Name: 층류의 전단 응력에 따라 내피 전구 세포를 평가하기 위해 병렬 플레이트 흐름 회의소와 지속적인 흐름 회로 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-17T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 43 s
Description: 배우세요 병렬 플레이트 흐름 회의소와 지속적인 흐름 회로를 사용하여 내피 전구 세포에 층류 전단 응력을 가하고 세포 부착 및 형태 변화를 평가하는 방법. 이 기술은 생리학적 조건에서 세포 거동을 연구하는 데 유용합니다.

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저자는 가공과 흐름 회의소를 통해 이미지 세포 기술의 지원에 대한 Leica Microsystems에서 흐름 챔버 부품 및 매트 Maudsley를 모으는 그의 지칠 줄 모르는 노력에 대한 바이오 메디컬 악기와 기계 공장에서 조 오웬 감사드립니다. 우리는 듀크 재관류 서비스에서 케빈 콜린스와 유동 회로 설계에 대한 유용한 제안 의생명 공학과에서 박사 스티브 월레스에게 빚을 수 있습니다. 우리는 또한 RC1HL099863 - 01 &quot;장치를 지원 순환계의 biocompatibility을 향상시키기 위해 Autologous EPC 내막 &#39;부여를 통해 지원 알렉 산드라 Jantzen와 NIH 지원을위한 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 대학원 연구 장학생 프로그램을 감사드립니다.

