattende forskning har utforsket spesifikke nevrontyper og synaptiske veier, er en dypere forståelse av hvordan nevroner samarbeider danner cellesammensetninger og påvirker spatiotemporal informasjonsbehandling på tvers av kretser og nettverk fortsatt unnvikende5.

Akutte, ex vivo hjerneskiver er sentrale elektrofysiologiske verktøy for å studere intakte nevrale kretser, og tilbyr en kontrollert innstilling for å undersøke oscillatoriske aktivitetsmønstre av nevral funksjon, synaptisk overføring og tilkobling, med implikasjoner i farmakologisk testing og sykdomsmodellering 6,7,8. Denne studieprotokollen fremhever to viktige hjernekretser - hippocampus-cortical (HC) involvert i lærings- og minneprosesser 9,10, og olfaktorisk pære (OB) ansvarlig for luktdiskriminering 11,12,13. I disse to regionene genereres nye funksjonelle nevroner kontinuerlig av voksen neurogenese gjennom livet i pattedyrhjerner14. Begge kretsene demonstrerer flerdimensjonale dynamiske nevrale aktivitetsmønstre og iboende plastisitet som deltar i omkobling av det eksisterende nevrale nettverket og letter alternative informasjonsbehandlingsstrategier når det er nødvendig15,16.

Akutte, ex-vivo hjerneskivemodeller er uunnværlige for å dykke inn i hjernens funksjonalitet og forstå sykdomsmekanismer på mikrokretsnivå. Imidlertid tilbyr in vitro-cellekulturer avledet fra humane induserte pluripotente stamceller (iPSCs) nevronale nettverk en lovende vei for translasjonsforskning, som sømløst forbinder funn fra dyreforsøk til potensiell human klinisk behandling17,18. Disse menneskesentriske in vitro-analysene fungerer som en pålitelig plattform for å vurdere farmakologisk toksisitet, muliggjøre presis legemiddelscreening og fremme forskning på innovative cellebaserte terapeutiske strategier19,20. Ved å anerkjenne den sentrale rollen til iPSC nevronmodellen, har vi dedikert den tredje modulen i denne protokollstudien for å grundig undersøke de funksjonelle egenskapene til dets avledede nettverk og for å finjustere de tilknyttede cellekulturprotokollene.

Disse elektrogene nevrale modulene har blitt ofte studert ved hjelp av teknikker som kalsium (Ca2+ bildebehandling), patch-klemmeopptak og mikroelektroderader med lav tetthet (LD-MEA). Mens Ca2+ bildebehandling tilbyr kartlegging av enkeltcelleaktivitet, er det en cellemerkingsbasert metode hindret av sin lave temporale oppløsning og utfordringer i langsiktige opptak. LD-MEA mangler romlig presisjon, mens patch-clamp, som er en invasiv enkeltstedsteknikk og arbeidskrevende, ofte gir en lav suksessrate 21,22,23. For å møte disse utfordringene og effektivt undersøke nettverksomfattende aktivitet, har storskala samtidige nevrale opptak dukket opp som en sentral tilnærming for å forstå beregningsprinsippene for nevrale dynamikker som ligger til grunn for hjernens kompleksitet og deres implikasjoner i helse og sykdom24,25.

I denne JoVE-protokollen demonstrerer vi en storskala nevral opptaksmetode basert på MEA (HD-MEA) med høy tetthet for å fange opp spatiotemporal nevronaktivitet på tvers av ulike hjernemodaliteter, inkludert hippocampus- og olfaktoriske pærekretser fra ex vivo akutte skiver i musehjernen (figur 1A-C) og in vitro humane iPSC-avledede nevronnettverk (figur 1D-E), tidligere rapportert av vår gruppe og andre kolleger26,27,28,29,30,31,32,33,34,35. HD-MEA, bygget på CMOS-teknologi (complementary-metal-oxide-semiconductor), kan skryte av brikkekretser og forsterkning, noe som tillater opptak på under millisekunder over en 7mm 2-arraystørrelse36. Denne ikke-invasive tilnærmingen fanger opp multi-site, etikettfrie ekstracellulære avfyringsmønstre fra tusenvis av nevronale ensembler samtidig ved bruk av 4096 mikroelektroder ved høy spatiotemporal oppløsning, og avslører den intrikate dynamikken til lokale feltpotensialer (LFP) og multiunit spiking activity (MUA) 26,29.

Gitt de enorme dataene som genereres av denne metodikken, er et sofistikert analytisk rammeverk avgjørende, men utgjør utfordringer37. Vi har utviklet beregningsverktøy som omfatter automatisk hendelsesdeteksjon, klassifisering, grafteori, maskinlæring og andre avanserte teknikker (figur 1F) 26,29,38,39. Ved å integrere HD-MEA med disse analyseverktøyene, er en helhetlig tilnærming utviklet for å undersøke den intrikate dynamikken fra individuelle cellesammensetninger til bredere nevrale nettverk på tvers av ulike nevrale modaliteter. Denne kombinerte tilnærmingen utdyper vår forståelse av beregningsdynamikken i normale hjernefunksjoner og gir innsikt i anomalier som er tilstede under patologiske forhold28. Videre kan innsikt fra denne tilnærmingen drive fremskritt innen hjerneinspirert modellering, nevromorf databehandling og nevrale læringsalgoritmer. Til syvende og sist holder denne metoden løfte om å avdekke kjernemekanismene bak nevrale nettverksforstyrrelser, potensielt identifisere biomarkører og veilede etableringen av presise diagnostiske verktøy og målrettede behandlinger for nevrologiske forhold.

Protocol

Alle eksperimenter ble utført i samsvar med gjeldende europeiske og nasjonale forskrifter (Tierschutzgesetz) og ble godkjent av kommunen (Landesdirektion Sachsen; 25-5131/476/14).

