Name: 인간 Monocyte Chemotaxis에서 생체 외에서 그리고 Vivo에서 인신 매매 Murine 림프 구 측정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: 배우세요 생체 외 실시간 단핵구 화학주성 분석 및 생체 내 림프구 이동 추적 방법을 사용하여 면역학 연구에서 세포 이동을 정량 평가하는 기술을 익히세요.

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이 작품 의학 및 영양 연구에 대 한 록펠러 대학, 록펠러 대학에 로버트 슨 치료 개발 기금 그리고 Sackler 센터에서 의사 과학자에 대 한 버나드 L. 슈워츠 프로그램에 의해 지원 되었다는 록펠러 대학입니다.

모든 절차는 록펠러 대학에 의해 승인 되었다 &#39; 기관 동물 관리 및 사용 위원회. 모든 동물은 특정 병원 체 자유로운 조건에서 보관 되어 있었다.
 1. 체 외에서 Chemotaxis <ol><li>문화 THP-1 세포와 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 4-(2-hydroxyethyl)-1 보충 로스웰 파크 기념 연구소 1640 (RPMI 1640)에 6- piperazineethanesulfonic 산 (HEPES; 25 m m) (미디어 완료), 0.5-1.0 x 10 6 셀/mL 사이 밀도 유지.</li>
	<li>에는 35 m m 세포 배양 접시, 30 분에 대 한 calcein acetoxymethyl (calcein-오전; 2.5 µ M) 또는 37 ° C에서 완전 한 미디어에 적합 한 형광 성 염료 다른 조건 당 3.5 x 10 라벨 5 THP-1 셀 
	참고: 염료 세포 막 투과성 및 라이브 셀 라벨와 호환 되어야 합니다.</li>
	<li>사전 따뜻한 플레이트 리더를 37 ° c. 
	참고: 뿐만 아니라 온도 제어, 하단-읽기 기능이입니다 또한 필요. 마이그레이션 단계 1.10.2 정량화에 대 한 플레이트 리더를 대안에 대 한 참조 셀.</li>
	<li>셀 라벨는 하는 동안 준비 시험 접시와 낮은 챔버.
	<ol><li>사용 24-잘 조직 배양 플레이트, 잘 당 한 상태. 3 중에 수행 하는 각 조건.</li>
		<li>행 크의 추가 750 µ L &#39; s Buffered 소금물 (HBSS) 24-잘 접시에 25 mM HEPES 및 0.1% 소 혈 청 알 부 민 (BSA)와 버퍼. 이 기저 제어 상태 역할을 합니다.
		비교 조건, 750 µ L에서 아래쪽 챔버에 전체 볼륨을 항상 유지에 대 한 <ol><li>다른 사용 우물. 
			참고:이 예제에서는 인간 monocyte chemoattractant 단백질-1 (MCP-1) 역할을 chemotaxis 7에 대 한 긍정적인 제어 합니다.
			<li>어셈블 시 혼합물 25 mm HEPES HBSS, BSA (0.1%), 및 MCP-1을 결합 하 여 <ol>(75 ng/mL). 성인 소 혈 청을 사용 하 여 (2.7 %v / v) 추가 긍정적인 컨트롤로 MCP-1. 
				참고: Chemokine 및 chemokine 농도 연구에서 혈 축에 따라 달라 집니다. 동결 건조 된 MCP-1 최종 농도 50 μ g/mL의 재고 솔루션 BSA (0.1%)와 증류수에 resuspended 이다. 이 작업 솔루션 10 μ g/mL의 물에 희석 수 있습니다. 더 낮은 약 실에이 솔루션의 5.6 μ 추가.</li>
			</ol></li></ol></li> <li>아래쪽 챔버의 구성이 완료 된 후 삽입 탭 플레이트의 노치와 정렬 있도록 각 잘 다공성 삽입 장소. 
		참고: 삽입에 대 한 적절 한 기 공 크기를 선택 하십시오. Monocytes, lymphocytes 3 μ m의 기 공 크기를 잘 수행합니다. 일부 세포 유형 및 chemokine 시스템은 최적의 마이그레이션에 대 한 매트릭스 코팅 표면이 필요할 수 있습니다. 예를 들어 측정 THP 1 monocyte chemotaxis MCP-1으로, fibronectin 또는 콜라겐 코팅 삽입은 것이 좋습니다. 정량에 대 한 플레이트 리더, 삽입 있어야 빛 impermeant 코팅, 폴 리 에틸렌 테 레프 탈 레이트, 등 비 마이그레이션의 탐지를 방지 하기 위해 상단에 셀 챔버 8.</li>
