Microfluidic 흐름 전지를 사용하여 흐름에서 혈소판 접착 및 집계

바이오 플럭스 시스템은 제어된 순류(sheer flow)에서 살아있는 세포 분석을 실행하기 위한 자동화된 기기 및 미세유체 장치입니다. 이 시스템은 웰 플레이트 미세유체 기술을 사용하여 미크론 규모의 플로우 셀 장치를 SBS 표준 웰 플레이트에 통합합니다. BioFlex는 높은 처리량과 감소된 혈액량으로 혈소판 부착 및 응집 연구를 수행하는 데 사용할 수 있습니다.

형광 염료로 표지된 전혈을 우물에 첨가한 다음 채널을 통해 흐릅니다. 제어된 순류(sheer flow) 하에서 고해상도 현미경 데이터가 생성되며, 이는 약물 화합물 및 기타 다양한 매개변수가 있는 상태에서 혈소판 부착 및 응집을 정량화합니다. 안녕하세요, 저는 Flexion Biosciences의 RD 연구소에서 근무하는 Mike Schwartz입니다.

오늘 우리는 혈소판 접착 분석에서 미세유체 플로우 셀을 사용하는 절차를 보여드리겠습니다. 당사는 실험실에서 다양한 혈관 생물학 분석을 위해 이 프로토콜을 사용합니다. 시작하겠습니다.

쇠고기, 플로우 셀 실험을 실행하기 전에 바이오 플럭스 플레이트의 미세유체 채널은 이 실험에 사용될 관심 콜라겐의 단백질 코팅으로 준비되어야 합니다. 바이오 플럭스 플레이트의 24개 실험 채널 각각은 이 플레이트의 입구 우물과 출구 우물에 연결됩니다. 입구 우물은 채널을 공급하는 왼쪽 우물이고 출구 우물은 오른쪽에 있으며 콜라겐 1 스톡을 밀리리터당 200 마이크로 그램의 농도로 희석합니다.

0.02 몰 아세트산에서는 사용되는 각 채널에 대해 20 마이크로 리터가 필요합니다. 이 실험에는 11개의 채널이 필요하므로 200마이크로리터의 콜라겐 코팅을 만듭니다. 한 채널은 코팅되지 않은 상태로 유지되며, 마이크로 피펫 팁과 함께 부드러운 반복에 의해 혼합됩니다.

마이크로 피펫을 사용하여 각 채널에 20마이크로리터의 코팅을 추가하여 액체를 웰의 내부 펀치로 분배합니다. 여기에 표시된 바와 같이 관심 미세유체 채널에 노란색 염료를 공급하면 혈소판 부착 및 응집에 대한 음성 대조군으로 콜라겐이 없는 하나의 채널이 포함됩니다. 콜라겐 코팅이 모든 해당 채널에 추가된 후 인터페이스를 플레이트에 부착합니다.

bio flux 1000 인터페이스를 사용하는 경우 두 래치를 모두 스테이지에 고정할 수 있습니다. Bio flux 200 인터페이스를 사용하는 경우 첫 번째 손가락으로 4개의 나사를 조입니다. 그런 다음 모두 설정되면 토크 드라이버를 사용하여 완전히 조입니다.

토크 드라이버는 최대값에 도달하면 딸깍 소리를 냅니다. 바이오 플럭스 소프트웨어의 수동 모드를 사용하여 배출구에서 2D 제곱센티미터로 관심 채널에 관류를 적용합니다. 글쎄요, 현미경에서 저전력 대물렌즈를 사용하여 입구 웰을 찾고 반대쪽 내부 펀치가 액체로 채워지는 것을 관찰합니다.

먼저 몇 분 후에 내부 펀치를 천천히 채우고 입구 내부 펀치가 채워지면 소프트웨어에서 중지를 눌러 모든 채널에서 풍요로움을 멈춰야 합니다. 플레이트를 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 이 잠복기 동안에는 1시간의 잠복이 끝나면 전혈 준비를 시작할 수 있습니다.

혈액이 준비되면 계면을 제거하고 PBS 1ml와 칼슘 및 마그네슘 이온을 배출구에 추가합니다. 글쎄, 콘센트 우물에서 센티미터 당 2 딘으로 풍성하게 시작하고 10 분 동안 계속 풍성하게 계속하십시오. 10분 후, 풍요로움을 멈추십시오 계면을 제거한 후 입구와 출구 우물 모두에서 과도한 PBS를 제거합니다.

내부 펀치를 채우는 액체를 제거하지 마십시오. 채널을 차단하려면 각 콘센트에 1ml의 차단 용액을 추가하십시오. 잘 사용하기 위하여, 출구에서 2개의 식사에 센티미터 당 제곱으로 관류하고 10 분 동안 관류를 계속하십시오.

10분 후에 풍요로움을 멈추고 인터페이스를 제거하십시오. 이제 채널이 준비되었으며 플레이트가 콜라겐으로 코팅되는 동안 하루 종일 사용할 수 있습니다. 1시간의 배양 동안, 단식 중인 개인의 신선한 혈액을 이미징하고 플레이트로 주입할 수 있도록 준비해야 합니다.

