마이 그 레이션의 인간 T 림프구 분리, 문화 및 분석 체외에서

T 림프구 이동은 림프 기관으로의 귀환 중에 발생하며, 혈관 구조에서 빠져 나와 말초 조직으로 들어갑니다. 이 과정에는 T 세포 표면과 다른 세포의 접착 상호 작용이 포함됩니다. 이러한 현상을 조사하기 위해 in vitro human T 림프구를 분리, 배양하고 접착 단백질로 코팅된 조직 배양 플레이트에 놓습니다.

ICAM 1 및 케모카인 SDF 1. 그런 다음 T 림프구 이동의 이미지를 획득하고 분석할 수 있습니다. 안녕하세요, 저는 로체스터 대학교 백신 생물학 및 면역학 센터의 김민수 연구실의 크레이그 르포트(Craig LeFort) 연구실입니다.

오늘은 인간 청소년 림프구의 격리 및 배양 절차, 체외 이동 분석을 보여드리겠습니다. 우리는 실험실에서 이 분석을 사용하여 인테그린과 T 세포 이동의 역할을 연구합니다. T 세포의 주요 인테그린은 림프구 기능 관련 항원 1 또는 LFA 1입니다.

LFA 1에 대한 특정 리간드는 ICAM 1과 같은 icas입니다. 또한, T-세포 이동에는 방향성 신호를 제공하고 인테그린을 활성화하기 위해 친족 신호가 필요합니다. 당사의 분석에서는 인간 ICAM one 및 CX CL 12 또는 SDF one을 T 세포 이동을 위한 기질로 사용합니다.

시작하겠습니다. 건강한 헌혈자로부터 인간 혈액을 채취한 후 혈액을 실온으로 식히십시오. 이 작업은 약 30분 정도 걸립니다.

혈액이 냉각되면 3ml의 실온, 다형체 밀도 구배 매체를 8ml의 둥근 바닥 폴리스티렌 튜브에 부드럽게 피펫팅합니다. 그런 다음 그 위에 전혈 3ml를 부드럽게 첨가합니다. 혼합을 피하는 것이 중요합니다.

튜브를 원심분리기에 넣고 500G 45분 동안 돌립니다. 원심분리 후 실온에서 말초 혈액 단핵 세포 또는 P BMC는 다른 혈액 성분과 분리됩니다. PBMC 계층은 위에서 첫 번째 흐린 띠로 나타납니다.

멸균 상태에서 맑은 노란색의 상부 단계를 조심스럽게 제거하고 폐기하십시오. 그런 다음 P 1000 마이크로 피펫을 사용하여 PBMC 층을 새로운 원뿔형 튜브로 옮깁니다. PBMC를 500G의 PBS 원심분리 셀로 5분 동안 두 번 세척합니다.

매번 상등액은 세탁 후 다소 흐려집니다. 10%FBS, 1%페니실린 스트렙토마이신 및 밀리리터당 1마이크로그램을 포함하는 20ml의 RPMI 1640 배지에 세포를 다시 현탁시킵니다. PHA가 존재하는 상태에서 Phyto hemagglutinin 또는 PHA 배양은 T 림프구 활성화 및 확장을 유도합니다.

피펫을 사용하여 pbmC를 T 75 배양 플라스크로 옮깁니다. 다음으로 섭씨 37도, 이산화탄소 5%를 1시간에서 24시간 동안 배양했습니다. 이 단계를 통해 플라스크 표면에 부착되는 단핵구가 현탁액에 남아 있는 림프구와 분리될

배양 후 주로 림프구가 포함된 모든 배지를 조심스럽게 제거하고 15ml 원추형 튜브로 옮깁니다. 500g에서 5분간 원심분리기를 사용합니다. Reese는 RPMI 1640의 세포 펠릿이었으며 FBS, 페니실린, 스트렙토마이신 및 PHA가 섭씨 37도에서 배양된 25ml의 RPMI 1640을 포함하는 새로운 T 75 flaz로 세포를 전달합니다.

