Name: 마이 그 레이션의 인간 T 림프구 분리, 문화 및 분석 체외에서 /em (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-01T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: 배우세요 인간 T 림프구 분리, 배양 및 체외 이동 분석 방법을. ICAM-1과 SDF-1 코팅 플레이트를 사용하여 면역세포 역학을 연구하고 이미징 기법으로 세포 이동을 정량화합니다.

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이 프로젝트는 국민 건강 기금 HL087088 (MK)의 연구소와 HL18208 (MK)에 의해 지원되었다.

1. 인간의 T Lymphocytes의 분리 <ol><li> 건강한 기증자로부터 인간의 혈액을 구합니다. 혈액은 다음 단계로 진행하기 전에 실내 온도 (~ 30 분)로 냉각 수 있습니다. </li><li> 부드럽게 8 ML 왕복 하단의 폴리스티렌 튜브로 실내 온도 Polymorph 밀도 기울기 미디어 3 ML을 피펫. 부드럽게 Polymorph 미디어 위에 전체 혈액의 3 ML를 추가합니다. 두 시약의 혼합되지 않도록하는 것이 중요합니다. </li><li> 실온에서 45 분간 500 XG에서 튜브를 원심 분리기. </li><li> 원심 분리에 따라, 말초 혈액 mononuclear 세포 (PBMC)는 이제 최고 셀 레이어에 다른 혈액 구성 요소에서 분리합니다. PBMC 계층은 첫 번째 흐림 밴드로, 위에서 아래로 나타납니다. </li><li> 조심스럽게 PBMC 레이어 위에 혈액의 맑은 노란색 상위 단계를 제거하고 15 ML 50 ML 원뿔 관에 PBMC 레이어를 전송하는 P1000 micropipette를 사용합니다. </li><li> 오분 때마다 500 XG에서 세포를 centrifuging, PBS로 두 번 PBMC 씻으십시오. 뜨는은 각 씻고 나서 약간 뿌연됩니다. </li></ol> 2. 인간의 T Lymphocytes의 문화 <ol><li> 피펫 사용하여 10 % FBS를 포함한 20 ML RPMI 1640 미디어 T - 75 문화 플라스크에 PBMC을 전송, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신, 1 μg / ML phytohemagglutinin (PHA). </li><li> 37 품어 ° C와 5% 적어도 1 시간 및 최대 24 시간 동안 CO 2. 이 단계는 중단에 남아 lymphocytes에서 분리된 것으로, 술병의 표면에 점착 성의 것입니다 monocytes을 수 있습니다. 짧은 부화 (1 시간)가이 단계에서 사용하는 경우, 그것은 단계 2.1에 명시된 바와 같이 PHA와 보완없이 10% FBS, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신을 포함하는 RPMI 1640 미디어를 사용하기 위해 허용됩니다. </li><li> 신중하게, 술병에서 미디어를 모두 제거 50 ML 원뿔 관에 추가하고, 5 분 500 XG에 원심 분리기. </li><li> 지금은 주로 lymphocytes을 포함하는 세포 펠렛을 Resuspend, 10 % FBS를 포함한 25 ML RPMI 1640 미디어를 포함하는 새로운 T - 75 플라스크에 세포를 전송, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신, 1 μg / ML PHA. </li><li> 삼일 (PBMC의 초기 부화가 야간 있었다면 이일)에 대한 37 ° C에서 알을 품다. 성장 후 24 시간 후, 신선한 미디어 15-20 ML을 추가하고 큰 T - 175 플라스크로 전송해야 할 수도 있습니다. </li><li> 삼일 후, 50 ML 원뿔 관에 술병과 전송에서 미디어 및 정지 lymphocytes를 제​​거하는 피펫을 사용합니다. 5 분 500 XG에 원심 분리기. </li><li> 10% FBS 25 ML (T - 75) 50 ML (T - 175) RPMI 1640을 포함하는 새로운 T - 75 또는 T - 175 플라스크에 세포 펠릿 및 전송 세포를 Resuspend, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신, 20 NG / ML 인간 IL - 2 또는 IL - 15. </li><li> 4-7일에 대한 lymphocytes 성장. T - 75 플라스크로 시작하는 경우, 문화 1-2 일 후에 확대와 T - 175 플라스크로 전송해야합니다. </li></ol> 3. 관내 림프구 마이 그 레이션 분석에서 <ol><li> 마이 그 레이션 분석하기 전에 일일, 코트 4 PBS에서 A 또는 G 하루 20 μg / ML 단백질과 유리 바닥 0.17 mm 요리 ° C. </li><li> PBS로 광범위하게 접시를 씻으십시오. </li><li> 인간 ICAM-1/Fc (10 μg / ML)과 인간 SDF - 1 접시에 PBS 용액에서 이러한 시약을 추가하고 실온에서 4 시간 잠복기 (2 μg / ML).를 무력화 </li><li> 먼저 hemacytometer를 사용하여 T - 175 플라스크에 문화의 세포 밀도를 결정하여 T lymphocytes를 준비합니다. 