인간 Monocyte Chemotaxis에서 생체 외에서 그리고 Vivo에서 인신 매매 Murine 림프 구 측정

림프 구 chemotaxis 및 마이그레이션에 대 한 양적 평가 대 한 프로토콜은 면역학 연구를 위한 중요 한 도구입니다. 여기, 생체 외에서 프로토콜 허용 실시간, 다중화 세포 이동의 평가 뿐만 아니라 상호 보완적인 vivo에서 기술 활성화 추적 기본 셀의 비장에 설명 되어 있습니다.

이 분석의 전반적인 목표는 in vitro에서 단핵구 화학주성을 실시간으로 정량화하고 in vivo에서 림프구 이동을 추적하는 것입니다. 시험관 내 방법은 면역 세포 화학주성에 대한 혈청 인자의 영향과 같은 면역학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. in vitro 기술의 주요 장점은 실시간으로 정량 및 다중 측정이 가능하다는 것입니다.

in vivo 방법은 특정 세포 유형이 수용 동물 내에서 어떻게 이동하는지에 대한 면역학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. in vivo 기술은 동일한 동물 내에서 여러 세포 유형의 이동을 정량적으로 평가하는 데 특히 유용합니다. 실험을 시작하기 전에 35mm 세포 배양 접시에 THP-1 세포를 30분 동안 섭씨 37도의 완전한 배지에 넣어 형광 염료로 라벨링합니다.

세포가 배양하는 동안 25 millimolar HEPES 및 0.1%BSA로 완충된 750 마이크로리터의 HBSS를 24 well plate의 배경 및 positive control well에 추가합니다. BSA가 보충된 물에 적절한 농도의 MCP-1을 실험 및 양성 대조군 웰에 첨가합니다. 그리고 다공성 인서트를 각 웰에 넣고 인서트의 탭이 플레이트의 노치와 정렬되도록 주의하십시오.

인서트를 배치한 후 하단 웰에서 기포를 제거하는 것이 중요한데, 기포가 형광 측정을 방해할 수 있으므로 말입니다. 배양이 끝나면 라벨링된 세포를 15ml 원추형 튜브로 옮겨 원심분리로 수집합니다. 그리고 결과 펠릿을 육안으로 검사하여 염료의 흡수를 확인합니다.

다음으로, 상등액을 조심스럽게 진공 흡입하고 동일한 원심분리기 조건에서 25밀리몰 HEPES가 보충된 무혈청 RPMI-1640 배지로 세포를 세척합니다. 계수를 위해 HEPES가 있는 신선한 무혈청 배지에 펠릿을 재현탁합니다. 그리고 부피를 1-1.5 곱하기 10 밀리리터당 6 셀의 최종 농도로 조정하십시오.

각 웰의 상부 챔버에 250마이크로리터의 세포를 추가하고 플레이트를 섭씨 37도의 플레이트 리더에 넣습니다. 그런 다음 염료에 대한 적절한 형광 여기 및 방출 파장에서 1-3분 간격으로 바닥 챔버의 형광 판독값을 획득합니다. 기증자 세포의 입양 이식을 준비하기 위해, 먼저, 마취된 수컷 8주에서 12주 된 C57 블랙 식스 마우스의 전체 비장을 얼음 위에 완전한 배지가 들어 있는 세포 배양 접시의 40마이크로미터 나일론 메쉬 필터로 채취합니다.

주사기 플런저의 끝을 사용하여 메쉬를 통해 비장을 부드럽게 침식합니다. 단일 세포 현탁액이 얻어지면 세포를 15ml 원추형 튜브로 옮기고 4가지 부피의 염화암모늄 칼륨 용해 완충액을 첨가하여 적혈구를 고갈시킵니다. 실온에서 5분 후, 원심분리로 세포를 수집하고 펠릿을 2-5배 10에서 밀리리터당 7번째 세포 농도로 완전한 배지에 재현탁합니다.

새로운 40마이크로미터 나일론 메쉬를 통해 세포를 변형시켜 세포 파편을 제거합니다. 그리고 투여받은 쥐당 7개의 세포에 10 번 라벨을 붙인 후 섭씨 37도에서 30분 동안 고정하면 유지되는 살아있는 세포 호환 형광 염료를 사용합니다. 배양이 끝나면 HEPES가 보충된 4가지 부피의 HBSS로 세포를 세척합니다.

