Summary
여기서는 HD-MEA를 사용하여 대규모 신경 앙상블, 특히 해마, 후각 전구 회로 및 인간 신경 네트워크의 계산 역학을 탐구합니다. 계산 도구와 결합된 시공간 활동을 캡처하면 신경 앙상블 복잡성에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 이 방법은 뇌 기능에 대한 이해를 높여 잠재적으로 신경 장애에 대한 바이오마커 및 치료법을 식별합니다.
Abstract
대규모 뉴런 네트워크와 복잡한 분산 미세 회로는 시공간 뉴런 활동 패턴에서 나타나는 지각, 인지 및 행동을 생성하는 데 필수적입니다. 상호 연결된 뉴런 앙상블의 작용 그룹에서 발생하는 이러한 동적 패턴은 다중 스케일 신경 정보를 처리하고 코딩하기 위한 정확한 계산을 용이하게 하여 더 높은 뇌 기능을 유도합니다. 이러한 복잡성의 기저에 있는 신경 역학의 계산 원리를 조사하고 건강과 질병에 대한 생물학적 과정의 다중 스케일 영향을 조사하기 위해 대규모 동시 기록이 중요한 도구가 되었습니다. 여기에서 고밀도 미세전극 어레이(HD-MEA)는 생체 외 쥐 뇌 절편의 해마 및 후각 전구 회로와 인간 유도 만능 줄기 세포(iPSC)의 체외 세포 배양에서 얻은 신경 네트워크의 두 가지 신경 역학 방식을 연구하는 데 사용됩니다. 4096개의 미세전극이 있는 HD-MEA 플랫폼은 높은 시공간 분해능에서 동시에 수천 개의 신경 앙상블에서 세포 외 발화 패턴을 비침습적, 다중 사이트, 무표지 기록할 수 있습니다. 이 접근 방식을 통해 단일/다중 장치 스파이킹 활동 패턴 및 국부장 전위 진동을 포함한 여러 전기생리학적 네트워크 전반의 특징을 특성화할 수 있습니다. 이러한 다차원 신경 데이터를 면밀히 조사하기 위해 기계 학습 알고리즘, 자동 이벤트 감지 및 분류, 그래프 이론 및 기타 고급 분석을 통합하는 여러 계산 도구를 개발했습니다. 이 플랫폼으로 이러한 계산 파이프라인을 보완함으로써 셀 어셈블리에서 네트워크에 이르기까지 대규모, 다중 스케일 및 다중 모드 역학을 연구하기 위한 방법론을 제공합니다. 이것은 잠재적으로 건강과 질병의 복잡한 뇌 기능과 인지 과정에 대한 우리의 이해를 발전시킬 수 있습니다. 오픈 사이언스에 대한 헌신과 대규모 계산 신경 역학에 대한 통찰력은 뇌에서 영감을 받은 모델링, 뉴로모픽 컴퓨팅 및 신경 학습 알고리즘을 향상시킬 수 있습니다. 또한, 손상된 대규모 신경 계산과 상호 연결된 미세 회로 역학의 기본 메커니즘을 이해하면 특정 바이오마커를 식별하여 신경 장애에 대한 보다 정확한 진단 도구 및 표적 치료법을 위한 길을 열 수 있습니다.
Introduction
종종 세포 어셈블리라고 불리는 뉴런 앙상블(neuronal ensemble)은 뉴럴 코딩(neural coding)에서 중추적인 역할을 하며, 다중 스케일 신경 정보 1,2,3을 처리하기 위한 복잡한 계산을 용이하게 한다. 이러한 앙상블은 광범위한 신경 네트워크와 미묘한 미세 회로의 형성을 뒷받침합니다4. 이러한 네트워크와 진동 패턴은 지각과 인지를 포함한 고급 뇌 기능을 주도합니다. 광범위한 연구가 특정 뉴런 유형과 시냅스 경로를 탐구했지만, 뉴런이 어떻게 협력적으로 세포 어셈블리를 형성하고 회로와 네트워크 전반에 걸쳐 시공간 정보 처리에 영향을 미치는지에 대한 더 깊은 이해는 여전히 어려운 상태로 남아 있다5.
급성, 생체 외 뇌 절편은 온전한 신경 회로를 연구하기 위한 중추적인 전기 생리학적 도구로, 신경 기능, 시냅스 전달 및 연결성의 진동 활동 패턴을 조사하기 위한 제어된 설정을 제공하며, 약리학적 테스트 및 질병 모델링에 영향을 미칩니다 6,7,8. 이 연구 프로토콜은 학습 및기억 과정에 관여하는 해마-피질(HC)과 냄새 감별을 담당하는 후각구(OB) 11,12,13의 두 가지 주요 뇌 회로를 강조합니다. 이 두 영역에서, 포유류의 뇌에서 일생 동안 성체 신경 발생에 의해 새로운 기능적 뉴런이 지속적으로 생성된다14. 두 회로 모두 기존 신경망을 재배선하는 데 참여하고 필요할 때 대체 정보 처리 전략을 용이하게 하는 다차원 동적 신경 활동 패턴과 고유한 가소성을 보여줍니다15,16.
급성 생체 외 뇌 절편 모델은 뇌 기능을 탐구하고 미세 회로 수준에서 질병 메커니즘을 이해하는 데 필수적입니다. 그러나 인간 유도만능줄기세포(iPSC) 신경망에서 유래한 체외 세포 배양은 동물 실험의 결과를 잠재적인 인간 임상 치료에 원활하게 연결하는 중개 연구의 유망한 길을 제공합니다17,18. 이러한 인간 중심의 체외 분석은 약리학적 독성을 평가하고, 정확한 약물 스크리닝을 가능하게 하며, 혁신적인 세포 기반 치료 전략에 대한 연구를 심화하기 위한 신뢰할 수 있는 플랫폼 역할을 합니다19,20. iPSC 신경 세포 모델의 중추적인 역할을 인식하여, 당사는 이 프로토콜 연구의 세 번째 모듈을 통해 파생된 네트워크의 기능적 특성을 철저히 조사하고 관련 세포 배양 프로토콜을 미세 조정했습니다.
이러한 전기 발생 신경 모듈은 일반적으로 칼슘(Ca2+ 이미징), 패치 클램프 기록 및 저밀도 미세 전극 어레이(LD-MEA)와 같은 기술을 사용하여 연구되었습니다. Ca2+ 이미징은 단일 세포 활동 매핑을 제공하지만, 낮은 시간 분해능과 장기 기록의 어려움으로 인해 방해를 받는 세포 표지 기반 방법입니다. LD-MEA는 공간 정밀도가 부족한 반면, 패치 클램프는 침습적인 단일 부위 기술이며 힘들기 때문에 성공률이 낮은 경우가 많습니다 21,22,23. 이러한 문제를 해결하고 네트워크 전반의 활동을 효과적으로 조사하기 위해 대규모 동시 신경 기록은 뇌 복잡성의 기저에 있는 신경 역학의 계산 원리와 건강 및 질병에 미치는 영향을 이해하기 위한 중추적인 접근 방식으로 부상했습니다24,25.
이 JoVE 프로토콜에서는 생체 외 쥐 뇌 급성 절편(그림 1A-C)의 해마 및 후각 전구 회로(그림 1A-C) 및 체외 인간 iPSC 유래 신경 네트워크(그림 1D-E)를 포함한 다양한 뇌 양식에 걸쳐 시공간 신경 활동을 캡처하기 위한 고밀도 MEA(HD-MEA)를 기반으로 하는 대규모 신경 기록 방법을 시연합니다,27,28,29,30,31,32,33,34,35입니다. CMOS(Complementary-Metal-Oxide-Semiconductor) 기술을 기반으로 하는 HD-MEA는 온칩 회로 및 증폭을 자랑하며 7mm2 어레이 크기36에서 밀리초 미만의 기록이 가능합니다. 이 비침습적 접근법은 높은 시공간 분해능에서 4096개의 미세전극을 사용하여 수천 개의 신경 앙상블에서 동시에 다중 부위, 표지가 없는 세포외 발사 패턴을 캡처하여 국소전위(LFP) 및 다단위 스파이킹 활성(MUA)26,29의 복잡한 역학을 보여줍니다.