약 2-5 X 10 5 세포는 마이 그 레이션 분석을 위해 적절한 세포 밀도를 달성하기 위해 요리마다 사용해야합니다. </li><li> PBS로 두 번 T lymphocytes 씻으 다음 1 MG / ML D - 포도당을 포함하는 하나 ML L - 15 미디어 resuspend. </li><li> 광범위하게 PBS로 ICAM-1/Fc와 SDF - 1 코팅 접시를 씻으십시오. </li><li> 접시 1 ML 미디어에서 T의 lymphocytes을 전송하고 37 그들을 유지 ° C. </li></ol> 4. NIS 요소 소프트웨어를 사용하여 이미지 시퀀스를 캡처 <ol><li> NIS 요소 소프트웨어를 여십시오. </li><li> 카메라 설정 메뉴에서, 살아있는 영상 및 이미지 캡처 모두 모드로 "2x2 비닝"을 선택합니다. </li><li> 응용 프로그램 메뉴로 가서 실행 / 정의 실험을 선택합니다. </li><li> 이미지와 이미지 캡처 시퀀스의 총 길이 사이의 시간의 길이를 선택합니다. </li><li> 이미지 수집을 시작하기 위해 "실행"버튼을 누르십시오. </li><li> 전지 추적할 수 및 마이 그 레이션 매개 변수 (속도, 경로 길이, 변위 등) ImageJ, AutoQuant 또는 Volocity (그림 1)를 포함한 여러 소프트웨어 패키지 중 하나를 사용하여 계량. </li><li> 각각의 셀 및 timepoint 수집 (그림 2)와 원점에서 각 셀에 대해 일반적인 시작 지점 (그림 3)과 그래프에 예상이됩니다 생성하려면 "거미줄 계획을,"XY 좌표. </li></ol> 5. 대표 결과 IL - 2 또는 IL - 15, T의 lymphocytes 중 하나의 존재에 문화의 일 6뿐만 아니라 긍정적인 CD4 및 / 또는 CD8 얼룩 같은 긍정적인 인 경우에는 3 번 CD의 얼룩에 의해 결정 세포의&gt; 98%을 구성합니다. IL - 2에 대해서는 83 % CD4 + 세포가 15 % CD8 +와 &lt;1 %의 CD4 + CD8 + 세포를 발견했습니다. IL - 15의 경우, 우리는 88 %의 CD4 + 세포, CD8 + 11% 및 &lt;1 %의 CD4 + CD8 + 세포를 발견했습니다. ICAM-1/SDF-1 기판에 대한 T 림프구 마이 그 레이션하는 동안, 세포는 1 시간 기간 동안 유지할 수 약 15 μm의 / 분 속도를 전시. ICAM-1/SDF-1에 대한 T 림프구 마이 그 레이션, LFA - 1 - 중재 접착에 따라 달라집니다 같은 반 LFA - 1 리간드 차단 항체 것은 심각하게 마이 그 레이션을 억제. <img src="/files/ftp_upload/2017/2017fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. T lymphocytes 마이 그 레이션의 세포 추적. 전체 혈액에서 분리된 6 일간 IL - 2 또는 IL - 15의 면전에서 교양 T의 lymphocytes 10 μg / ML ICAM - 1과 함께 코팅 유리 바닥으로 요리를 준수하고 마이 그 레이션하는 허용되었습니다 2 μg / ML SDF - 1. 이미지는 30 분 10 초마다을 인수했다. 세포는 각 이미지를 식별하고 Volocity 소프트웨어를 사용하여 시간이 지남에 추적되었다. 이 영화는 ~ 15 μm의 / 분 속도로 T lymphocytes의 임의의 마이 그 레이션을 보여줍니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2017/2017_Kim_Movie1.mov">비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> T lymphocytes 마이 그 레이션의 영화 1. 세포 추적. T의 lymphocytes는 전체 혈액에서 분리의 면전에서 교양 IL - 2 6 일 또는 IL - 15는 10 μg / ML ICAM - 1, 2 μg / ML SDF - 1 코팅 유리 바닥으로 요리를 준수하고 마이 그 레이션하는 허용되었습니다 . 이미지는 30 분 10 초마다을 인수했다. 세포는 각 이미지를 식별하고 Volocity 소프트웨어를 사용하여 시간이 지남에 추적되었다. 이 영화는 ~ 15 μm의 / 분 속도로 T lymphocytes의 임의의 마이 그 레이션을 보여줍니다. <img src="/files/ftp_upload/2017/2017fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. Spatiotemporal 세포 위치. 각 세포의 XY 좌표는 Volocity 소프트웨어를 사용하여 각 시점에 대한 취득했다. <img src="/files/ftp_upload/2017/2017fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. "스파이더 웹 플롯." XYt를 사용하면 각 셀에 대한 15 세포가 무작위로 선택되었으며 원점에서 일반적인 출발점와 제휴해서 역모를 조정합니다. 거미 웹 음모를 비교하면 서로 다른 실험 조건 사이의 마이 그 레이션의 차이를 빠르게 시각적으로 묘사를 제공합니다. 제어 조건 하에서 T 림프구 마이 그 레이션 (왼쪽 패널) 및 안티 LFA - 1 리간드 차단 항체 (오른쪽 패널)의 존재에 플롯.

