층류의 전단 응력에 따라 내피 전구 세포를 평가하기 위해 병렬 플레이트 흐름 회의소와 지속적인 흐름 회로

이 비디오 기사의 전반적인 목표는 부착 세포를 층류 조건에 적용하고 잘 정량화할 수 있는 유체 전단 응력에 대한 반응을 평가하는 기술을 설명하는 것입니다. 이것은 먼저 플로우 챔버 없이 플로우 회로를 조립함으로써 달성됩니다. 회로에는 리저버 펄스, 댐퍼, 하드 튜빙, 소프트 튜빙, 4방향 스톱 콕 및 연결된 루어 어댑터, 에어 필터가 포함됩니다.

다음 단계는 멸균 상태에서 셀 매체와 같은 원하는 풍성한 8개로 회로를 채운 다음 펌프를 시작하여 펄스 댐퍼를 채우고 공기 튜브를 퍼지하는 것입니다. 그 다음에는 셀 장착 슬라이드를 플로우 챔버의 바닥 플레이트에 삽입합니다. 절차의 마지막 단계는 플로우 챔버가 일렬로 연결된 플로우 회로의 완전한 조립입니다.

궁극적으로, 형광 현미경을 사용하여 투명 챔버를 통해 유체 전단 응력에 노출된 상태에서 형광 표지된 내피 전구 세포의 정렬을 보여주는 결과를 얻을 수 있으며, 이를 통해 세포의 기능적 거동을 연구할 수 있습니다. 세포에 유체 전단 응력을 가하여 생체 내 생리학을 모방해야 하는 경우가 많습니다. 우리는 병렬 플레이트 흐름 챔버와 연속 흐름 회로를 설계하여 흐름 조건에서 셀을 연구하고 투명 챔버를 통해 관찰할 수 있습니다.

이 기술은 의학 및 공학 분야에서 귀중한 연구 도구가 될 수 있습니다. 당사의 플로우 챔버(flow chamber)는 정립 또는 도립 현미경을 사용하여 유동 중인 세포의 간헐적 또는 실시간 시각화를 가능하게 합니다. 또한 Dr.Ach Nick의 설계를 통해 연구원들은 표준 현미경 렌즈를 사용하여 투명 또는 방사선 불투과성 표면의 세포를 이미지화할 수 있습니다.

또한, 유동 조건에서 세포에 대한 약물의 효과를 연구하기 위해 약리학 연구에서 중요한 도구로 사용될 수 있습니다. 설정의 시각화는 프로토콜 읽기만으로는 여러 단계를 마스터하기 어렵기 때문에 매우 중요합니다. Dr.Ock Next의 실험실에서 일반적으로 사용되는 플로우 챔버와 플로우 회로를 설정하는 방법에 대한 단계별 지침을 제공하여 플로우 회로를 조립하도록 하겠습니다.

펄스 댐퍼의 한쪽 끝에 36인치 하드 튜빙 세그먼트를 부착하여 시작합니다.amp다른 쪽 끝에. 18인치 세그먼트의 소프트 튜빙을 부착합니다. 18인치 소프트 튜빙 섹션 끝에 8인치 수형 루어 어댑터 1개를 놓습니다.

수컷 루어를 1/8인치 암컷 루어 어댑터에 연결합니다. 암 루어를 새로운 18인치 소프트 튜빙 세그먼트에 부착합니다. 250ml 유리 비커 캡에 세 개의 구멍을 뚫습니다.

튜브를 끼우려면 1.5인치 세그먼트의 소프트 튜브를 하나의 구멍에 삽입하십시오. 통풍구로. 캡에 있는 다른 두 개의 구멍을 통해 단단하고 부드러운 튜브의 다른 쪽 끝을 저장소 역할을 하는 250ml 유리병에 삽입합니다.

단단한 튜브가 저장소 바닥에 닿는지 확인하십시오. 회로 설정 전반에 걸쳐 무균 상태를 유지하는 것은 이 절차의 성공에 매우 중요합니다. 따라서 모든 부품은 멸균되어야 하며 전체적으로 멸균 장갑을 착용해야 합니다.

조립된 부품 외에도 이러한 부품은 멸균해야 합니다. 완전한 플로우 챔버 1개, 소프트 튜빙 3 x 2인치 세그먼트, 수형 1개 및 암수 1개, 8인치 루어 어댑터 1개, 1/2인치 납작머리 나사 4개, 6 5 16인치, 8개 30초. 인치당 인치 트랙, 납작머리 나사, 핀셋 한 쌍, 유리 슬라이드 한 개, 증기로 살균된 수건 두 장.