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우리의 흐름 회로와 흐름 챔버은 우리가 정의된 유체 전단 응력에 자기편 세포, 예를 들어 EPCs를 대상 수 있습니다. 챔버 위쪽과 아래쪽은 투명, 세포 부착과 형태가 챔버 자체를 통해 실시간으로 중 평가하거나 흐름 챔버 분해 흐름 실험 후 수 있습니다.되기 때문에 그 시점에서, 세포는 무균 조건 하에서 수확 수 있으며, 다시 도금하거나, 또는 추가 분석을 위해 DNA 또는 RNA 등을 수집하는 데 사용됩니다. 층류 흐름을 달성하기 위해 챔버의 디자인은 몇 가지 조건이 충족되는 등해야합니다. 첫째, 흐름 점성 세력에 관성 세력의 비율이다는 레이놀즈수 (재)를 계산하여 확인할 수 판상,해야합니다. (점성 세력이 predominate면, 다시 작은이고 흐름 판상 또는 '완전히 개발'이다 - 일반적으로 다시 &lt;2300하십시오.관성 세력이 predominate 경우가 불안정 때까지 흐름이 점점 더 무작위되는대로 다시&gt; 4000의 경우입니다.) 우리는 방정식 3 8에 따라 다시 계산할 수 있습니다 <img alt="방정식 3" src="/files/ftp_upload/3349/3349eq3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="등식 3"> ρ는 유체 밀도는 어디, Q는 유량이며, μ는 점도이다, W와 H는 각각 챔버의 너비와 높이,, 그리고 D H는 방정식 4 8에 의해 정의, 유압 직경입니다 <img alt="방정식 4" src="/files/ftp_upload/3349/3349eq4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="방정식 4"> 166에 이르기까지 높이와 세명의 흐름 챔버의 레이놀즈 번호 - 267 μm의, 13.9의 범위 - 34.6 유동 속도에서 C15 dynes / cm 2의 전단 응력을 구하는 alculated. 234-100 dynes / cm 2의 전단 응력 계산 유량에서 실의 레이놀즈 번호는 90.4에서였다. 이러한 레이놀즈 번호의 모든 2300보다 훨씬 낮은이며, 층류에 대한 기준을 충족. 둘째, 속도 필드와 전단 응력에 대한 흐름 채널 (즉, 완전히 개발), 입구의 길이, L 전자 이상이어야합니다 슬라이드 유체 유입구로부터 거리를 따라 거리 독립적 있습니다. 이것은 방정식 5 9 따르면, 입구 길이를 계산하여 만족하실 수 있습니다. <img alt="방정식 5" src="/files/ftp_upload/3349/3349eq5.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="방정식 5"> 위에 나열된 값을, 입구 길이는 0.01에서 0.25 cm로 다양합니다. 셋째, 측면 방향으로 속도와 전단 응력이 다양하지 않도록하기 위해서는크게 한 차원 채널 유동에 대한 값 (Δ의 수소 이온 농도 / 2L)에서 비율 H / W 1보다 훨씬 작아야합니다. 한 차원 유동에서 벽면 전단 응력의 95 %로 2 차원 흐름 조건에서 평균 벽 전단 응력 들어, H / W는 0.10와 동일해야하며 2 차원 흐름 조건에서 벽면 전단 응력에 대한 수 한 차원 유동에서 벽면 전단 응력의 97.5 %가 H / W는 0.05와 동일해야합니다. 우리의 설계 흐름 챔버 1.7 가로 cm 및 166의 크기로 - 높이 267 μm의 이러한 기준을 만족하고 있습니다. 입구에는 측면 압력 그라디언트가없는 경우 압력 흐름의 방향에서만 달라집니다. 이것은 흐름 경로에 염료 또는 입자를 사용하여 평가하실 수 있습니다. 또한, 꾸준한 유동 실험, 펄스 dampener은 유동 회로에 삽입됩니다. 펄스 dampener은 puls의 대부분을 밖으로 걸립니다atility은 회로에서 롤러 펌프에 의해 발생하고, 우리는 지속적인 흐름의 대략적인 가정 수 있습니다. 그것이 효과적으로 롤러 펌프의 특정 주파수의 출력 흐름 pulsations를 없앨 수 있도록주의의 활용 펄스 dampener는 회로에 사용되는 펌프와 튜브와 호환되어야합니다. 및 I / P 26 튜브 - 모든 Masterflex L / S 시리즈 펌프 (600 RPM을 0)으로 배출 라인에서 사용할 때 우리가 데모에서 Masterflex L / S 펄스 dampener는 층류 흐름을 실현하고 있습니다. 타악기 흐름 들어, 프로그램 펌프는 다양한 파형을 생성하는 데 사용할 수 있습니다. 타악기 흐름 들어, 프로그램 펌프는 다양한 파형을 생성하는 데 사용할 수 있습니다. 또한 회로가 perfusate 이러한 것을 표본을 설계 쉽게 셀 또는 유동 매체의 오염을 위험없이 다른 시간 지점에서 수령하실 수 있습니다. 우리 예제에서, NO 2의 농도가 -와 chemiluminescence에 의해 측정되었다Ionics / Sievers 질산 산화물 분석기 (NOA 280, Sievers 악기, 볼더, CO는)로 이전 10 설명했다. 아질산 분석에 사용 reductant 아니오로 아질산염을 변환하지 절감 잠재력을 가지고 있지만 같은 질산염과 같은 질소의 높은 산화물을 줄이기 위해 부족한 초산 (14.5 M 아세트산 산 및 0.05 M KI)에 칼륨 요오드화물되었으며 따라서 상대적이다 아질산염에 대한 특정. 샘플 6하면서 잃어버린 볼륨 조정하면서 생산 총액의 아질산이 생성 농도 및 회로의 총 볼륨의 제품으로 계산되었다. 다음 단계는 유동 실험의 성공적인 실행을 위해 중요하다 : <ol class="lroman"><li> 거품들이 표면에서 세포를 찢을 수있는 잠재력을 갖고 있기 때문에 그것은 흐름을 설정하는 동안 거품 형성을 방지하는 것이 바람직하다. 이 최선의 하단 부분에 흐름 챔버의 상단 부분을 게재할 때 돌보는 방지할 수 있습니다서로 모두 평행을 유지하고 readjustments없이 한 움직임 하단에 상단을 낮추는 방법으로 성취. 이렇게에서 유동 채널의 현재 및 / 또는 부동 수 있습니다 작은 공기 방울은 알루미늄 하우징 중 하나를 끝에있는 버블 트랩으로 우회한다. </li><li> 저수지의 유출 관이 저수지의 바닥까지 도달하도록하는 것이 중요합니다. 