	</ol></li> <li>Calcein 오전와 30 분에 대 한 셀을 잠복기 후 15 mL 원뿔 튜브에 세포 현 탁 액을 전송. 2 분에 대 한 1000 x g에서 원심 분리기 세포 육안으로 직접 검사 calcein-오전 ( 그림 1)의 확인을 셀.</li>
	<li>신중 하 게 상쾌한 진공 흡 인기를 사용 하 여 제거 합니다. 혈 청 무료 RPMI 1640 HEPES 25 m m와 보완에 레이블된 셀을 씻어. 1000 x g 2 분 동안에 세포를 원심 및 삭제는 상쾌한.</li>
	<li>Resuspend 셀 세럼 무료 RPMI 1640 HEPES 25 m m로 보완. 셀 및 셀 10 6 셀/mL x 1.0-1.5의 최종 농도에 볼륨 조정.</li>
	<li>삽입 (위 약 실)에 세포 현 탁 액의 분배 250 μ.</li>
	<li>모든 상단 챔버 채워 졌, 부드럽게 접시를 올리고 마이그레이션 및 탐지를 방해할 수 있는 공기 방울의 존재에 대 한 밑면을 검사 후. 거품을 제거 하려면 먼저 다음 다시 삽입 위치를 제거해 보십시오. 실패할 경우 27 G 니 들을 사용 하 여 거품을 찔린 다음 삽입 위치를.</li>
	<li>37 ° C에 미리 데워 진된 플레이트 리더에 접시를 놓습니다.
	<li>취득 형광 읽기 1-3 분 간격 아래에서 <ol>. Calcein 오전에 사용 하 여, 형광 흥분 및 방출 파장에서 설정 485 nm와 520 nm, 각각. 셀 유형 및 chemokine 시스템에 따라 chemotaxis 일반적으로 이상의 1-4 h ( 그림 2A) 발생 합니다.</li>
		<li>연속 측정 하는 대신 485에는 거꾸로 형광 현미경 ( 그림 2B) 흥분 하 고 빛의 감지를 사용 하 우물 이미지 플레이트 리더를 사용 하 여 및 520 nm, 각각. 낮은 확대를 사용 하 여 삽입의 밑면의 대부분을 잡으려고. ImageJ 또는 유사한 소프트웨어 9 이미지를 처리 하 여 셀을 계량.</li>
	</ol></li></ol> 2. Murine Lymphocytes 입양 전송 <ol><li>기증자 세포의 준비 <ol><li>Anesthetize 8-12 주-isoflurane 마 취 (1-3%)는 기화 기를 사용 하 여 오래 된 C57BL/6J 남성 기증자 쥐. 발가락-핀치에 의해 마 취의 적절 한 깊이 확인.</li>
		<li>부정사 위치에 마우스를 놓습니다. 메스와 중간 절 개를 만들고 상단 왼쪽된 복 막 공간에서 비장을 찾습니다. 삭제할 모든 비장 고 완벽 한 미디어 (RPMI 10 %FBS 25mm HEPES 보충, 1 mL/비장) 얼음에 합니다. 잘린에 의해 마 취 기증자 동물을 안락사.</li>
		<li>단일 셀 펜션과 전송 15 mL 원뿔 튜브에 게 주사기 플런저의 끝을 사용 하 여 완전 한 미디어 (1 mL /spleen)로 40 µ m 나일론 메시 부드럽게 통해 비장 조직 갈기.</li>
		<li>추가 4 염화 염화 칼륨 (ACK) 세포의 버퍼 볼륨과 lyse 적혈구를 실 온에서 5 분 동안 품 어.</li>
		<li>1000 x g 실 온에서 2 분 동안에 세포를 원심 고 상쾌한 삭제. 적혈구는 펠 릿에 남아, 경우 ACK 세포의 용 해 버퍼에서 resuspend, 실 온에서 5 분 동안 품 어, 1000 x g 2 분 동안에 세포를 원심 및 상쾌한 삭제.</li>
		<li>Resuspend 2 5 10 7 셀/mL, x의 농도에 완전 한 미디어에 셀 다음 40 µ m 나일론 메쉬 셀 파편 제거를 통해 세포 현 탁 액을 변형.</li>
		<li>레이블 1 형광 염료와 호환 10 7 셀/받는 사람 마우스 x 셀 생활과 그 5-chloromethylfluorescein diacetate (최종 농도 2 μ M) 10 등 이후 고정 시 유지 될 것 이다 . 30 분 동안 37 ° C에서 품 어 
		참고: 하나 이상의 세포 인구를 추적 하려면 추가 셀 인구와 다른 형광 성 염료를 사용 합니다. 5-(and-6)-(((4-chloromethyl) 벤 조일와 기증자 세포의 부분을 표시 하는 예를 들어,) 아미노) tetramethylrhodamine (최종 농도 2 μ M) 11.</li>
		<li>추가 4 볼륨 HBSS 보충 25mm HEPES, 다음 2 분 및 폐기 상쾌한 1000 x g에서 원심 분리기. HBSS HEPES 25 m m 1 x 10 8 셀/mL의 최종 농도에 보충에 펠 릿을 resuspend.