1. Ex-vivo hjerneskiver fra hippocampus-kortikale og olfaktoriske pærekretser på HD-MEA

  1. Fremstilling av eksperimentelle skjære- og opptaksløsninger (figur 2A)
    1. På forsøksdagen tilberedes 0,5 l høysukrose skjæreoppløsning og 1 liter kunstig cerebrospinalvæske (aCSF) opptaksløsning (tabell 1A,B).
      1. Tilsett alle faste kjemikalier til en tørr volumetrisk kolbe, fyll deretter en del av veien med dobbeltdestillert (dd) vann.
      2. Tilsett MgCl2 og CaCl2 fra 1 M lagerløsninger, og fyll deretter resten med dd-vann. Begynn å røre kontinuerlig med en magnetomrører til synlige faste stoffer har oppløst ~ 5 min.
    2. Bruk et frysepunktosmometer for å validere osmolariteten mellom 350-360 mOsm for skjæreløsningen med høy sukrose og 315-325 mOsm for aCSF-opptaksløsningen.
    3. Bruk en pH-måler for å validere pH mellom 7,3-7,4 for skjæreløsningen med høy sukrose og 7,25-7,35 for aCSF-opptaksløsningen. Begynn kontinuerlig boblende med 95%O2 og 5% CO2.
    4. Legg skjæreløsningen med høy sukrose på is i minst 30 minutter før skiver og begynn kontinuerlig boblende med 95%O2 og 5% CO2.
    5. Etter 10 min karbogenasjon, fyll et 50 ml beger med 30 ml skjæreløsning og oppbevar det i fryseren (-20 °C) i 20-30 minutter eller til det er delvis frosset.
      MERK: Alle løsninger skal tilberedes friske for hvert eksperiment. DD-vannet som brukes her er autoklavert ultrarent vann lagret ved romtemperatur (RT). Mengden løsning som utarbeides, bør skreddersys til det spesifikke studiespørsmålet.
  2. Klargjøring av arbeidsområder for hjerneskiver (figur 2A)
    1. Ta dyret inn i forsøksrommet.
      MERK: I denne protokollen ble C57BL/J6 hunnmus i alderen 8-16 uker brukt som tidligere beskrevet 26,29,32. Dyret skal ha akklimatisering i minst 30 minutter etter transport. Langdistanseoverføringer (dvs. inter-institutt) bør unngås samme dag som eksperimentet. Dyrets alder, kjønn og belastning må bestemmes ut fra det spesifikke studiespørsmålet.
    2. Mens dyret akklimatiserer seg og den høye sukroseoppløsningen avkjøles, plasser de nødvendige verktøyene i hvert utpekt arbeidsområde (se materialfortegnelse).
    3. Forbered arbeidsområdet for gjenoppretting og vedlikehold av hjerneskiver. Fyll skivekammeret med karbogenert aCSF-opptaksløsning og plasser kammeret i vannbadet satt til 32 °C. Opprettholde kontinuerlig karbogenasjon gjennom hele forsøket.
    4. Forbered arbeidsområdet for forberedelse av hjernestykke. Sett opp vibratomen - plasser bladet i vibratombladholderen og kalibrer vibratomen til de riktige innstillingene (bladets kjørehastighet: 0,20 mm / s, høydeamplitude: 95 μm, bladvinkel: 45 °). Fyll vibratomisbrettet med is og bufferbrettet med en skjæreløsning med høy sukrose og begynn å karbogenere oppløsningen i bufferbrettet.
    5. Forbered arbeidsområdet for hjerneforberedelse. Fyll petriskålen i 150 mm glass med is og legg et 90 mm plastdyrkningsfat med filterpapir inni. Fyll plastkulturfatet med en skjæreløsning med høy sukrose og begynn å karbogenere. Tilsett en dråpe superlim på den kjølte prøveplaten og fest agaroseformen.
      MERK: Agarosemugg tilberedes minst dagen før med 3% agarose i vann i en tilpasset musehjerneform.
    6. Til slutt, forbered arbeidsområdet for hjerneutvinning. Dekk aluminiumsfolie med silkepapir, hent et 50 ml beger som inneholder slaps med høy sukrose skjæreløsning, og tilsett isofluran i anestesikammeret.
      MERK: Anestesi vil bli lagt til anestesikammeret ~ 1 min før dyreplassering. Et 50 ml beger med 30 ml høysukrose skjæreløsningsslush vil bli fjernet fra -20 °C fryser ~ 2 min før halshugging.
  3. Ekstraksjon og kutting av musehjerne
    MERK: Hele denne prosedyren bør utføres så raskt som mulig for å unngå mangel på oksygenering til hjernen. Hjernefjerning bør bare ta 1-2 min fra halshugging til nedsenking i slapset med høy sukroseløsning.
    1. Bedøv dyret med riktig dose isofluran (0,5 ml/1 l anestesikammer). Bestem dybden av anestesi gjennom en pote klemme; Bekreft mangelen på poteuttaksrefleks før du fortsetter.
    2. Overfør dyret til silkepapiret i arbeidsområdet for hjerneutvinning og halshugg det med kirurgisk saks.
    3. Sett irissaks inn i hjernestammen og hold den nederste saksen flush med calvaria. Skjær langs sagittal suturen til koronal suturen er nådd. Plasser irissaks i øyehulene og skjær gjennom metopisk sutur. Bruk buet tang for å flytte sidene av calvaria ned, og utsette hele hjernen.
      MERK: Vær forsiktig med både irissaks og tang for ikke å punktere hjernen mens du skjærer gjennom suturene.
    4. Skyv hjernen med den stumpe kanten av de buede tangene inn i 50 ml begeret med 30 ml skjæreløsningsslaps med høy sukrose. La det forbli i 1 min.
    5. Overfør hjernen til 90 mm plastdyrkningsfat med kjølt karbogenert skjæreløsning i arbeidsområdet for klargjøring av hjernen. Orienter hjernen for posisjonering i agaroseformen.
    6. Legg til en liten prikk med superlim til rostralenden av agaroseformen. Plasser hjernen i formen med slikkepotten. Sørg for at hjernen er plassert med dorsalsiden ned for horisontal skive.
      NOTAT: Plasseringen av lim i formen vil endres avhengig av interesseområdet (ROI). For hippocampus-kortikale (HC) og olfaktoriske pære (OB) skiver, sørg for at OB er stabilisert og sidene av hjernen forblir fri for lim. For mye lim vil påvirke kuttekvaliteten og forårsake rifter under vibratomskiver.
    7. Flytt prøveplaten inn i bufferbrettet, flytt kappskiven på plass med riktig vinkel, og øk høyden på bufferbrettet for å bringe bladet så nær hjernen som mulig.
    8. Skjær på 0,20 mm / s hastighet 300 μm intervaller av HC- og OB-vev, og samle dem etter hver skiverunde med en glass Pasteur-pipette.
    9. La skivene ligge i det aCSF-fylte restitusjonskammeret i et vannbad på 32 °C i 45 minutter, etterfulgt av 1 time ved RT. Sørg for at skivene ikke overlapper hverandre og er helt eksponert for den karbogenerte løsningen.
      MERK: Sørg for å opprettholde kontinuerlig karbogenering av alle oppløsninger og eventuelle kamre som er nevnt som inneholder løsningen. En trykkregulator kan brukes til å opprettholde konsistent karbogenasjon.

2. In-vitro humant iPSC-basert nevronnettverk på HS-MEA

MERK: Alle iPSC-nevroner som ble brukt i denne studien er kommersielt oppnådd (se materialfortegnelse). Disse humane cellene skilte seg fra stabile iPS-cellelinjer som ble avledet fra humant perifert blod eller fibroblaster.

  1. Belegg av HD-MEA-brikker for in vitro humane iPSC-cellekulturer (figur 2B)
    1. Plasser HD-MEA-brikken på opptaksplattformen, fyll reservoaret med PBS og test brikken før belegg. Start Brainwave programvare. Velg Fil > ny innspillingsøkt. Sett opptaksparametrene til å ha en opptaksfrekvens på 50 Hz og en samplingsfrekvens på 18 kHz / elektrode. Endre forsterkerforskyvningen for å kalibrere brikken. Se tabell 2 for feilsøkingstips.
      MERK: Registreringsfrekvensen og parameterne for samplingsfrekvens vil avhenge av datatype og individuelle systemkrav.
    2. Steriliser og prekondisjoner HD-MEA.
      1. Tørk av brikken og glassringen med vev fuktet med 96 % etanol (EtOH) under panseret, legg deretter hver enhet i en steril 100 mm x 20 mm petriskål og fyll MEA-reservoaret med 70 % EtOH i 20 minutter.
      2. Aspirer EtOH og vask reservoaret med sterilt, filtrert dd-vann 3 ganger. Tilsett 1 ml forkondisjoneringsmedier og inkuber over natten ved 37 °C og 5 % CO2.
        MERK: Forkondisjoneringsmedier må være en saltbasert løsning for å gjøre HD-MEA-overflaten mer hydrofil. Dette kan inkludere tidligere klargjorte BrainPhys (BP) komplette medier (ikke >3 måneder gamle) (tabell 1C).
    3. Frakk HD-MEAs. Neste dag, aspirer pre-conditioning media. Tilsett 1 ml 0,1 mg/ml poly-dl-ornitin (PDLO) for å belegge hele det aktive området. Inkuber ved 37 °C over natten i en inkubator.
    4. Forbered og varm media til RT. Protokollene her utnytter funksjonelle humane iPSC-nevroner fra to kommersielle kilder; Dermed varierer mediekomponentene for hver leverandør. En protokoll er beskrevet i (tabell 1C, D) .
    5. Aspirer PDLO, vask 3 ganger med dd-vann og la sponsene tørke under panseret i 10 min.
    6. Fyll en 35 mm x 10 mm petriskål med sterilt, filtrert dd-vann og legg det ved siden av brikken for å opprettholde riktig fuktighet og unngå fordampning av de frøede cellene i de neste trinnene.
  2. Plettering og vedlikehold av humane iPSC-nevroner ved HS-MEA (figur 2B)
    1. Tine og fortynne celler til ønskede celler per mikroliterkonsentrasjon (dvs. 1000 celler / μL for å oppnå 50.000 celletetthet i en 50 μL dråpe på HD-MEA) (tabell 1C).
    2. Pipetter cellesuspensjonen på overflaten av det sponaktive området ved bruk av et medium med høyt lamininpunkt (tabell 1D).
    3. Inkuber ved 37 °C med 5 % CO2 i 45-60 minutter.
    4. Fyll forsiktig 2 ml medier i HD-MEA reservoaret (tabell 1C).
    5. Utfør 100 % medieendring på dag 1 (DIV1) etter seeding ved bruk av RT-medier (tabell 1C). Bytt 50% av mediet hver 3-4 dag. Hold HD-MEA inkubert ved 37 °C med 5 % CO2 gjennom hele eksperimentet.
      MERK: Pipett forsiktig for å unngå å løsne cellene. Kontroller fargen på mediet for forurensning. Intervallet og mengden medieendring kan bestemmes av individuelle studiespørsmål eller cellebehov / spesifikasjoner.
    6. Valgfritt: Kontroller fremdriften av cellekulturvekst mellom DIV4-DIV8 under et oppreist differensialinterferenskontrast (DIC) mikroskop etter rengjøring av scenen med >70% EtOH.

