September 9th, 2020
광 시트 기반 형광 현미경 검사는 발달 생물학에서 가장 가치있는 도구입니다. 비교 연구의 주요 문제는 주변 분산입니다. 우리의 프로토콜은 여러 표본의 동시 라이브 이미징을위한 실험 프레임 워크를 설명하고, 따라서, 적극적으로이 문제를 해결.
Sample Chamber-Based Light Sheet Florescence Microscope는 높은 처리량보다는 높은 함량을 위해 설계되었습니다. 따라서 라이브 이미징 분석은 순차적으로 수행되어야 하므로 주변 변화의 영향을 덜 받아야 합니다. 당사의 거미줄 홀더는 여러 배아의 적층 및 동시 이미징을 가능하게 하여 주변 변동을 제거하고 처리량을 증가시킵니다.
거미줄 홀더에 배아를 장착하려면 특정 기교가 필요합니다. 설명 비디오는 많은 짧은 행동 제스처의 순서를 설명하는 데 이상적입니다. Sample Chamber-Based of Light Sheet 형광 현미경의 보정용.
먼저, 섭씨 80도의 드라이 블록 히터 믹서에서 아가로스 분취액을 재액화합니다. 용융된 아가로스를 섭씨 35도로 냉각시키고 50마이크로리터의 아가로스를 1.5ml 반응 튜브로 옮깁니다. 0.5 마이크로 리터의 형광 마이크로 스피어 용액을 1 분 동안 분당 1, 400 회전으로 아가로 스와 혼합하고 거미줄 홀더의 슬롯 구멍을 10 마이크로 리터의 아가로 형성 마이크로 스피어 용액 혼합물로 채 웁니다.
얇은 아가로스 필름만 남을 때까지 가능한 한 많은 아가로스를 흡인하고 아가로스가 30-60초 동안 응고되도록 합니다. 시료 챔버에 오토클레이브 수돗물을 채우고 거미줄 홀더를 시료 챔버에 천천히 삽입합니다. 감지 렌즈 앞의 홈이 있는 구멍을 이동하고 홀더를 조명 및 감지 축을 기준으로 45도 위치로 회전합니다.
거미줄 홀더는 투과광 채널에서 보이지 않아야 합니다. 적절한 형광 채널로 전환하고 레이저 출력과 노출 시간을 조정하여 형광 미세구가 적절한 신호를 제공하도록 합니다. 현재 가로 방향으로 향하는 아가로스 필름을 완전히 포함하는 volume of view를 지정하고 각 조명 및 검출 렌즈 조합에 대해 가능한 최대 축 해상도를 계산하여 Z spacing을 정의합니다.
그런 다음 형광 마이크로스피어의 3차원 테스트 Z 스택을 기록하고 X, Y 및 Z 최대 투영을 보정 차트와 비교합니다. 미세구가 흐릿하거나 흐릿하거나 왜곡되어 보이는 경우. 조명 및/또는 감지 렌즈의 위치를 조정합니다.
배아 결핵 형성의 경우, 라인당 1-6웰 플레이트의 A1, A2, A3 및 B3 웰에 8ml의 오토클레이브 수돗물을 추가합니다. 그런 다음 7ml의 오토클레이브 수돗물과 1ml의 차아염소산나트륨 용액을 B1 및 B2 웰에 추가합니다. 첫 번째 플레이트를 실체 현미경 아래에 놓고 세포 여과기가 포함된 첫 번째 배아를 A1 웰에 삽입합니다.
배아를 30-60초 동안 부드럽게 저어 세척한 후 거름망을 B1 웰로 옮깁니다. 스트레이너를 A30 웰로 옮기기 전에 플레이트를 2초 동안 세게 흔듭니다. 부드러운 교반으로 1분 동안 배아를 씻고 여과기를 B2 웰로 옮겨 대부분의 배아가 완전히 결핵 형성이 될 때까지 격렬하게 흔듭니다.
그런 다음, 스트레이너를 A3 웰로 옮겨 1분 동안 부드럽게 세척한 후, 다른 라인의 배아가 입증된 대로 처리될 때까지 비경화된 배아의 스트레이너를 B3 웰에 보관합니다. 배아를 거미줄 홀더에 장착하려면 시연된 대로 아가로스의 또 다른 분취량을 재액화합니다. 아가로스가 식으면 거미줄 홀더를 실체 현미경 아래에 놓고 홈이 있는 구멍에 10마이크로리터의 아가로스를 추가합니다.
피펫 팁을 사용하여 홈이 있는 구멍에 아가로스를 펴 바르고 얇은 아가로스 필름만 남을 때까지 가능한 한 많은 아가로스를 흡입합니다. 아가로스가 굳어지면 붓을 사용하여 배아를 조심스럽게 골라 아가로스 필름에 옮깁니다. 홈이 있는 구멍의 긴 축을 따라 앞쪽-뒤쪽 축이 홈이 있는 구멍의 긴 축과 정렬되도록 배열합니다.
