Name: 를 사용하여 림프구 혈관 외로 유출 분석 체외 인간의 혈액 - 뇌 장벽의 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: 학습하세요 인간 혈액-뇌 장벽 모델을 이용한 림프구 혈관 외로 유출 분석 방법을 통해 중추신경계 염증 질환의 메커니즘을 규명하고 새로운 치료 전략 개발에 활용할 수 있습니다.

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이 연구는 Collaborative Research Centre CRC TR128 "Initiating/Effector versus Regulatory Mechanisms in Multiple Sclerosis-Progress toward Tackling the Disease"(Project A9 to H.W. and C.C.G., project B1 to N.S.)의 지원을 받았습니다.

1. 셀 인간의 뇌 미세 혈관 내피 세포의 문화 (HBMEC) <ol><li> 세포 배양 플라스크의 코팅 <ol><li> 상기 피브로넥틴 용액을 제조 15 mL의 원심 분리 튜브에 10 ㎖의 PBS를 추가한다. 150 μL의 피브로넥틴을 넣고 잘 섞는다. </li><li> 바닥을 덮는 T-25 세포 배양 물 플라스크 피브로넥틴 용액 2 mL를 넣고. 배양기에서 37 ℃에서 적어도 3 시간 동안 세포 배양 플라스크를 인큐베이션. 피브로넥틴 코팅 된 플라스크를 37 ℃ / 5 % CO 2에서 2 주 동안 저장 될 수있다. </li></ol></li><li> 시드와 HBMEC의 세포 배양 <ol><li> 세포 배양 플라스크의 바닥에서 대기음 피브로넥틴 용액. 6 mL의 ECM-B 배지에 현탁하고 7.2 × 104 HBMEC / cm² 이상 추가 (= ECM-B는 5 % 소 태아 혈청, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 및 1 %의 내피 세포 성장 보충 보충). 37 ° C / 5 % CO 2에서 인큐베이션. 현미경을 사용하여 매일 세포의 성장을 확인하십시오. </li><li> 3 일마다 매체를 변경합니다.수확 또는 HBMEC 약 80 %의 합류에 도달 분할 세포. HBMEC 생리적 특성의 손실을 방지하기 위해 통로 (1) 및 (15) 사이에 사용한다. </li></ol></li><li> 수확 HBMEC. <ol><li> 1의 비율로 PBS로 accutase (1X)를 혼합하여 용액을 제조 accutase 1. 추가 사용까지 수욕에서 37 ° C에서 accutase 솔루션을 유지합니다. </li><li> 15 mL의 원심 분리 튜브에 세포 배양 플라스크에서 ECM-B의 매체에 옮긴다. 세포 배양 플라스크의 바닥에 5 ㎖의 PBS를 추가하여 HBMEC 씻는다. 대기음 PBS 및 세척 단계를 두 번 더 반복한다. </li><li> 2ml의 accutase의 미리 가온 용액을 첨가. 2 분 동안 37 ℃에서 인큐베이션. 그 후, HBMEC 단단히 세포 배양 플라스크을 여러 번 눌러 다시 일시 중지됩니다. 세포 분리는 현미경을 사용하여 제어 </li><li> 이전에 15 ㎖의 튜브에 저장된 ECM-B 매체 빨리 HBMEC을 분리하기 시작 다시 세포 배양 플라스크에 첨가한다. 대부분의 HBMEC이 될 때까지 반복 플라스크의 바닥을 씻어다시 중단. </li><li> 15 mL의 원심 분리 튜브에 세포 현탁액을 전송. 실온에서 10 분 동안 300 XG 원심 분리기. 상등액을 버리고 1 mL의 ECM-B 배지에서 세포를 다시 일시. 세포를 세어 용액 ECM-B 배지 당 3 × 105 HBMEC의 최종 농도를 달성하기 위해 세포 현탁액을 희석. </li></ol></li></ol> 셀 문화 삽입 2. 준비 <ol><li> 세포 배양 삽입의 코팅 중요 사항 : 세포 배양 삽입의 막을 만지지 마십시오. <ol><li> 각 세포 배양 용 삽입 100 μL의 피브로넥틴 용액 (1.1.1 참조) (도 1a)와 96- 웰 편평 바닥 플레이트의 한 웰 (광 제어 웰)를 추가한다. 37 ℃에서 적어도 3 시간 동안 배양. 배양 대기음 피브로넥틴 솔루션 후. </li><li> 100 μL HBMEC의 세포 배양 삽입 정학 잘 광학 컨트롤을 추가합니다. 셀의 하부 구획에 600 μL ECM-B 매체 추가문화 삽입합니다. 37 ° C / 5 배리어 무결성 (도 1b)까지의 CO 2 %에 도달시 사일 아니라 광 제어에 HBMEC 현미경 평가하여 세포 성장을 확인 - 3 부화. 참고 : 사일 이상 세포 성장은하지 않는 것이 좋습니다. </li><li> 선택적 : 염증 상태를 모방하는 하부 구획의 매체를 흡인하고 24 시간 마이그레이션 분석 전에 500 U / ㎖의 IFN-γ / TNF-α 보충 ECM-B 배지로 교체한다. </li></ol></li></ol> 윤회의 분석의 날에 에반스 블루 3. 품질 관리 <ol><li> 에반스 블루 용액의 제조 <ol><li> 15 ML의 원심 분리기 튜브를 사용하여 200 μL의 B27 보충제와 PBS / B27 솔루션 믹스 10 mL의 PBS를 준비합니다. 에반스 블루 원액을 희석 (20 ㎎ / ㎖ PBS) 1 : PBS / B27 1,000. </li></ol></li><li> 에반스 블루 투과성 분석 <ol><li> 상부 구획이어서 하부 구획에서 매체 기음합류 HBMEC 단층을 함유 한 세포 배양 인서트. 세포 배양 삽입에 100 μL 에반스 블루 솔루션을 추가합니다. </li><li> 상기 하부 구획에 600 μL PBS / B27을 추가하고, 37 ℃ / 5 % CO 2에서 60 분 동안 배양한다. 