3. Ex-vivo og in vitro storskala nevrale opptak med HD-MEA

  1. Klargjøring av arbeidsområde for registrering av hjerneskiver (figur 2A)
    1. Mens hjernestykker gjenopprettes, plasserer du de nødvendige verktøyene i hvert angitte arbeidsområde (se Materialfortegnelse).
      MERK: Hovedsystemoppsettet må optimaliseres og testes i god tid før hjernesnittets eksperimentelle dag. Perfusjonssystemet (innløpsledninger, pumpeutløpsledninger, slanger og jording) må testes med PBS eller aCSF og en HD-MEA på opptaksplattformen for å sikre et rent signal, økt signal-støyforhold og mangel på perfusjonsstøy.
    2. Belegg HD-MEA chipen med 0,1 mg/ml PDLO for å forbedre vev-chip-koblingen og inkubere ved 37 °C i 20 minutter.
    3. Under chipinkubasjon, fyll det tyngdekraftbaserte perfusjonssystemet og linjene med opptak av aCSF. Sørg for kontinuerlig karbogenering av perfusjonssystemet. Still inn en strømningshastighet på 4,5 ml/min og en temperatur på 37 °C.
    4. Plasser HD-MEA-brikken på opptaksplattformen, fyll reservoaret med aCSF, test perfusjonssystemet og feilsøk eventuell gjenværende systemstøy.
      1. Start Brainwave programvare. Velg Fil > ny innspillingsøkt. Sett opptaksparametrene til å ha en opptaksfrekvens på 1 Hz og en samplingsfrekvens på 14 kHz / elektrode. Endre forsterkerforskyvningen for å kalibrere brikken. Se tabell 2 for feilsøkingstips.
        MERK: Registreringsfrekvensen og parameterne for samplingsfrekvens vil avhenge av datatype og individuelle systemkrav.
    5. Forsikre deg om at opptaksområdet er mørkt gjennom et rombelysningssystem eller et skyggelagt bur på det optiske bordet.
    6. Juster stereomikroskopet med HD-MEA-brikkereservoaret og det aktive området for bildeopptak.
    7. Plasser ankeret i flisbeholderen for å balansere.
      MERK: Anker er en skreddersydd platinaharpe med minimale ledninger for å fremme oksygenering; Noen kommersielle er imidlertid tilgjengelige.
    8. Legg farmakologiske forbindelser til passende perfusjonsrør.
      MERK: I denne protokollen ble både spontane og 100 μM 4-aminopyridin (4-AP) farmakologisk induserte opptak oppnådd som tidligere beskrevet. Farmakologiske forbindelser kan skreddersys til det spesifikke studiespørsmålet.
    9. I arbeidsområdet for tilberedning av hjerneskiver legger du en ny 90 mm plastkulturskål i en petriskål i 150 mm glass. Legg til aCSF og begynn å karbogenere.
  2. Kretsopptak fra HC- og OB-skiver ved bruk av HD-MEAer
    MERK: Skivekobling bør utføres så raskt som mulig for å unngå mangel på oksygenering til skiven. Kobling bør bare ta ~ 1 min fra den første plasseringen av det mikrodissekerte stykket på det chipaktive området til den endelige perfusjonssystemoppstarten.
    1. Fjern skiven fra hjerneskivens gjenopprettingskammer med en glasspipette og legg den i en 90 mm plastkulturfat med kontinuerlig karbogenering. Ved hjelp av et mikrodisseksjonsverktøy, isolere HC eller OB fra det omkringliggende hjernestykkevevet.
    2. Flytt de isolerte HC- eller OB-akutte skivene med en glasspipette inn i HD-MEA-beholderen. Juster stykket forsiktig på MEA-området med en fin børste. Sug alle løsninger fra HD-MEA-brikken godt med et aspirasjonssystem.
    3. Legg ankeret forsiktig oppå skiven med tang.
      MERK: Ankeret skal plasseres uten skivebevegelse for å unngå tap av kobling.
    4. Tilsett forsiktig oppløsning til sponbeholderen og start perfusjonssystemet.
      MERK: Sørg for laminær strømning fra perfusjonsinnløpet og pumpeutløpet for optimale opptaksparametere.
    5. Forsikre deg om at opptaksområdet er tilstrekkelig dimmet gjennom rombelysningssystemet eller med et skyggelagt bur på et optisk bordoppsett.
    6. La skiven akklimatisere seg i 10 minutter før du begynner opptak eller ytterligere farmakologisk modulering.
    7. Start Brainwave programvare. Velg Fil > ny innspillingsøkt. Sett opptaksparametrene til å ha en opptaksfrekvens på 1 Hz og en samplingsfrekvens på 14 kHz / elektrode. Endre forsterkerforskyvningen for å kalibrere brikken.
      MERK: Som nevnt tidligere i avsnitt 3.1.4.1, må du sørge for å bruke de samme opptaksparametrene mens du utfører systemtester.
    8. Trykk på Record for å starte oppkjøpet med de forhåndsinnstilte eksperimentelle forholdene.
    9. Umiddelbart etter det endelige opptaket, ta lett avbildning av det akutte hjernestykket. Flytt stykket tilbake til stykkets gjenvinningskammer, fjern alt organisk materiale som er koblet til flisen med en pensel, og fortsett med neste skive. Rengjør HD-MEA som beskrevet i pkt. 3.4.
  3. Klargjøring av arbeidsområde for menneskelig iPSC-opptak og nettverksomfattende opptak på HD-MEA (figur 2B)
    MERK: Bytt media enten dagen før opptak eller umiddelbart etter menneskelig iPSC-opptak (tabell 1C). I studier med funksjonelle nevroner ble media endret hver 4. dag, og på 4, 8, 16 og 24 DIV-medier endres umiddelbart etter iPSC-opptak.
    1. Sikre et sterilt arbeidsmiljø ved å rengjøre HD-MEAs anskaffelsesplattform med >70 % EtOH.
    2. Sett forsiktig en polydimetylsiloksan (PDMS)-basehette med referanse på HD-MEA ringen under hetten. Flytt HD-MEA-brikken til iPSC-opptaksarbeidsområdet og fest HD-MEA-brikken til anskaffelsesplattformen.
    3. Forsikre deg om at opptaksområdet er tilstrekkelig dimmet gjennom et rombelysningssystem eller et skyggelagt bur på et optisk bord.
    4. La HD-MEA-brikken balansere i 10 minutter før opptakene starter, eller ytterligere farmakologisk modulering.
    5. Start Brainwave programvare. Velg Fil > ny innspillingsøkt. Sett opptaksparametrene til å ha en opptaksfrekvens på 50 Hz og en samplingsfrekvens på 18 kHz / elektrode. Endre forsterkerforskyvningen for å kalibrere brikken.
      MERK: Som nevnt tidligere i avsnitt 2.1.1, mens du utfører en systemtest før belegg og plating, må du sørge for å bruke de samme opptaksparametrene.
    6. Registrer spontan avfyringsaktivitet eller farmakologisk induserte responser fra det humane iPSC-nettverket hver dag i eksperimentplanen (dvs. 4, 8, 16, 24 DIV).
      MERK: Ikke la brikken forbli utenfor inkubatoren i >30 minutter for å opprettholde stabil temperatur og fuktighet og forhindre temperatursjokk på cellene.
    7. Inkuber HD-MEA ved 37 °C med 5 % CO2 i løpet av forsøket.
    8. Når eksperimentet er fullført, fikser du det nevrale nettverket på spon og flekker for ytterligere optisk avbildning eller rengjør HD-MEAene direkte, som beskrevet i trinn 3.4.
  4. Rengjøring av HD-MEA chips
    1. Etter forsøket, kast løsningen i henhold til riktig avfallshåndtering og skyll med dd-vann.
    2. Tilsett vaskemiddelet, rengjør det aktive området og hele reservoaret med en Q-tip, og kast vaskemiddelet. Fyll på med vaskemiddel, inkuber i 20 minutter, og kast deretter vaskemiddelet.
    3. Skyll grundig med vann av laboratoriekvalitet. Skyll deretter 3-4 ganger med dd-vann.
    4. Bruk lufttrykk til å tørke HD-MEA-brikken grundig.

4. Analyse av storskala nevrale opptak fra HD-MEA

MERK: Selv om trinn 4.1 er spesifikt for Brainwave-programvare, kan trinn 4.2 endres basert på hver brukers kommersielt tilgjengelige HD-MEA-enhetstype.