		<ol><li>하나 이상의 형광 염료를 사용 하는 경우 계속 주입 직전까지 분리 하는 세포 인구.</li>
			<li>이후의 흐름 cytometry 보상 통 솔루션 (1 mL)을 각 색의 세포의 작은 약 수 (10 μ) 전송.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>림프 톨의 전송 <ol><li>8-12 주 Anesthetize-isoflurane (1-3%);는 기화 기를 사용 하 여의 오래 된 C57BL/6J 남성 받는 사람 마우스 발가락 핀치에 의해 마 취의 깊이 확인. 동물에 수의 연 고를 적용 &#39; 건조 방지 하기 위해 s 눈.</li>
		<li>짧게 소용돌이 기증자 세포 (1 s) 및 1 mL 주입 주사기 27 g, 바늘, 0.5에 해당 하는 경우 차동 레이블이 세포 인구를 결합.
		<ol><li>이후의 흐름 cytometry 분석 통 솔루션 (1 mL) 혼합된 셀의 작은 약 수 (10 μ) 전송.</li>
		</ol></li> <li>기증자 동물 발생 하기 쉬운 위치에 배치. 눈, 약간 내 다 눈알을 일으키는 등 피부에 가벼운 꼬리 압력 적용.</li>
		<li>Medially 바늘을 직접 하 고 각 받는 사람 마우스에 복고풍 orbitally 기증자 세포 현 탁 액의 100 µ L를 주입. 셀도 꼬리 정 맥을 통해 주입 할 수 있습니다.</li>
		<li>는 점차적으로 주사 바늘을 철회 하 고 복구에 혼자 마우스를 놓습니다. 그것은 의식; 회복 될 때까지 동물을 모니터링 일단 완전히 복구 된 반환 동물 사회 주택.</li>
	</ol></li> <li>수집 및 분석 <ol><li>1 시간 후 anesthetize 한 기화 기를 사용 하 여 받는 사람 마우스 isoflurane 마 취 (1-3%)와 함께, 발가락-핀치에 의해 마 취의 깊이 확인. 비장 (또는 관심의 다른 조직) 수확 (2.1.2 단계.) 각 받는 사람 마우스와 완전 한 미디어 (1 mL/받는 사람)에 장소에서. 잘린에 의해 마 취 동물을 안락사. 
		참고: 조직 수확 전에 더 긴 간격으로 적어도 24 h. 통해 조직 축적 증가</li>
		<li>주사기 플런저의 끝을 사용 하 여 단일 세포 현 탁 액 및 전송 15 mL 원뿔 튜브에 게 완전 한 미디어로 40 µ m 나일론 메시 부드럽게 통해 비장 조직 갈기.</li>
		<li>추가 4 볼륨 ACK 세포의 버퍼링 하 고 실 온에서 5 분을 품 어. 실 온에서 2 분 동안 1000 x g에 세포 현 탁 액을 원심 및 상쾌한 삭제.</li>
		<li>얼룩에서 resuspend 셀 버퍼 (인산 염 버퍼 염 분 보충 1 %FBS). 셀 고 3 x 10 7 셀/mL의 최종 농도를 조정 합니다. 세포 현 탁 액의 100 µ L 하단 플레이트 라운드 96 잘 전송.</li>
		<li>Cytometry에 의해 분석을 위해 원하는 마커 (재료의 표 참조)에 대 한 얼룩 셀. 원하는 표시에 대 한 fluorophore 활용 된 항 체 (재료의 표 참조)를 추가 하 고 어둠 속에서 20 분 동안 4 ° C에서 품 어. 100 µ L를 추가 3 분 1000 x g에서 세포를 원심 버퍼, 얼룩 및 삭제는 상쾌한.</li>
		<li>200 µ L에 펠 릿을 resuspend 3 분 1000 x g에서 세포를 원심 버퍼, 얼룩 및 삭제는 상쾌한.</li>
		<li>Resuspend 125 µ L 얼룩에 펠 릿 버퍼 및 표준 절차를 사용 하 여 교류 cytometer를 사용 하 여 샘플을 수집. 
		참고: 녹색 염료 488 nm 레이저에 의해 흥분 되 고 방출 505 530/30 dichroic 필터 감지. 주황색 염료는 561에 의해 흥분 및 방출 582/15의 dichroic 필터에 의해 검출 된다.
		<ol><li>2.1.8.2 각 형광 성 염료에 대 한 보상에서 사용 저장 셀. 
			참고: fluorophores 여기 및 라벨 염료의 방출 스펙트럼과 구슬 기반 보상을 사용 하 여 차선 보상 발생 합니다.</li>
			<li>사용 하 여 단계 2.2.2.1에서에서 저장 된 입력된 셀의 비율을 정확 하 게 결정 경우 하나 이상의 레이블이 인구 ( 그림 3)를 사용 하 여 차동 입력된 셀을 표시. 레이블이 없는 셀 ( 그림 4)에 표시 된 계산의 비율에 따라 조직 특정 마이그레이션.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