조심스럽게 집게를 사용하여 세포 배양 삽입을 제거합니다. </li></ol></li><li> 에반스 블루 측정 <ol><li> 상기 하부 구획에서 PBS / B27를 제거하고 블랙 폴리스티렌 96- 웰 평면 바닥 플레이트의 웰에 두 100 μL를 각각 전송. 테칸 무한 M200 프로 플레이트 리더로 플레이트를 삽입하고, Z 최적의 위치를 ​​결정한다. </li><li> (예 : 여기 620 nm의 방출 : 680 nm의 여기 대역 : 9 nm의 발광 대역 : 20 ㎚, 175x를 향상 25 개 깜박 통합 시간 : 20 μS) 에반스 블루 이용한 각 설정의 기준 여기. </li><li> HBMEC 장벽 기능이 씨앗 후 다른 시간 지점에서 HBMEC를 통해 에반스 블루 침투를 묘사 한 표준 곡선에 수집 된 데이터를 비교할 확인하려면보내고 셀 (우측도 1b). </li></ol></li></ol> 4. 마이그레이션 분석 <ol><li> 말초 혈 단핵 세포 (PBMC) 제조. <ol><li> 15 ML의 원심 분리기 튜브에 10 mL의 RPMI를 추가하고 200 μL B27 보충제를 추가합니다. 5 분 동안 300 XG에 PBMC 세포를 원심 분리를 계산. 5 × 106 세포 / ml로 RPMI / B27 최종 농도 PBMC를 다시 일시. </li></ol></li><li> 마이그레이션 분석의 설정 <ol><li> 합류 HBMEC 단층 (도 1a)을 함유하는 세포 배양 물 삽입물의 상부 구획이어서 하부 구획에서 대기음 매체. 도너 단위 당 24 웰 플레이트의 한 웰 (시험관 제어)를 또한 세포 배양 인서트 100 μL PBMC 현탁액을 각각 추가하고. </li><li> 체외 제어 PBMC에 세포 배양 용 삽입 500 μL의 하부 구획에 600 μL RPMI / B27을 추가하고, 37 ℃ / 5 % CO 2에서 6 시간 동안 배양한다. </lI&gt; </ol></li><li> 마이그레이션 된 PBMC의 수확 <ol><li> 집게를 사용하여 세포 배양 삽입을 꺼내 조심스럽게 멤브레인을 건드리지 않고 400 μL PBS와 바닥을 씻어. 세포 배양 삽입을 폐기하십시오. </li><li> 20 μL 유동 카운트 fluorospheres 추가 세포 배양의 하부 구획 (약 1,000 비즈 / μL)의 시험 관내 제어뿐만 아니라 넣고 잘 섞는다. 튜브 유동 세포 계측법 PBMC 현탁액을 수득 한 용액의 전송. </li></ol></li></ol> 5. 유동 세포 계측법 <ol><li> 샘플 준비 <ol><li> 실온에서 5 분 동안 원심 분리기 (300) XG PBMC. </li><li> 100 μL에 형광 색소 - 컨쥬 게이트 항체를 첨가하여 항체 용액을 제조는 샘플 당 (PBS / 1 % BSA / 2 mM의 EDTA) 버퍼 유동 세포 계측법. 1 μL CD4-FITC 아래 제시된 결과, 1-μLCD3를 PerCP / Cy5.5, 1 μL CD56-PC7 1 μL CD8-A700, 1 μL CD16-A750은 샘플 당 사용되었다. </li><li> PB를 다시 중단항체 용액 100 μL의 MC 및 4 ° C에서 30 분 동안 배양한다. </li><li> 250 μL를 5 분 동안 300 XG에 버퍼 원심 유동 세포 계측법에 추가. </li></ol></li><li> 샘플 획득 <ol><li> 필요한 양의 PBMC를 일시 중지 다시 버퍼의 유동 세포 계측법 (사용 사이토 흐름에 따라 다름). </li><li> 유동 계수 fluorospheres를 검출 (525) 및 700 nm 파장 간의 활성 검출기 플로우 사이토 미터를 사용하여 염색 PBMC 획득 (여기 488 nm의 발광 525 - 700 ㎚). (다음 단계 Kaluza G 소프트웨어 동작 사이토 Gallios 흐름이 사용되는 경우의 예이다 :. (1) 컴퓨터를 시작할 작동 시스템이 완전히 로딩 될 때 (2) 버튼 &quot;을 사이토의&quot;를 누름으로써 플로우 사이토 시작할 . (3) &quot;오픈 프로토콜&quot;버튼을 누름으로써 각각 획득 프로토콜로드. (4)에 필요한 프로토콜을 선택하고 &quot;열기&quot;를 선택한다. (5)과 우측 클릭하여 각 시료에 대한 프로토콜 중복가상 회전 목마 &quot;중복&quot;필드에 왼쪽 클릭에 표시 프로토콜에 마우스 버튼을 클릭합니다. (6) 샘플에서의 각각의 샘플에 라벨. (7) 슬라이드 쇼의 표시 위치에 샘플을 전송 및 획득을 시작한다.) </li></ol></li><li> 샘플 분석 <ol><li> 각각의 소프트웨어를 사용하여 데이터 흐름 계측법 열기 결과. 체외 대조군 웰의 PBMC transmigrated 대한 관심뿐만 아니라 세포 개체군의 수를 결정하고, 각 분석 소프트웨어를 사용하여 카운트 fluorospheres 흐름. (게이팅 전략의 예 (도 께 결과 1 부 C가 주어진다 : 전방 산란 채널 (FSC) 플롯 대 측방 산란 채널 (SSC)에서 림프구를 선택 우선, NK 세포 서브 세트의 윤회를 분석 림프구이다. 다음 CD56 플롯 대 CD3 및 CD56 + CD3 표시 -. NK 세포가 선택 NK 세포의 부분 집합을 구별하는, NK 세포에 표시되는CD56 CD16 CD56 대 플롯 및 밝은 CD16 / 어둡게 -뿐만 아니라 CD56 + CD16 희미 NK 세포가 선택된다. 또한, 유동 계수 fluorospheres 그들의 수를 결정하는 시간에 대한 525 내지 700 nm의 사이에 발광 갖는 채널의 그래프에 표시된 후속 FSC 대 SSC 플롯으로부터 선택된다.) </li><li> 각 샘플의 총 세포 수를 계산하기 위해, 유량 계수를 사용 fluorospheres 세포의 검출 수를 정규화 : <img alt="방정식" src="/files/ftp_upload/55390/55390eq1.jpg" /></li><li> 이전 총 세포와 시험 관내 제어 총 셀 간의 비율로서 이전 셀의 비율을 결정한다. </li></ol></li></ol>