그렇지 않으면, 공기 perfusate 수준이 약간 튜브 끝 아래 일인 경우는 저수지에서 챔버로 연결 튜브에 빨려 수 있습니다. </li><li> 연구원은 펌프가 실수로 공기가 회로와 챔버로 빨려을 초래 하리라는 흐름을 개시,시 반대 방향으로 실행되지 않도록 펌프 흐름의 방향을 잘 알고 있어야합니다. </li><li> 거품의 형성을 (혈청에 포함된 단백질 변성에 의한)하지 않으려면, 우리는 perfusa 위의 약 인치 챔버에서 저수지로 연결 튜브를 낮출 조언저수지 안쪽 테 수준. 그러나, 유동 매체 수준 이상을 유지하면 실험 중에 저수지에 흐름을 확인할 수 있습니다. </li><li> 함께 챔버 부품을 폈다하면 다른 손으로 전기 드라이버를 운영하면서 굳게 한 손으로 주택을 파악하는 것이 중요합니다. 전기 드라이버의 움직임이 나사가 강화되면 '주변의 챔버를 던지다'가능성을 가지고 토크로 번역됩니다. </li><li> 회로의 형성과 그 표면에 묻은 세포를 리프팅로부터 압력 파를 방지하려면 모든 stopcocks이 흐름을 시작하기 전에 열려 있는지 확인합니다. </li><li> 특히 장기 흐름 연구 (&gt; 48시간) 우리는 튜브의 파괴 방지하기 위해 펌프 헤드에 삽입되도록 더 더 탄력 튜브를 사용하는 것이 좋습니다. </li><li> 튜브가 아프 - 조정 펌프 헤드 치아로 인해 펌프 헤드 내부에 '마이 그 레이션'이라는 수도 있습니다. 그러므로 우리는 어떻게 욕조에 가까운주의를 기울이고 제안ING는 펌프 헤드의 확보와 튜브가 '에서 가져온'또는 실험 중에 dislodged 경우 쉽게 통보 수와 같은 표시 펜으로 튜브의 각 끝을 표시합니다. </li><li> 항상 신중하게 잘못된 연결로 인해 실험 기간 동안 perfusate의 누출을 방지하기 위해 재관류를 시작하기 전에 회로와 챔버의 모든 단일 커넥터를 확인하십시오. 이것은 펄스 완충기의 유입과 유출 커넥터 특히 중요합니다! </li><li> 당신은 형광 라벨을 사용하면 조명 노출을 제한할 것을 잊지 마십시오. </li></ol> 우리의 흐름 챔버 가능한 제한 높이가 채널의 높이 알루미늄으로 가공하여 고정된다는 점입니다. 그러나, 이것은 각각의 실험하기 전에 채널의 높이를 확인하고 조정할 필요하지 않는 장점을 가지고 있으며, 따라서 단지 원하는 값으로 펌프 흐름을 조정하여 전단 응력 계산을 단순화합니다. 연구 목표에 따라, 그것은하는 것이 바람직하다 수 있습니다증가 펌프 속도없이 전단 응력을 향상시킬 수 있습니다. 이 경우에는 우리가 perfusate의 점도를 증가하는 것이 좋습니다, 예를 들어,이 매체 11 dextran을 추가. 흐름 회로의 수 제한이 세포 metabolites의 매우 작은 농도를 정할려고 할 때 문제가 될 수있는 사용할 매체의 큰 볼륨입니다. 여기에 표시되지 있지만, 그것은 실질적으로 작은 저수지와 펄스 dampener를 사용하여 회로 볼륨을 줄이고 튜브 길이와 직경을 감소 수 있습니다. 또한, 문화의 세포에 유체 전단 응력을 적용하는 데 사용할 수있는 여러 상용 시스템이있다. Microfluidic 기반 시스템은 이러한 채널 12,13,14에 대한 입력 및 출력 저수지 역할을 잘 접시에 솔루션을 로드된 다른 microfluidic 유동 채널 세포의 동시 분석을 활성화 Fluxion에서 BioFlux 시스템을 예. 그러나 이러한 및 기타 마이크로유체 시스템은 표준 현미경 슬라이드와 호환되지 않습니다 및 RT - PCR이나 서양 얼룩과 같은 추가 실험을위한 세포 충분히 대량의 복구를 위해 허용하지 않습니다. 또한, 그들은 덜 사용자 친절 40,000 달러 최소 비용 및 액세서리 장비에 따라 10 만 달러 이상의 총 도달 수 있습니다. Flexcell 국제 공사, Flexcell의 테이프와 FlexFlow 시스템에서 사용할 두 macrofluidic 시스템이 성공적으로 내피 세포 15,16,17, 유체 유동 조건 하에서 인간의 고리 세포 18 섬유아 세포 19 연구하는 데 사용되었습니다. GlycoTech를 통해 제공되는 세 번째 시스템은, 종양 세포 접착 20 내피 백혈구 유착 monolayers에 21 연구 활용되었습니다. 테이프 시스템은 여러 개의 슬라이드가 한 번에 동일한 전단 응력 조건에서 실행되도록하지만,보기 창을 부족 - 우리와 달리를설계 - 흐름에 따라 세포의 실시간 시각화를위한 허용하지 않습니다. FlexFlow 시스템은보기 창을 가지고 있지만, 대부분의 실험실에서 사용되는 표준 현미경 없을 수도 똑바로 현미경을 필요로합니다. 또한, FlexFlow 시스템은 흐름 챔버에 배치하면 반전이 될 수있는 셀 코팅 커버 슬립이 필요합니다. 이것은 우리가 우리의 연구에서 보여주는 이러한 티타늄 코팅 유리로 불투명 표면에 형광 세포의 시각화 걸​​로. 마지막으로, 전문적인 커버 전표는 Flexcell의 테이프 시스템과 유사한 멀티 - 만 달러 가격 범위에있는 FlexFlow 시스템에 대해 구체적으로 구매해야합니다. GlycoTech 상당히 저렴하지만, 편리하게 우리의 챔버처럼 autoclaved 줄기 수없는 주조 아크릴에서 제조됩니다 원형과 사각형 병렬 플레이트 흐름 챔버 스를 제공합니다. 참고의 설명했습니다 다른 흐름 챔버 스는 autoclavable 수그들은 특별한 미세 렌즈 22,23을 필요로하기 때문에 허무 나타납니다. GlycoTech 시스템은 반복 사용과 두께의 변화하므로 시간 (제조 업체가 매 10 사용 후 새로 구입하는 것이 좋습니다)를 통해 챔버의 높이가 변경됩니다 상단 및 하단 플레이트 사이 interposed 실리콘 고무 가스켓을 사용합니다. O - 링 내장된 우리 알루미늄 챔버의 상단 및 하단 플레이트의 완전한 반대에 대한 허용과 실험 사이의 지속적인 챔버의 높이를 보장합니다. 마지막으로, 진공 펌프는 우리 디자인에서 필요하지 않습니다 GlycoTech 실, 등 많은 유동 챔버 설계의 누설 방지 밀봉을 달성하기 위해 필요합니다. 여기에 표시되지 반면, 흐름 챔버는 세포 부착 및 / 또는 행동의 실시간 영상에 대한 전체 흐름을 실험 중에 현미경으로 보관하실 수 있습니다. 