  1. Forhåndsbehandling av rådata og hendelsesgjenkjenning
    1. Åpne en innspilt rådatafil (.brw) i Brainwave-programvaren. Velg Analyse > LFP-deteksjon eller piggdeteksjon.
      MERK: LFP-deteksjon bruker IIR-filtrering med et Butterworth-filter avlav passart 4. orden (1–100 Hz). Harde terskelalgoritmer inkluderer en høy terskel på 150 μV, en lav terskel på -150 μV, et energivindu mellom 70-120 ms, en ildfast periode på 10 ms og en maksimal hendelsesvarighet på 1 s. Single og MUA Spike Detection bruker IIR-filtrering med et høypass 4. ordens Butterworth-filter (300-3500 Hz). En PTSD-algoritme brukes med en standardavviksfaktor på 8, en maksimal levetid på 2 ms og en ildfast periode på 1 ms.
    2. For HC- og OB-kretsopptak legger du til alternativet Avansert arbeidsområde i den oppdagede hendelsesfilen (.bxr) for å importere bildet av strukturelt lys som er tatt fra stereomikroskopet. Når du undersøker storskala HC-kretser, opprett strukturelle lag som inneholder dentate gyrus (DG), hilus, Cornu Ammonis 1 (CA1), Cornu Ammonis 3 (CA3), entorhinal cortex (EC) og perirhinal cortex (PC). Når du undersøker storskala OB-kretser, opprett strukturelle lag som inneholder det olfaktoriske nervelaget (ONL), glomerulært lag (GL), eksternt pleksiformlag (EPL), mitralcellelag (MCL) og granulatcellelag (GCL). Betrakt EPL og MCL som projeksjonslaget (PL), inkludert den olfaktoriske cortex (OCx).
  2. Databehandling med en egendefinert Python-databehandlingspipeline
    1. Denoising
      1. Les .bxr-fil ved hjelp av et spesialskrevet Python-skript 26,29,32 og h5py 3.6.0 python-pakke.
      2. Pakk ut piggtog knyttet til iPSC-nettverksopptakene og LFP-hendelsestog knyttet til HC- og OB-hjerneskiveopptakene.
      3. Karakterisere hendelser med et totalt antall aktive elektroder mindre enn 0,1 % eller 10 % av de gjennomsnittlige aktive elektrodene per gjennomsnittlig hendelse eller påviste hendelser som faller utenfor et statistisk rimelig avfyringshastighetsområde som tilfeldige hendelser og fjerne dem. I tillegg må du bruke terskelverdier for amplitude og hendelsesvarighet.
        MERK: For skytehastighetsområdet vurderes 0,1-15 pigger/s og 0,1-60 LFP-hendelser/min. Dette er eksempler på rateterskelverdier som brukes for de analyserte datasettene. Tersklene for hastighet, amplitude og varighet vil avhenge av individuelle data.
      4. Lagre de resulterende hendelsestogdataene med tilhørende spatiotemporal informasjon i .npy-filformat.
    2. Rastergrammer
      1. Les filtrerte NPY- og BXR-hendelser, og generer et rasterplott ved hjelp av PYPLOTT-funksjonen Matplotlib (https://matplotlib.org/3.5.3/api/_as_gen/matplotlib.pyplot.html).
      2. I tillegg, for hjerneskiveopptak med lagspesifisitet, sorter og grupper elektrode-ID-ene basert på lagene produsert i trinn 4.1.2.
    3. Gjennomsnittlig skyteaktivitet
      1. Behandle tidsseriedataene fra BXR-filen, og beregne hver elektrodes gjennomsnittlige avfyringshastighet (antall hendelser / opptakstid).
      2. Konstruer en datamatrise der radene og kolonnene representerer koordinatene til elektrodene i HD-MEA 64 x 64-matrisen, der hver matriseverdi betyr gjennomsnittlig avfyringshastighet.
      3. Bruk et plottebibliotek som Matplotlibs imshow eller Seaborns varmekartfunksjoner i Python.
      4. Bruk det "varme" fargekartet her, og lag et informativt varmekart som visuelt innkapsler den romlige fordelingen av gjennomsnittlige avfyringshastigheter over elektrodematrisen.
    4. Representative bølgeformspor
      1. Les tidsseriedata fra BRW-filen og generer en bølgeformsporing ved hjelp av Matplotlib pyplot-funksjonen. (https://matplotlib.org/3.5.3/api/_as_gen/matplotlib.pyplot.html).
      2. Skriv inn ønsket elektrode-ID, tidsintervall og frekvensbånd for et representativt bølgeformspor. Frekvensbånd definert i disse analysene inkluderer lavfrekvente LFP-svingninger (1-100 Hz) med båndpassfiltrerte δ-, θ-, β- og γ frekvensbånd; skarpe bølgekrusninger (SWR) (140-220 Hz); og høyfrekvent singel og MUA (300-3500 Hz). Frekvensbåndene δ, θ, β og γ er henholdsvis 1-4 Hz, 5-12 Hz, 13-35 Hz og 35-100 Hz.
    5. Effektspektral tetthet
      1. Les tidsseriedata fra BRW-filen og beregne periodogrammene for å skjelne de dominerende frekvensene som ligger til grunn for den oscillerende aktiviteten innenfor hver tidsserie.
      2. Konstruer pseudofargespektrogrammer av frekvens-tidsdynamikken.
        MERK: Spektra beregnes ved hjelp av Welchs metode ved å bruke Fast Fourier Transform av registrerte LFP-er for å estimere spektral effekttetthet41.
      3. Skriv inn ønsket elektrode-ID, tidsintervall og frekvensbånd for et spektralt tetthetskart. Frekvensbånd definert i disse analysene inkluderer de som er beskrevet i trinn 4.2.4.
    6. Funksjonell tilkobling
      1. For hjernesnittkretsopptak, følg trinn 4.2.6.2-4.2.6.4.
      2. Les tidsseriedata fra .brw-filen og beregn krysskovariansen mellom par av aktive elektroder i 64 x 64-arrayet ved hjelp av Pearsons korrelasjonskoeffisient (PCC)42.
      3. Tilpass en vektor autoregressiv modell til tidsserien ved hjelp av multivariat Granger kausalitet for å kvantifisere påvirkningen av en tidsserie på en annen.
      4. Bruk rettet overføringsfunksjon (DTF) for å vurdere retningsinformasjonsflyt innenfor de korrelerte koblingene.
        MERK: Funksjonell tilkobling i flerlagsnettverket etableres ved å angi en korrelasjonsverditerskel basert på de over gjennomsnittet og to standardavvik for alle krysskovariansverdier43,44.
      5. For iPSC-opptak, følg trinn 4.2.6.6-4.2.6.8.
      6. Les spiketrains-data fra .bxr-filen og beregn en 64x64-matrise av PCC-korrelasjonskoeffisientene mellom alle kombinasjoner av binned piggtog ved hjelp av spike_train_correlation funksjoner (https://elephant.readthedocs.io/en/v0.7.0/reference/spike_train_correlation.html).
        MERK: Funksjonell tilkobling i nettverket med flere lag opprettes ved å angi en terskel for korrelasjonsverdi basert på terskelen over gjennomsnittet og to standardavvik for alle kovariansverdier.
      7. Videre implementerer du romlige-temporale filtre (STF) og avstandsavhengige latensterskler (DdLT) filtreringsprosedyrer på tilkoblingsmatrisen for å eliminere potensielle sammenkoblede tilkoblinger som overskrider maksimal forplantningshastighet (satt til 400 mm / s) 45.
      8. Trekk ut negative topper fra resulterende krysskorrelasjonsmatriser med filtrerings- og terskeloperasjoner for å identifisere de hemmende forbindelsene ved hjelp av filtrert og normalisert krysskorrelasjonshistogram (FNCCH) algoritme45.
      9. Transformer hver tilkoblingsmatrise til en dynamisk graffil (.gexf).
    7. Kart over nettverkstilkobling
      1. Åpent datalaboratorium i Gephi program 9.2 versjon (https://gephi.org) for den dynamiske grafen for å plotte bestemte tidsbinger.
      2. Bruk geografisk oppsett i oppsettvinduet for romlig tilordning.
      3. Plasser parameterbegrensninger på Gradområde og Kantvekt for sammenligning.
      4. Tilordne Nodal Color, Edge Size og Degree Size for bedre visualisering.