저자는 이 기사의 연구, 저자 및/또는 출판과 관련하여 다음과 같은 잠재적인 이해 상충을 선언했습니다. 및 U.B.는 재무 공개가 없습니다. TSH. Biogen으로부터 여행 및 회의 비용을 받았습니다. NS는 Biogen과 Novartis Pharma로부터 연사 및 자문위원회 사례금과 Biogen으로부터 여행 경비를 받았습니다. H.W.는 Bayer Healthcare, Biogen, Merck Serono, Novartis 및 Sanofi-Genzyme의 과학 자문 위원회/운영 위원회에서 활동한 대가로 보상을 받았습니다. 그는 또한 Bayer Vital GmbH, Bayer Schering AG, Biogen, CSL Behring, Fresenius Medical Care, Glaxo Smith Kline, GW Pharmaceuticals, Lundbeck, Merck Serono, Omniamed, Novartis 및 Sanofi-Genzyme으로부터 연사 사례금 및 여행 지원을 받았습니다. 그는 Biogen, Merck Serono, Novartis 및 Sanofi-Genzyme에서 컨설턴트로 보상을 받았습니다. H.W.는 Bayer Vital, Biogen, Genzyme, Merck Serono, Novartis, Sanofi-Aventis Germany 및 Sanofi US로부터 연구 지원을 받았습니다. C.C.G.는 Genzyme, Novartis Pharma GmbH 및 Bayer Health Care로부터 회의 참석에 대한 연사 사례금과 여행 경비를 받았습니다.