섭씨 121도에서 60분 동안 고압멸균. 유량 회로 흐름 챔버를 4 x 4 방향 정지 콕을 하나씩 한 방향으로 놓고 스톱 콕 및 모든 멸균 된 부품을이 멸균 필드에 놓습니다. 멸균 장갑을 착용한 상태에서 두 개의 4방향 스톱 콕을 연결합니다.

열린 샘플 포트에 캡을 놓습니다. 흐름 회로의 두 개의 소프트 튜빙 세그먼트를 연결하는 수형 및 암형 루어 어댑터를 분리하고 연결된 스톱 코크를 삽입합니다. 탱크에 삽입된 부드러운 튜브를 30ml 주사기에 부착하고 주사기 피스톤을 제거합니다.

병에 125ml의 EPC 배지를 채웁니다. 소프트 튜브를 스톱 콕에 다시 연결합니다. 멸균 주사기 필터를 통풍구에 넣습니다.

이제 흐름 회로를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%의 가습 인큐베이터로 옮깁니다. Clamp 단단한 튜브를 이러한 유형의 석탄 Palmer 튜브와 함께 사용하도록 표시된 마스터 플렉스 롤러 펌프 헤드에 넣습니다. 튜브가 롤러 펌프 장착 트랙과 겹치지 않는지 확인하십시오.

펌프 헤드에서 나오는 튜브의 양쪽 위치를 마킹 펜으로 표시합니다. 모든 스톱 코크가 샘플 포트 쪽으로 닫히고 흐름 회로를 따라 열려 있는지 확인한 후 펌프를 시작합니다. 흐름의 방향을 확인합니다.

PERFUSE 8은 유리 저장소에서 하드 튜브를 통해 펄스 댐퍼로 이동해야 합니다. 플로우 챔버 조립의 경우, 멸균 장갑을 사용하여 2인치 소프트 튜빙 세그먼트 1개를 1/8인치 암 루어 어댑터 1개에 연결합니다. 다른 2인치 소프트 튜빙 세그먼트를 1/8인치 수형 루어 어댑터에 연결합니다.

암 루어 어댑터가 있는 2인치 소프트 튜브를 유입 포트에 부착하고 수 루어 어댑터가 있는 2인치 소프트 튜브를 유출 포트에 부착합니다. 이 두 루어 어댑터에 4방향 스톱 코크를 부착하십시오. 나머지 2인치 소프트 튜빙 조각을 버블 트랩에서 나오는 측면 포트 커넥터에 연결하고 멸균 핀셋을 사용하여 단방향 스톱 콕을 부착합니다.

세포 배양 용기에서 세포 시딩된 슬라이드를 제거하고 플로우 챔버의 바닥 플레이트에 있는 홈에 놓습니다. 주사기나 피펫을 사용하여 슬라이드가 셀 장착 면이 위를 향하도록 배치하고 셀 장착 슬라이드 위에 10ml의 따뜻한 EPC 매체를 놓습니다. 매체가 흐름 챔버의 슬라이드를 덮을 수 있도록 하되 바닥판의 O-링 위로 매체를 흘리지 마십시오.

플로우 챔버의 상판을 바닥 플레이트에 놓고 나사 구멍을 정렬합니다. 챔버 나사 플레이트에 기포가 유입되지 않도록 두 플레이트를 평행하게 유지하십시오. 함께. 배터리로 작동되는 자동 드라이버를 사용하여 de 유입 측 버블 트랩 포트에 부착된 단방향 정지 콕을 열어 유입 버블 트랩을 공기

10ml 주사기를 사용하여 유입 튜브를 EPC 매체로 부드럽게 세척한 다음 이 스톱 콕을 닫고 캡을 씌웁니다. 이제 공기 de 유출 포트 4방향 정지 콕을 열고 흐름 챔버를 통해 EPC 매체를 부드럽게 세척하여 챔버 채널을 만듭니다. 다시 10 밀리리터 주사기를 사용하여 4 방향 정지 수탉 연결을 모두 덮고 닫습니다.

flow chamber를 조립된 flow circuit과 함께 가습된 incubator로 옮깁니다. 유량 회로 펌프를 일시 중지하고 유량 회로를 닫습니다. 누출을 방지하기 위해 흐름 방향으로 자지를 멈춥니다.

플로우 챔버를 유량 회로에 연결 플로우 챔버를 유량 회로에 연결한 후 스톱 코크를 흐름 방향으로 엽니다. 유량 펌프를 다시 시작하고 PERFUSE 8이 올바른 방향으로 흐르는지 확인합니다. 유속을 원하는 순면 응력으로 조정합니다.