<ol><li>Hyun, Y. M., Chung, H. L., McGrath, J. L., Waugh, R. E., Kim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activated+integrin+VLA-4+localizes+to+the+lamellipodia+and+mediates+t+cell+migration+on+VCAM-1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Activated integrin VLA-4 localizes to the lamellipodia and mediates t cell migration on VCAM-1.</a> J Immunol. 183, 359-369 (2009).</li>
<li>Morin, N. A., Oakes, P. W., Hyun, Y. M., Lee, D., Chin, Y. E., King, M. R., Springer, T. A., Shimaoka, M., Tang, J. X., Reichner, J. S., Kim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonmuscle+myosin+heavy+chain+IIA+mediates+integrin+LFA-1+de-adhesion+during+T+lymphocyte+migration%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">Nonmuscle myosin heavy chain IIA mediates integrin LFA-1 de-adhesion during T lymphocyte migration.</a> The Journal of experimental medicine. 205, 195-205 (2008).</li>
<li>Hyun, Y. M., Lefort, C. T., Kim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+integrins+and+their+ligand+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Immunologic+research%22%5BJournal%5D)">Leukocyte integrins and their ligand interactions.</a> Immunologic research. , (2009).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

본 실험에서는, 우리는 기본 인간 T의 lymphocytes의 운동성를 분석하는 간단한 시스템에 대한 자세한 내용을 제공합니다. 체외 마이 그 레이션 assays 다양한 세포 유형의 운동에 관련된 다양한 분자와 신호 경로의 역할을 해부하다하는 데 사용되었습니다. 우리 프로토콜에서 자신의 실험을 설계할 때 염두에 두어야하는 몇 가지 중요한 컨트롤은 다음과 같습니다 : 1) 소 혈청 알부민 (BSA) 또는 폴리 - L 라이신 (PLL)과 같은 비 접착제 또는 비 인테 접착제 기판 코팅을, 각각 2 ) 인테 특정 등 SDF - 1의 프로토콜에서 설명한대로 stimulatory 신호 않고 인테 그린의 특이성, 그리고 3) 공동 코팅을 결정하는 항체 치료를 차단.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11875</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>SH300070.03</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신(Penicillin-Streptomycin)</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>1-Step Polymorphs</td><td>Accurate Chemical &amp;amp; Scientific Corporation</td><td>AN221725</td><td></td></tr><tr><td>PHA</td><td>Remel, Thermo Fisher Scientific</td><td>R30852801</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 IL-2(Rec. human IL-2)</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>202-IL</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 IL-15(Rec. human IL-15)</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>247-IL</td><td></td></tr><tr><td>Protein G</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>19459</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 ICAM-1/Fc(Rec. human ICAM-1/Fc)</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>720-IC</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 SDF-1(Rec. human SDF-1)</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>350-NS</td><td></td></tr></tbody></table>