여기서 우리는 인간의 혈액 - 뇌 장벽에 걸쳐 림프구의 윤회를 조사하기 위해 기술을 제시한다. 중추 신경계에 림프구 이동의 체외 분석에서 림프구의 혈관 외 유출, 잠재적 인 질병 관련 변경 및 새로운 치료 방법의 기본 프로세스를 연구하는 것이 중요하다. 혈액 - 뇌 장벽 모델의 몇 가지 수정이 가능합니다. 예를 들어, 상기 상부 구획으로부터 세포 이주되지 않은 세포 집단의 조성을 조사하기 위해 분석 될 수있다. 또한, 24 시간 전에 분석에 IFN-γ 및 TNF-α와 HBMEC 단층 치료 염증성 CNS 장애, 21, 25의 효과를 연구하기 위해 염증이 혈액 - 뇌 장벽을 모방하는데 사용될 수있다. 마찬가지로, 다른 물질과 HBMEC 또는 림프구의 치료는 림프구의 혈관 외 유출에 미치는 영향을 조사 할 수 있습니다 (예를 들어 자신을부착 분자...

조직에 혈액에서 림프구 마이그레이션은 면역 감시 중요하다. 특정 분자 상호 작용의 시퀀스는 소장, 피부, 림프절, 중추 신경계 (CNS), 및 기타 조직으로 한 부위 특이 적 혈관 외 유출을 보장한다. 림프구 이동에 변화가 넓은 확산 질환이 다수의 병태 생리에 참여하고 있습니다. 면역 특권 CNS로 마이그레이션 단단히 통제 목적에 따라이 프로세스의 변화는 뇌척수염 3, 시신경 척수염, 뇌졸중, 및 다발성 경화증 (MS) 2, 4, 5, 6, 7과 같은 CNS 관련 질환에 관여한다. 따라서 더 나은 질병의 병태 생리를 이해하고 도구를 개발하는 림프구의 혈관 외 유출을 연구하는 것이 중요하다<html> 질병 부담이 8, 9, 10, 11, 12의 간척. 림프구는 별개의 경로를 통해 중추 신경계로 이동한다. 혈액 - 뇌 장벽 맥락총 내의 전역 혈액 - 뇌척수액 장벽을 통해 거미 막밑 공간에 모세관 세정맥을 통한 혈관 외 유출 1, 13, 14, 15가 설명되었다. 뇌 혈관 장벽을 통과 마이그레이션은 내피 세포 (14)와 림프구의 상호 작용에 의해 수행된다. 주변부에서 내피 세포는 대조적으로, CNS의 내피 세포함으로써 엄격 혈액 - 뇌 장벽을 횡단 할 수있는 세포와 단백질의 양을 제한하는 단단한 접합부 분자의 높은 발현 양아가씨 = &quot;외부 참조&quot;&gt; 16. 단단히 접합 염증 완화 결과 및 부착 분자의 발현을 유도한다; 따라서, CNS 1, 17, 18로 림프구 이동을 향상. 혈액 - 뇌 장벽을 통해 혈관 외로 유출 다단계 과정이다. 내피 세포 테더 림프구 다음 주로 셀렉틴 1 (15)에 의해 매개되는 과정에서 내피 굴러. 이어서, 림프구상에서 발현 내피 세포에 의해 분비 케모카인 및 각각의 케모카인 수용체 간의 상호 작용함으로써 내피 세포를 1 밀착성을 촉진 인테그린의 구조적 변화를 유도한다. 마지막으로, 혈관 주위 공간으로 transmigrating 전에 혈액의 흐름에 대한 내피 장벽을 따라 하나 크롤링을 림프구, 즉시 직접 기어 박스 실속확고한 부착 1, 19, 20의 사이트 igrate. 림프구의 혈관 외 유출의 이러한 모든 단계는 별개의 기술 (21)를 사용하여 체외에서 분석 할 수 있습니다. 시간 경과 비디오 현미경은 초기 테 더링 및 15 롤링을 연구하는 데 사용됩니다. 접착 분석은 장벽 (22) 내피 회사 체포에 대한 자세한 정보를 제공합니다. 여기에서 입증 된 바와 같이 윤회 분석은 면역 세포 윤회 21, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29의 분석을 허용한다. 체외 혈액 뇌 장벽 모델에서 인간을 사용하여, 우리는 더 높은 마이그레이션 백분율이 보여 최근 수CD56 밝은 CD16의 atory 용량 / 어두워 - NK 세포 CD16 + 대조 물이 막내 실 21이 NK 세포 서브 세트의 우세에 의해 반사 된 희미한들은 CD56에 비해. 따라서, 우리의 실험 장치는 생체 내 상황을 모방하기에 적합한 것 같다.