이것이 원하는 경우, 우리는 37 perfusate 온도를 유지하기 위해 챔버에 따라 열 램프 또는 온수 패드를 사용하는 것이 좋습니다 ° C. 모피셀 또는 metabolites 또는 investigational 약물 또는 대리인 중 하나도 '재순환'이 24 원하는하지 않은 경우도, 롤러 펌프는 주사기 펌프로 대체하실 수 있습니다. 그것은 유체 전단 응력에 따라 휴대 전화의 상호 작용을 평가하기 위해 합류 EPCs의 계층 이상의 자기편 세포, 예를 들어 형광등 혈소판 (Achneck 외 의해 설명되어있는 혈소판 분석을 사용합니다. 6,25)을 통해 다르게 표시 세포를 유동하는 것도 가능합니다. 우리의 흐름 챔버는 perfusate 샘플링 포트와 보는 창 같은 다른 사용 가능한 유동 회의소의 귀중한 기능을 결합하여 하나 거꾸로 또는 직립 현미경과의 호환성의 중요한 이점이 있습니다. 그것은 완전히 autoclavable하고 지속적인 챔버의 높이에서, leakproof 인감을 달성하기위한 진공 펌프의 필요없이 반복 실험 수 있습니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 제품 / 시약 </td><td> 회사 </td><td> 제품 # </td></tr><tr><td> 10 ML 주사기 </td><td> 콜 Parmer 악기 (주) </td><td> 07940-12 </td></tr><tr><td> 1 웨이 Stopcoks </td><td> 콜 Parmer 악기 (주) </td><td> 30600-00 </td></tr><tr><td> 30 ML 주사기 </td><td> BD 의료 </td><td> 309,650 </td></tr><tr><td> 4 - 웨이 Stopcocks </td><td> 콜 Parmer 악기 (주) </td><td> 30600-04 </td></tr><tr><td> 알루미늄 합금 </td><td> N / A </td><td> 6061 </td></tr><tr><td> 셀 - 문화 요리 (4 자, 사각형) </td><td> 써모 과학; Nunc </td><td> 267,061 </td></tr><tr><td> 휴대폰 추적기 오렌지 </td><td> Invitrogen </td><td> C34551 </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> 연구 생명체 </td><td> 2162D </td></tr><tr><td> DPBS (-/-)</td><td> Invitrogen </td><td> 14190-144 </td></tr><tr><td> EGM - 2 Singlequots </td><td> Lonza </td><td> CC - 4176 </td></tr><tr><td> 여성 Luer 어댑터 </td><td> 콜 Parmer 악기 (주) </td><td> SI - 45500-04 </td></tr><tr><td> Fibronectin </td><td> 시그마 </td><td> F0895 - 2MG </td></tr><tr><td> 모자와 유리병 (250ml) </td><td> 콜 Parmer 악기 (주) </td><td> 34594-24 </td></tr><tr><td> 하드 튜브 </td><td> 콜 Parmer 악기 (주) </td><td> 06508-16 </td></tr><tr><td> HBSS </td><td> 시그마 </td><td> H8264 - 500ML </td></tr><tr><td> Histopaque </td><td> 시그마 </td><td> H8889 - 500ML </td></tr><tr><td> Hoechst 얼룩 솔루션 </td><td> 시그마 </td><td> H6024 </td></tr><tr><td> Hyclone FBS </td><td> 써모 과학 </td><td> SH30071.01 </td></tr><tr><td> L - 글루타민 </td><td> Lonza </td><td> 17 - 605E </td></tr><tr><td> 남성 Luer 어댑터 </td><td> 콜 Parmer 악기 (주) </td><td> EW - 45505-04 </td></tr><tr><td> MCDB - 131, 1X 중간 </td><td> Cellgro </td><td> 15-100 - 이력서 </td></tr><tr><td> 가시 폴리 프로필렌 부품 </td><td> 콜 Parmer 악기 (주) </td><td> 06365-90 </td></tr><tr><td> O - 링 </td><td> N / A </td><td> AS568A </td></tr><tr><td> 펄스 - Dampener </td><td> 콜 Parmer 악기 (주) </td><td> 07596-20 </td></tr><tr><td> 펌프 드라이브 (Masterflex L / S 가변 속도 경제 운전) </td><td> 콜 Parmer 악기 (주) </td><td> 7524-40 </td></tr><tr><td> 펌프 헤드 (Masterflex 쉬운 부하 펌프 헤드) </td><td> 콜 Parmer 악기 (주) </td><td> 07518-60 </td></tr><tr><td> 슬라이드 </td><td> 콜 Parmer 악기 (주) </td><td> 48500-00 </td></tr><tr><td> 소프트 관 </td><td> 콜 Parmer 악기 (주) </td><td> 96400-16 </td> &lt;/ TR&gt; <tr><td> 주사기 필터 </td><td> 콜 Parmer 악기 (주) </td><td> 02915-12 </td></tr><tr><td> Sytox 오렌지 핵산 얼룩 </td><td> Invitrogen </td><td> S - 11368 </td></tr><tr><td> 트립신 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> Lonza </td><td> CC - 5012 </td></tr><tr><td> 트립신 중화 솔루션 </td><td> Lonza </td><td> CC - 5002 </td></tr></tbody></table>

