백혈구와 내피 세포 간의 상호 작용을 연구하기 위한 층류 기반 분석

부착된 사이토카인 자극 내피 단층이 있는 유리 슬라이드를 흐름 챔버에 넣는 것으로 시작합니다.

이러한 내피 세포는 셀렉틴과 같은 표면 접착 분자와 케모카인과 같은 내피 결합 이동 신호를 발현합니다.

형광 표지된 백혈구를 플로우 챔버에 도입합니다.

백혈구가 내피 단일층 위로 흐르면서 활성화된 내피 세포와 결합합니다.

내피 세포의 셀렉틴은 백혈구의 해당 리간드에 결합합니다.

셀렉틴-리간드 상호작용은 약하고 일시적이어서 백혈구가 흐르는 매질의 힘으로 내피 단층을 따라 굴러갈 수 있습니다.

롤링을 통해 백혈구는 케모카인과 상호 작용하여 인테그린을 활성화하고 백혈구의 확고한 정지를 촉진할 수 있습니다.

그 후, 백혈구는 내피 단층을 가로질러 퍼지며, 이는 면역 반응의 중요한 단계인 전이 가능성을 나타냅니다.

이 분석은 백혈구를 내피 세포에 관류시키면서 백혈구의 접착, 탈부착 및 전이의 메커니즘을 연구하는 데 도움이 됩니다.

1마이크로몰의 세포 투과성 녹색 형광 핵산 염색을 사용하여 백혈구를 형광으로 표지합니다. 라벨링 후 백혈구를 섭씨 37도에서 30분 동안 배양합니다. 그런 다음 세포를 300배 g에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 펠릿화합니다.

인산염 완충 식염수에 재현탁하여 세포를 세척합니다. 그런 다음 세포를 300배 g에서 5분 동안 원심분리합니다. 유속에 따라 분석 완충액에 세포 5밀리리터를 현탁시킵니다. 그런 다음 수조를 가열하여 섭씨 37도를 유지합니다.

그런 다음 50밀리리터 관류 주사기를 따로 보관하고 주사기 홀더에 설치합니다. 그런 다음 펌프 부피를 0밀리리터, 직경을 26.70밀리미터로 하여 펌프를 철수 모드로 설정합니다. 그런 다음 루어 잠금 커플러를 주사기에 부착하고 엘보우 루어 커넥터가 있는 튜브를 루어 잠금 커플러에 연결합니다. 그런 다음 튜브의 자유단을 플로우 챔버에 부착합니다. 고정된 혈소판에 백혈구를 부착하려면 슬라이드를 주사기와 연결하십시오.

백혈구를 관류한 다음 혈관 또는 혈소판 단층 층에 부착하려면 분석 완충액이 들어 있는 50밀리리터 원뿔형 튜브에 두 번째 튜브를 부착한 다음 1밀리리터 피펫을 사용하여 튜브를 채웁니다. 튜브가 채워지면 압착하여 흐름 챔버에 연결합니다. 백혈구를 관류하기 전에 3밀리몰의 염화칼슘과 2밀리몰의 염화마그네슘을 세포 현탁액에 첨가합니다. 그런 다음 세포를 섭씨 37도에서 5분 동안 배양합니다.

챔버와 튜브에 끼일 수 있는 공기를 제거하려면 세포를 관류하기 전에 분석 완충액으로 관류하십시오. 그런 다음 튜브를 압착하여 끝을 닫고 튜브를 분석 완충액에서 세포 현탁액으로 전환하여 내부에 갇힌 기포를 방지합니다.

첫 번째 세포가 도착하려면 적절한 유속과 전단 응력으로 세포를 관류합니다. 세포를 계속 관류시키면서 2분 동안 유속과 전단 응력을 유지합니다. 그런 다음 디지털 카메라에 연결된 10배 배율의 형광 현미경을 사용하여 2분에서 6분 사이에 롤링 및 억제 셀의 6개 이미지를 캡처합니다.