<table><tbody><tr><td>CaCl2 또는 MgCl2</td>Fibronectin 없이 <td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td></tr> 소 혈장 T-25 세포 배양 플라스크<tr><td></td><td>에서 추출한</td><td>Sigma</td><td>F1141-5MG</td></tr><tr><td></td><td>Greiner BioOne</td><td>690160</td><td></td></tr><tr><td>HBMEC</td><td>ScienCell</td><td>1000</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Pelobiotech</td><td>PB-H-6023</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Sigma</td><td>A6964-100ML</td><td></td></tr><tr><td>ECM-b</td><td>ScienCell</td><td>1001-b</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>ScienCell</td><td>1001-b</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>ScienCell</td><td>1001-b</td><td></td></tr><tr><td>내피 세포 성장 보충제</td><td>ScienCell</td><td>1001-b</td><td></td></tr><tr><td>Transwell</td><td>Corning</td><td>3472</td><td>clear, 6.5 mm 직경, 3.0 & 마이크로; m 기공 크기</td></tr><tr><td>96웰 플랫 바닥 플레이트</td><td>Corning</td><td>3596</td><td></td></tr><tr><td>Evans 블루</td><td>시그마</td><td>E2129-10G</td><td>원액: 1g/50mL PBS</td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td>50x 농축</td></tr><tr><td>Infinite M200Pro</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96웰 블랙 플랫 바닥 플레이트</td><td>Greiner BioOne</td><td>675086</td><td></td></tr><tr><td>48웰 플레이트</td><td>Corning</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>61870-010</td><td></td></tr><tr><td>유량 계수 형광구</td><td>Beckman Coulter</td><td>7547053</td><td></td></tr><tr><td>Na-EDTA</td><td>시그마</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Gallios 10색 유세포 분석기</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kaluza 1.5a</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TNF-&알파;</td><td>Peprotech</td><td>300-01A</td><td></td></tr><tr><td>IFN-&감마;</td><td>Peprotech</td><td>300-02</td><td></td></tr><tr><td>CD3-PerCP/Cy5.5</td><td>Biolegend</td><td>300430</td><td>클론 UCHT1</td></tr><tr><td>CD56-PC7</td><td>Beckman Coulter</td><td>A21692</td><td>클론 N901</td></tr><tr><td>CD16-A750</td><td>Beckman Coulter</td><td>A66330</td><td>클론 3G8</td></tr><tr><td>CD4-FITC</td><td>Biolegend</td><td>300506</td><td>클론 RPA-T4</td></tr><tr><td>CD8-A700</td><td>Beckman Coulter</td><td>A66332</td><td>클론 B9.11</td></tr></tbody></table>

를 사용하여 림프구 혈관 외로 유출 분석<em&gt; 체외</em&gt; 인간의 혈액 - 뇌 장벽의 모델

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

중추 신경계 (CNS)에 넘쳐 림프구는 면역 감시 중요하다. 림프구의 혈관 외 유출의 질병 관련 변경은 CNS의 병태 생리 학적 변화 될 수 있습니다. 따라서, CNS에 림프구 이동의 조사 염증성 CNS 질환을 이해하고 새로운 치료 방법을 개발하는 것이 중요하다. 여기에서 우리는 림프구의 혈관 외 유출을 연구하는 인간의 혈액 - 뇌 장벽의 체외 모델을 제시한다. 인간 뇌 미세 혈관 내피 세포 (HBMEC)는 confluently 혈액 - 뇌 장벽의 내피를 모방 삽입 트랜스 웰 다공성 폴리에틸렌 테레 프탈레이트 상에 성장된다. 배리어 기능 zonula occludens 면역, transendothelial 전기 저항 (티이)의 측정뿐만 아니라, 에반스 블루 투과 분석에 의해 확인된다. NK 세포를 -이 모델은 / 어두워 CD56 밝은 CD16으로 드문 림프구 아형의 diapedesis의 조사를 할 수 있습니다. Furtherm철광석, 다른 세포, 사이토 카인 및 케모카인, 질병과 관련된 변경, 및 림프구의 이동성에 대한 구별 능력 치료법의 효과를 연구 할 수있다. 마지막으로, 내피 장벽의 염증성 자극의 영향뿐만 아니라, 다른 치료법이 분석 될 수있다.

NK 세포 및 인간 혈액 - 뇌 장벽 모델 (도 1A)를 사용하여 T 세포의 서브 세트 윤회를 나타내는 대표적인 결과를 나타낸다. HBMEC 단층의 무결성은 단단히 접합 분자 ZO-1, transendothelial 전기 저항 (티이) 측정 및 에반스 블루 투과 (도 1b)의 염색에 의해 확인 하였다. 다음 3 - 사일 배양 HBMEC가 꽉 접합 분자 ZO-1 (왼쪽 그림 1B 등)를 표시했다. 또한 HBMEC (오른쪽,도 1b) 에반스 청색 transendothelial 전기 저항 (도 1b의 중앙)뿐만 아니라 감소 된 투과성을 나타내는 단층으로 성장했다. 및 CD56는 CD4 +와 CD8 + T 두 전직 등의 세포를 포함 CD16 + NK 세포 하위 집합 및...

여기에서는 체외에서 중추신경계로의 림프구 전이를 조사할 수 있는 인간 혈액-뇌 장벽 모델에 대해 설명합니다.