층류의 전단 응력에 따라 내피 전구 세포를 평가하기 위해 병렬 플레이트 흐름 회의소와 지속적인 흐름 회로

Parallel-plate Flow Chamber and Continuous Flow Circuit to Evaluate Endothelial Progenitor Cells under Laminar Flow Shear Stress

이 방법의 전반적인 목표는 층류 조건에 점착 성의 세포를 제목과 잘 같지는 유체 전단 응력 1 자신의 응답을 평가하는 기술을 설명하는 것입니다. 우리의 흐름 챔버 설계 및 흐름 회로 (그림 1) (그림 11C) 흐름 동안 여러 시간 지점에서 (그림 11A, B) 흐름을 바로 앞에 셀 형태의 세포 접착 및 이미징의 테스트를 가능하게하는 투명한 가시 영역을 포함 및 이후 흐름 (그림 11D). 이 실험은 인간의 탯줄과 함께 그림 아르 혈액 파생 내피 전구 세포 (EPCs)와 돼지의 EPCs 2,3합니다. 이 방법은 또한 다른 자기편 셀 유형, 예를 들어 평활근 세포 (SMCs) 또는 섬유아 세포에 적용됩니다. 챔버 및 회로의 모든 부분은 쉽게 증기 autoclaving로 소독하고 있습니다. 다른 대조적으로여왕님 예 microfluidic의 챔버 셀 (셀 크기에 따라&gt; 1 만달러)의 큰 번호, 세포 배양 또는 다른 실험 예 DNA 또는 RNA 추출, 또는 immunohistochemistry (그림 11E)에 대한 살균 조건 하에서 유동 실험 후 복구할 수 또는 전자 현미경 5 스캔. 전단 응력은 perfusate, 유체 점성, 또는 채널의 높이와 넓이의 흐름 속도를 변화하여 조정할 수 있습니다. 한 차원 흐름이 유지되는 확보하면서 후자는 액체 볼륨 또는 셀 요구를 줄일 수 있습니다. 챔버의 높이가 크게 여러 실험의 용이성을 증가 가스켓의 사용에 의존하지 않기 때문에 그것은 실험 챔버 사이의 높이를 측정하는 필요가 없습니다. 또한, 회로 설계를 쉽게 분석 및 / 또는 유체 전단 응력의 ​​노출에 따라 세포에 의해 분비 metabolites의 부량, 예를 들어 질산 산화물 (그림 12) 6 perfusate 샘플의 수집을 가능하게 </suP&gt;.

우리는 살균 지속적인 흐름 회로에서 층류 유동 전단 응력에 따라 자기편 세포 수있는 방법을 설명하고 있습니다. 세포 &#39;유착, 형태는 투명 챔버를 통해 신진 대사 분석 및 미래의 실험이나 문화에 대한 전단 노출 후 수확한 세포 회로에서 얻은 샘플을 공부하실 수 있습니다.

이 방법의 전반적인 목표는 부착 세포를 층류 조건에 노출시키고, 그에 따른 반응을 평가하는 기술을 설명하는 것입니다...