그리고 펠릿을 신선한 HBSS와 HEPES에 1 곱하기 10 밀리리터 당 8 번째 세포 농도로 재현탁시킵니다. 다음으로, 기증자 세포를 잠시 와류로 돌려 27 게이지 0.5 인치 바늘이 장착 된 1 밀리리터 주사기에로드합니다. 마취된 8주에서 12주 된 C57 블랙 6 수혜 마우스를 엎드린 자세로 놓고 첫 번째 동물의 눈과 같은 피부에 가벼운 꼬리 압력을 가하여 안구가 약간 튀어나오게 합니다.

100마이크로리터의 기증자 세포의 후안와 주사를 위해 바늘을 내측으로 향하게 합니다. 그런 다음 바늘을 점차적으로 빼내고 완전히 회복될 때까지 모니터링하면서 마우스를 개별 복구 케이지에 넣습니다. 동물을 적절하게 마취하고 주입 절차를 잘 수행하여 동물 간 및 실험 전반에 걸쳐 일관된 세포 전달을 보장하는 것이 중요합니다.

입양 이식 후 최대 24시간까지, 수혜자당 1ml의 완전한 배지로 비장을 수확합니다. 그리고 방금 시연된 것처럼 적혈구가 없는 단세포 현탁액을 생성합니다. 계수 후, 염색 완충액에서 세포 현탁액을 10의 3배로 조절하여 10 밀리리터당 7개 세포로 농도를 조절합니다.

그리고 100마이크로리터의 세포를 96웰 원형 바닥 플레이트의 개별 웰로 옮깁니다. 표준 유세포 분석 프로토콜에 따라 관심 marker에 대한 세포를 염색합니다. 빛으로부터 보호된 얼음에서 20분 후 100마이크로리터의 염색 완충액으로 세포를 세척하고 두 번째 원심분리를 위해 200마이크로리터의 새 염색 완충액에 펠릿을 재현탁합니다.

그런 다음 펠릿을 125마이크로리터의 새로운 염색 완충액에 재현탁시키고 표준 프로토콜에 따라 유세포 분석기에서 세포 샘플을 분석합니다. 이동을 추적하기 위한 자동화된 형광 판독은 혈청의 존재 하에서 증강되는 MCP-1로의 세포 이동 유도를 명확하게 보여줍니다. 이동 자극의 강도에 따라, 형광 신호가 증가하기 전에 최소 15분의 지연이 있으며, 이는 상부 챔버에서 이동하는 세포보다 더 빠른 속도로 삽입물의 아래쪽에서 하부 챔버로 용액으로 통과함에 따라 세포가 최고조에 달하고 점차 감소할 수 있습니다.

하나 이상의 형광 표지된 세포 집단이 채택적으로 전달되는 경우, 세포 집단 혼합의 차이를 설명하기 위해 입력 물질 내 세포 집단의 상대적 비율을 정량화하는 것이 중요합니다. 예를 들어, 이 실험에서 녹색과 주황색 형광 세포의 비율은 0.97 대 1이었습니다. 밀매는 회수된 라벨링된 세포의 수를 회수된 총 세포 수로 나눈 값으로 정량화되었습니다.

동물 간에 회수된 세포의 수에는 상당한 차이가 있지만, 주어진 동물의 경우 녹색 형광 세포와 주황색 형광 세포의 비율은 일반적으로 거의 같습니다. 일단 숙달되면 시험관 내 기술은 4시간 안에 완료할 수 있으며, 생체 내 기술은 적절하게 수행되면 6시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안, 실험실에 기포가 생성되지 않도록 하고 양적으로 이식된 세포의 역궤도 주입 동안 일관성을 유지하기 위해 노력하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

개발 후 이 기술은 면역학 분야의 연구자들이 체외 및 생체 내에서 화학주성을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 체외 화학주성 분석을 실시간으로 수행 및 모니터링하고, 네이티브 림프구를 분리하여 채택 이식 및 생체 내 이동을 추적하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 여러분의 실험에 행운을 빕니다.