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

이 형질전환 분석의 전체적인 목표는 인 비트로(in vitro) 환경에서 중추신경계로의 림프구 혈관외 유출을 조사하는 것입니다. 이 방법은 중추신경계의 염증성 질환에 대한 이해를 증진하고 새로운 치료법을 개발하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 몇 가지 장점은 접근성이 용이하며, 단일 세포 수준에서 희귀 림프구 집단을 분석할 수 있다는 점입니다.이 방법은 혈뇌장벽(blood-brain barrier)을 가로지르는 림프구의 투과에 대한 통찰을 제공할 수 있으며, 혈액-뇌척수액 장벽(blood-cerebrospinal fluid barrier)을 통한 투과 연구에도 적용될 수 있습니다. 또한, 혈뇌장벽 모델의 무결성을 평가하기 위해 Evans blue 투과도 분석을 수행할 수 있습니다. 먼저, 37 °C 및 5% CO2 조건의 세포 배양 인큐베이터에서 최소 3시간 동안 배양하기 위해, 갓 조제한 fibronectin 용액 2 mL를 T-25 세포 배양 플라스크 바닥에 도포하는 것으로 시작하십시오.배양이 끝나면, 피브로넥틴 용액을 6 mL의 완전 ECM-b 배지에 7.2 × 10⁴개의 인간 뇌 미세혈관 내피세포(HBMEC)로 교체하고 플라스크를 인큐베이터에 다시 넣습니다. HBMEC의 합류도가 80%에 도달하면, 상청액을 15 mL 원심 분리 튜브로 옮기고 부착된 세포를 5 mL의 PBS로 3회 세척합니다. 3번째 세척 후, 미리 데워둔 Accutase 용액 2 mL를 세포에 첨가하고 37 °C에서 2분 동안 처리합니다.그 다음 플라스크를 여러 번 가볍게 두드린 후, 광학 현미경으로 세포의 탈착 여부를 확인합니다. 세포가 플라스크 바닥에서 떨어지기 시작하면, 수확한 상청액을 사용하여 대부분의 HBMEC가 재현탁될 때까지 플라스크를 반복적으로 헹굽니다. 그런 다음 세포 현탁액을 15-milliliter 원심분리용 튜브로 옮겨 원심분리하고, 세포 수를 세기 위해 1-milliliter의 신선한 ECM-b 배지에 펠렛을 재현탁합니다.형질전환 분석을 위해 세포 배양 인서트를 준비하려면, 먼저 각 인서트와 96-well 평평한 바닥 플레이트의 웰 하나에 fibronectin 용액 100 µL를 추가합니다. 37 °C에서 3시간 후에 fibronectin 용액을 100 µL의 HBMEC로 교체하고, 세포 배양 인서트의 하단 구획에 신선한 ECM-b 배지 600 µL를 추가합니다. 그 후 플레이트를 세포 배양 인큐베이터에 넣고 3~4일 동안 배양합니다.장벽 무결성이 달성되었는지 테스트하려면, 하나의 세포 배양 인서트의 상단 및 하단 챔버에서 배지를 흡입하고, 인서트에 갓 조제한 Evans blue 용액 100 µL를 추가합니다. 하단 챔버에 B27이 보충된 PBS 600 µL를 추가하고 플레이트를 인큐베이터로 되돌립니다. 1시간 후, 핀셋을 사용하여 인서트를 조심스럽게 제거하고, 하단 챔버에서 100 µL의 PBS B27을 검은색 폴리스티렌 96-웰 평저 플레이트의 개별 웰 두 개에 옮깁니다.그 다음 플레이트를 멀티모드 마이크로플레이트 리더기에 로드하고, 최적의 z-축 위치를 결정합니다. HBMEC 장벽 기능을 확인하기 위해, 적절한 설정으로 에반스 블루 염료 용액의 흡광도를 측정하고, 획득한 데이터를 세포 파종 후 서로 다른 시점에서 HBMEC를 통해 투과된 에반스 블루의 표준 곡선과 비교합니다. 세포 단일층 형성이 확인되면, 말초혈액 단핵구(PBMC) 샘플을 B27이 보충된 RPMI 배지에서 5 × 10⁶ cells/mL 농도로 재현탁합니다.다음으로, 단층으로 합류된 HBMEC가 포함된 적절한 수의 세포 배양 인서트의 상단 및 하단 구획에서 배지를 흡입하여 제거하고, 공여자당 100 µL의 PBMC를 세포 배양 인서트와 각 in vitro 대조군용 24-웰 플레이트의 한 웰에 추가합니다. 