본 비디오 논문의 전반적인 목적은 부착 세포를 층류 조건에 노출시키고, 정량화가 가능한 유체 전단 응력에 대한 반응을 평가하는 기술을 설명하는 것입니다. 이를 위해 먼저 유동 챔버 없이 유동 회로를 구성합니다. 회로는 저장조, 펄스 댐퍼, 하드 튜브, 소프트 튜브, 4방향 스톱콕 및 연결용 루어 어댑터, 그리고 공기 필터로 구성됩니다.다음 단계는 멸균 조건 하에서 세포 배지와 같이 원하는 풍부한 완충액으로 회로를 채운 후, 펌프를 가동하여 펄스 댐퍼를 채우고 튜브 내의 공기를 제거하는 것입니다. 이어서 세포가 안착된 슬라이드를 유동 챔버의 하단 플레이트에 삽입합니다. 절차의 마지막 단계는 유동 챔버를 연결하여 유동 회로의 조립을 완료하는 것입니다.최종적으로, 형광 현미경을 통해 투명 챔버 내에서 유체 전단 응력 노출 하에 정렬된 형광 표지 혈관 내피 전구 세포의 결과를 얻어 세포의 기능적 거동을 연구할 수 있습니다. 세포의 생체 내 생리를 모사하기 위해서는 세포에 유체 전단 응력을 가하는 것이 필요합니다. 본 연구에서는 유동 조건 하에서 세포를 연구하고 투명 챔버를 통해 관찰할 수 있도록 평행판 유동 챔버와 연속 유동 회로를 설계하였습니다.이 기술은 의학과 공학 분야에서 가치 있는 연구 도구로 활용될 수 있습니다. 당사의 유동 챔버(flow chamber)를 사용하면 정립 현미경 또는 도립 현미경을 통해 흐름 하에 있는 세포를 간헐적으로 또는 실시간으로 시각화할 수 있습니다. 또한, Dr.Ach Nick의 설계 덕분에 연구자들은 표준 현미경 렌즈를 사용하여 투명하거나 방사선 불투과성인 표면 위에서 세포를 이미징할 수 있습니다.또한, 이는 유동 조건 하의 세포에 약물이 미치는 영향을 연구함으로써 약리학 연구의 중요한 도구로 활용될 수 있습니다. 여러 단계가 프로토콜을 읽는 것만으로는 숙달하기 어렵기 때문에, 장치 구성의 시각화가 매우 중요합니다. Dr.Ock Next 연구실에서 일반적으로 사용되는 플로우 챔버와 유동 회로의 설정 방법에 대해 단계별 지침을 제공하겠습니다. 유동 회로를 조립하는 방법은 다음과 같습니다.먼저 36인치 길이의 하드 튜브 세그먼트를 펄스 댐퍼의 한쪽 끝에 연결하고, 반대쪽 끝에 18인치 길이의 소프트 튜브 세그먼트를 연결합니다. 18인치 소프트 튜브 섹션의 끝에 1/8인치 수형 루어 어댑터를 장착합니다.수컷 루어(male lure)를 1/8인치 암컷 루어 어댑터에 연결합니다. 암컷 루어를 새로운 18인치 길이의 소프트 튜빙 세그먼트에 부착합니다. 250밀리리터 유리 비커 캡에 구멍 세 개를 뚫습니다.튜빙을 맞추기 위해, 1.5 inch 길이의 소프트 튜빙 세그먼트를 한쪽 구멍에 삽입하여 공기 배출구로 사용합니다. 하드 튜빙과 소프트 튜빙의 자유단을 캡의 나머지 두 구멍을 통해 저장소 역할을 할 250 milliliter 유리 병 내부로 삽입합니다.딱딱한 튜브가 저장조 바닥까지 닿도록 하십시오. 회로 설정 전반에 걸쳐 무균 상태를 유지하는 것이 이 절차의 성공에 매우 중요합니다. 따라서 모든 부품은 멸균되어야 하며, 작업 전 과정에서 멸균 장갑을 착용해야 합니다.조립된 부품 외에 다음 부품들을 반드시 멸균해야 합니다. 완전한 플로우 챔버 1개, 3x2인치 크기의 소프트 튜빙 세그먼트(수컷 1개, 암컷 1개), 1/8인치 루어 어댑터, 1/2인치 평두 나사 4개, 6 5/16인치(인치당 나사산 30개) 평두 나사 8개, 핀셋 1쌍, 유리 슬라이드 1개, 그리고 수건 2개를 증기로 멸균합니다.121°C에서 60분 동안 오토클레이브 멸균을 수행합니다. 유로 회로 유량 챔버, 4방향 콕 2개, 1방향 콕 1개 및 모든 멸균된 부품들을 멸균 구역 위에 배치합니다. 멸균 장갑을 착용한 상태에서 두 개의 4방향 콕을 연결합니다.열려 있는 샘플 포트에 캡을 씌웁니다. 유로 회로의 두 소프트 튜빙 세그먼트를 연결하는 수컷 및 암컷 루어 어댑터를 분리하고 연결된 스톱콕을 삽입합니다. 리저버에 삽입된 소프트 튜빙을 30 milliliter 시린지에 연결하고 시린지 피스톤을 제거합니다.병에 EPC 배지 125 milliliters를 채웁니다. 소프트 튜빙을 스톱콕에 다시 연결합니다. 공기 배출구에 멸균 시린지 필터를 장착합니다.이제 유동 회로를 37 °C, 5% 이산화탄소가 공급되는 가습 배양기로 옮깁니다. 이 유형의 coal Palmer 튜빙에 사용하도록 지정된 master flex 롤러 펌프 헤드에 하드 튜빙을 고정하십시오. 튜빙이 롤러 펌프 장착 트랙과 겹치지 않도록 확인하십시오.마킹 펜을 사용하여 펌프 헤드의 양쪽에서 나오는 튜빙 지점을 표시하십시오. 모든 스톱콕이 샘플 포트 쪽으로는 닫혀 있고 유로를 따라 열려 있는지 확인한 후, 펌프를 가동하십시오. 흐름 방향을 확인하십시오.PERFUSE 8은 유리 저장조에서 하드 튜빙을 통해 펄스 댐퍼로 이동해야 합니다. 유동 챔버 조립을 위해, 멸균 장갑을 착용한 상태에서 2인치 소프트 튜빙 세그먼트 하나를 1/8인치 암형 루어 어댑터에 연결하십시오. 또 다른 2인치 소프트 튜빙 세그먼트를 1/8인치 수형 루어 어댑터에 연결하십시오.암형 루어 어댑터가 달린 2인치 소프트 튜빙을 유입구 포트에 연결하고, 수형 루어 어댑터가 달린 2인치 소프트 튜빙을 유출구 포트에 연결하십시오. 이 두 루어 어댑터에 4방향 스톱콕을 부착하십시오. 남은 2인치 소프트 튜빙 조각을 버블 트랩에서 나오는 측면 포트 커넥터에 연결하고, 멸균 핀셋을 사용하여 일방향 스톱콕을 부착하십시오.세포가 배양된 슬라이드를 세포 배양 용기에서 꺼내 유동 챔버 바닥 플레이트의 홈에 배치합니다. 