Representative Results

Multimodel spatiotemporal kartlegging og ekstraksjon av oscillerende avfyringsfunksjoner
For å kvantifisere nettverksomfattende LFP- og pigghendelser som dukket opp fra dynamiske nevronale ensembler, undersøkte vi synkrone storskala avfyringsmønstre i HC- og OB-kretser og menneskelige iPSC-nettverk. Registrerte hjerneskivekretser fra trinn 3.2 og registrerte iPSC-nettverk fra trinn 3.3 ble analysert i henhold til trinn 4.1-4.2 i protokollen. Først ble hendelsesdeteksjon og støyfjerning utført for alle registrerte datasett og regionalt løst i henhold til kretsspesifikasjoner. Deretter ble topografisk pseudofarget romlig kartlegging av gjennomsnittlige storskala LFP- og piggfyringsmønstre, rastergram av oppdagede hendelser og representative 5-s-spor av filtrerte bølgeformer plottet (figur 3 A-I). Topografisk pseudofargekartlegging av storskala LFP- og piggfyringshastighetsmønstre ble overlappet på de respektive mikroskop-tatte optiske bildene av HC (figur 3A), OB (figur 3B) og humant iPSC-nevronnettverk (figur 3C). Dette gjør det mulig å undersøke individuelle krets- og nettverksbaserte oscillerende mønstre og responser. HC- og OB-rastergrammer inneholder registrerte LFP-hendelsestall sortert over DG-, Hilus-, CA3-, CA1-, EC- og PC-lagene i HC-kretsen og ONL-, OCx-, GL-, PL- og GCL-lagene i OB-nettverket over en 60-s tidsintervall (figur 3D, E). Det menneskelige iPSC-rastergrammet viser synkrone oppdagede pigghendelser i det sammenkoblede dyrkede nettverket over en 20 s tidskasse (figur 3G). Deretter viser 5s representative hendelsesspor fra storskala HD-MEA-opptakssteder en rekke registrerte oscillatoriske frekvenser i HC (dvs. valgt elektrode i CA3) (figur 3G) og OB (dvs. valgt elektrode i GL) (figur 3H) kretser og multienhetspiggsprengningsaktivitet i det humane iPSC-nettverket fra fire utvalgte aktive elektroder i arrayet (figur 3I). Disse eksemplariske signalene viser biosignalsignaturer, inkludert lavfrekvente LFP-svingninger (1-100 Hz) med båndpassfiltrerte δ-, θ-, β- og γ frekvensbånd; skarpe bølgekrusninger (SWR) (140-220 Hz); og høyfrekvent singel og MUA (300-3500 Hz). Til slutt ble effektspektral tetthetsanalyse (PSD) brukt til samtidig å kvantifisere et spesifikt oscillatorisk bånds effektstørrelse i den sammenkoblede HC- og OB-kretsen registrert fra HD-MEA (figur 3J, K).

Multimodalt nettverksomfattende funksjonelt connectom
For å utlede storskala tilkobling av flerlags nevrale nettverk fra samtidig avfyringsmønstre av samtidige aktive nevronensembler, ble krysskovariansen mellom par av aktive elektroder i oppdagede hendelser beregnet i henhold til trinn 4.2.6 i protokollen. Her ble korrelasjonskoeffisienten sortert basert på lag i HC- og OB-kretsen eller usortert i iPSC-nettverket og deretter lagret i en symmetrisk matrise. Funksjonelle tilkoblinger av HC- og OB-kretser ble generert ved å anvende multivariat Granger-kausalitet og rettet overføringsfunksjon (DTF) for å kvantifisere innflytelsen fra en tidsserie på en annen og vurdere retningsinformasjonsflyten innenfor de korrelerte koblingene i de forskjellige nettverkene. Connectome-kartlegging av HC (figur 4A) og OB (figur 4B) og nettverksvisualisering ble utført ved hjelp av Gephi-programmet 9.2-versjonen (https://gephi.org). Lignende parameterbegrensninger ble plassert på de funksjonelle koblingene for å sammenligne HC- og OB-hjerneskivekretsene og illustrerte 100 s av den funksjonelle tilkoblingen til oppdagede LFP-hendelser. Noder skaleres i henhold til gradstyrke med nodal farge som indikerer lag- og koblingsfarge som identifiserer intra- og mellomlagsforbindelsene. Funksjonelle tilkoblinger av menneskelige iPSC-nettverk ble generert ved å bruke romlige-temporale filtre (STF) og avstandsavhengige latensterskler (DdLT) for å forbedre utvalget av signifikante koblinger og avgrense identifiseringen av meningsfulle forbindelser ved å bruke filtrert og normalisert krysskorrelasjonshistogram (FNCCH) analyse. Connectome-kartlegging av menneskelige iPSC-nettverk på hele HD-MEA-brikkevisualiseringen (figur 4C) utført ved hjelp av Gephi. Nodal farge indikerer eksitatorisk eller hemmende inngang, og koblingsfarge identifiserer forbindelser.

Figure 1
Figur 1: Oversikt over eksperimentell og beregningsorientert plattform på storskala HD-MEA. (A) Isometrisk skjematisk fremstilling av våre multimodale biohybrid nevroelektroniske plattformer realisert med CMOS-basert HD-MEA for å fange nevral dynamikk fra HC, OB og humane iPSC nevronkretser og nettverk. (B) Skjematisk arbeidsflyt for musens hjernesnitting og dens arbeidslandskap for å få HC- og OB-skiver. (C) topografiske representasjoner av storskala avfyringsmønstre registrert samtidig fra hele HC- og OB-skivene lagt over de ekstraherte ekstracellulære bølgeformene til skivene optiske bilder. (D) Skjematisk fremstilling av iPSC nevrale nettverk hentet fra mennesker. (E) Fluorescensmikrografer som viser cellulær c-fos og somatisk/dendritisk MAP-2 av hele det menneskelige nevronnettverket på HD-MEA-brikken (venstre) matchet med hele kartet over gjennomsnittlig avfyringsaktivitet (høyre). (F) Beregningsrammeverk inkludert avansert dataanalyse, tilkoblingskartlegging og AI-maskinlæringsverktøy for å analysere flerdimensjonale nevrale data hentet fra store opptak på HD-MEAer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Oppsett for ex-vivo brain slice og in vitro human iPSC kultur forberedelse og opptak arbeidsområder. (A) Skjematisk arbeidsflyt som illustrerer oppsettet for klargjøring av HC- og OB-stykker, med de nødvendige verktøyene og utstyret i hvert arbeidsområde. (B) Skjematisk representasjon for menneskelig iPSC-kulturforberedelse, inkludert nødvendige verktøy og enheter. En fullstendig liste over materialer er inkludert i trinn 1.2.2, 2.1, 2.2, 3.1.1, 3.3 og materialfortegnelsen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Kartlegging og uttrekk av romlige temporale mønstre av nettverksdynamikk. (A-C) Gjennomsnittlig LFP og spike rate romlige kart, beregnet over fem minutters opptak, lagt på mikroskoplysbildet. (VG Nett) Rasterplott som viser oppdagede, denoiserte LFP-hendelser i en 60-sekunders dataunderprøve og topper i en 20-sekunders dataunderprøve. (VG Nett) Representativ bølgeformsporekstraksjon fra et 5-sekunders segment av rasterplottdata-underprøven (uthevet rødt i rasterplottet), vist som rå LFP-oscillatoriske bånd (1-100 Hz); δ (1-4 Hz), θ (5-12 Hz), β (13-35 Hz) og γ (35-100 Hz) frekvensbånd; SWR (140-220 Hz); og høyfrekvent singel og MUA-spiking (300-3500 Hz). (J,K) Effektspektrale tetthetskart over raske og langsomme oscillerende LFP-er (1-100 Hz) og SWR (140-220 Hz). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Organisering av multimodale nettverksomfattende funksjonelle tilkoblinger. (AC) Gephi-kart som illustrerer nodal funksjonell tilkobling, der noder tilsvarer en av eksempelfargefeltforklaringene (nedenfor), mens koblingene (eller kantene) er skyggelagt for å matche tilkoblingsnodene. Eksempelforklaringer for (A) HC-, (B) OB- og (C) iPSC-lag vises i en matrise på 64 x 64. HC- og OB-lag er plottet over en 100-s tidskasse for effektivt å redusere antall synlige noder og koblinger for visualiseringsformål. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tabell 1: Løsninger for preparering av hjerneskiver og medier for iPSC nevrale kulturer. (A) Skjæreløsning med høy sukrose for preparat av ex vivo hjerneskiver. (B) aCSF-opptaksløsning for ex-vivo forberedelse og opptak av hjerneskiver. (VG Nett) Human neuronal iPSC Media Protocol, hvor (C) er BrainPhys komplette medier som brukes til celletining, HD-MEA-brikkebelegg og dyrket HD-MEA-vedlikehold, og (D) prikkemediet som brukes til HD-MEA-cellebelegg. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 2: Feilsøking av vanlige problemer med opptak av HD-MEA-opptak. En liste over vanlige problemer, deres potensielle årsaker og feilsøkingsløsninger relatert til HD-MEA-brikker, opptaksplattform, systemstøy og programvare. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Discussion

Den intrikate dynamikken til spatiotemporal nevronaktivitet, som kommer fra sammenkoblede nevronale ensembler, har lenge vært gjenstand for intriger i nevrovitenskap. Tradisjonelle metoder, som patch-clamp, standard MEA og Ca2+ bildebehandling, har gitt verdifull innsikt i hjernens kompleksitet. Imidlertid kommer de ofte til kort når det gjelder å fange opp den omfattende nettverksomfattende beregningsdynamikken 21,22,23. Den tekniske protokollen til HD-MEA-plattformen, som beskrevet i denne JoVE-studien, representerer et betydelig sprang fremover, og tilbyr panoramautsikt over nevral dynamikk på tvers av ulike modaliteter, fra cellesammensetninger til ekspansive nettverk (dvs. akutte, ex vivo musehjerneskiver og in vitro humane iPSC-nettverk)26,29,30,32.

