C. 예쁜꼬마선충 배반구 해부: 난자 껍질을 제거하고 배아 세포를 해리하는 방법

- 이 해부를 위해 두 개의 마이크로 피펫을 사용하십시오 : 하나는 난자와 거의 같은 너비의 개구부와 두 배 너비의 개구부가 있고, 이들 사이의 빠른 이동을 용이하게하기 위해 우물에 구성 된 일련의 용액을 사용합니다.

먼저, 성체 자웅동체를 배아가 터지는 것을 방지하기 위해 삼투압 균형이 잡힌 난염 용액에 넣습니다. 발달 중인 배아를 방출하기 위해 벌레를 반으로 자릅니다.

그런 다음 2세포 단계 배아를 식별합니다. 이 세포는 수정란의 분열에 의해 형성된 할구입니다. 더 큰 구멍이 있는 마이크로피펫을 사용하여 배아를 차아염소산염 용액인 표백제로 옮기면 보호용 달걀 껍질을 분해하기 시작합니다.

40-55초 후에 배아를 Shelton의 성장 배지(SGM)로 이식합니다. 세 번째 웰에 넣기 전에 SGM의 두 웰에서 각 배아를 짧게 세척하여 표백제의 모든 흔적을 제거합니다.

이제 더 작은 마이크로피펫을 사용하여 배아를 반복적으로 피펫팅하여 난자를 제거하고 할구를 노출시키는 기계적 힘을 제공합니다. 배아를 계속 부드럽게 피펫팅하여 개별 배구 세포를 분리합니다. 다음 프로토콜에서는 이 기술이 작동하는 것을 볼 수 있습니다.

- 오른손과 왼손으로 10마이크로리터의 용량으로 미세 모세관의 양쪽 끝을 잡습니다. 미세 모세관을 양쪽 끝으로 당겨 장력을 가하고 모세관의 중심을 버너 위로 가져와 손으로 당긴 두 개의 모세관을 만듭니다.

해부 현미경 아래에서 손으로 당긴 모세 혈관의 끝을 집게로 다듬습니다. 배아 이식 및 난자 껍질 제거를 위해 두 개의 팁 개구부 크기를 각각 C. elegans 배아의 짧은 축 길이의 약 2배와 1배로 만듭니다.

당겨진 모세관을 입 피펫팅 장치에 부착합니다. 45마이크로리터의 달걀 소금 용액을 멀티 웰 슬라이드의 웰에 피펫팅합니다.

5-10마리의 성체 예쁜꼬마선충을 우물에 놓습니다. 초기 예쁜꼬마선충 배아를 얻으려면 예쁜꼬마선충 몸통의 오른쪽과 왼쪽에 두 개의 바늘을 놓고 바늘을 서로 지나쳐 성체를 조각으로 자릅니다.

45마이크로리터의 차아염소산염 용액을 함유한 웰 옆에 있는 웰에 피펫을 삽입하고, 45마이크로리터의 Shelton의 성장 배지를 후속 3개의 웰에 피펫팅합니다. 1세포 단계 및 초기 2세포 단계 배아를 더 큰 크기의 개구부가 있는 입 피펫으로 하이포코라이트 용액으로 옮기고 40-55초 동안 기다립니다.

처음 두 웰 각각에서 1-2초씩 Shelton의 성장 배지를 사용하여 다음 세 개의 웰로 배아를 옮겨 배아를 세척합니다. 더 작은 크기의 개구부가 있는 손으로 그린 모세관을 사용하여 난자 껍질을 제거하기 위해 배아를 조심스럽게 피펫팅하는 것을 반복합니다.

그 후, 손으로 채취한 모세혈관을 지속적으로 피펫으로 연결하여 2세포 단계 배아 할구를 분리합니다.

- 달걀 껍질을 제거한 후 파열을 방지하기 위해 배아를 위아래로 피펫팅할 때 가해지는 힘을 최소화합니다.