24시간 동안 성장한 후 15-20ml의 신선한 배지를 추가하고 더 큰 T 1 75 플라스크로 옮겨야 할 수 있습니다. 3일 또는 2일 동안 계속 배양하십시오. PBMC의 초기 배양이 3일 후 하룻밤 동안 이루어진 경우, 피펫을 사용하여 부유 림프구가 포함된 배지를 제거하고 500G에서 50분 동안 50ml 원추형 튜브 원심분리기로 옮깁니다.

Reese는 세포 펠릿이 되어 세포를 25밀리리터의 RPMI 1640을 함유하는 새로운 T 75로 옮겼습니다. FBS를 사용하면 페니실린, 스트렙토마이신 및 인간 IL 2 또는 IL 15가 세포를 인큐베이터에 넣습니다. T 75 플라스크를 시작하는 경우 배양물을 확장하여 T 1 75 플라스크로 옮겨야 합니다.

하루에서 이틀 후에 림프구가 자라서 총 4일에서 7일 동안 자랍니다. 이동 분석 하루 전, PBS의 단백질 A 또는 G 1밀리리터당 20마이크로그램으로 바닥 0.17mm 유리 접시를 코팅하고 다음 날 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다. PBS로 접시를 광범위하게 씻은 다음 PBS 용액의 ICAM one FC 및 human SD F1을 접시에 추가합니다.

분자를 고정시키기 위해 실온에서 4시간 동안 배양합니다. 혈류 세포 분석기를 사용하여 배양된 세포의 밀도를 측정합니다. 그런 다음 PBS로 림프구를 2회 세척하고 배양 후 D 포도당을 포함하는 L 15 배지 1밀리리터에 재현탁시키고, 코팅된 접시를 ICAM 1 FC 및 SDF 1로 광범위하게 세척하고 PBS로 1 밀리리터의 배지에 있는 T 림프구를 접시로 광범위하게 이동시키며, 이동 분석에 적합한 세포 밀도를 달성하기 위해 접시당 약 2 내지 5배 10 - 5번째 세포를 사용해야 합니다.

세포 이동의 이미지를 얻으려면 섭씨 37도의 가열된 챔버와 같은 온도 제어 환경의 현미경 스테이지에 접시를 놓습니다. 이미지 설정 메뉴에서 NIS 요소 소프트웨어를 엽니다. 2 by two binning을 라이브 이미징과 이미지 캡처 모두의 모드로 선택합니다.

응용 프로그램 메뉴로 이동하여 선택, 정의, 실행, 실험을 선택합니다. 이미지 사이의 시간과 총 시간을 선택합니다. 이미지 캡처 시퀀스의 경우 실행 버튼을 눌러 획득 후 이미지 획득을 시작합니다.

속도, 경로 길이 및 변위와 같은 마이그레이션 매개변수는 Image J, Auto Quant 또는 veloc과 같은 소프트웨어 패키지를 사용하여 정량화할 수 있습니다. 스파이더 웹 플롯을 생성하려면 각 셀과 시점에 대한 XY 좌표를 수집하고 원점에서 각 셀에 대한 공통 시작점이 있는 그래프에 투영합니다. 여기에 표시된 T 림프구를 ICAM 및 SDF one에서 배양 플레이팅하고 30분 동안 10초마다 이미지화했습니다.

이 동영상은 각 세포에 대한 XYT 좌표를 사용하여 분당 약 15미크론의 속도로 T 림프구의 무작위 이동을 보여줍니다. 15개의 세포가 무작위로 선택되고 원점에서 공통 시작점으로 표시되었습니다. 거미줄 플롯을 비교하면 서로 다른 실험 조건 간의 이동 차이를 시각적으로 빠르게 묘사할 수 있습니다.

제어 조건 하에서 T 림프구 이동에 대한 플롯은 왼쪽에 표시되고, 오른쪽에는 anti LFA one ligand blocking 항체가 있는 경우 T 림프구 이동에 대한 플롯이 표시됩니다. 이러한 데이터는 T 림프구가 인테그린 LFA 1을 활용하여 ICAM 1 기질로 이동한다는 것을 보여줍니다. 방금 시술 중에 배양된 인간 T 림프구를 사용하여 이동 분석을 수행하는 방법을 보여드렸습니다.

추적 및 이동 분석을 단순화하기 위해 ICAM one coated dish에 적절한 수의 세포를 추가하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 그게 다야. 시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.