Akutte, ex-vivo musehjerneskiver har vært et grunnleggende verktøy i nevronforskning, og letter molekylære og kretsnivåundersøkelser 6,7. Utfordringen med å opprettholde vevets levedyktighet har imidlertid vært en vedvarende flaskehals. Protokollen som er avgrenset i denne studien introduserer kritiske modifikasjoner for å optimalisere kvaliteten og levetiden til disse skivene for å utnytte fordelene på HD-MEA-plattformen. Denne protokollen understreker viktigheten av - i) Oppnå skiveuniformitet, der bruk av en vibratome foretrekkes fremfor en vevshakker på grunn av dens presisjon og minimale vevskader, til tross for avveiningen av lengre kuttetider. ii) Sikre konstant karbogenasjon gjennom hele prosessen, fra ekstraksjon til opptak, for å opprettholde vevets levedyktighet. iii) Regulere temperatur og tillate tilstrekkelig restitusjonstid før opptak. iv) Bruk av en agaroseblokk eller mugg for å stabilisere hjernen, forhindre riving og minimere limkontakt. v) Opprettholde optimale strømningshastigheter av karbogenert aCSF i HD-MEA-reservoaret for å sikre skivehelsen samtidig som man unngår problemer som frakobling, støy og drift (tabell 2).

For både musehjerneskiver og humane iPSC-preparater er forbedring av elektrodevevgrensesnittkobling avgjørende 30,46,47. Vår protokoll understreker viktigheten av å utnytte det adhesjonsfremmende molekylet Poly-dl-ornitin (PDLO). Dette molekylet øker ikke bare overflaten for å oppdage elektriske signaler, men øker også elektrisk ledningsevne46. Ved å gjøre det, fremmer det cellulær adhesjon, vekst og utvikling av funksjonelle nettverksegenskaper. Slik optimalisering spiller en sentral rolle i å øke effektiviteten til HD-MEA-plattformen. Dette sikrer i sin tur nøyaktig og konsistent analyse av mikroskala ex vivo og in vitro connectomes og deres spatiotemporale avfyringssekvenser. Spesielt har PDLO vist seg å overgå andre substrater som polyetylenimin (PEI) og poly-l-ornitin (PLO) for å fremme spontan avfyringsaktivitet og respons på elektriske stimuli i nevronkulturer. I tillegg har PDLO blitt brukt til overflatefunksjonalisering på HD-MEA og vist seg å forbedre elektrodeskjæringskoblingsgrensesnittet og øke signal-støy-forholdet i både OB- og HC-skiver26,29. Tillegget av et spesialbygd platinaanker forsterker elektrodeskivegrensesnittkoblingen ytterligere, noe som fører til opptak med høyere signal-til-støy-forhold.

Bruken av HD-MEA for både ex-vivo musehjerneskiver og in vitro humane iPSC-nettverk introduserer en metode som er dyktig til å utforske omfattende, multiskala og multimodal dynamikk. Denne innovative tilnærmingen bringer imidlertid frem betydelige utfordringer, spesielt i datahåndtering 48,49,50,51. Et enkelt HD-MEA-opptak tatt med 18 kHz/elektrodesamplingsfrekvens genererer svimlende 155 MB/s med data. Datavolumet eskalerer raskt når man tar hensyn til flere skiver, forskjellige farmakologiske forhold eller langvarige registreringsperioder. En slik tilstrømning av informasjon krever robuste lagringsinfrastrukturer og avanserte beregningsverktøy for strømlinjeformet behandling. HD-MEA-plattformens evne til samtidig å samle inn data fra tusenvis av nevronale ensembler er både en velsignelse og et hinder. Det gir suveren innsikt i beregningsdynamikken til hjernefunksjoner, men det krever også et raffinert analytisk rammeverk. I denne JoVE-protokollen har vi gitt eksempler på beregningsstrategier, inkludert storskala hendelsesdeteksjon, klassifisering, grafteori, frekvensanalyse og maskinlæring. Disse metodene understreker den intensive innsatsen som er gjort for å takle utfordringene ved å analysere komplekse nevrale data. Likevel er det fortsatt betydelig rom for utvikling av mer avanserte beregningsverktøy for å analysere disse flerdimensjonale nevrale datasettene. Bevæpnet med passende verktøy og metoder, er potensialet til HD-MEA-plattformen forstørret, og gir dyp innsikt i vanskelighetene med hjernefunksjoner under både sunne og patologiske forhold.

I hovedsak tilbyr HD-MEA-plattformen, når den integreres med de detaljerte protokollene og beregningsverktøyene som diskuteres, en transformativ tilnærming til å forstå hjernens intrikate arbeid. Ved å fange storskala, multiskala og multimodal dynamikk, gir den uvurderlig innsikt i prosesser som læring, hukommelse og informasjonsbehandling. Videre har anvendelsen i in vitro humane iPSC-nettverk potensialet til å revolusjonere legemiddelscreening og personlig medisin. Selv om denne plattformen representerer et betydelig fremskritt innen nevrovitenskapelig forskning, er det imidlertid avgjørende å erkjenne og adressere de iboende tekniske utfordringene. Med kontinuerlig forbedring og integrering av avanserte beregningsverktøy, står HD-MEA-plattformen klar til å innlede en ny epoke med presise diagnostiske verktøy, identifisering av spesifikke biomarkører og målrettede terapier for nevrologiske lidelser.

Disclosures

Forfatterne oppgir ingen konkurrerende eller økonomiske interesser.