마이 그 레이션의 인간 t 림프구 분리, 문화 및 분석 체외에서</em

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

T lymphocytes의 마이 그 레이션은 다른 세포 또는 세포외 기질 단백질로 표현 리간드와 함께 세포 표면 integrins의 접착제 상호 작용을 포함한다. 낮은 친화 상태에서 세포 첨단에 높은 친화력 상태로 integrins의 정확한 spatiotemporal 활성화 T 림프구 마이 그 레이션에 대한 중요<sup&gt; 1</sup&gt;. 마찬가지로, 세포 후행 가장자리의 철회는, 또는 uropod, 영구적인 인테 종속적인 T 림프구의의 운동성을 유지하는 데 필요한 단계입니다<sup&gt; 2</sup&gt;. 수단으로 면역 또는 염증 질환 대상 integrins 많은 치료 방법은 leukocytes의 과도한 모집 및 마이 그 레이션을 억제하기 위해<sup&gt; 3</sup&gt;. 인간의 T 림프구의 마이 그 레이션을 조절 분자 이벤트를 연구하기 위해, 우리는를 활용해야<em&gt; 체외에서</emT 림프구는 vasculature에서 모집하는 동안 발생하는 환경을 모방 2 차원 기판의 셀 마이 그 레이션을 분석&gt; 시스템. T의 lymphocytes 먼저 인간의 기증자로부터 격리되고 나서 자극을 7 일에서 열흘 동안 양식입니다. 분석하는 동안, T의 lymphocytes는 세포 유착 분자 -1 (ICAM - 1), 인테 LFA - 1에 대한 리간드와 stromal 세포 - 파생 요소 - 1 (SDF - 1) 코팅 기판에 준수 및 마이 그 레이션하는 허용됩니다. 우리의 데이터는 T lymphocytes는 ~ 15 μm의 / 분 철새 속도를 전시 것을 보여줍니다. T 림프구 마이 그 레이션은 인테 그린의 봉쇄에 의해 저해 수 있습니다<sup&gt; 1</sup&gt; 또는 세포 actomyosin 기계 억제제에 의해 그 세포 마이 그 레이션을 조절<sup&gt; 2</sup&gt;.

T 림프구 마이 그 레이션 림프 기관, vasculature에서 출구로 유도하는 동안 발생하고, 주변 조직을 체결. 여기, 우리는 T 림프구 마이 그 레이션을 분석하는 데 사용할 수있는 프로토콜을 설명<em&gt; 체외에서</em&gt;.

마이 그 레이션의 인간 T 림프구 분리, 문화 및 분석 체외에서</em

T 림프구의 이동은 세포 표면 인테그린과 다른 세포에 발현된 리간드 또는 세포 외 기질과의 접착성 상호작용을 포함합니다.

T 림프구 이동은 림프 기관으로의 호밍, 혈관에서의 유출 및 말초 조직으로의 진입 과정 중에 일어납니다. 이 과정은 T 세포 표면과 다른 세포 간의 접착 상호작용을 포함합니다. 이 현상을 시험관 내(in vitro)에서 조사하기 위해 인간 T 림프구를 분리 및 배양한 후, 접착 단백질이 코팅된 조직 배양 플레이트에 배치합니다.ICAM 1 및 케모카인 SDF 1입니다. 이후 T 림프구 이동 이미지를 획득하여 분석할 수 있습니다. 안녕하세요, 저는 로체스터 대학교 백신 생물학 및 면역학 센터의 김민수 교수님 연구실의 Craig LeFort입니다.오늘은 인간 T 림프구의 분리 및 배양, 그리고 이들의 인비트로(in vitro) 이동 분석 절차를 보여드리겠습니다. 저희 실험실에서는 인테그린의 역할과 T 세포의 이동을 연구하기 위해 이 분석법을 사용합니다. T 세포의 주요 인테그린은 림프구 기능 관련 항원 1(lymphocyte function associated antigen one) 또는 LFA-1입니다.LFA 1의 특이적 리간드는 ICAM 1과 같은 ICAM 계열입니다. 또한, T세포 이동에는 방향성 신호를 제공하고 인테그린을 활성화하기 위한 케모카인 신호가 필요합니다. 본 실험에서는 T세포 이동을 위한 기질로 인간 ICAM 1 및 CXCL 12 또는 SDF 1을 사용합니다.그럼 시작해 보겠습니다. 건강한 기증자로부터 인혈을 채취한 후, 혈액을 상온에서 식힙니다. 이 과정은 약 30분이 소요됩니다.혈액을 냉각시킨 후, 상온의 polymorph density gradient media 3 mL를 8 mL 원형 바닥 폴리스티렌 튜브에 조심스럽게 피펫팅합니다. 그 다음, 그 위에 전혈 3 mL를 조심스럽게 첨가합니다. 이때 혼합되지 않도록 주의하는 것이 중요합니다.튜브를 원심분리기에 넣고 500 G에서 45분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후 실온에서 말초혈액 단핵구 또는 PBMC가 다른 혈액 성분으로부터 분리됩니다. PBMC 층은 상단에서 첫 번째로 나타나는 흐린 띠 형태로 관찰됩니다.무균 조건 하에서, 투명한 노란색의 상층액을 조심스럽게 제거하여 버립니다. 그런 다음 P 1000 마이크로 파이펫을 사용하여 PBMC 층을 새로운 원뿔형 튜브로 옮깁니다. PBMC를 PBS로 두 번 세척하며, 세포를 500 G에서 5분 동안 원심 분리합니다.매 세척 후 상층액은 다소 뿌옇게 보일 것입니다. 10% FBS, 1% penic