배아를 안정화하려면 1-2 마이크로리터의 아가로스를 배아와 아가로스 필름 사이의 틈에 조심스럽게 피펫으로 넣으십시오. 아가로스가 응고되면 장착된 배아가 있는 거미줄 홀더를 이미지 버퍼로 채워진 샘플 챔버에 천천히 삽입합니다. 배아를 이미지화하려면 거미줄 홀더가 조명 및 감지 축에 대해 45도 위치에 있는지 확인하고 투과광 채널에서 배아를 시야의 중앙으로 이동합니다.
거미줄 홀더가 보이지 않아야 합니다. 다음으로, 배아의 중간 평면이 초점면과 겹치고 윤곽이 선명하게 나타날 때까지 Z의 마이크로 번역 단계가 있는 배아를 이동합니다. 형광 채널로 전환하지 않고 배아를 양방향으로 250미크론 이동하여 시야량을 지정합니다.
여러 방향으로 이미징이 필요한 경우, 배아를 적절하게 회전시키고, 배아에 초점을 맞추고, 방금 보여준 대로 시야량을 지정합니다. 그런 다음 장착된 다른 모든 배아에 대해 이 절차를 반복합니다. 모든 배아에 대해 볼륨 오브 뷰(volume of view)가 지정되면 형광 채널과 타임 랩스 매개변수를 정의하고 이미징 프로세스를 시작합니다.
며칠 동안 지속되는 분석의 경우, 증발을 줄이기 위해 샘플 챔버 입구를 적어도 부분적으로 덮는 것이 좋습니다. 이미징 분석이 끝나면 샘플 챔버에서 거미줄 홀더를 조심스럽게 제거하고 작은 페인트 브러시를 사용하여 아가로스 필름에서 배아를 분리하고 적절하게 라벨링된 현미경 슬라이드에 배아를 놓습니다. 적절한 표준 사육 조건에서 배양을 위해 슬라이드를 회수 접시에 놓습니다.
부화 시점이 다가오면 회수 접시를 자주 확인하고 부화한 유충을 24웰 플레이트의 개별 우물로 옮깁니다. 우물을 적절한 성장 배지로 반쯤 채운 다음 적절한 표준 사육 조건에서 유충을 배양합니다. 관찰된 개체가 성체가 되면 적절한 짝짓기 파트너를 제공하고 며칠 후에 자손을 확인합니다.
이 비디오에서는 약 하루 동안 서로 다른 형질전환 초파리 계통에서 파생된 3개의 배아의 형광 신호 역학을 관찰할 수 있습니다. 유사한 형광 패턴이 예상되었는데, 모든 라인이 아마도 유비쿼터스하고 구성적으로 활성화된 프로모터의 제어 하에 핵 국소화 EGFP를 발현했기 때문입니다. 그러나 비교 라이브 이미징 결과에서는 발현 패턴에서 주위 분산으로 인한 2차 효과가 아닌 강한 공간적 시간적 차이가 나타났습니다.
동일한 피기백 기반 전이유전자를 가진 3개의 Tribolium 배아에 대한 이 분석에서. gastrulation 중 serosa window closure process의 비교 라이브 이미징 결과는 두 번째 sub-line이 다른 두 sub-line보다 현저하게 더 강한 전체 신호를 제공한다는 것을 시사합니다. 이러한 데이터가 나타내는 바와 같이, 게놈 컨텍스트는 Tribolium에서 전이유전자의 발현 수준에도 큰 영향을 미칠 수 있습니다.
당사의 접근 방식은 야생형 대조 배아를 동시에 이미지화할 수 있기 때문에 knockdown 및 knockout 표현형을 분석하는 데 매우 적합합니다. 우리의 프로토콜은 또한 두 개 이상의 곤충 종의 형태 형성을 비교하는 데 사용할 수 있습니다. 따라서 개발의 진화에 대한 더 깊은 통찰력을 얻을
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본 연구는 광판 형광현미경을 사용하여 여러 시료의 동시 생체 이미징을 위한 프로토콜을 제시하며, 발달 생물학에서 주변 환경의 변화에 대응합니다. 배아를 쌓기 위한 거미줄 홀더를 사용하여 방법의 효율성을 향상시키고 불일치를 최소화합니다.
Simultaneous live imaging of multiple insect embryos addresses ambient variance in comparative studies, a critical factor for reliable phenotypic analysis in target validation and mechanistic de-risking. By enabling high-throughput imaging under consistent conditions, the method supports predictive confidence in early discovery workflows where genetic perturbations are evaluated. This approach enhances assay reproducibility and scalability, directly impacting enterprise R&D efficiency in preclinical model characterization.
The method integrates into discovery biology workflows by improving assay readiness for genetic screening and phenotypic analysis, particularly when comparing multiple genetic backgrounds or species.