Acknowledgments

Denne studien ble støttet av institusjonelle midler (DZNE), Helmholtz Association innenfor Helmholtz Validation Fund (HVF-0102), og Dresden International Graduate School for biomedisin og bioteknologi (DIGS-BB). Vi vil også gjerne anerkjenne plattformen for atferdsdyrtesting ved DZNE-Dresden (Alexander Garthe, Anne Karasinsky, Sandra Günther og Jens Bergmann) for deres støtte. Vi ønsker å erkjenne at en del av figur 1 ble opprettet ved hjelp av plattformen BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
150 mm Glass Petri Dish generic generic Brain Preparation Workspace, Brain Slice Recording Workspace
0.22 μm Sterile Filter Unit  Assorted Assorted Assorted
90 mm Plastic Culture Dish TPP 93100 Brain Preparation Workspace, Brain Slice Recording Workspace
Agarose Roth 6351.5 Brain Preparation Workspace
Agarose Mold CUSTOM CUSTOM Brain Preparation Workspace; Custom designed 3D Printer Design, available upon request
Aluminum Foil generic generic Brain Extraction Workspace
Anesthesia chamber generic generic Brain Extraction Workspace; Assorted Beaker, Bedding etc
Ascorbic Acid Sigma Aldrich A4544-25G Solution Preparation Workspace
Assorted Beakers generic generic Solution Preparation Workspace; 50 mL
Assorted Luers Cole Parmer 45511-00 Brain Slice Recording Workspace
Assorted Volumetric flasks generic generic Solution Preparation Workspace; 500 mL, 1 L
B27 Supplement Life Technologies 17504-044 BrainXell Commercial Supplier Protocol
BDNF Peprotech 450-02 BrainXell Commercial Supplier Protocol
Biological Safety Cabinet with UV Lamp Assorted Assorted HD-MEA Coating, Plating, Mainainance Workspace
BrainPhys Neuronal Medium  STEMCELL Technologies  05790  CDI, and BrainXell Commerical Supplier Protocol
Brainwave Software 3Brain AG Version 4 Brain Slice and Human iPSC Recording Workspace
BrainXell Glutamatergic Neuron Assay  BrainXell  BX-0300  BrainXell Commercial Supplier Protocol
CaCl2 Sigma Aldrich 21115-100ML Solution Preparation Workspace
Carbogen generic generic All Workspaces; 95%/5% O2 and CO2 mixture
Cell Culture Incubator  Assorted Assorted Assorted
CMOS-based HD-MEA chip 3Brain AG CUSTOM Brain Slice and Human iPSC Recording Workspace
Conical Tubes, 50 mL, Falcon (Centrifuge Tubes)  STEMCELL Technologies  38010  CDI Commerical Supplier Protocol
Crocodile Clip Grounding Cables JWQIDI B06WGZG17W Brain Slice Recording Workspace
Curved Forceps FST 11052-10 Brain Extraction Workspace
DMEM/F12 Medium Life Technologies  11330-032 BrainXell Commercial Supplier Protocol
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline without Ca2+ and Mg2+ (D-PBS) STEMCELL Technologies  37350  CDI Commerical Supplier Protocol
Filter Paper Macherey-Nagel 531 011 Brain Preparation Workspace
Fine Brush Leonhardy 773 Brain Slice Preparation Workspace, Brain Slice Recording Workspace
Forceps VITLAB 67895 Brain Slice Recording Workspace
GDNF Peprotech 450-10 BrainXell Commercial Supplier Protocol
Geltrex Life Technologies A1413201 BrainXell Commercial Supplier Protocol
Glass pasteur pipette Roth 4518 Brain Slice Preparation Workspace, Brain Slice Recording Workspace
Glucose Sigma Aldrich G7021-1KG Solution Preparation Workspace
GlutaMAX Life Technologies 35050-061 BrainXell Commercial Supplier Protocol
Gravity-based Perfusion System ALA VC3-8xG Brain Slice Recording Workspace
HD-MEA Recording platform 3Brain AG CUSTOM Brain Slice and Human iPSC Recording Workspace
Heater Warner Instruments TC-324C Brain Slice Recording Workspace
Hemocytometer or Automated Cell Counter Assorted Assorted HD-MEA Coating, Plating, Mainainance Workspace
Hypo Needles Warner Instruments 641489 Brain Slice Recording Workspace
iCell GlutaNeurons Kit, 01279  CDI R1061  CDI Commerical Supplier Protocol
Iris Scissors Vantage V95-304 Brain Extraction Workspace
Isoflurane Baxter HDG9623 Brain Extraction Workspace
KCl Sigma Aldrich P5405-250G Solution Preparation Workspace
Laminin  Sigma-Aldrich  L2020  CDI Commerical Supplier Protocol
Liquid Nitrogen Storage Unit  Assorted Assorted HD-MEA Coating, Plating, Mainainance Workspace
Magnetic Stirrer generic generic Solution Preparation Workspace
Metal Screws Thorlabs HW-KIT2/M Brain Slice Recording Workspace
MgCl2 Sigma Aldrich M1028-100ML Solution Preparation Workspace
MgSO4 Sigma Aldrich 63138-250G Solution Preparation Workspace
Microdissection Tool Holder  Braun 4606108V Brain Slice Preparation Workspace, Brain Slice Recording Workspace
Microdissection Tool Needle Braun  9186166 Brain Slice Preparation Workspace, Brain Slice Recording Workspace
Modular Stereomicroscope Leica CUSTOM Brain Slice Recording Workspace; custom specifications and modifications
N2 Supplement Life Technologies 17502-048 CDI, and BrainXell Commercial Supplier Protocol
NaCl Sigma Aldrich S3014-1KG Solution Preparation Workspace
NaH2PO4 Sigma Aldrich S0751-100G Solution Preparation Workspace
NaHCO3 Sigma Aldrich S5761-500G Solution Preparation Workspace
Neurobasal Medium  Life Technologies 21103-049 BrainXell Commercial Supplier Protocol
Optical Cage System Thorlabs Assorted Brain Slice Recording Workspace
Optical Table w/Breadboard Thorlabs SDA7590 Brain Slice Recording Workspace
PDLO Sigma Aldrich P0671 HD-MEA Coating, Brain Slice Recording Workspace
Penicillin-streptomycin, 100x  Thermo Fisher Scientific  15140-122  CDI Commerical Supplier Protocol
Pipette tips TipONE S1120-8810 Brain Slice Recording Workspace
Pipettors  Assorted Assorted Assorted
Platinum Anchor CUSTOM CUSTOM Brain Slice Recording Workspace
Polyethylene Tubing Assorted Assorted Brain Slice Recording Workspace
Pump MasterFlex 78018-22 Brain Slice Recording Workspace
Razor Blade Apollo 10179960 Brain Preparation Workspace
Reference Electrode Cell Culture Cap CUSTOM CUSTOM Human iPSC Recording Workspace; Custom designed 3D Printer Design, available upon request
Rubber Pipette Bulb Duran Wheaton Kimble 292000205 Brain Slice Preparation Workspace, Brain Slice Recording Workspace
Serological Pipettes, 1 mL, 2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL Assorted Assorted Assorted
Slice Recovery Chamber CUSTOM CUSTOM Brain Slice Recovery Workspace; Custom designed 3D Printer Design, available upon request
Spatula ISOLAB 047.06.150 Brain Preparation Workspace
Sucrose Sigma Aldrich 84100-1KG Solution Preparation Workspace
Super Glue UHU 358221 Brain Slice Preparation Workspace
Surgical Scissors Peters Instruments BC 344 Brain Extraction Workspace
Tabletop Centrifuge  Assorted Assorted Assorted
TGF-β1 Peprotech 100-21C BrainXell Commercial Supplier Protocol
Tissue Paper generic generic Brain Extraction Workspace
Trypan Blue STEMCELL Technologies  07050  CDI Commerical Supplier Protocol
Upright Microscope Olympus CUSTOM Imaging Workspace; Custom specifications and modifications
Vacusip Integra 159010 Brain Slice Recording Workspace
Vibratome Leica VT1200s Brain Slice Preparation Workspace; Includes: Specimen plate, buffer tray, ice tray, specimen plate holding tool, vibratome blade adjusting tool
Vibratome Blade Personna N/A Brain Slice Preparation Workspace
Water Bath Lauda L000595 Brain Slice Recovery Workspace