슬라이드의 세포 배양면이 위를 향하도록 배치되었는지 확인하십시오. 주사기나 피펫을 사용하여 10 milliliters의 가온된 EPC 배지를 세포 배양 슬라이드 위에 넣습니다. 배지가 유동 챔버 내의 슬라이드를 덮도록 하되, 바닥 플레이트의 O-링 위로 배지가 넘치지 않게 주의하십시오.유동 챔버의 상단 플레이트를 하단 플레이트 위에 놓고 나사 구멍을 맞춥니다. 챔버 나사 플레이트 내부에 기포가 유입되지 않도록 두 플레이트를 평행하게 유지하며 결합합니다. 자동 배터리 구동 드라이버를 사용하여 유입측 기포 트랩 포트에 연결된 일방향 스톱콕을 열어 유입 기포 트랩의 공기를 제거합니다.10 milliliter 주사기를 사용하여 유입 튜브를 EPC 배지로 부드럽게 세척한 다음, 해당 스톱콕을 잠그고 캡으로 닫습니다. 이제 유출 포트의 4방향 스톱콕을 열고 흐름 챔버를 통해 EPC 배지를 부드럽게 흘려보내 챔버 채널 내의 공기를 제거합니다. 다시 10 milliliter 주사기를 사용하여 모든 4방향 스톱콕 연결부를 캡으로 닫고 잠급니다.조립된 유로 회로와 함께 유동 챔버를 가습 인큐베이터로 옮깁니다. 유로 회로 펌프를 일시 정지하고, 누출을 방지하기 위해 흐름 방향에 있는 스톱콕을 잠가 유로 회로를 차단합니다.유동 챔버를 유동 회로에 연결합니다. 유동 챔버가 유동 회로에 연결되면, 흐름 방향으로 스톱콕을 엽니다. 유동 펌프를 다시 작동시키고 PERFUSE eight가 올바른 방향으로 흐르는지 확인합니다. 원하는 전단 응력에 맞게 유속을 조절합니다.유동 실험 중에 광학 또는 형광 현미경을 통해 세포를 이미지화하기 위해 유동 챔버를 회로에서 분리할 수 있습니다. 이를 위해 스톱콕-스톱콕 연결 부위에서 유동 챔버를 유동 회로로부터 분리하십시오. 분석을 위해 관류액 샘플을 수집하십시오.먼저, 펌프를 일시 정지하고 펄스 댐퍼(pulse dampener)와 가장 가까운 스톱 콕(stop cock)을 잠급니다. 보호 캡을 제거한 뒤, 오염되지 않도록 캡을 뒤집어 놓습니다. 샘플 포트에 소형 시린지를 삽입합니다.샘플 포트와 펄스 댐퍼 방향의 회로는 열어둔 채, 유동 챔버 방향의 스톱콕을 잠급니다. 회로에서 원하는 양의 샘플을 취한 후, 시린지를 제거하기 전에 샘플 포트 방향의 스톱콕을 잠급니다. 채취한 샘플을 라벨이 부착된 바이알에 보관하고 -80 °C에서 냉동합니다.샘플 포트를 다시 막고, 흐름을 시작하기 전에 모든 스톱콕이 열려 있는지 확인하십시오. 이 방법을 사용하면 인간 혈액 유래 혈관내피 전구세포를 15분 이내에 티타늄 슬라이드에 파종할 수 있으며, 생리적 전단 응력 하에서 부착시킬 수 있습니다. 이 그림에서 보듯, EPC는 15 dynes/cm²의 유체 전단 응력 하에서 파종 직후 약 210 µm²에서 3시간 후 약 657 µm², 48시간 후에는 약 1,152 µm²까지 흐름의 영향으로 확장됩니다.이 광학 현미경 이미지는 인간 EPC의 무작위한 방향성을 보여줍니다. 100 dynes/cm²의 유속으로 3시간 동안 흐름을 가한 후 6시간 동안 정적인 상태로 유지했을 때, 세포들은 퍼져나갔으나 여전히 무작위한 방향으로 배열되어 있습니다. 100 dynes/cm²의 유체 전단 응력을 48시간 동안 가한 후, EPC들은 흐름 방향에 따라 정렬 및 배향되었습니다.여기에서 EPCs는 CTO로 라벨링되었으며, 유동 후 사멸을 확인하기 위해 세포핵을 herx로 염색하였습니다. 비교를 위해, 이 이미지는 유동 방향으로 정렬된 티타늄 슬라이드 상의 돼지 EPCs를 보여줍니다. 48시간의 유동과 제곱센티미터당 15 dines의 전단 응력 노출 후, 세포 경계는 anti pcam 염색으로, 핵은 cytoxin 핵산 염색으로 염색하였습니다.본 방법을 통해 분비된 세포 대사산물을 분석하거나 정량화하기 위해 미리 정해진 시점에 PERFUSE eight의 샘플을 얻을 수 있습니다. 여기 porcine EPC를 이용한 48시간 유동 실험 중 아질산염 생성의 예시가 제시되어 있습니다. 이 절차를 수행할 때는 전 과정에서 무균 상태를 유지하는 것이 중요합니다.또한, 지속적인 흐름을 시작하기 전에 유동 챔버 내의 기포 수를 줄이기 위한 필요한 조치를 취하는 것이 중요한데, 이는 기포가 세포를 떼어낼 수 있기 때문입니다. 또한, 실험 중 PERFUSE eight의 누출을 방지하기 위해 관류 전 유동 챔버와 회로의 모든 연결 부위를 확인할 것을 권장합니다. 이 챔버는 상단 및 하단 플레이트의 완전한 밀착을 가능하게 하고 진공 펌프 없이도 누출 없는 밀봉을 제공하는 O-링이 내장된 구조로 설계되었습니다.이 기능은 실험 간 챔버 높이를 일정하게 유지하며, 고무 가스켓이나 별도의 조정 필요성을 없애줍니다. 당사의 유동 챔버는 표준 현미경 슬라이드를 사용합니다. 따라서 향후 추가 실험에 사용할 수 있는 다량의 세포를 확보할 수 있습니다.예를 들어, 유동 처리 후 세포에서 추출한 RNA와 DNA를 통해 단백질 합성 또는 유전자 발현을 평가할 수 있습니다. 본 회로 설계에서는 분석을 위해 8개의 관류 샘플을 수집할 수 있으며, 유체 전단 응력 하의 세포에서 분비되는 산화질소의 주요 산화 대사물인 nitrite와 같은 세포 대사물을 정량화할 수 있습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 부착 세포에 유체 전단 응력을 가하기 위해 유동 챔버와 멸균 유동 회로를 조립하는 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다.