저자 공개할 게 없다

면역 세포 이동의 정량화는 간단한를 사용 하 여 수행할 수 있습니다 그리고 신속한 분석 실험 체 외에서 그리고 vivo에서모두. 혈 청에 의해 인간 monocytes MCP-1 그라디언트 및 확대에 대 한 응답에서의 chemotaxis 생체 외에서 설명합니다. Vivo에서, 기증자 murine splenocytes 차동 표시 했다 고 입양 전송 다음 받는 사람 동물에서 발견 했다.
몇 시간 포인트 샘플링의 장점이 플레이트 리더를 사용 하 여 (자주 매일 30 s) 및 셀 자동화 마이그레이션의 정량. 이 평가 및 개인 우물의 수동 계산의 더 노동 집약적인 방법 피하에 대 한 단일 시간 지점을 선택 하는 필요성을 obviates. 또한,이 방법은 현미경 검사 법에 의해 수집 될 수 있다 보다 더 동적 정보를 제공 합니다. 분석 하는 동안 그것는 셀 아래쪽 챔버에 삽입을 떨어질 것 이다 형광 강도에 기여 하지 것 이다 유...

강력한 면역에는 부상, 감염에 적절 하 게 응답 하 고 생성 하는 self-tolerance 세포 유형의 수많은 복잡 한 시간적 및 공간 조정을 필요 합니다. 여러 다스 chemokine 수용 체와 그들의 해당 ligands 발견 되었습니다 하 고 특정 셀에 의해 특징이 제공 분자 기계 장치는 특정 시간에 특정 조직으로 지시 될 수 있다. 따라서, 공부 chemotaxis 및 마이그레이션 면역학 연구의 필수적인 구성 요소 이다. 실제로, 설명 체 외에서 분석 결과 가속 C C 19와 21 발산3으로 T-세포의 chemotaxis 혈 공동 인자를 식별 하기 위해 심사 도구로 사용 최근 했다. 여기에 설명 된 방법의 목적은 면역 세포 chemotaxis에서 생체 외에서 그리고 vivo에서의 정량적 평가 허용 하는.
Boyden (셀 이동과 침략) 챔버 분석 결과 셀 마이그레이션4,5을 평가 하기 위한, 재현, 저렴 하 고 빠른 방법입니다. 표준 분석 결과에서 상단 챔버 셀, 시드 고 낮은 챔버로 셀 이동에서 다공성 삽입으로 구분 됩니다. 원하는 시간에 셀 삽입의 밑면 마이그레이션한 고정 고 가벼운 현미경 검사 법에 의해 정량에 대 한 스테인드 될 수 있습니다. 그러나, 이러한 측정 동적 데이터 수집 하는 걸로 단일 끝점으로 데이터 수집을 제한 하 고 분석을 위한 최적의 시간 점을 결정 광범위 한 최적화를 요구할 수 있습니다. 여기, 여러 적응 chemotaxis에서 생체 외에서의 실시간, 양적 및 다중화 측정을 허용 하는 설명 합니다.
Vivo에서 학문에 대 한 기능 끝점 사용 됩니다, 즉 주어진된 조직에 세포의 특정 축적. 사전 분류 기증자 세포 입양 전송을 통해 받는 사람 동물에 소개 된다. 이러한 기증자 세포 이후에 받는 조직 수확 후 cytometry로 식별할 수 있습니다. 또한 다른 종류의 세포는 단일 받는 사람 동물 내에서 인신 매매의 결정에 대 한 수 있도록 공동 상표 전략이 이다. 이 방법은 셀 주입, 및 생리 간 동물 다양성에 대 한 계정에서 동물 간 편차를 제거합니다.