혈액은 구연산나트륨, 항응고제에 넣어야 하며 채취 후 3시간 이내에 사용해야 합니다. 먼저, DMSO에 함유된 칼슘 M 4밀리몰을 부피당 1-1000 부피로 희석하여 혈액에 첨가합니다. 4 마이크로 몰을 얻기 위해 칼슘은 부드러운 반전으로 혼합됩니다.

다음으로, 칼슘 am이라고 표시된 혈액 1ml를 10개의 1포인트 5밀리리터 마이크로 튜브에 분배합니다. GP 2 B 3 a 억제제 항체를 원하는 희석으로 각 튜브에 추가합니다. 무 항체 음성 대조군과 부드러운 반전으로 혼합된 관련 없는 항체 양성 대조군을 포함해야 합니다.

플로우 셀(flow cell) 실험을 실행하기 전에 10분마다 부드러운 반전으로 혼합하여 실온에서 튜브를 1시간 동안 배양합니다. 콜라겐을 위한 바이오 플럭스 제어 모듈에 자동화된 프로토콜을 설정해야 합니다. 1. 배출구에서 10분 동안 109센티미터 제곱미터의 속도로 혈액을 흐르도록 프로토콜을 설정합니다.

음, BioFlex 1000 워크스테이션을 사용하여 fitz 파장 및 타임 랩스 설정에서 원하는 스테이지 위치 획득을 포함하는 데이터 수집 매개변수를 설정해야 합니다. 이 프로토콜에 대한 일반적인 이미지 획득 계획은 총 10분 동안 30초마다 10 x 대물렌즈를 사용하여 캡처할 채널당 하나의 시야각으로 구성됩니다. 추가 시야 및 대체 타임랩스 설정도 가능합니다.

자동 프로토콜 및 데이터 수집 매개변수가 설정되면 BioFlex 플레이트로 돌아가 내부 펀치를 제외한 채널 양쪽의 액체를 제거합니다. 신속하게 작업하기 위해 각 조건의 혈액 500마이크로리터를 각 채널의 출력 웰에 넣습니다. output wells는 관찰 영역까지의 최단 경로이고 콜라겐 코팅에 대한 혈액의 보다 즉각적인 반응을 제공하기 때문에 혈액을 전달하는 데 사용됩니다.

또한 항체가 없는 대조 혈액을 콜라겐으로 코팅된 채널과 방금 막힌 채널에 배치합니다. 플레이트를 BioFlex 1000 워크스테이션 현미경에 놓고 인터페이스를 고정합니다. 원점으로 정의된 첫 번째 교정 지점을 찾아 스테이지 목록 보정을 수행합니다.

그런 다음 두 번째 보정 지점을 찾아 표시합니다. 이 보정을 적절한 스테이지 목록에 적용합니다. 이렇게 하면 플레이트의 모든 보기 위치를 자동으로 찾을 수 있습니다.

혈액 세트가 포함된 채널 중 하나로 스테이지를 이동하여 BioFlex 몽타주 소프트웨어에서 노출 시간 및 게인과 같은 이미지 캡처 파라미터를 맞춥니다. 원하는 버튼을 클릭하여 적절한 워크플로우를 시작합니다. 이렇게 하면 흐름 프로토콜과 이미지 획득이 동시에 시작됩니다.

실험이 끝나면 BIOFLU 1000 워크스테이션에서 플레이트를 제거하고 기관 지침에 따라 폐기합니다. 바이오 플럭스 시스템의 콜라겐 코팅 미세유체 채널 사용. 공격적인 혈전 형성은 처리되지 않은 대조군 혈액 샘플에서 시간이 지남에 따라 관찰됩니다.

대조적으로, 코팅되지 않은 채널에서는 혈전 형성이 관찰되지 않습니다. 최근에 수행된 한 실험에서 통제 조건에서 응집체의 평균 크기는 2000마이크로미터 제곱이었습니다. GP two B three A는 콜라겐에 대한 접착에 의해 활성화될 때 혈소판 혈소판 상호작용 및 응집 안정화의 강력한 매개체이며, 순전히 노출되기 전 1시간 동안 anti GB two B three a 항체로 배양 후 혈전의 크기 감소 및 혈전 형성 빈도의 감소가 관찰됩니다.

용량 의존적 반응은 일반적으로 109cm 제곱미터에서 관찰될 수 있으며 이 특정 억제제에 대한 IC 50 값은 17나노몰이었습니다. 항체가 없는 대조군과 비교하여 이 기증자에 대한 최대 억제는 10 dine centimeter 제곱에서 11%였습니다. 48 웰 높은 전단 플레이트는 최대 200D per cm 제곱 또는 5, 000 역 초까지 보존혈액 실험을 실행하는 데에도 사용할 수 있습니다.

방금 미세유체 흐름 채널을 사용하여 생리학적으로 관련된 혈관 생물학 실험을 수행하는 방법을 보여드렸습니다. 이 프로토콜을 수행할 때 올바른 완충액에서 콜라겐을 희석하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 항상 올바른 피펫팅 기법을 사용하여 기포가 유입되지 않도록 하고 항상 실험실의 생물 안전 규정을 준수하십시오.

그게 다야. 시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.