이 방법론에 의해 생성된 데이터의 방대함을 감안할 때, 정교한 분석 프레임워크가 필수적이지만37. 우리는 자동 이벤트 감지, 분류, 그래프 이론, 기계 학습 및 기타 고급 기술을 포괄하는 계산 도구를 개발했습니다(그림 1F)26,29,38,39). HD-MEA를 이러한 분석 도구와 통합하면 개별 세포 어셈블리에서 다양한 신경 양식에 걸쳐 더 광범위한 신경망에 이르는 복잡한 역학을 조사하기 위한 전체론적 접근 방식이 고안되었습니다. 이러한 결합된 접근법은 정상적인 뇌 기능의 계산 역학에 대한 우리의 이해를 심화시키고 병리학적 조건에 존재하는 이상에 대한 통찰력을 제공한다28. 또한 이 접근 방식의 통찰력은 뇌에서 영감을 받은 모델링, 뉴로모픽 컴퓨팅 및 신경 학습 알고리즘의 발전을 촉진할 수 있습니다. 궁극적으로 이 방법은 신경망 교란 이면의 핵심 메커니즘을 밝히고, 잠재적으로 바이오마커를 식별하고, 신경 질환에 대한 정확한 진단 도구 및 표적 치료법을 만드는 데 도움이 될 수 있습니다.
Protocol
모든 실험은 해당 유럽 및 국가 규정(Tierschutzgesetz)에 따라 수행되었으며 지역 당국(Landesdirektion Sachsen; 25-5131/476/14)의 승인을 받았습니다.
1. HD-MEA의 해마-피질 및 후각 전구 회로에서 생체 외 뇌 절편
- 실험적 절단 및 기록 용액 준비(그림 2A)
- 실험 당일에는 0.5L의 고자당 절단액과 1L의 인공 뇌척수액(aCSF) 기록 용액을 준비합니다(표 1A,B).
- 모든 고체 화학 물질을 건조한 부피 플라스크에 넣은 다음 이중 증류수(dd)로 일부를 채웁니다.
- 1M 원액에서 MgCl2 및 CaCl2 를 첨가한 다음 나머지를 dd 물로 채웁니다. 눈에 보이는 고체가 ~5분 동안 용해될 때까지 자석 교반기로 계속 저어주기 시작합니다.
- 어는점 삼투압계를 사용하여 고자당 절단 용액의 경우 350-360mOsm, aCSF 기록 용액의 경우 315-325mOsm 사이의 삼투압을 검증합니다.
- pH 측정기를 사용하여 고자당 절단 용액의 경우 7.3-7.4, aCSF 기록 용액의 경우 7.25-7.35 사이의 pH를 검증합니다. 95 % O2 및 5 % CO2 로 연속 버블 링을 시작합니다.
- 슬라이싱하기 전에 고자당 절단 용액을 얼음 위에 최소 30분 동안 놓고 95%O2 및 5%CO2로 연속 버블링을 시작합니다.
- 10분 동안 탄화한 후 50mL 비커에 30mL 절단 용액을 채우고 냉동실(-20°C)에서 20-30분 동안 또는 부분적으로 얼 때까지 보관합니다.
참고: 모든 용액은 각 실험에 대해 신선하게 준비해야 합니다. 여기에 사용된 dd 물은 상온(RT)에서 저장된 고압멸균된 초순수입니다. 준비된 솔루션의 양은 특정 연구 질문에 맞게 조정되어야 합니다.
- 실험 당일에는 0.5L의 고자당 절단액과 1L의 인공 뇌척수액(aCSF) 기록 용액을 준비합니다(표 1A,B).
- 브레인 슬라이스 작업 공간 준비(그림 2A)
- 동물을 실험실로 데려오세요.
참고: 이 프로토콜에서, 8-16주 된 C57BL/J6 암컷 마우스를 앞서 기술한 바와 같이 사용하였다 26,29,32. 동물은 운송 후 최소 30분 동안 적응할 수 있어야 합니다. 장거리 이동(즉, 기관 간)은 실험과 같은 날에 피해야 합니다. 동물의 나이, 성별 및 균주는 특정 연구 질문에 따라 결정되어야 합니다. - 동물이 적응하고 고자당 용액이 식는 동안 필요한 도구를 지정된 각 작업 공간에 놓습니다( 재료 표 참조).
- 브레인 슬라이스 복구 및 유지 관리 작업 공간을 준비합니다. 슬라이스 회수 챔버를 탄화된 aCSF 기록 용액으로 채우고 챔버를 32°C로 설정된 수조에 넣습니다. 실험 전반에 걸쳐 지속적인 탄산화를 유지합니다.
- 브레인 슬라이스 준비 작업 공간을 준비합니다. 비브라톰 설정 - 비브라톰 블레이드 홀더에 블레이드를 놓고 비브라톰을 올바른 설정(블레이드 이동 속도: 0.20mm/s, 높이 진폭: 95μm, 블레이드 각도: 45°)으로 보정합니다. 비브라톰 얼음 트레이에 얼음을 채우고 버퍼 트레이에 고자당 절단 용액을 채우고 버퍼 트레이에서 용액을 탄화하기 시작합니다.
- 두뇌 준비 작업 공간을 준비합니다. 150mm 유리 페트리 접시에 얼음을 채우고 내부에 여과지가 있는 90mm 플라스틱 배양 접시를 놓습니다. 플라스틱 배양 접시에 고자당 절단 용액을 채우고 탄수화를 시작합니다. 식힌 표본 플레이트에 초강력 접착제 한 방울을 추가하고 아가로스 몰드를 부착합니다.
참고: 아가로스 곰팡이는 맞춤형 마우스 뇌 곰팡이에서 물에 3% 아가로스로 적어도 전날 준비됩니다. - 마지막으로 뇌 추출 작업 공간을 준비합니다. 알루미늄 호일을 티슈 페이퍼로 덮고 고자당 절단 용액 슬러시가 들어 있는 50mL 비커를 꺼내 마취실에 이소플루란을 추가합니다.
알림: 마취는 동물을 배치하기 ~1분 전에 마취실에 추가됩니다. 30mL의 고자당 절단 용액 슬러시가 포함된 50mL 비커는 참수 ~20분 전에 -20°C 냉동고에서 제거됩니다.
- 동물을 실험실로 데려오세요.
- 쥐 뇌의 추출 및 절단
알림: 이 전체 절차는 뇌에 산소 공급이 부족하지 않도록 가능한 한 빨리 수행해야 합니다. 뇌 제거는 참수에서 고자당 절단 용액 슬러시에 담그는 데 1-2분밖에 걸리지 않습니다.- 적절한 용량의 이소플루란(0.5mL/1L 마취실)으로 동물을 마취합니다. 발 꼬집을 통해 마취의 깊이를 결정하십시오. 진행하기 전에 발 철수 반사가 없는지 확인하십시오.
- 동물을 뇌 적출 작업 공간의 휴지로 옮기고 수술용 가위로 목을 베십시오.
- 홍채 가위를 뇌간에 삽입하고 아래쪽 가위를 종골과 같은 높이로 유지합니다. 관상 봉합사에 도달할 때까지 시상 봉합사를 따라 자릅니다. 아이리스 가위를 눈구멍에 넣고 메토피 봉합사를 자릅니다. 구부러진 집게를 사용하여 칼바리아의 측면을 아래로 이동하여 뇌 전체를 노출시킵니다.
알림: 홍채 가위와 집게를 모두 사용하여 봉합사를 절단하는 동안 뇌에 구멍을 뚫지 않도록 주의하십시오. - 구부러진 집게의 뭉툭한 가장자리가 있는 뇌를 30mL의 고자당 절단 용액 슬러시가 들어 있는 50mL 비커에 밀어 넣습니다. 1분 동안 그대로 두십시오.
- 뇌 준비 작업 공간에서 차가운 탄수화 절단 용액을 사용하여 뇌를 90mm 플라스틱 배양 접시로 옮깁니다. 아가로스 곰팡이에 위치하기 위해 뇌의 방향을 지정합니다.
- 아가로스 몰드의 로스트랄 끝에 작은 슈퍼 접착제 점을 추가합니다. 주걱으로 뇌를 틀에 넣습니다. 수평 슬라이싱을 위해 뇌가 등쪽을 아래로 향하게 배치했는지 확인합니다.
알림: 금형에서 접착제의 위치는 관심 영역(ROI)에 따라 변경됩니다. 해마-피질(HC) 및 후각구(OB) 절편의 경우 OB가 안정화되고 뇌 측면에 접착제가 없는지 확인합니다. 접착제가 너무 많으면 슬라이싱 품질에 영향을 미치고 비브라톰 슬라이싱 중에 찢어질 수 있습니다. - 검체 플레이트를 버퍼 트레이로 이동하고, 블레이드를 올바른 각도로 제자리로 이동하고, 버퍼 트레이 높이를 높여 블레이드를 브레인에 최대한 가깝게 만듭니다.
- 0.20mm/s의 속도로 300μm 간격으로 HC 및 OB 조직을 슬라이스한 다음 유리 파스퇴르 피펫으로 슬라이스할 때마다 수집합니다.
- 32°C 수조의 aCSF로 채워진 회수 챔버에 슬라이스를 45분 동안 그대로 둔 다음 RT에서 1시간 동안 그대로 둡니다. 슬라이스가 겹치지 않고 탄화 용액에 완전히 노출되도록 합니다.
알림: 모든 용액과 용액을 포함하는 언급된 모든 챔버의 지속적인 탄수화를 유지해야 합니다. 압력 조절기는 일관된 탄수화를 유지하기 위해 사용할 수 있습니다.
2. HD-MEA의 체외 인간 iPSC 기반 신경 네트워크
참고: 이 연구에 사용된 모든 iPSC 뉴런은 상업적으로 획득되었습니다( 자료표 참조). 이러한 인간 세포는 인간 말초 혈액 또는 섬유아세포에서 유래한 안정적인 iPS 세포주에서 분화되었습니다.
- 체외 인간 iPSC 세포 배양을 위한 HD-MEA 칩 코팅(그림 2B)
- HD-MEA 칩을 획득 기록 플랫폼에 놓고 저장소를 PBS로 채우고 코팅하기 전에 칩을 테스트합니다. Brainwave 소프트웨어를 시작합니다. [파일] > [새 레코딩 세션]을 선택합니다. 기록 주파수 가 50Hz이고 S를 갖도록 기록 매개변수를 설정합니다. amp링 주파수 는 18kHz/전극입니다. 변경 Ampliifier Offset 을 사용하여 칩을 보정합니다. 문제 해결 팁은 표 2 를 참조하십시오.
알림: 녹음 주파수 및 samp링 주파수 매개변수는 데이터 유형 및 개별 시스템 요구 사항에 따라 다릅니다. - HD-MEA를 멸균하고 사전 컨디셔닝합니다.
- 후드 아래에서 96% 에탄올(EtOH)을 적신 티슈로 칩과 유리 링을 닦은 다음 각 장치를 멸균된 100mm x 20mm 페트리 접시에 넣고 MEA 저장소에 70% EtOH를 20분 동안 채웁니다.
- EtOH를 흡인하고 멸균되고 여과된 dd-water로 저장소를 3회 세척합니다. 1mL의 프리컨디셔닝 배지를 추가하고 37°C 및 5%CO2에서 밤새 배양합니다.
참고: 프리컨디셔닝 매체는 HD-MEA 표면을 친수성으로 만들기 위해 염 기반 용액이어야 합니다. 여기에는 이전에 준비된 BrainPhys(BP) complete media(>3개월 이상)가 포함될 수 있습니다(표 1C).
- HD-MEA를 코팅합니다. 다음 날, 사전 컨디셔닝 배지를 흡인합니다. 1mL의 0.1mg/mL 폴리-dl-오르니틴(PDLO)을 추가하여 전체 활성 영역을 코팅합니다. 인큐베이터에서 37°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
- RT를 위해 미디어를 준비하고 예열합니다. 여기의 프로토콜은 두 가지 상업적 소스의 기능적 인간 iPSC 뉴런을 활용합니다. 따라서 미디어 구성 요소는 각 공급업체마다 다릅니다. 하나의 프로토콜이 (표 1C, D)에 설명되어 있다.
- PDLO를 흡입하고 dd-water로 3번 세척한 다음 칩을 후드 아래에서 10분 동안 건조시킵니다.
- 35mm x 10mm 페트리 접시에 멸균되고 여과된 dd-water를 채우고 칩 옆에 놓아 적절한 습도를 유지하고 다음 단계에서 파종된 세포가 증발하는 것을 방지합니다.
- HD-MEA 칩을 획득 기록 플랫폼에 놓고 저장소를 PBS로 채우고 코팅하기 전에 칩을 테스트합니다. Brainwave 소프트웨어를 시작합니다. [파일] > [새 레코딩 세션]을 선택합니다. 기록 주파수 가 50Hz이고 S를 갖도록 기록 매개변수를 설정합니다. amp링 주파수 는 18kHz/전극입니다. 변경 Ampliifier Offset 을 사용하여 칩을 보정합니다. 문제 해결 팁은 표 2 를 참조하십시오.
- HD-MEA에서 인간 iPSC 뉴런의 도금 및 유지(그림 2B)
- 세포를 마이크로리터 농도당 원하는 세포로 해동 및 희석합니다(즉, HD-MEA에서 50μL 드롭에서 50,000개의 세포 밀도를 얻기 위해 1000세포/μL)(표 1C).
- 높은 라미닌 도팅 매체를 사용하여 칩 활성 영역 표면의 셀 현탁액을 피펫팅합니다(표 1D).
- 37 °C에서 5 % CO2 로 45-60 분 동안 배양합니다.
- HD-MEA reservoir에 2mL의 배지를 부드럽게 채웁니다(표 1C).
- RT 매체를 사용하여 1일차(DIV1) 사후 시드에 100% 매체 교체를 수행합니다(표 1C). 3-4일마다 미디어의 50%를 교체합니다. 실험 내내 HD-MEA를 37°C에서 5%CO2 로 배양합니다.
알림: 세포가 빠지지 않도록 피펫을 부드럽게 합니다. 미디어의 색상에 오염이 있는지 확인하십시오. 배지 교환의 간격과 양은 개별 연구 질문 또는 세포 요구/사양에 따라 결정될 수 있습니다. - 선택 사항: >70% EtOH로 스테이지를 세척한 후 정립 미분 간섭 대비(DIC) 현미경으로 DIV4-DIV8 사이의 세포 배양 성장 진행 상황을 확인합니다.
3. HD-MEA를 사용한 체외 및 체외 대규모 신경 기록
- 브레인 슬라이스 기록 작업 공간 준비(그림 2A)
- 브레인 슬라이스가 복구되는 동안 필요한 도구를 지정된 각 작업 공간에 배치합니다( 자료 표 참조).
알림: 주요 시스템 설정은 브레인 슬라이스 실험일 훨씬 전에 최적화되고 테스트되어야 합니다. 관류 시스템(입구 라인, 펌프 출구 라인, 튜브 및 접지)은 깨끗한 신호, 증가된 신호 노이즈 비율 및 관류 노이즈 부족을 보장하기 위해 녹음 플랫폼에서 PBS 또는 aCSF 및 HD-MEA로 테스트해야 합니다. - HD-MEA 칩에 0.1mg/mL의 PDLO를 코팅하여 조직-칩 결합을 강화하고 37°C에서 20분 동안 배양합니다.
- 칩 배양 중에 중력 기반 관류 시스템과 라인을 기록 aCSF로 채웁니다. 관류 시스템의 지속적인 탄화를 보장합니다. 유속을 4.5mL/분으로 설정하고 온도를 37°C로 설정합니다.
- HD-MEA 칩을 수집 기록 플랫폼에 놓고, 저장소를 aCSF로 채우고, 관류 시스템을 테스트하고, 남아 있는 시스템 노이즈 문제를 해결합니다.
- Brainwave 소프트웨어를 시작합니다. [파일]> [새 레코딩 세션]을 선택합니다. 기록 주파수 가 1Hz이고 S를 갖도록 기록 매개변수를 설정합니다. amp링 주파수 는 14kHz/전극입니다. 변경 Ampliifier Offset 을 사용하여 칩을 보정합니다. 문제 해결 팁은 표 2 를 참조하십시오.
알림: 녹음 주파수 및 samp링 주파수 매개변수는 데이터 유형 및 개별 시스템 요구 사항에 따라 다릅니다.
- Brainwave 소프트웨어를 시작합니다. [파일]> [새 레코딩 세션]을 선택합니다. 기록 주파수 가 1Hz이고 S를 갖도록 기록 매개변수를 설정합니다. amp링 주파수 는 14kHz/전극입니다. 변경 Ampliifier Offset 을 사용하여 칩을 보정합니다. 문제 해결 팁은 표 2 를 참조하십시오.
- 실내 조명 시스템이나 광학 테이블의 그늘진 케이지를 통해 녹음 영역이 어두운지 확인하십시오.
- 이미지 획득을 위해 실체현미경을 HD-MEA 칩 저장소 및 활성 영역에 맞춥니다.
- 평형을 맞추기 위해 칩 저장소에 앵커를 놓습니다.
알림: Anchor는 산소 공급을 촉진하기 위해 최소한의 와이어가 있는 맞춤형 백금 하프입니다. 그러나 일부 상업용을 사용할 수 있습니다. - 적절한 관류관에 약리학적 화합물을 추가합니다.
참고: 이 프로토콜에서, 자발적 및 100μM 4-아미노피리딘(4-AP) 약리학적으로 유도된 기록이 앞서 설명된 바와 같이 수득되었다. 약리학적 화합물은 특정 연구 질문에 맞게 조정할 수 있습니다. - 브레인 슬라이스 준비 작업 공간에서 150mm 유리 페트리 접시에 새 90mm 플라스틱 배양 접시를 놓습니다. aCSF를 추가하고 탄수화물 생성을 시작합니다.
- 브레인 슬라이스가 복구되는 동안 필요한 도구를 지정된 각 작업 공간에 배치합니다( 자료 표 참조).
- HD-MEA를 사용한 HC 및 OB 슬라이스의 회로 전체 레코딩
참고: 슬라이스 커플링은 슬라이스에 산소가 공급되지 않도록 가능한 한 빨리 수행해야 합니다. 커플링은 칩 활성 영역에 미세 절개된 슬라이스를 처음 배치한 후 최종 관류 시스템 시작까지 ~1분밖에 걸리지 않습니다.- 유리 피펫으로 뇌절편 회수실에서 절편을 제거하고 연속 탄수화와 함께 90mm 플라스틱 배양 접시에 넣습니다. 미세해부 도구를 사용하여 주변 뇌 절편 조직에서 HC 또는 OB를 분리합니다.
- 유리 피펫을 사용하여 분리된 HC 또는 OB 급성 절편을 HD-MEA 저장소로 옮깁니다. 미세한 브러시로 MEA 활성 영역의 슬라이스를 부드럽게 정렬합니다. 흡인 시스템으로 HD-MEA 칩의 모든 용액을 잘 빨아들입니다.
- 집게를 사용하여 앵커를 슬라이스 위에 부드럽게 놓습니다.
알림: 앵커는 커플링 손실을 방지하기 위해 슬라이스 이동 없이 배치해야 합니다. - 칩 저장소에 용액을 부드럽게 추가하고 관류 시스템을 시작합니다.
알림: 최적의 기록 매개변수를 위해 관류 입구와 펌프 출구에서 층류를 확인하십시오. - 실내 조명 시스템을 통해 또는 광학 테이블 설정의 음영 케이지를 통해 녹음 영역이 적절하게 어두워졌는지 확인합니다.
- 슬라이스가 녹음 또는 추가 약리학적 조절을 시작하기 전에 10분 동안 적응하도록 합니다.
- Brainwave 소프트웨어를 시작합니다. [파일]> [새 레코딩 세션]을 선택합니다. 기록 주파수 가 1Hz이고 S를 갖도록 기록 매개변수를 설정합니다. amp링 주파수 는 14kHz/전극입니다. 변경 Ampliifier Offset 을 사용하여 칩을 보정합니다.
알림: 섹션 3.1.4.1의 앞부분에서 설명한 대로 시스템 테스트를 수행하는 동안 동일한 기록 매개변수를 적용해야 합니다. - Record를 눌러 사전 설정된 실험 조건으로 수집을 시작합니다.
- 최종 기록 직후, 급성 뇌 절편의 광 이미징을 캡처합니다. 슬라이스를 슬라이스 회수 챔버로 다시 옮기고 브러시로 칩에 결합된 유기 물질을 제거한 후 다음 슬라이스를 계속합니다. 섹션 3.4에 설명된 대로 HD-MEA를 청소합니다.
- HD-MEA에서 인간 iPSC 기록 작업 공간 및 네트워크 전체 기록 준비 (그림 2B)
참고: 녹화 전날 또는 iPSC 녹화 직후에 미디어를 교체하십시오(표 1C). 기능적 뉴런을 사용한 연구에서는 4일마다 배지를 교체했으며, 4, 8, 16 및 24에서는 iPSC 기록 직후 DIV 배지를 교체했습니다.- >70% EtOH로 HD-MEA 수집 플랫폼을 세척하여 멸균 작업 환경을 보장합니다.
- 폴리디메틸실록산(PDMS) 베이스 캡을 후드 아래의 HD-MEA 링에 참조하여 조심스럽게 놓습니다. HD-MEA 칩을 iPSC 레코딩 작업 공간으로 옮기고 HD-MEA 칩을 획득 플랫폼에 연결합니다.
- 실내 조명 시스템이나 광학 테이블의 그늘진 케이지를 통해 녹음 영역이 적절하게 어두워졌는지 확인합니다.
- 녹음 또는 추가 약리학적 조절을 시작하기 전에 HD-MEA 칩이 10분 동안 평형을 이루도록 합니다.
- Brainwave 소프트웨어를 시작합니다. [파일] > [새 레코딩 세션]을 선택합니다. 기록 주파수 가 50Hz이고 S를 갖도록 기록 매개변수를 설정합니다. amp링 주파수 는 18kHz/전극입니다. 변경 Ampliifier Offset 을 사용하여 칩을 보정합니다.
알림: 섹션 2.1.1의 앞부분에서 설명한 대로 코팅 및 도금 전에 시스템 테스트를 수행하는 동안 동일한 기록 매개변수를 적용해야 합니다. - 실험 계획의 각 날짜(즉, 4, 8, 16, 24 DIV)에 인간 iPSC 네트워크의 자발적 발화 활동 또는 약리학적으로 유도된 반응을 기록합니다.
알림: 안정적인 온도와 습도를 유지하고 세포에 대한 온도 충격을 방지하기 위해 칩을 >30분 동안 인큐베이터 외부에 두지 마십시오. - 실험 과정에서 37°C에서 5%CO2로 HD-MEA를 배양합니다.
- 실험 완료 후 3.4단계에 설명된 대로 추가 광학 이미징을 위해 칩 및 염색에 신경 네트워크 고정을 하거나 HD-MEA를 직접 세척합니다.
- HD-MEA 칩 세척
- 실험 후 적절한 폐기물 처리에 따라 용액을 폐기하고 dd-water로 헹굽니다.
- 원하는 세제를 넣고 Q-tip으로 작업 영역과 물통 전체를 청소한 다음 세제를 버리십시오. 세제를 다시 채우고 20분 동안 배양한 다음 세제를 버립니다.
- 실험실 등급의 물로 철저히 헹굽니다. 그런 다음 dd-water로 3-4 번 헹굽니다.
- 공기압을 사용하여 HD-MEA 칩을 완전히 건조시킵니다.
4. HD-MEA의 대규모 신경 기록 분석
참고: 4.1단계는 Brainwave 소프트웨어에 따라 다르지만 4.2단계는 각 사용자의 상용 HD-MEA 장치 유형에 따라 수정할 수 있습니다.
- 원시 데이터 전처리 및 이벤트 감지
- 녹음된 원시 데이터 열기 file (.brw) Brainwave 소프트웨어에서. LFP 감지 또는 스파이크 감지> 분석을 선택합니다.
알림: LFP 감지는 저역 통과4차 버터 워스 필터(1-100Hz)를 사용한 IIR 필터링을 사용합니다. 하드 임계값 알고리즘에는 150μV의 높은 임계값, -150μV의 낮은 임계값, 70-120ms 사이의 에너지 창, 10ms의 내화 주기 및 1초의 최대 이벤트 지속 시간이 포함됩니다. 단일 및 MUA 스파이크 감지는 고역 통과 4차 버터워스 필터(300-3500Hz)와 함께 IIR 필터링을 사용합니다. PTSD 알고리즘은 표준 편차 계수 8, 피크 수명 2ms, 불응 기간 1ms로 적용됩니다. - HC 및 OB 회로 기록의 경우, 검출된 이벤트 파일(.bxr)에 Advanced Workspace 옵션을 추가하여 실체현미경에서 캡처한 구조광 이미지를 가져옵니다. 대규모 HC 회로를 검사할 때는 치상이랑(DG), 힐러스, 코르누 암모니스 1(CA1), 코르누 암모니스 3(CA3), 내측 피질(EC) 및 주변 피질(PC)을 포함하는 구조층을 생성합니다. 대규모 OB 회로를 검사할 때 후각 신경층(ONL), 사구체층(GL), 외부 망상층(EPL), 승모세포층(MCL) 및 과립 세포층(GCL)을 포함하는 구조층을 만듭니다. EPL과 MCL을 후각 피질(OCx)을 포함한 투영층(PL)으로 간주합니다.
- 녹음된 원시 데이터 열기 file (.brw) Brainwave 소프트웨어에서. LFP 감지 또는 스파이크 감지> 분석을 선택합니다.
- 사용자 지정 Python 계산 파이프라인을 사용한 데이터 처리
- 노이즈 제거
- 사용자 지정 작성된 Python 스크립트 26,29,32 및 h5py 3.6.0 python 패키지를 사용하여 .bxr 파일을 읽습니다.
- iPSC 네트워크 기록과 관련된 스파이크 트레인과 HC 및 OB 브레인 슬라이스 회로 기록과 관련된 LFP 이벤트 트레인을 추출합니다.
- 총 활성 전극 수가 평균 이벤트당 평균 활성 전극의 0.1% 또는 10% 미만인 이벤트 또는 통계적으로 합리적인 발화율 범위를 벗어나는 감지된 이벤트를 무작위 이벤트로 특성화하고 제거합니다. 또한 진폭 및 이벤트 기간 임계값을 적용합니다.
참고: 발사 속도 범위의 경우 0.1-15 스파이크/초 및 0.1-60 LFP 이벤트/분이 고려됩니다. 다음은 분석된 데이터 세트에 사용되는 속도 임계값의 예입니다. 속도, 진폭 및 기간 임계값은 개별 데이터에 따라 다릅니다. - 결과 이벤트 학습 데이터를 함께 제공되는 시공간 정보와 함께 .npy 파일 형식으로 저장합니다.
- 래스터그램
- 필터링된 이벤트 .npy 및 .bxr 파일을 읽고 Matplotlib pyplot 함수(https://matplotlib.org/3.5.3/api/_as_gen/matplotlib.pyplot.html)를 사용하여 래스터 플롯을 생성합니다.
- 또한 층 특이성을 갖는 뇌 절편 기록의 경우 4.1.2단계에서 생성된 층을 기반으로 전극 ID를 정렬하고 그룹화합니다.
- 평균 발사 활동
- .bxr 파일의 시계열 데이터를 처리하여 각 전극의 평균 발화율(이벤트 수/기록 시간)을 계산합니다.
- 행과 열이 HD-MEA 64 x 64 배열의 전극 좌표를 나타내고, 여기서 각 행렬 값은 평균 발화율을 나타내는 데이터 행렬을 생성합니다.
- Python에서 Matplotlib의 imshow 또는 Seaborn의 히트맵 함수와 같은 플로팅 라이브러리를 사용합니다.
- 여기에 '핫' 컬러 맵을 사용하여 전극 어레이 전반에 걸친 평균 발사 속도의 공간 분포를 시각적으로 캡슐화하는 유익한 히트맵을 만듭니다.
- 대표적인 파형 트레이스
- .brw 파일에서 시계열 데이터를 읽고 Matplotlib pyplot 함수를 사용하여 파형 추적을 생성합니다. (https://matplotlib.org/3.5.3/api/_as_gen/matplotlib.pyplot.html).
- 대표적인 파형 트레이스를 위해 원하는 전극 ID, 시간 빈 및 주파수 대역을 입력합니다. 이러한 분석에서 정의된 주파수 대역에는 대역 통과 필터링된 δ, θ, β 및 γ 주파수 대역이 있는 저주파 LFP 발진(1-100Hz)이 포함됩니다. 날카로운 파동 리플 (SWR) (140-220 Hz); 및 고주파 단일 및 MUA(300-3500Hz). 주파수 대역 δ, θ, β 및 γ는 각각 1-4Hz, 5-12Hz, 13-35Hz 및 35-100Hz입니다.
- 파워 스펙트럼 밀도
- .brw 파일에서 시계열 데이터를 읽고 주기도를 계산하여 각 시계열 내에서 진동 활동의 기반이 되는 주요 주파수를 식별합니다.
- 주파수-시간 동특성의 의사 색상 스펙트로그램을 생성합니다.
참고: 스펙트럼은 스펙트럼 전력 밀도(41)를 추정하기 위해 기록된 LFP의 고속 푸리에 변환(Fast Fourier Transform)을 활용하여 웰치(Welch)의 방법을 사용하여 계산된다. - 스펙트럼 밀도 맵에 대해 원하는 전극 ID, 시간 구간 및 주파수 대역을 입력합니다. 이러한 분석에서 정의된 주파수 대역에는 4.2.4단계에서 설명한 주파수 대역이 포함됩니다.
- 기능적 연결성
- 브레인 슬라이스 회로 기록의 경우 4.2.6.2-4.2.6.4단계를 수행합니다.
- .brw 파일에서 시계열 데이터를 읽어 들이고 Pearson의 상관 계수(PCC)42를 사용하여 64 x 64 배열에서 활성 전극 쌍 간의 교차 공분산을 계산합니다.
- 다변량 Granger 인과 관계를 사용하여 벡터 자기 회귀 모델을 시계열에 피팅하여 한 시계열이 다른 시계열에 미치는 영향을 정량화합니다.
- DTF(Directed Transfer Function)를 적용하여 상관 관계가 있는 링크 내의 방향 정보 흐름을 평가합니다.
참고: 다층 네트워크의 기능적 연결은 모든 교차 공분산 값43,44의 평균과 두 표준 편차를 초과하는 상관 값 임계값을 설정하여 설정됩니다. - iPSC 녹화의 경우 4.2.6.6-4.2.6.8단계를 따르십시오.
- .bxr 파일에서 spiketrains 데이터를 읽어 들이고 spike_train_correlation 함수(https://elephant.readthedocs.io/en/v0.7.0/reference/spike_train_correlation.html)를 사용하여 비닝된 스파이크 열의 모든 조합 간에 PCC 상관 계수의 64x64 행렬을 계산합니다.
참고: 다층 네트워크의 기능적 연결은 모든 교차 공분산 값의 평균과 두 표준 편차를 기반으로 상관 값 임계값을 설정하여 설정됩니다. - 또한 연결 매트릭스에 STF(Spatial-Temporal Filter) 및 DdLT(Distance-Dependent Latency Threshold) 필터링 절차를 구현하여 최대 전파 속도(400mm/s로 설정)45를 초과하는 잠재적인 쌍 연결을 제거합니다.
- 필터링 및 임계값 연산을 통해 결과 상호상관 행렬에서 음의 피크를 추출하여 필터링 및 정규화된 상호상관 히스토그램(FNCCH) 알고리즘45를 사용하여 억제 연결을 식별합니다.
- 각 연결 행렬을 동적 그래프(.gexf) 파일로 변환합니다.
- 네트워크 연결 맵
- Gephi 프로그램 9.2 버전(https://gephi.org)의 개방형 데이터 실험실 은 특정 시간 그룹을 그리는 동적 그래프를 위한 것입니다.
- 공간 매핑을 위해 레이아웃 창에서 Geo Layout 을 적용합니다.
- 비교를 위해 Degree Range(각도 범위 ) 및 Edge Weight(모서리 가중치) 에 매개변수 구속조건을 배치합니다.
- 더 나은 시각화를 위해 Nodal Color, Edge Size 및 Degree Size 를 할당합니다.
- 노이즈 제거
Representative Results
다중 모델 시공간 매핑 및 진동 발사 특징 추출
동적 신경 앙상블에서 나타난 네트워크 전반의 LFP 및 스파이크 이벤트를 정량화하기 위해 HC 및 OB 회로와 인간 iPSC 네트워크에서 동기식 대규모 발화 패턴을 조사했습니다. 3.2 단계로부터 기록된 뇌 절편 회로와 3.3 단계로부터 기록된 iPSC 네트워크는 프로토콜의 4.1-4.2 단계에 따라 분석되었다. 먼저, 기록된 모든 데이터 세트에 대해 이벤트 감지 및 노이즈 제거가 수행되었으며 회로 사양에 따라 지역적으로 해결되었습니다. 다음으로, 평균 대규모 LFP 및 스파이크 발사 패턴의 지형학적 의사 색상 공간 매핑, 감지된 이벤트의 래스터그램 및 필터링된 파형의 대표적인 5-s 트레이스를 표시했습니다(그림 3 A-I). 대규모 LFP 및 스파이크 발화 속도 패턴의 지형학적 유사 색상 매핑은 HC(그림 3A), OB(그림 3B) 및 인간 iPSC 신경 네트워크(그림 3C)의 현미경으로 캡처된 광학 이미지에 오버레이되었습니다. 이를 통해 개별 회로 및 네트워크 기반 진동 패턴과 응답을 조사할 수 있습니다. HC 및 OB 래스터그램에는 HC 회로의 DG, Hilus, CA3, CA1, EC 및 PC 계층과 OB 네트워크의 ONL, OCx, GL, PL 및 GCL 계층에 대해 60초 시간 빈에 걸쳐 정렬된 감지된 LFP 이벤트 수가 포함됩니다(그림 3D,E). 인간 iPSC 래스터그램은 20초 시간 빈에 걸쳐 상호 연결된 배양 네트워크의 동기 감지 스파이크 이벤트를 표시합니다(그림 3G). 다음으로, 대규모 HD-MEA 기록 부위의 5s 대표 이벤트 트레이스는 HC(즉, CA3에서 선택된 전극)(그림 3G) 및 OB(즉, GL에서 선택된 전극)(그림 3H) 회로에서 기록된 다양한 진동 주파수와 어레이에서 선택된 4개의 활성 전극에서 인간 iPSC 네트워크의 다중 단위 스파이크 파열 활동을 보여줍니다(그림 3I)). 이러한 예시적인 신호들은 대역통과 필터링된 δ, θ, β 및 γ 주파수 대역들을 갖는 저주파 LFP 발진(1-100Hz)을 포함하는 생체신호 시그니처를 보여주고; 날카로운 파동 리플 (SWR) (140-220 Hz); 및 고주파 단일 및 MUA(300-3500Hz). 마지막으로, 전력 스펙트럼 밀도(PSD) 분석을 사용하여 HD-MEA에서 기록된 상호 연결된 HC 및 OB 회로에서 특정 발진 대역의 전력 크기를 동시에 정량화했습니다(그림 3J,K).
멀티모달 네트워크 전반의 기능성 커넥톰
동시 활성 뉴런 앙상블의 동시 발사 패턴으로부터 다층 신경망의 대규모 연결을 추론하기 위해, 검출된 이벤트에서 활성 전극 쌍 간의 교차 공분산은 프로토콜의 4.2.6단계에 따라 계산되었습니다. 여기서, 상관 계수는 HC 및 OB 회로의 레이어를 기반으로 정렬되거나 iPSC 네트워크에서 정렬되지 않은 후 대칭 행렬에 저장되었습니다. HC 및 OB 회로의 기능적 커넥톰은 다변량 Granger 인과 관계 및 지시 전달 함수(DTF)를 적용하여 한 시계열이 다른 시계열에 미치는 영향을 정량화하고 별개의 네트워크에서 상관 링크 내의 방향 정보 흐름을 평가하여 생성되었습니다. HC(그림 4A) 및 OB(그림 4B)의 커넥톰 매핑 및 네트워크 시각화는 Gephi 프로그램 9.2 버전(https://gephi.org)을 사용하여 수행되었습니다. HC 및 OB 브레인 슬라이스 회로를 비교하기 위해 기능 링크에 유사한 매개 변수 제약 조건을 배치하고 감지된 LFP 이벤트의 기능적 연결성을 100초 동안 설명했습니다. 노드는 각도 강도에 따라 크기가 조정되며, 노드 색상은 레이어를 나타내고 링크 색상은 레이어 내 및 레이어 간 연결을 식별합니다. 인간 iPSC 네트워크의 기능적 커넥톰은 공간 시간 필터(STF) 및 거리 종속 대기 시간 임계값(DdLT)을 적용하여 생성되었으며, 필터링되고 정규화된 교차 상관 히스토그램(FNCCH) 분석을 적용하여 중요한 링크의 선택을 향상시키고 의미 있는 연결의 식별을 개선했습니다. Gephi를 사용하여 수행된 전체 HD-MEA 칩(그림 4C) 시각화에서 인간 iPSC 네트워크의 커넥톰 매핑. 노드 색상은 흥분성 또는 억제성 입력을 나타내고 링크 색상은 연결을 식별합니다.
그림 1: 대규모 HD-MEA의 실험 및 계산 플랫폼 개요. (A) HC, OB 및 인간 iPSC 신경 회로 및 네트워크에서 신경 역학을 캡처하기 위해 CMOS 기반 HD-MEA로 구현된 다중 모드 바이오 하이브리드 신경 전자 플랫폼의 등각 투영 개략도 표현. (B) HC 및 OB 슬라이스를 얻기 위한 마우스 뇌 슬라이싱 및 작업 환경에 대한 개략적인 워크플로. (C) 추출된 세포외 파형과 중첩된 전체 HC 및 OB 슬라이스로부터 동시에 기록된 대규모 소성 패턴의 지형학적 표현이 슬라이스 광학 이미지. (D) 인간으로부터 얻은 iPSC 신경 네트워크의 개략도. (E) HD-MEA 칩(왼쪽)에서 전체 인간 신경 네트워크의 세포 c-fos 및 체세포/수지상 MAP-2를 전체 평균 발사 활동 맵(오른쪽)과 일치시키는 형광 현미경 사진. (F) HD-MEA의 대규모 기록에서 얻은 다차원 신경 데이터를 분석하기 위한 고급 데이터 분석, 연결 매핑 및 AI 기계 학습 도구를 포함한 계산 프레임워크. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 생체 외 뇌 절편 및 체외 인간 iPSC 배양 준비 및 기록 작업 공간의 레이아웃. (A) HC 및 OB 슬라이스를 준비하기 위한 설정을 보여주는 개략적인 워크플로우로, 각 작업 공간에 필요한 도구와 장비가 포함되어 있습니다. (B) 필요한 도구 및 장치를 포함한 인간 iPSC 배양 준비를 위한 개략도. 전체 재료 목록은 1.2.2, 2.1, 2.2, 3.1.1, 3.3 단계 및 재료 목차에 포함되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 네트워크 동역학의 시공간 패턴 매핑 및 추출. (A-C) 평균 LFP 및 스파이크 속도 공간 맵, 5분 동안 계산되어 현미경 광 이미지에 겹쳐집니다. (D-F) 60초 데이터 하위 샘플에서 감지되고 노이즈가 제거된 LFP 이벤트와 20초 데이터 하위 샘플에서 스파이크를 나타내는 래스터 플롯입니다. (지-I) 래스터 플롯 데이터 하위 샘플(래스터 플롯에서 빨간색으로 강조 표시)의 5초 세그먼트에서 대표 파형 추적 추출, 원시 LFP 진동 대역(1-100Hz)으로 표시됨; δ(1-4Hz), θ(5-12Hz), β(13-35Hz) 및 γ(35-100Hz) 주파수 대역; SWR(140-220Hz); 및 고주파 단일 및 MUA 스파이크(300-3500Hz). (J,K) 빠르고 느린 진동 LFP(1-100Hz) 및 SWR(140-220Hz)의 전력 스펙트럼 밀도 맵. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 멀티모달 네트워크 전반의 기능적 커넥톰의 구성. (A-C) Gephi 맵은 노드 기능 연결을 보여주며, 여기서 노드는 예제 색상 막대 범례(아래) 중 하나에 해당하고 링크(또는 가장자리)는 연결 노드와 일치하도록 음영 처리됩니다. (A) HC, (B) OB 및 (C) iPSC 레이어에 대한 범례 예가 64 x 64 배열에 표시됩니다. HC 및 OB 레이어는 시각화를 위해 표시되는 노드 및 링크의 수를 효과적으로 줄이기 위해 100초 시간 빈에 걸쳐 플로팅됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1: iPSC 신경 세포 배양을 위한 뇌 절편 준비 및 배지용 솔루션. (A) 생체 외 뇌 절편 준비를 위한 고자당 절단 용액. (B) 생체 외 뇌 절편 준비 및 기록을 위한 aCSF 기록 용액. (씨디) 인간 신경 iPSC 배지 프로토콜, 여기서 (C)는 세포 해동, HD-MEA 칩 코팅 및 배양된 HD-MEA 유지에 사용되는 BrainPhys 완전 배지이고, (D) HD-MEA 세포 도금에 사용되는 도팅 배지입니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 2: 일반적인 HD-MEA 레코딩 획득 문제 해결. HD-MEA 칩, 기록 플랫폼, 시스템 노이즈 및 소프트웨어와 관련된 일반적인 문제, 잠재적 원인 및 문제 해결 솔루션 목록입니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
상호 연결된 뉴런 앙상블에서 발생하는 시공간 뉴런 활동의 복잡한 역학은 오랫동안 신경 과학의 흥미로운 주제였습니다. 패치 클램프, 표준 MEA 및 Ca2+ 이미징과 같은 기존 방법론은 뇌 복잡성에 대한 귀중한 통찰력을 제공했습니다. 그러나 네트워크 전반의 포괄적인 계산 역학(computational dynamics)을 포착하는 데 부족한 경우가 많다(21,22,23). 이 JoVE 연구에서 자세히 설명된 HD-MEA 플랫폼의 기술 프로토콜은 세포 어셈블리에서 광범위한 네트워크(즉, 급성, 생체 외 마우스 뇌 절편 및 체외 인간 iPSC 네트워크)에 이르기까지 다양한 양식에 걸쳐 신경 역학에 대한 파노라마 보기를 제공하는 중요한 도약을 나타냅니다26,29,30,32.
급성 생체 외 마우스 뇌 절편은 신경 연구의 기초 도구였으며 분자 및 회로 수준 조사를 용이하게 했습니다 6,7. 그러나 조직 생존력을 유지하는 문제는 지속적인 병목 현상이었습니다. 이 연구에서 설명된 프로토콜은 HD-MEA 플랫폼에서 이점을 활용하기 위해 이러한 슬라이스의 품질과 수명을 최적화하기 위해 중요한 수정 사항을 도입합니다. 이 프로토콜은 - i) 슬라이스 균일성 달성, 슬라이스 시간이 길어지는 절충 시간에도 불구하고 정밀도와 조직 손상 최소화로 인해 조직 초퍼보다 비브라톰을 사용하는 것이 선호됩니다. ii) 조직 생존력을 유지하기 위해 추출에서 기록에 이르기까지 공정 전반에 걸쳐 일정한 탄수화를 보장합니다. iii) 온도를 조절하고 기록하기 전에 적절한 회복 시간을 허용합니다. iv) 아가로스 블록 또는 몰드를 사용하여 뇌를 안정화하고 찢어짐을 방지하며 접착제 접촉을 최소화합니다. v) HD-MEA 저장소 내에서 탄화된 aCSF의 최적 유속을 유지하여 슬라이스 상태를 보장하면서 디커플링, 노이즈 및 드리프트와 같은 문제를 방지합니다(표 2).
생쥐 뇌 절편과 인간 iPSC 제제 모두에서 전극-조직 계면 결합을 향상시키는 것이 가장 중요합니다30,46,47. 당사의 프로토콜은 접착 촉진 분자인 폴리-dl-오르니틴(PDLO) 활용의 중요성을 강조합니다. 이 분자는 전기 신호를 검출하기 위한 표면적을 증가시킬 뿐만 아니라 전기 전도도를 증가시킨다(46). 이를 통해 세포 접착, 성장 및 기능적 네트워크 특성의 개발을 촉진합니다. 이러한 최적화는 HD-MEA 플랫폼의 효율성을 향상시키는 데 중추적인 역할을 합니다. 이는 마이크로 스케일의 ex-vivo 및 in-vitro 커넥톰과 시공간 발화 시퀀스에 대한 정확하고 일관된 분석을 보장합니다. 특히, PDLO는 신경 세포 배양에서 자발적 발화 활동과 전기 자극에 대한 반응성을 촉진하는 데 있어 폴리에틸렌이민(PEI) 및 폴리-l-오르니틴(PLO)과 같은 다른 기질을 능가하는 것으로 나타났습니다. 또한, PDLO는 HD-MEA의 표면 기능화에 사용되었으며, 전극-슬라이스 결합 인터페이스를 향상시키고 OB 및 HC 슬라이스26,29 모두에서 신호 대 잡음비를 증가시키는 것으로 나타났다. 맞춤형 플래티넘 앵커를 추가하면 전극-슬라이스 인터페이스 커플링이 더욱 강화되어 더 높은 신호 대 잡음비로 녹음할 수 있습니다.
생체 외 마우스 뇌 절편과 체외 인간 iPSC 네트워크 모두에 HD-MEA를 활용하면 광범위하고 멀티스케일 및 멀티모달 역학을 탐색하는 데 능숙한 방법이 도입됩니다. 그러나 이러한 혁신적인 접근 방식은 특히 데이터 관리에서 상당한 문제를 야기합니다 48,49,50,51. 18kHz/전극 샘플링 주파수에서 수집된 단일 HD-MEA 레코딩은 155MB/s의 엄청난 데이터를 생성합니다. 데이터 볼륨은 여러 슬라이스, 다양한 약리학적 조건 또는 장시간의 기록 기간을 고려할 때 급격히 증가합니다. 이러한 정보의 유입에는 강력한 스토리지 인프라와 간소화된 처리를 위한 고급 컴퓨팅 도구가 필요합니다. 수천 개의 신경 앙상블에서 동시에 데이터를 수집할 수 있는 HD-MEA 플랫폼의 기능은 장점이자 장애물입니다. 뇌 기능의 계산 역학에 대한 최고의 통찰력을 제공하지만 정교한 분석 프레임워크도 필요합니다. 이 JoVE 프로토콜에서는 대규모 이벤트 감지, 분류, 그래프 이론, 주파수 분석 및 기계 학습을 포함한 계산 전략의 예를 제공했습니다. 이러한 방법은 복잡한 신경 데이터 분석의 문제를 해결하기 위한 집중적인 노력을 강조합니다. 그럼에도 불구하고 이러한 다차원 신경 데이터 세트를 분석하기 위한 고급 계산 도구를 개발할 수 있는 상당한 여지가 여전히 있습니다. 적절한 도구와 방법론으로 무장한 HD-MEA 플랫폼의 잠재력은 확대되어 건강한 상태와 병리학적 상태 모두에서 뇌 기능의 복잡성에 대한 심오한 통찰력을 제공합니다.
본질적으로 HD-MEA 플랫폼은 논의된 세부 프로토콜 및 계산 도구와 통합될 때 뇌의 복잡한 작동을 이해하기 위한 혁신적인 접근 방식을 제공합니다. 대규모, 다중 규모 및 다중 모드 역학을 캡처하여 학습, 기억 및 정보 처리와 같은 프로세스에 대한 귀중한 통찰력을 제공합니다. 또한 체외 인간 iPSC 네트워크에서의 적용은 약물 스크리닝 및 맞춤형 의학에 혁명을 일으킬 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. 그러나 이 플랫폼은 신경 과학 연구의 상당한 발전을 나타내지만 내재된 기술적 문제를 인정하고 해결하는 것이 중요합니다. 지속적인 개선과 고급 계산 도구의 통합을 통해 HD-MEA 플랫폼은 정밀 진단 도구, 특정 바이오마커 식별 및 신경 장애에 대한 표적 치료의 새로운 시대를 열 준비가 되어 있습니다.
Disclosures
저자는 경쟁 또는 재정적 이익이 없음을 선언합니다.
Acknowledgments
이 연구는 기관 기금(DZNE), Helmholtz Validation Fund(HVF-0102) 내 Helmholtz Association, Dresden International Graduate School for Biomedicine and Bioengineering(DIGS-BB)의 지원을 받았습니다. 또한 드레스덴 DZNE-드레스덴의 행동 동물 실험 플랫폼(Alexander Garthe, Anne Karasinsky, Sandra Günther, Jens Bergmann)의 지원에도 감사의 뜻을 전합니다. 그림 1의 일부는 플랫폼 BioRender.com 를 사용하여 작성되었음을 알려드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 150 mm Glass Petri Dish | generic | generic | Brain Preparation Workspace, Brain Slice Recording Workspace |
| 0.22 μm Sterile Filter Unit | Assorted | Assorted | Assorted |
| 90 mm Plastic Culture Dish | TPP | 93100 | Brain Preparation Workspace, Brain Slice Recording Workspace |
| Agarose | Roth | 6351.5 | Brain Preparation Workspace |
| Agarose Mold | CUSTOM | CUSTOM | Brain Preparation Workspace; Custom designed 3D Printer Design, available upon request |
| Aluminum Foil | generic | generic | Brain Extraction Workspace |
| Anesthesia chamber | generic | generic | Brain Extraction Workspace; Assorted Beaker, Bedding etc |
| Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A4544-25G | Solution Preparation Workspace |
| Assorted Beakers | generic | generic | Solution Preparation Workspace; 50 mL |
| Assorted Luers | Cole Parmer | 45511-00 | Brain Slice Recording Workspace |
| Assorted Volumetric flasks | generic | generic | Solution Preparation Workspace; 500 mL, 1 L |
| B27 Supplement | Life Technologies | 17504-044 | BrainXell Commercial Supplier Protocol |
| BDNF | Peprotech | 450-02 | BrainXell Commercial Supplier Protocol |
| Biological Safety Cabinet with UV Lamp | Assorted | Assorted | HD-MEA Coating, Plating, Mainainance Workspace |
| BrainPhys Neuronal Medium | STEMCELL Technologies | 05790 | CDI, and BrainXell Commerical Supplier Protocol |
| Brainwave Software | 3Brain AG | Version 4 | Brain Slice and Human iPSC Recording Workspace |
| BrainXell Glutamatergic Neuron Assay | BrainXell | BX-0300 | BrainXell Commercial Supplier Protocol |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | 21115-100ML | Solution Preparation Workspace |
| Carbogen | generic | generic | All Workspaces; 95%/5% O2 and CO2 mixture |
| Cell Culture Incubator | Assorted | Assorted | Assorted |
| CMOS-based HD-MEA chip | 3Brain AG | CUSTOM | Brain Slice and Human iPSC Recording Workspace |
| Conical Tubes, 50 mL, Falcon (Centrifuge Tubes) | STEMCELL Technologies | 38010 | CDI Commerical Supplier Protocol |
| Crocodile Clip Grounding Cables | JWQIDI | B06WGZG17W | Brain Slice Recording Workspace |
| Curved Forceps | FST | 11052-10 | Brain Extraction Workspace |
| DMEM/F12 Medium | Life Technologies | 11330-032 | BrainXell Commercial Supplier Protocol |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline without Ca2+ and Mg2+ (D-PBS) | STEMCELL Technologies | 37350 | CDI Commerical Supplier Protocol |
| Filter Paper | Macherey-Nagel | 531 011 | Brain Preparation Workspace |
| Fine Brush | Leonhardy | 773 | Brain Slice Preparation Workspace, Brain Slice Recording Workspace |
| Forceps | VITLAB | 67895 | Brain Slice Recording Workspace |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | BrainXell Commercial Supplier Protocol |
| Geltrex | Life Technologies | A1413201 | BrainXell Commercial Supplier Protocol |
| Glass pasteur pipette | Roth | 4518 | Brain Slice Preparation Workspace, Brain Slice Recording Workspace |
| Glucose | Sigma Aldrich | G7021-1KG | Solution Preparation Workspace |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050-061 | BrainXell Commercial Supplier Protocol |
| Gravity-based Perfusion System | ALA | VC3-8xG | Brain Slice Recording Workspace |
| HD-MEA Recording platform | 3Brain AG | CUSTOM | Brain Slice and Human iPSC Recording Workspace |
| Heater | Warner Instruments | TC-324C | Brain Slice Recording Workspace |
| Hemocytometer or Automated Cell Counter | Assorted | Assorted | HD-MEA Coating, Plating, Mainainance Workspace |
| Hypo Needles | Warner Instruments | 641489 | Brain Slice Recording Workspace |
| iCell GlutaNeurons Kit, 01279 | CDI | R1061 | CDI Commerical Supplier Protocol |
| Iris Scissors | Vantage | V95-304 | Brain Extraction Workspace |
| Isoflurane | Baxter | HDG9623 | Brain Extraction Workspace |
| KCl | Sigma Aldrich | P5405-250G | Solution Preparation Workspace |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | CDI Commerical Supplier Protocol |
| Liquid Nitrogen Storage Unit | Assorted | Assorted | HD-MEA Coating, Plating, Mainainance Workspace |
| Magnetic Stirrer | generic | generic | Solution Preparation Workspace |
| Metal Screws | Thorlabs | HW-KIT2/M | Brain Slice Recording Workspace |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M1028-100ML | Solution Preparation Workspace |
| MgSO4 | Sigma Aldrich | 63138-250G | Solution Preparation Workspace |
| Microdissection Tool Holder | Braun | 4606108V | Brain Slice Preparation Workspace, Brain Slice Recording Workspace |
| Microdissection Tool Needle | Braun | 9186166 | Brain Slice Preparation Workspace, Brain Slice Recording Workspace |
| Modular Stereomicroscope | Leica | CUSTOM | Brain Slice Recording Workspace; custom specifications and modifications |
| N2 Supplement | Life Technologies | 17502-048 | CDI, and BrainXell Commercial Supplier Protocol |
| NaCl | Sigma Aldrich | S3014-1KG | Solution Preparation Workspace |
| NaH2PO4 | Sigma Aldrich | S0751-100G | Solution Preparation Workspace |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761-500G | Solution Preparation Workspace |
| Neurobasal Medium | Life Technologies | 21103-049 | BrainXell Commercial Supplier Protocol |
| Optical Cage System | Thorlabs | Assorted | Brain Slice Recording Workspace |
| Optical Table w/Breadboard | Thorlabs | SDA7590 | Brain Slice Recording Workspace |
| PDLO | Sigma Aldrich | P0671 | HD-MEA Coating, Brain Slice Recording Workspace |
| Penicillin-streptomycin, 100x | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | CDI Commerical Supplier Protocol |
| Pipette tips | TipONE | S1120-8810 | Brain Slice Recording Workspace |
| Pipettors | Assorted | Assorted | Assorted |
| Platinum Anchor | CUSTOM | CUSTOM | Brain Slice Recording Workspace |
| Polyethylene Tubing | Assorted | Assorted | Brain Slice Recording Workspace |
| Pump | MasterFlex | 78018-22 | Brain Slice Recording Workspace |
| Razor Blade | Apollo | 10179960 | Brain Preparation Workspace |
| Reference Electrode Cell Culture Cap | CUSTOM | CUSTOM | Human iPSC Recording Workspace; Custom designed 3D Printer Design, available upon request |
| Rubber Pipette Bulb | Duran Wheaton Kimble | 292000205 | Brain Slice Preparation Workspace, Brain Slice Recording Workspace |
| Serological Pipettes, 1 mL, 2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL | Assorted | Assorted | Assorted |
| Slice Recovery Chamber | CUSTOM | CUSTOM | Brain Slice Recovery Workspace; Custom designed 3D Printer Design, available upon request |
| Spatula | ISOLAB | 047.06.150 | Brain Preparation Workspace |
| Sucrose | Sigma Aldrich | 84100-1KG | Solution Preparation Workspace |
| Super Glue | UHU | 358221 | Brain Slice Preparation Workspace |
| Surgical Scissors | Peters Instruments | BC 344 | Brain Extraction Workspace |
| Tabletop Centrifuge | Assorted | Assorted | Assorted |
| TGF-β1 | Peprotech | 100-21C | BrainXell Commercial Supplier Protocol |
| Tissue Paper | generic | generic | Brain Extraction Workspace |
| Trypan Blue | STEMCELL Technologies | 07050 | CDI Commerical Supplier Protocol |
| Upright Microscope | Olympus | CUSTOM | Imaging Workspace; Custom specifications and modifications |
| Vacusip | Integra | 159010 | Brain Slice Recording Workspace |
| Vibratome | Leica | VT1200s | Brain Slice Preparation Workspace; Includes: Specimen plate, buffer tray, ice tray, specimen plate holding tool, vibratome blade adjusting tool |
| Vibratome Blade | Personna | N/A | Brain Slice Preparation Workspace |
| Water Bath | Lauda | L000595 | Brain Slice Recovery Workspace |
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