<table><tbody><tr><td>RPMI-1640</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>ATCC</td><td>30-2020</td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 플라스크</td><td>Corning</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>Calcein AM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C1430</td><td>여기: 485nm, 방출: 520nm</td></tr><tr><td>세포 문화 접시</td><td>Corning</td><td>1007</td><td></td></tr><tr><td>24 웰 플레이트</td><td>Corning</td><td>353504</td><td></td></tr><tr><td>Fluoroblok Fibronectin 인서트</td><td>Corning</td><td>CB354597</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 원뿔형 튜브</td><td>Corning</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>세포 신호 기술</td><td>9998S</td><td></td></tr><tr><td>인간 재조합 MCP-1</td><td>Peprotech</td><td>300-04</td><td></td></tr> 칼슘과 마그네슘이 함유된 <tr><td>성인 소 혈청</td><td>시그마</td><td>B9433</td><td></td></tr><tr><td>HBSS; 페놀 레드 없음</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax M2e 플레이트 리더</td><td>분자 장치</td><td></td><td></td></tr><tr><td>올림푸스 IX71 도립 형광 현미경</td><td>올림푸스 Isothesia</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Henry Schein 동물 건강</td><td>11695-6776-2</td><td>이소플루오란 마취</td></tr><tr><td>셀 스트레이너 40um 나일론</td><td>팔콘 코닝</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>ACK 용해 버퍼</td><td>품질 생물학적</td><td>118-156-101</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker 오렌지 CMTMR 염료</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C2927</td><td>여기: 541nm, 방출: 565nm</td></tr><tr><td>CellTracker Green CMFDA 염료</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C2925</td><td>여기: 485nm, 방출: 520nm</td></tr><tr><td>5ml 주사기</td><td>BD 주사기</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>1ml TB 주사기</td><td>BD 주사기</td><td>309625</td><td></td></tr><tr><td>THP-1 세포주</td><td>ATCC</td><td>TIB-202</td><td></td></tr><tr><td>브릴리언트 바이올렛 421 안티 마우스 CD3 항체</td><td>Biolegend</td><td>100228</td><td>여기: 405nm, 방출: 421nm</td></tr><tr><td>브릴리언트 바이올렛 605 안티 마우스 CD19 항체</td><td>Biolegend</td><td>115540</td><td>여기: 405nm, 방출: 603nm</td></tr><tr><td>96웰 원형 바닥판</td><td>Corning</td><td>353077</td><td></td></tr><tr><td>LSRII</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>유세포 분석기</td></tr></tbody></table>

인간 monocyte chemotaxis에서 생체 외에서 그리고 vivo에서 인신 매매 murine 림프 구 측정

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Chemotaxis는 특정 화학 그라데이션1따라 마이그레이션. 발산은 해부학과 시간적 특이성2세포질 매매 홍보 혈 cytokines. Chemotaxis는 세포의 중요 한 기능 그리고 양이 많게 될 수 있는 다른 면역 세포에 생체 외평가. 이 원고 chemotaxis의 평가 허용 하는 방법에 설명 합니다 둘 다 생체 외에서 그리고 vivo에서, 셀 라인 및 기본 셀을 포함 하 여 다양 한 셀 형식에 대 한. 생체 외에서플레이트 기반 포맷 허용 몇 가지 조건 동시에 비교 실시간, 1-4 헤 체 외에서 분석 결과 조건 주 작동 근 그리고 길 항 근, 소개를 조작할 수 있습니다 내에서 완료 될 수 있습니다 그리고 뿐만 아니라 chemokinesis에서 chemotaxis 차별화는 임의 운동. Vivo에서 인신 매매 평가, 대 한 면역 세포는 여러 형광 염료로 표시 고 입양 전송에 사용 될 수 있습니다. 셀의 차동 라벨 혼합된 셀 인구 함으로써 분산 감소 하 고 적절 하 게 구동된 실험에 필요한 동물의 수를 줄이고 동일한 동물에 소개 될 수 있습니다. 1 시간 만큼 적게 발생 하는 림프 조직으로 마이그레이션 하 고 여러 조직 구획을 샘플링할 수 있다. Cytometry 조직 수확에 따라 여러 종류의 세포 철새 패턴의 급속 한 양적 분석 할 수 있습니다.

Calcein 오전 염료를 사용 하는 경우 셀의 시각적 검사 레이블 통풍 관 (그림 1)를 확인 합니다. 자동화 된 형광 판독 시간이 지남에 삽입의 아래쪽에 셀 교통으로 마이그레이션을 추적 합니다. 이러한 데이터는 명확 하 게 혈 청 (그림 2A)에 의해이 응답의 확대 뿐만 아니라 MCP-1으로 셀 이동의 유도 표시. 철새 자극의 강도 따라, 신호 증가 전에 적어도 15 분의 지연이 있다. 형광 신호 피크 하 고 점차적으로 거부할 수 있습니다. 이 셀 셀 위 약 실에서 마이그레이션 보다 더 빠른 속도로 낮은 챔버로 솔루션으로 통과 삽입의 밑바닥에 고착 하는 셀의 수에 있는 순수한 감소를 나타냅니다. 더 강한 철새 자극에 일반적으로 결과) 형광 값;에 상승의 이전 발병 형광; 증가의 b) 빠른 속도 그리고 c) 높은 피크 형광 값. 거꾸로 형광 현미경 검사 법에 의해...