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hebb, D. O. The Organization of Behavior; A Neuropsychological Theory. , Wiley. New York. (1949).
  2. Cossart, R., Garel, S. Step by step: cells with multiple functions in cortical circuit assembly. Nat Rev Neurosci. 23, 395-410 (2022).
  3. Carrillo-Reid, L., Yuste, R. Playing the piano with the cortex: role of neuronal ensembles and pattern completion in perception and behavior. Curr Opin Neurobiol. 64, 89-95 (2020).
  4. Buzsáki, G. Large-scale recording of neuronal ensembles. Nat Neurosci. 7, 446-451 (2004).
  5. Buzsáki, G. Neural Syntax: Cell assemblies, synapsembles, and readers. Neuron. 68 (3), 362-385 (2010).
  6. Huang, Y., Williams, J. C., Johnson, S. M. Brain slice on a chip: opportunities and challenges of applying microfluidic technology to intact tissues. Lab Chip. 12 (12), 2103-2117 (2012).
  7. Cho, S., Wood, A., Bowlby, M. Brain slices as models for neurodegenerative disease and screening platforms to identify novel therapeutics. Curr Neuropharmacol. 5 (1), 19-33 (2007).
  8. Bliss, T. V. P., Collingridge, G. L. A synaptic model of memory: long-term potentiation in the hippocampus. Nature. 361, 31-39 (1993).
  9. Anderson, P., Morris, R., Amaral, D., Bliss, T., O'Keefe, L. The Hippocampus Book. , Oxford University Press. New York. (2006).
  10. Lisman, J., et al. Viewpoints: how the hippocampus contributes to memory, navigation and cognition. Nat Neurosci. 20, 1434-1447 (2017).
  11. Mori, K., Nagao, H., Yoshihara, Y. The olfactory bulb: Coding and processing of odor molecule information. Science. 286 (5440), 711-715 (1999).
  12. Buck, L., Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: A molecular basis for odor recognition. Cell. 65 (1), 175-187 (1991).
  13. Bushdid, C., Magnasco, M. O., Vosshall, L. B., Keller, A. Humans can discriminate more than 1 trillion olfactory stimuli. Science. 343 (6177), 1370-1372 (2014).
  14. Kempermann, G. Why new neurons? Possible functions for adult hippocampal neurogenesis. J Neurosci. 23 (3), 635-638 (2003).
  15. Aimone, J. B., Wiles, J., Gage, F. H. Computational influence of adult neurogenesis on memory encoding. Neuron. 61 (2), 187-202 (2009).
  16. Nithianantharajah, J., Hannan, A. J. Enriched environments, experience-dependent plasticity and disorders of the nervous system. Nat Rev Neurosci. 7, 697-709 (2006).
  17. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  18. Espuny-Camacho, I., et al. Pyramidal neurons derived from human pluripotent stem cells integrate efficiently into mouse brain circuits in vivo. Neuron. 77 (3), 440-456 (2013).
  19. Rajamohan, D., et al. Current status of drug screening and disease modelling in human pluripotent stem cells. Bioessays. 35 (3), 281-298 (2013).
  20. Heilker, R., Traub, S., Reinhardt, P., Schöler, H. R., Sterneckert, J. iPS cell derived neuronal cells for drug discovery. Trends Pharmacol Sci. 35 (10), 510-519 (2014).
  21. Zhao, S. R., Mondéjar-Parreño, G., Li, D., Shen, M., Wu, J. C. Technical applications of microelectrode array and patch clamp recordings on human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. J Vis Exp. (186), e64265 (2022).
  22. Hamill, O. P., McBride, D. W. Induced membrane hypo/hyper-mechanosensitivity: A limitation of patch-clamp recording. Annu Rev Physiol. 59, 621-631 (1997).
  23. Manz, K. M., Siemann, J. K., McMahon, D. G., Grueter, B. A. Patch-clamp and multi-electrode array electrophysiological analysis in acute mouse brain slices. STAR Protoc. 2 (2), 100442 (2021).
  24. Lee, C. H., Park, Y. K., Lee, K. Recent strategies for neural dynamics observation at a larger scale and wider scope. Biosens Bioelectron. 240, 115638 (2023).
  25. Urai, A. E., Doiron, B., Leifer, A. M., Churchland, A. K. Large-scale neural recordings call for new insights to link brain and behavior. Nat Neurosci. 25 (1), 11-19 (2022).
  26. Hu, X., Khanzada, S., Klütsch, D., Calegari, F., Amin, H. Implementation of biohybrid olfactory bulb on a high-density CMOS-chip to reveal large-scale spatiotemporal circuit information. Biosens Bioelectron. 198, 113834 (2022).
  27. Amin, H., Marinaro, F., Tonelli, D. D. P., Berdondini, L. Developmental excitatory-to-inhibitory GABA-polarity switch is disrupted in 22q11.2 deletion syndrome: A potential target for clinical therapeutics. Sci Rep. 7 (1), 15752 (2017).
  28. Amin, H., Nieus, T., Lonardoni, D., Maccione, A., Berdondini, L. High-resolution bioelectrical imaging of Aβ-induced network dysfunction on CMOS-MEAs for neurotoxicity and rescue studies. Sci Rep. 7 (1), 2460 (2017).
  29. Emery, B. A., Hu, X., Khanzada, S., Kempermann, G., Amin, H. High-resolution CMOS-based biosensor for assessing hippocampal circuit dynamics in experience-dependent plasticity. Biosens Bioelectron. 237, 115471 (2023).
  30. Amin, H., et al. Electrical responses and spontaneous activity of human iPS-derived neuronal networks characterized for 3-month culture with 4096-electrode arrays. Front Neurosci. 10, 121 (2016).
  31. Lonardoni, D., et al. Recurrently connected and localized neuronal communities initiate coordinated spontaneous activity in neuronal networks. PLoS Comput Biol. 13 (7), e1005672 (2017).
  32. Emery, B. A., et al. Large-scale multimodal recordings on a high-density neurochip: Olfactory bulb and hippocampal networks. 2022 44th Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine & Biology Society (EMBC). , Glasgow, Scotland, United Kingdom. 3111-3114 (2022).
  33. Rossi, L., Emery, B. A., Khanzada, S., Hu, X., Amin, H. Pharmacologically and electrically-induced network-wide activation of olfactory bulb with large-scale biosensor. 2023 IEEE BioSensors Conference (BioSensors). , London, United Kingdom. 1-4 (2023).
  34. Emery, B. A., et al. Recording network-based synaptic transmission and LTP in the hippocampal network on a large-scale biosensor. 2023 IEEE BioSensors Conference (BioSensors). , London, United Kingdom. 1-4 (2023).
  35. Hierlemann, A., Frey, U., Hafizovic, S., Heer, F. Growing cells atop microelectronic chips: Interfacing electrogenic cells in vitro with CMOS-based microelectrode arrays). Proceedings of the IEEE. 99 (2), 252-284 (2011).
  36. Berdondini, L., et al. Active pixel sensor array for high spatio-temporal resolution electrophysiological recordings from single cell to large scale neuronal networks. Lab Chip. 9, 2644-2651 (2009).
  37. Siegle, J. H., Hale, G. J., Newman, J. P., Voigts, J. Neural ensemble communities: open-source approaches to hardware for large-scale electrophysiology. Curr Opin Neurobiol. 32, 53-59 (2015).
  38. Amin, H., Maccione, A., Zordan, S., Nieus, T., Berdondini, L. High-density MEAs reveal lognormal firing patterns in neuronal networks for short and long term recordings. 2015 7th International IEEE/EMBS Conference on Neural Engineering (NER). , Montpellier, France. 1000-1003 (2015).
  39. Altuntac, E., et al. Bottom-up neurogenic-inspired computational model. 2023 IEEE BioSensors Conference (BioSensors). , London, United Kingdom. 1-4 (2023).
  40. Maccione, A., et al. A novel algorithm for precise identification of spikes in extracellularly recorded neuronal signals. J Neurosci Methods. 177 (1), 241-249 (2009).
  41. Welch, P. D. The use of fast Fourier transform for the estimation of power spectra: A method based on time averaging over short, modified periodograms. IEEE Transactions on Audio and Electroacoustics. 15 (2), 70-73 (1967).
  42. Eggermont, J. J., Munguia, R., Pienkowski, M., Shaw, G. Comparison of LFP-based and spike-based spectro-temporal receptive fields and cross-correlation in cat primary auditory cortex. PLoS One. 6 (5), e20046 (2011).
  43. Damos, P. Using multivariate cross correlations, Granger causality and graphical models to quantify spatiotemporal synchronization and causality between pest populations. BMC Ecol. 16, 33 (2016).
  44. Kaminski, M. J., Blinowska, K. J. A new method of the description of the information flow in the brain structures. Biol Cybern. 65, 203-210 (1991).
  45. Pastore, V. P., Massobrio, P., Godjoski, A., Martinoia, S. Identification of excitatory-inhibitory links and network topology in large-scale neuronal assemblies from multi-electrode recordings. PLoS Comput Biol. 14 (8), e1006381 (2018).
  46. Amin, H., Dipalo, M., De Angelis, F., Berdondini, L. Biofunctionalized 3D nanopillar arrays fostering cell guidance and promoting synapse stability and neuronal activity in networks. ACS Appl Mater Interfaces. 10 (17), 15207-15215 (2018).
  47. Woeppel, K., Yang, Q., Cui, X. T. Recent advances in neural electrode-tissue interfaces. Curr Opin Biomed Eng. 4, 21-31 (2017).
  48. Steinmetz, N. A., Koch, C., Harris, K. D., Carandini, M. Challenges and opportunities for large-scale electrophysiology with Neuropixels probes. Curr Opin Neurobiol. 50, 92-100 (2018).
  49. Siegle, J. H., Hale, G. J., Newman, J. P., Voigts, J. Neural ensemble communities: open-source approaches to hardware for large-scale electrophysiology. Curr Opin Neurobiol. 32, 53-59 (2015).
  50. Freeman, J. Open source tools for large-scale neuroscience. Curr Opin Neurobiol. 32, 156-163 (2015).
  51. Stevenson, I. H., Kording, K. P. How advances in neural recording affect data analysis. Nat Neurosci. 14 (2), 139-142 (2011).

Tags

Denne måneden i JoVE utgave 205 HD-MEA storskala nevrale opptak nevrale kretser / nettverk hippocampus-kortikale skiver olfaktoriske pæreskiver iPSC-nevroner vev-elektrodegrensesnitt connectom grafteori cellesamlinger beregningsorientert nevrovitenskap kunstig intelligens maskinlæring
Opptak og analyse av multimodal storskala nevronal ensembledynamikk på CMOS-integrert mikroelektrode med høy tetthet
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Emery, B. A., Khanzada, S., Hu, X.,… More

Emery, B. A., Khanzada, S., Hu, X., Klütsch, D., Amin, H. Recording and Analyzing Multimodal Large-Scale Neuronal Ensemble Dynamics on CMOS-Integrated High-Density Microelectrode Array. J. Vis. Exp. (205), e66473, doi:10.3791/66473 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter