교정 곡선

교정 곡선을 사용하여 알 수 없는 샘플의 농도를 예측할 수 있습니다. 완전히 정확하려면 표준 샘플을 알 수 없는 샘플과 동일한 행렬에서 실행해야 합니다. 샘플 매트릭스는 시료에 존재할 수 있는 용매 및 모든 염, 단백질, 금속 이온 등을 포함하는 관심 있는 분석물 이외의 샘플의 성분이다. 실제로, 알 수 없는 샘플이 복잡한 생물학적 또는 환경 샘플에서 일 수 있기 때문에, 알 수 없는 것과 동일한 매트릭스에서 교정 샘플을 실행하는 것은 때때로 어렵습니다. 따라서, 많은 교정 곡선은 인공 뇌척수액 또는 인공 소변과 같은 실제 샘플을 밀접하게 근사화하는 샘플 매트릭스에서 만들어지지만 정확하지 않을 수 있습니다. 보정 곡선의 농도 범위는 예상 알 수 없는 샘플에서 브래킷을 해야 합니다. 이상적으로 예상 농도 샘플 위와 아래 몇 농도 측정된다.

많은 교정 곡선은 선형이며 m이 경사이고 b가 y-intercept인 기본 방정식 y=mx+b에 맞을 수 있습니다. 그러나 모든 곡선이 선형이 아니며 때로는 선을 얻으려면 하나 또는 두 개의 축 세트가 로그리스믹 스케일에 있습니다. 선형 회귀는 일반적으로 컴퓨터 프로그램을 사용하여 수행되며 가장 일반적인 방법은 최소 사각형 피팅을 사용하는 것입니다. 선형 회귀 분석을 통해 결정 계수라고 하는 R² 값이 주어집니다. 간단한 단일 회귀의 경우 R^2는 상관 계수(r)의 제곱이며 y 값이 예측 된 선에서 얼마나 멀리 떨어져 있는지에 대한 정보를 제공합니다. 완벽한 선은 R² 값이 1이고 교정 곡선의 대부분의 R² 값은 0.95이상입니다. 교정 곡선이 선형인 경우 경사는 감도의 척도입니다: 농도 변화에 대한 신호의 변화정도입니다. 경사가 큰 가파른 선은 보다 민감한 측정을 나타냅니다. 교정 곡선은 계측기가 선형 응답을 제공하는 농도 범위인 선형 범위를 정의하는 데도 도움이 될 수 있습니다. 이 범위 외부에서는 기악 고려 사항으로 인해 응답이 테이퍼될 수 있으며 교정방정식을 사용할 수 없습니다. 이를 선형성 제한이라고 합니다.

검출 제한은 노이즈로부터 통계적으로 결정할 수 있는 가장 낮은 양입니다. 일반적으로 이것은 잡음의 3배인 신호로 정의됩니다. 검출 제한은 교정 곡선의 경사에서 계산할 수 있으며 일반적으로 S.D.가 노이즈의 표준 편차인 LOD=3*S.D./m로 정의됩니다. 잡음은 여러 측정의 표준 편차를 취하여 측정됩니다. 또는 한 추적에서 노이즈를 기준선의 표준 편차로 추정할 수 있습니다. 수량 제한은 샘플 간에 분화할 수 있고 일반적으로 노이즈의 10배로 정의되는 양입니다.

1. 표준 만들기: 직렬 희석

1. 표준의 농축 재고 솔루션을 만드십시오. 전형적으로, 화합물은 정확하게 밖으로 무게다음 양적 플라스크로 정량적으로 전송된다. 일부 용매를 추가, 샘플이 용해되도록 혼합, 다음 적절한 용매와 라인에 채우기.
2. 직렬 희석을 수행합니다. 희석에 필요한 표준의 양을 다른 체피 플라스크와 파이펫을 가져 간 다음 용매로 라인에 채우고 혼합하십시오. 10배 희석은 전형적으로 이루어지므로 10mL 체적 플라스크의 경우 이전 희석의 1mL를 추가합니다.
3. 더 많은 희석에 필요한 대로 계속, 다음 샘플을 만들기 위해 희석하기 위해 이전 솔루션에서 파이펫. 좋은 교정 곡선을 위해서는 적어도 5 개의 농도가 필요합니다.

2. 교정 곡선및 알 수 없는 샘플 실행

1. UV-Vis 분광광계로 샘플을 실행하여 교정 곡선에 필요한 기악 반응을 결정합니다.
2. 첫 번째 샘플로 읽기를 가져 가라. 체계적인 오류가 있는 경우 무작위로 샘플을 실행하는 것이좋습니다(즉, 가장 높거나 가장 높지 않음에서 가장 높지 않음에서 가장 높지 않음). 소음의 추정을 얻으려면 주어진 샘플 3-5x에서 판독값을 반복하십시오.
3. 추가 표준 샘플을 실행하여 각 샘플에 대한 측정을 반복하여 잡음의 추정값을 얻습니다. 나중에 플롯을 만들 도록 데이터를 기록합니다.
4. 알 수 없는 샘플을 실행합니다. 가능한 한 표준을 실행하는 것과 유사한 조건을 사용합니다. 따라서, 샘플 매트릭스 또는 버퍼는 동일해야 하며, pH는 동일해야 하며, 농도는 표준 실행의 범위에 있어야 한다.

3. 교정 곡선 만들기

1. 스프레드시트에 데이터를 기록하고 컴퓨터 프로그램을 사용하여 데이터 대 농도를 플롯합니다. 각 점에 대해 적어도 트리플리케이트 측정을 수행한 경우 오류 막대는 각 점의 오류를 추정하기 위해 해당 측정값의 표준 편차를 플로팅할 수 있습니다. 일부 곡선의 경우 데이터를 선을 얻으려면 로그로 축으로 플로팅해야 할 수 있습니다. 교정 곡선을 제어하는 방정식은 일반적으로 미리 알려지므로 방정식에 로그가 있을 때 로그 플롯이 사용됩니다.
2. 교정 곡선을 검사합니다. 선형으로 보이나요? 비선형으로 보이는 부분이있습니까(예: 기악 응답의 한계에 도달)? 확인하려면 모든 데이터를 소프트웨어를 사용하여 선형 회귀에 맞춥시게 합니다. 결정계수(R2)가높지 않은 경우, 선에 맞지 않는 커브의 시작 또는 끝에 있는 일부 점을 제거하고 선형 회귀를 다시 수행한다. 큰 오류 표시줄이 있기 때문에 중간에 있는 점을 제거하는 것은 허용되지 않습니다. 이 분석에서 곡선의 어떤 부분이 선형인지 결정합니다.
3. 선형의 출력은 m이 경사이고 b가 y-intercept인 형식 y=mx+b의 방정식이어야 합니다. 경사의 단위는 y축 단위/농도이며, 이 예에서(도 1)흡광도/μM이다. y-intercept 단위는 y축 단위입니다. 결정계수(R2)가 얻어진다. R^2가 높을수록 적합도가 높아진다. 완벽한 핏으로 R^2의 1이 됩니다. 프로그램은 또한 경사 및 가로채기에 오류의 추정을 제공 할 수 있습니다.

4. 결과: 블루 염료의 흡수도 보정 곡선 #1

1. 파란색 염료 #1(631nm)의 흡수를 위한 교정 곡선은아래(그림 1)를도시한다. 응답은 0에서 10 μM까지 선형입니다. 그 농도는 반응이 UV-Vis 분광포토미터의 선형 범위를 벗어났기 때문에 신호가 평준화되기 시작합니다.
2. LOD를 계산합니다. 교정 곡선의 경사에서 LOD는 3 *S.D. (노이즈)/m입니다. 이러한 교정 곡선의 경우, 노이즈는 반복 측정의 표준 편차를 취하여 얻어졌고 0.021이었다. LOD는 3*0.021/.109=0.58 μM입니다.
3. LOQ를 계산합니다. LOQ는 10*S.D.(노이즈)/m입니다. 이 교정 곡선의 경우 LOQ는 10*0.021/.109 =1.93 μM입니다.
4. 알 수없는 농도를 계산합니다. 선 방정식을 사용하여 알 수 없는 샘플의 농도를 계산합니다. 교정 곡선은 알 수 없는 것이 표준 샘플의 선형 범위에 속하는 경우에만 유효합니다. 판독값이 너무 높으면 희석이 필요할 수 있습니다. 이 예에서는 알 수 없는 스포츠 음료가 1:1로 희석되었습니다. 흡광도는 0.243이고 이것은 2.02 μM의 농도에 해당했다. 따라서 스포츠 음료에서 #1 청색 염료의 최종 농도는 4.04 μM이었다.

그림 1. 블루 염료의 UV-Vis 흡수를 위한 교정 곡선. 왼쪽: 흡광도는 #1 있는 청색 염료의 다른 농도로 측정되었습니다. 흡광도가 1이상인 10μM 이후에 응답이 레벨오프됩니다. 오류 막대는 동일한 샘플의 반복된 측정에서 발생하며 표준 편차입니다. 오른쪽: 교정 곡선의 선형 부분은 선, y=0.109*x + 0.0286에 맞습니다. 알 수 없는 데이터는 검은색으로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

교정 곡선은 분석 화학, 생화학 및 제약 화학 분야의 많은 분야에서 사용됩니다. 분광법, 크로마토그래피 및 전기 화학 측정과 함께 사용하는 것이 일반적입니다. 교정 곡선은 토양 샘플에서 환경 오염 물질의 농도를 이해하는 데 사용할 수 있습니다. 그것은 뇌 액의 샘플에서 신경 전달 물질의 농도 결정 사용할 수 있습니다., 제약 샘플에 비타민, 또는 음식에 카페인. 따라서 교정 곡선은 환경, 생물학적, 제약 및 식품 과학 응용 분야에서 유용합니다. 교정 곡선을 만드는 데 있어 가장 중요한 부분은 시료 혼합물과 밀접하게 근사하는 매트릭스에 있는 정확한 표준 샘플을 만드는 것입니다.

전기화학 보정 곡선의 예가아래(그림 2)를도시한다. 데이터는 불소용 이온 선택적 전극으로 수집되었다. 전기화학 데이터는 Nernst 방정식 E=E⁰ + 2.03*R*T/(nF) * 로그 C를 따릅니다. 따라서, 농도 데이터(x축)는 선을 얻기 위해 로그 스케일에 그려야 한다. 이 교정 곡선은 치약이나 식수의 불소 농도를 측정하는 데 사용될 수 있습니다.

그림 2. 이온 선택적 전극에 대한 교정 곡선. 불소의 다른 농도에 대한 불소 선택적 전극(mV 내)의 반응이 플롯된다. 전극 응답에 대한 예상 방정식은 25°C에서 y(mV)=-59.2*로그 x+b입니다. 실제 방정식은 y=-57.4*로그 x +56.38입니다. R² 값은 0.998입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.