림프 구 chemotaxis 및 마이그레이션에 대 한 양적 평가 대 한 프로토콜은 면역학 연구를 위한 중요 한 도구입니다. 여기, 생체 외에서 프로토콜 허용 실시간, 다중화 세포 이동의 평가 뿐만 아니라 상호 보완적인 vivo에서 기술 활성화 추적 기본 셀의 비장에 설명 되어 있습니다.

인간 Monocyte Chemotaxis에서 생체 외에서 그리고 Vivo에서 인신 매매 Murine 림프 구 측정

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and ...

이들 분석의 전반적인 목표는 단핵구의 화학주성을 인비트로(in vitro)에서 실시간으로 정량화하고, 림프구의 이동을 인비보(in vivo)에서 추적하는 것입니다. 인비트로 방법은 혈청 인자가 면역 세포의 화학주성에 미치는 영향과 같은 면역학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 인비트로 기술의 주요 장점은 실시간으로 정량적 및 다중 측정이 가능하다는 점입니다.in vivo 방법은 특정 세포 유형이 수용 동물 내에서 어떻게 이동하는지에 관한 면역학 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. in vivo 기법은 특히 동일한 동물 내에서 여러 세포 유형의 이동을 정량적으로 평가하는 데 유용합니다. 실험을 시작하기 전, 37 °C의 완전 배지가 담긴 35 mm 세포 배양 접시에서 THP-1 세포를 형광 염료로 30분 동안 표지하십시오.세포를 배양하는 동안, 25 mM HEPES와 0.1% BSA가 포함된 HBSS 750 µL를 24-well 플레이트의 배경 대조군 및 양성 대조군 웰에 첨가하십시오. BSA가 첨가된 증류수에 적절한 농도로 희석한 MCP-1을 실험군 및 양성 대조군 웰에 첨가하십시오. 그리고 다공성 인서트의 탭이 플레이트의 홈과 일치하도록 주의하여 각 웰에 인서트를 배치하십시오.인서트를 배치한 후 바닥 웰에서 기포를 제거하는 것이 매우 중요한데, 기포는 형광 측정에 방해가 되기 때문입니다. 배양이 끝나면, 원심분리를 통해 세포를 수집하기 위해 라벨링된 세포를 15 milliliter 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 그리고 생성된 펠릿을 육안으로 확인하여 염료의 흡수 여부를 확인합니다.다음으로, 상층액을 조심스럽게 진공 흡입하여 제거하고, 동일한 원심분리 조건 하에서 25 millimolar HEPES가 보충된 무혈청 RPMI-1640 배지로 세포를 세척합니다. 세포 수를 측정하기 위해 펠릿을 HEPES가 포함된 신선한 무혈청 배지에 재부유합니다. 그리고 최종 농도가 1~1.5 × 10⁶ cells/mL가 되도록 부피를 조절합니다.각 웰의 상단 챔버에 세포 250 µL를 넣고 플레이트를 37 °C 플레이트 리더기에 넣습니다. 그런 다음, 사용한 염료에 적합한 형광 들뜸 및 방출 파장에서 1~3분 간격으로 하단 챔버의 형광 값을 측정합니다. 입양 전이를 위한 공여자 세포를 준비하려면, 먼저 마취된 8~12주령 수컷 C57 black six 마우스의 비장을 전체 수확하여 얼음 위에 놓인 완전 배지가 담긴 세포 배양 접시 내의 40 µm 나일론 메쉬 필터에 거릅니다.주사기 플런저 끝을 사용하여 메쉬를 통해 비장을 부드럽게 마쇄합니다. 단일 세포 현탁액이 얻어지면 세포를 15 milliliter 원심 분리 튜브로 옮기고, 적혈구를 제거하기 위해 4배 부피의 ammonium chloride potassium 용혈 버퍼를 첨가합니다. 실온에서 5분 후, 원심 분리를 통해 세포를 수집하고 펠렛을 2~5 × 10⁷ cells/mL 농도의 완전 배지에 재현탁합니다.새로운 40 µm 나일론 메시로 세포를 걸러 세포 부스러기를 제거합니다. 그리고 수신 마우스당 1×10⁷개의 세포를 이후 고정 과정 후에도 유지되는 생세포 호환 형광 염료로 37°C에서 30분 동안 표지합니다. 배양이 끝나면 HEPES가 보충된 HBSS 4배 부피로 세포를 세척합니다.그리고 펠렛을 신선한 HBSS 및 HEPES에 재현탁하여 1 × 10⁸ cells/mL 농도로 맞춥니다. 다음으로, 공여 세포를 짧게 볼텍싱한 후 27게이지 0.5인치 바늘이 장착된 1mL 주사기에 주입합니다. 마취된 8~12주령의 C57BL/6 수용 쥐를 복와위로 배치하고, 첫 번째 동물의 안구 배측 피부에 가벼운 꼬리 쪽 압력을 가하여 안구가 약간 돌출되도록 합니다.공여 세포 100 µL를 안와 후 주입하기 위해 바늘을 내측으로 향하게 합니다. 그 다음, 바늘을 서서히 빼내고 마우스가 완전히 회복될 때까지 모니터링하며 개별 회복 케이지에 넣습니다. 동물들이 적절하게 마취되었는지 확인하는 것과, 동물 간 및 실험 간에 일관된 세포 전달을 보장하기 위해 주입 절차를 충분히 숙달하는 것이 매우 중요합니다.입양 전이 후 최대 24시간 이내에, 수recipient당 1 mL의 완전 배지에 비장을 수확합니다. 그리고 앞서 시연한 것과 같이 적혈구가 제거된 단일 세포 현탁액을 생성합니다. 세포 수를 센 후, 염색 완충액을 사용하여 세포 현탁액의 농도를 3 × 10⁷ cells/mL로 조정합니다.그리고 100 µL의 세포를 96웰 라운드 바텀 플레이트의 개별 웰에 옮깁니다. 표준 유세포 분석 프로토콜에 따라 세포를 관심 마커로 염색합니다. 빛이 차단된 상태로 얼음 위에서 20분간 둔 후, 100 µL의 염색 완충액으로 세포를 세척하고 펠렛을 200 µL의 신선한 염색 완충액에 재현탁하여 두 번째 원심분리를 수행합니다.그런 다음 펠렛을 125 µL의 신선한 염색 버퍼에 재현탁하고, 표준 프로토콜에 따라 유세포 분석기로 세포 샘플을 분석합니다. 이동을 추적하기 위한 자동 형광 판독 결과, MCP-1에 의한 세포 이동 유도가 확인되었으며 이는 혈청 존재 하에서 더욱 증강되었습니다. 이동 자극의 강도에 따라, 형광 신호가 증가하기 전 최소 15분의 지연 시간이 발생하며, 이 신호는 세포가 인서트 하단에서 하단 챔버 용액으로 상단 챔버에서 이동하는 세포보다 더 빠른 속도로 빠져나가면서 정점에 도달한 후 점차 감소할 수 있습니다.둘 이상의 형광 표지된 세포군을 입양 전이하는 경우, 세포군 혼합 시 발생할 수 있는 편차를 고려하기 위해 투입 물질 내 세포군의 상대적 비율을 정량화하는 것이 중요합니다. 예를 들어, 본 실험에서 녹색과 주황색 형광 세포의 비율은 0.97 대 1이었습니다. 세포 이동(trafficking)은 회수된 표지 세포 수를 회수된 총 세포 수로 나누어 정량화하였습니다.회수된 세포 수에는 동물 간에 상당한 차이가 있지만, 특정 동물의 경우 녹색 형광 세포와 오렌지색 형광 세포의 비율은 일반적으로 거의 동일합니다. 숙달되면 in vitro 기술은 4시간 이내에, in vivo 기술은 적절하게 수행했을 때 6시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 수행할 때 실험 챔버 내에 기포가 생기지 않도록 주의하고, 입양 전이된 세포의 안와 뒤 주입 시 일관성을 유지하는 것이 중요합니다.이 기술의 개발 이후, 면역학 분야의 연구자들은 체외(in vitro) 및 체내(in vivo)에서 화학주성을 탐구할 수 있는 길을 열게 되었습니다. 이 영상을 시청하신 후에는 체외 화학주성 분석을 실시간으로 수행 및 모니터링하는 방법과, 입양 전이 및 체내 이동 추적을 위해 천연 림프구를 분리하는 방법에 대해 충분히 이해하시게 될 것입니다. 시청해 주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