human-t-lymphocyte-isolation-culture-analysis-migration

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우리는 인간 피부 생검에서 피부 상주 T 세포를 효율적으로 분리하는 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 유세포 분석 및 생체 외 배양을 위한 충분한 수의 생존 가능한 인간 피부 상주 림프구를 생성합니다.

표현형 분석 및 대한 인간의 피부에서 림프구 분리<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 세포 배양

이 프로토콜의 목표는 형광 활성화 된 셀 정렬 (FACS)를 사용하여 인간의 림프 기형 낭종 같은 선박과 포피 선을 긋고있는 림프 내피 세포를 분리하는 것입니다. 이후 세포 배양하고이 세포의 확장, 유전 단백체, 기능 및 세포 분화 연구를위한 실험적인 새로운 수준의 정교한을 허용합니다.

다중 매개 변수 형광 활성화 된 셀 정렬하여 인간의 림프 내피 세포의 분리

림프구는 적응 면역 반응의 주요 플레이어입니다. 여기에서는 in vitro 및 in vivo에서 원하는 분자의 림프구 활성화의 생리학적 기능을 결정하기 위한 림프구 정제 프로토콜을 제시합니다. 설명된 실험 절차는 대조군 림프구와 유전자 변형 림프구 간의 기능적 능력을 비교하는 데 적합합니다.

분리 및 쥐 림프구의 활성화

여기에서는 체외에서 중추신경계로의 림프구 전이를 조사할 수 있는 인간 혈액-뇌 장벽 모델에 대해 설명합니다.

를 사용하여 림프구 혈관 외로 유출 분석<em&gt; 체외</em&gt; 인간의 혈액 - 뇌 장벽의 모델

림프 구 chemotaxis 및 마이그레이션에 대 한 양적 평가 대 한 프로토콜은 면역학 연구를 위한 중요 한 도구입니다. 여기, 생체 외에서 프로토콜 허용 실시간, 다중화 세포 이동의 평가 뿐만 아니라 상호 보완적인 vivo에서 기술 활성화 추적 기본 셀의 비장에 설명 되어 있습니다.

인간 Monocyte Chemotaxis에서 생체 외에서 그리고 Vivo에서 인신 매매 Murine 림프 구 측정

여기 창 자 연관 된 림프 조직 Peyer의 패치 및 배수 mesenteric 림프절을 포함 하 여 유도 사이트와 lamina propria 포함 이펙터 사이트에서 세포의 고립에 대 한 자세한 프로토콜 설명 및 작은 장 면역 시스템의 장 상피입니다.

마우스 작은 장의 면역 시스템에서 세포를 분리

이 프로토콜에서 림프구는 다공성 멤브레인에 의해 하단 챔버로부터 분리 된 트랜스 이민 시스템의 상부 챔버에 배치됩니다. 케모카인은 하단 챔버에 첨가되어 케모카인 그라데이션을 따라 활발한 이동을 유도합니다. 48 시간 후, 림프구는 트랜스 이민을 정량화하기 위해 두 챔버에서 계산됩니다.

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