세포 배양 인서트의 하단 구획에는 600 µL의 RPMI 및 B27 혼합액을, in vitro 대조군 웰에는 500 µL를 추가한 후 플레이트를 세포 배양 인큐베이터에 넣고 6시간 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 핀셋을 사용하여 세포 배양 인서트를 꺼내고, 막을 건드리지 않으면서 하단을 400 µL의 PBS로 조심스럽게 세척합니다.그 후 실험군 및 in vitro 대조군 웰의 세포에 20 µL의 Flow-Count Fluorospheres를 넣어 충분히 혼합하고, 이렇게 만들어진 PBMC 현탁액 1 mL를 각각의 해당 유세포 분석 튜브로 옮깁니다. 원심분리를 통해 세포를 회수하고, 각 시료에 100 µL의 유세포 분석 버퍼에 희석한 표적 형광 표지 항체를 첨가합니다. 4 °C에서 30분간 반응시킨 후, 250 µL의 신선한 유세포 분석 버퍼로 세포를 세척하고, 분석을 위해 적절한 부피의 유세포 분석 버퍼로 펠렛을 재현탁합니다.모든 데이터 수집이 완료되면 적절한 유세포 분석 소프트웨어를 엽니다. NK 세포 서브셋의 투과를 분석하려면, 먼저 측방 산란광(side scatter) 대 전방 산란광(forward scatter) 채널 도표에서 림프구를 선택하고, CD3 대 CD56 점 도표(dot plot)에 세포를 표시합니다. 그런 다음 CD56 양성, CD3 음성인 NK 세포를 선택합니다.이동한 NK 세포 하위 집단을 구분하기 위해, CD56 대 CD16 플롯에 세포를 표시하고 CD56bright, CD16dim 또는 음성인 세포와 CD56dim, CD16-양성인 세포를 게이팅합니다. 그런 다음 전방 산란(forward scatter) 대 측방 산란(side scatter) 플롯에서 Flow-Count Fluorospheres를 선택합니다. 비드 수를 결정하려면, 선택한 데이터를 525에서 700 nanometers 사이의 방출 파장을 포함하는 채널 대 시간 플롯에 표시합니다.마지막으로, 이동한 NK 세포의 백분율을 이동한 총 세포 수와 시험관 내 대조군(in vitro control)의 총 세포 수 사이의 비율로 결정합니다. 3~4일간의 배양 후, HBMEC는 밀착 연접 분자인 Zonula occludens-1을 발현하며, 경내피 전기 저항을 나타내고 Evans blue 염료 투과성이 감소한 단일층으로 성장합니다. 전체 PBMC 투과성 분석 전, 인터페론 감마와 TNF 알파로 내피세포 단일층을 24시간 동안 자극하면 분석된 모든 림프구 집단의 이동이 증가하는 결과가 나타납니다.흥미롭게도, CD56bright, CD16dim 또는 음성 NK 세포는 자극을 주지 않은 HBMEC와 사이토카인으로 활성화된 HBMEC 모두에서 CD56dim, CD16-양성 NK 세포보다 더 높은 이동 능력을 나타냅니다. 염증성 세포 단층을 통한 투과 전이의 상대적 증가는 전반적으로 CD56dim 세포에서 더 높게 나타나지만, 이는 CD56bright, CD16dim-음성 NK 세포가 척수강 내 구획에 풍부하다는 생체 내 관찰 결과와 유사합니다. 이 기술을 숙달하면 10시간 이내에 완료할 수 있습니다.인터페론 감마(interferon gamma)와 TNF 알파(TNF alpha)를 이용한 인 비트로(in vitro) 투과 전이 설정의 전처리를 통해 염증 조건에서의 림프구 이동을 연구할 수 있습니다. 본 프로토콜은 전단력을 적용하거나 성상교세포(astrocytes)와 같은 혈액-뇌 장벽의 다른 세포들과 공동 배양함으로써 수정될 수 있으며, 이를 통해 중추신경계로의 림프구 투과 전이에 대한 정교한 모델을 제공할 수 있습니다. 이 영상을 시청하고 나면 인간 혈액-뇌 장벽의 인 비트로 모델을 사용하여 림프구 투과 전이를 조사하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