우리는 생체내에서 호중구 chemoattractant의 근원에 대한 응답으로 호중구 모집 중에 동적으로 호중구 - 내피 세포 상호 작용을 측정하기위한 brightfield intravital 현미경의 프로토콜을 설명합니다. 호중구 intraluminal 크롤링, 마우스 cremaster 근육 조직에 transendothelial 마이 그 레이션 및 chemotaxis 시간은 타락한 동영상 사진 및 ImageJ와 추적과 시각입니다.

추적 호중구 Intraluminal 크롤링, Intravital 비디오 현미경에 의한 조직의 Transendothelial 마이 그 레이션 및 Chemotaxis

이 비디오는 혈액뇌장벽(BBB) 내피 모델을 통한 림프구 이식에 대한 실험적 조사를 보여줍니다. 인간 뇌 미세혈관 내피 세포(HBMEC)의 단층을 in vitro에서 생성하고, 림프구를 포함하는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 단층에 추가합니다. 그런 다음 세포를 배양하여 림프구 형질전환이 가능하도록 하고, 이동된 세포는 유세포 분석을 사용하여 정량화합니다.

미세혈관 내피 세포 단층을 통한 림프구 전이 연구

우리 인간의 내 피 monolayers에 걸쳐 monocytes에 의해 환생 및 거품 세포로 그들의 후속 성숙 측정 프로토콜을 설명 합니다. 이 혈액이 경향이 향상 시킬 수 있는 요인을 평가 하 고 다른 질병 조건 가진 사람에서 격리 하는 monocytes의 atherogenic 속성을 평가 하기 위해 다양 한 메서드를 제공 합니다.

Monocyte 환생 및 개인 만성 염증 성 조건에서 거품 세포 형성의 정량화

혈관 벽 손상 후 또는 염증 동안 백혈구 avidly 혈관 세포와 혈소판 상호 작용합니다. 여기, 우리 간단 층 흐름 기반 분석 결과 기초 백혈구와 셀룰러 파트너 간의 상호 작용 분자 메커니즘의 특성을 설명 합니다.

교양된 혈관 세포에 부착 혈소판 백혈구 신규 모집 조사 하 층 플로우 기반 분석

여기, 우리가 특정 표면 마커 및 공초점 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 흐름 체 외에서 매매 하는 monocyte 부분 모집단을 측정 하는 통합된 프로토콜 제시. 이 프로토콜은 다른 특정 표면 마커를 사용 하 여 다른 백혈구 하위 프로로 뿐만 아니라 순차 모집 단계를 탐험 하 사용할 수 있습니다.

생체 외에서 흐름 아래 Monocyte 모집단의 채용의 동시 연구

여기, 우리는 순 진, 염증된에서 백혈구 탈출구의 정량화 vivo에서 악성 murine 피부에 대 한 방법을 보여 줍니다. 두 모델의 머리 비교를 수행 하는 우리: 경 피 FITC 응용과 현장에서 photoconversion. 또한, 피부 종양에서 백혈구 탈출구를 추적 하기 위한 photoconversion 유틸리티를 설명 합니다.

백혈구 탈출구 Murine 피부 및 종양 림프 혈관을 통해 측정

여기 소개 된 프로토콜 vivo에서 염증 성 조건 하에서 기본 인간 림프 톨의 폐 유도 용량 특성을 수 있습니다. 알레르기 염증의 마우스 모델에서 adoptively 전송된 인간의 면역 세포의 폐 침투 몇 군데 하 고 화학적으로 허가 폐 조직의 빛 시트 형광 현미경 검사 법에 의해 측정할 수 있습니다.

고급 폐 유도 빛 시트 현미경 검사 법에 따라 알레르기 염증의 Vivo 모델에서 실험에서 인간 림프 톨의 이미징

여기에서 우리는 마우스 모형에 있는 혈액 단핵구의 화학전술 활동을 정량화하고, 혈액 단핵구에 영양, 약리학 및 유전 내정간섭의 효력을 평가하고 혈액 단핵구 파생된 대식세포특성화하기 위하여 프로토콜을 제시합니다 단핵구 화학 유도제 단백질-1 (MCP-1)을 사용하여 마우스 모델 - 로드 지하 막 유래 젤 플러그.

생체 내에서 단핵구 화학 적 활동의 정량화 및 혈액 단핵구 유래 대식세포의 특성화

이 프로토콜에서 림프구는 다공성 멤브레인에 의해 하단 챔버로부터 분리 된 트랜스 이민 시스템의 상부 챔버에 배치됩니다. 케모카인은 하단 챔버에 첨가되어 케모카인 그라데이션을 따라 활발한 이동을 유도합니다. 48 시간 후, 림프구는 트랜스 이민을 정량화하기 위해 두 챔버에서 계산됩니다.

Ex Vivo 트랜스이민 시스템에서 림프구 마이그레이션 평가

여기에서 우리는 화학 전술 보완 C5a 구배를 이미지 마우스 상주 복막 대식세포에 시간 경과, 위상 대조 현미경 검사법을 사용하여 방법을 설명합니다. 프로토콜은 그밖 면역 세포로 확장될 수 있습니다.

마우스 대식세포 화학의 시간 경과 화상 진찰

이 프로토콜은 정량 분석을 통해 특정 환경 조건에서 T 세포 이동의 일차 쥐 T 세포 분리 및 타임 랩스 현미경 검사 방법을 제공합니다.

일차 쥐 CD8+ T 세포에 대한 Real-Time In Vitro Migration Assay

배우세요 생체 외 실시간 단핵구 화학주성 분석 및 생체 내 림프구 이동 추적 방법을 사용하여 면역학 연구에서 세포 이동을 정량 평가하는 기술을 익히세요.

인간 Monocyte Chemotaxis에서 생체 외에서 그리고 Vivo에서 인신 매매 Murine 림프 구 측정

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