parallel-plate-flow-chamber-continuous-flow-circuit-to-evaluate

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

석판술으로 새겨져와 PDMS에서 가공 Microfluidic 흐름 여왕님 EC 장애와 염증과 관련된 기능적 결과를 알아내기 위해 적용됩니다. 대표 실험에서는 차등 전단 응력의 능력 시토킨 활성화 EC monolayers에 monocytic 세포 접착을 조절하기 위해이 입증되었습니다.

온칩 내피 염증성 Phenotyping

이 비디오는 백혈구와 내피 세포와 같은 세포 파트너의 상호 작용을 특성화하기 위한 층류 기반 분석을 보여줍니다. 이 방법은 혈관 세포의 손상되지 않고 합류하는 층에 관류될 때 백혈구의 접착, 데데젼 및 전이에 대한 동적 통찰력을 제공합니다.

백혈구와 내피 세포 간의 상호 작용을 연구하기 위한 층류 기반 분석

이 연구는 크게 생리학 관련 전단 흐름에 따라 세포 롤링 연구의 처리량을 증가, 멀티 웰 플레이트 미세 유체 시스템을 사용했다. 캐스케이드 및 환자 세포의 외인성 개체군의 전신 전달 다음 세포 호밍의 중요성을 원점 다단계 셀에서 셀 압연의 중요성을 감안할 때,이 시스템은 세포 기반 치료를 개선하기위한 스크리닝 플랫폼으로 잠재력을 제공한다.

의 체계적인 분석 체외 셀 롤링

생리 흐름 조건에서 순환 세포의 케모카인 - 감독 넘쳐을 연구하는 소설 입체 흐름 챔버 장치

혈소판 수혈 및 지혈은 혈액 은행 혈소판의 기능을 조사하기 위해 혈액 재구성 및 미세유체 유동 챔버를 사용하여 모델링되었습니다. 이 데이터는 혈소판 저장 병변이 지혈에 미치는 영향을 in vitro에서 보여줍니다.

미세 유체 흐름 챔버 지혈 및 혈소판 수혈을 모델링하기 위해 재구성 된 혈액을 사용하여<em&gt; 체외</em

유체 전단의 다양한 수준과 패턴은 내피 유전자 발현, 표현형 및 질병에 대한 감수성을 조절하는 것으로 알려져 있습니다. 우리는 '전단 고리'의 조립과 사용에 대해 논의합니다: 단방향, 주기적인 전단 응력 패턴을 생성하는 모델입니다. 전단 링은 조립이 간단하고 경제적이며 높은 세포 수율을 생성할 수 있습니다.

총회와 &#39;전단 반지&#39;의 응용 프로그램 : 궤도, 단방향 및 정기 유체 흐름 및 전단 응력에 대한 소설 내피 모델

이 논문은 동시에 혈소판 기능과 응고를 측정 지혈의 실험 모델을 설명합니다. 혈소판 및 피브린 형광을 실시간으로 측정하고, 혈소판의 부착 율, 응고 속도 및 응고의 개시가 결정된다. 모델은 수혈 농축 플로우하에 혈소판 응고 특성을 결정하는데 사용된다.

혈소판 수혈 및 지혈을위한 미세 유체 유량 용기 모델은 실시간으로 혈소판 증착 및 섬유소 형성을 측정합니다

이 연구는 혈소판의 부착, 퍼짐 및 유속 하의 분비를 연구하기위한 형광 현미경 기반의 방법을 설명합니다. 이 다목적 플랫폼은 혈전증과 지혈에 대한 기계 연구를 위해 혈소판 기능을 조사 할 수있게합니다.

흐름하에있는 혈소판 탈식 및 분비의 라이브 셀 이미징

혈관 벽 손상 후 또는 염증 동안 백혈구 avidly 혈관 세포와 혈소판 상호 작용합니다. 여기, 우리 간단 층 흐름 기반 분석 결과 기초 백혈구와 셀룰러 파트너 간의 상호 작용 분자 메커니즘의 특성을 설명 합니다.

교양된 혈관 세포에 부착 혈소판 백혈구 신규 모집 조사 하 층 플로우 기반 분석

여기, 유체 전단 응력에서 내 피 세포의 문화 및 유전자 표정 분석에 대 한 워크플로 제공 됩니다. 포함 된 동시에 주택 및 제어 환경에 양이 많은 PCR에 대 한 참조 외 인 RNA 사용 하 여 여러 흐름 챔버 모니터링에 대 한 물리적 배열이입니다.

가 여러 명의 병렬 접시 흐름 챔버를 사용 하 여 스트레스에 노출 된 내 피 세포의 유전자 표정 분석

우리는 관련 혈관 흐름 조건에서 혈관 내피 세포(EC)를 배양하기 위해 조정 가능한 젤라틴 기반 기질을 합성하고 특성화했습니다. 이 생체 모방 표면은 생리학적 및 병리학적 조건을 모두 복제하여 EC 행동에 대한 기계적 힘을 연구하고 혈관 건강 및 질병 메커니즘에 대한 이해를 증진합니다.

내피 세포 반응을 연구하기 위해 기질 강성과 흐름을 통합하는 시험관 내 모델

배우세요 병렬 플레이트 흐름 회의소와 지속적인 흐름 회로를 사용하여 내피 전구 세포에 층류 전단 응력을 가하고 세포 부착 및 형태 변화를 평가하는 방법. 이 기술은 생리학적 조건에서 세포 거동을 연구하는 데 유용합니다.

층류의 전단 응력에 따라 내피 전구 세포를 평가하기 위해 병렬 플레이트 흐름 회의소와 지속적인 흐름 회로

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