analysis-lymphocyte-extravasation-using-an-vitro-model-human-blood

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 비디오는 EAE 마우스 모델에서 혈액-뇌 장벽 파괴를 평가하는 절차를 보여줍니다. 다양한 크기의 형광 염료를 역궤도로 주입하여 뇌의 혈관을 순환합니다. 작은 염료는 틈을 통해 뇌 조직으로 누출되는 반면, 큰 염료는 장벽 손상 정도와 상관관계가 있는 파괴가 심한 경우에만 들어갑니다.

EAE 마우스 모델에서 형광 염료를 사용한 혈액-뇌 장벽 파괴 결정

이 비디오는 혈액뇌장벽(BBB) 내피 모델을 통한 림프구 이식에 대한 실험적 조사를 보여줍니다. 인간 뇌 미세혈관 내피 세포(HBMEC)의 단층을 in vitro에서 생성하고, 림프구를 포함하는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 단층에 추가합니다. 그런 다음 세포를 배양하여 림프구 형질전환이 가능하도록 하고, 이동된 세포는 유세포 분석을 사용하여 정량화합니다.

미세혈관 내피 세포 단층을 통한 림프구 전이 연구

혈액 - 뇌 장벽 (BBB)​​의 인체 모델의 확립 BBB 장애와 관련된 뇌 상태에 대한 연구를 혜택을 누릴 수 있습니다. 우리는 여기서, 다공질 막의 양측에 인간 성상 세포와 뇌 내피 세포의 공동 배양을 허용 접촉 BBB 모델의 제조를위한 개선 된 기술을 설명한다.

방법 혈액 - 뇌 장벽의 인간 세포 기반의 연락 모델의 준비를 위해 개선

여기에서는 임피던스 세포 분광법을 사용하는 혈액-뇌 장벽의 체외 쥐 모델을 설명하며, 활성화된 T 세포와의 상호 작용 시 내피 세포 무결성 및 투과성에 미치는 영향에 중점을 둡니다.

<em&gt; 체외</em&gt; 임피던스 분광학을 사용하여 혈액 - 뇌 장벽 모델 : T 세포 - 내피 세포 상호 작용에 초점

우리는 루시퍼 옐로우 (LY)가 hCMEC/D3 세포 단층의 명백한 paracellular 투과성을 결정하는 강력한 마커, 인간 혈액 뇌 장벽의 체외 모델임을 입증하기 위해 형광 분석방법을 제시합니다. 우리는 배양 된 hCMEC / D3 세포에서 동시 단일 층 형성의 역학을 결정하기 위해이 분석기를 사용했습니다.

루시퍼 옐로우 - 인간 혈액-뇌 장벽의 세포 모델에서 강력한 파라셀룰러 투과성 마커

여기에 우리가 현재에 cellulo BBB (혈액 뇌 장벽)의 설정을 설명 하는 프로토콜-Minibrain 폴리에스터 다공성 막 문화 인간의 BBB에 걸쳐 생체 또는 전염 성 요원의 전송 평가 시스템 삽입 및 그들의 이웃 뇌 세포에 생리 적 영향입니다.

병원 체 또는 의약품 및 두뇌와 그들의 상호 작용에 의해 장벽 횡단 연구를 인간의 혈액-뇌 인터페이스 모델

여기, 선물이 vivo에서 실험적인 자기 면역 뇌 중 혈관 단위의 장애를 조사 하는 프로토콜. 우리는 특별히 명과 limitans에서 혈액-뇌 장벽 침투성 및 백혈구 마이그레이션에 관련 된 gelatinase 활동을 확인 하는 방법 주소.

Vivo에서 실험적인 자기 면역 뇌 중 Neurovascular 단위의 내 피와 폐해 장벽의 장애 시각화

이 원고는 마우스에서 활성 실험자가 면역 뇌척수염(EAE)을 유도하는 프로토콜을 제시한다. 중추신경계(CNS)에서 침투된 림프구의 분리 및 특성화 방법도 림프구가 CNS 자가면역 질환의 발병에 어떻게 관여하는지 보여주기 위해 제시된다.

실험적인 자가면역 뇌척수염 중 중추신경계에서 림프구 침투의 흐름 세포 분석

여기에서는 만능 줄기 세포를 뇌 미세혈관 내피 세포(BMEC) 유사 세포로 분화할 수 있는 프로토콜인 확장된 내피 세포 배양 방법(EECM)에 대해 설명합니다. 이들 세포는 내피 세포 부착 분자 발현을 보여주므로 시험관 내에서 면역 세포 상호작용을 연구하기에 적합한 인간 혈액-뇌 장벽 모델입니다.

인간 유도 만능 줄기 세포를 성숙한 면역 표현형을 가진 뇌 미세혈관 내피 세포 유사 세포로 분화

이 보고서는 혈액-뇌 장벽 모델 구축을 위한 μSiM 플랫폼의 조립, 세포 배양 및 분석을 위한 프로토콜을 제공합니다.

혈액-뇌 장벽 모델링을 위한 MicroSiM(μSiM) 장벽 조직 플랫폼 사용

서로 다른 시점의 마우스에 두 개의 형광 염료를 투여하여 혈액뇌장벽(BBB) 파괴로 인한 염료 유출을 시각화하는 방법이 개발되었습니다. 동결 보호제로서 글리세롤을 사용함으로써 동일한 샘플에 대한 면역조직화학이 촉진되었습니다.

경미한 외상성 뇌 손상의 마우스 모델에서 혈액-뇌 장벽 파괴 평가

학습하세요 인간 혈액-뇌 장벽 모델을 이용한 림프구 혈관 외로 유출 분석 방법을 통해 중추신경계 염증 질환의 메커니즘을 규명하고 새로운 치료 전략 개발에 활용할 수 있습니다.

를 사용하여 림프구 혈관 외로 유출 분석

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