유동 실험 중에 플로우 챔버를 회로에서 제거하여 광 또는 형광 현미경을 통해 세포를 이미지화할 수 있습니다. 이렇게하려면 스톱 코크의 흐름 회로에서 흐름 챔버를 분리하여 콕 연결을 중지하십시오. 분석을 위해 8개의 샘플을 수집하기 위해 관류를 사용합니다.

먼저 펌프를 일시 중지하고 펄스 댐퍼에 가장 가까운 스톱 콕을 닫습니다. 보호 캡을 제거하고 거꾸로 놓아 오염되지 않았는지 확인하십시오. 작은 주사기를 샘플 포트에 삽입합니다.

플로우 챔버 방향으로 스톱 콕을 닫고 샘플 포트와 회로를 펄스 댐퍼 방향으로 유지합니다. 회로에서 원하는 양의 샘플을 끌어오고 주사기를 제거하기 전에 샘플 포트를 향해 스톱콕을 닫습니다. 여덟 개의 샘플을 라벨이 붙은 바이알에 보관하고 섭씨 영하 80도에서 얼립니다.

샘플 포트를 요약하고 흐름을 시작하기 전에 모든 스톱콕이 열려 있는지 확인하십시오. 이 방법을 사용하면 인간 혈액 유래 내피 전구 세포를 15분 이내에 티타늄 슬라이드에 파종하고 생리적 전단력에 부착할 수 있습니다. 이 그림에서 볼 수 있듯이, EPC는 파종 직후 약 210 평방 미크론에서 3 시간 후 약 657 평방 미크론, 평방 센티미터당 15 딘의 유체 전단 응력 48 시간 후에 약 1, 152 평방 미크론으로 흐름의 영향으로 확산됩니다.

이 광학 현미경 이미지는 인간 EPC의 무작위 방향을 보여줍니다. 평방 센티미터당 100 딘의 속도로 3시간 동안 흐른 후 6시간의 정적 착석 기간이 지난 후, 세포는 퍼졌지만 임의의 방향으로 남아 있습니다. 제곱센티미터당 100디미터에서 48시간 동안 유체 전단 응력을 가한 후 EPC가 정렬되고 흐름 방향으로 배향됩니다.

여기서 EPC는 CTO로 표지되고 세포핵은 herx로 염색되어 흐름 후 죽습니다. 비교를 위해 이 이미지는 흐름 방향에 따라 티타늄 슬라이드의 돼지 EPC를 보여줍니다. 48시간의 흐름과 전단 응력 노출의 제곱센티미터당 15딘 후, 세포 경계는 안티 pcam 염색으로 염색되고 핵은 사이톡신 핵산 염색으로 염색되었습니다.

또한 이 방법을 사용하면 분비된 세포 대사 산물의 분석 및/또는 정량화를 위해 미리 결정된 시점에서 PERFUSE eight의 샘플을 얻을 수 있습니다. 여기에 표시된 것은 돼지 EPC를 사용한 48시간 흐름 실험 중 아질산염 생산의 예입니다. 이 절차를 시도하는 동안 전체적으로 무균 상태를 유지하는 것이 중요합니다.

또한, 세포를 찢어버릴 수 있으므로 연속 흐름을 시작하기 전에 플로우 챔버의 기포 수를 줄이기 위해 필요한 조치를 취하는 것이 중요합니다. 또한 실험 중 PERFUSE eight의 누출을 방지하기 위해 풍부하기 전에 플로우 챔버와 회로의 모든 단일 연결을 확인하는 것이 좋습니다. 이 챔버는 내장 O-링으로 설계되어 상단 및 하단 플레이트의 완전한 반대를 허용하고 진공 펌프 없이 누출 방지 밀봉을 제공합니다.

또한 이 기능은 실험 사이에 일정한 챔버 높이를 보장하고 고무 개스킷 또는 조정의 필요성을 제거합니다. 당사의 플로우 챔버는 표준화된 현미경 슬라이드를 사용합니다. 따라서 추가 실험에 많은 수의 셀을 사용할 수 있습니다.

예를 들어, 플로우 후 세포의 RNA 및 DNA는 단백질 합성 또는 유전자 발현을 평가할 수 있습니다. 당사의 회로 설계는 유체 전단 응력 하에서 세포에서 분비되는 산화질소의 주요 산화 대사 산물인 아질산염과 같은 세포 대사 산물의 분석 및 정량화를 위해 8개의 관류 샘플을 수집할 수 있습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 접착 셀에 유체 전단 응력을 가하기 위해 당사의 플로우 챔버와 멸균 플로우 회로를 조립하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.