를 사용하여 림프구 혈관 외로 유출 분석 체외 인간의 혈액 - 뇌 장벽의 모델

이 transmigration assay의 전반적인 목표는 in vitro에서 중추 신경계로의 림프구 유출을 조사하는 것입니다. 이 방법은 중추 신경계의 염증성 질환에 대한 이해를 높이고 새로운 치료 접근법을 개발하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 몇 가지 장점은 쉽게 접근할 수 있고 단일 세포 수준에서 희귀 림프구 집단을 분석할 수 있다는 것입니다.

이 방법은 혈액-뇌관문을 통한 림프구 전이에 대한 통찰력을 제공할 수 있으며 혈액-뇌척수액 장벽을 통한 전이 연구에 적용할 수 있습니다. 또한 Evans 블루 투과 분석을 수행하여 혈액-뇌 장벽 모델의 무결성을 평가할 수 있습니다. T-25 세포 배양 플라스크의 바닥을 갓 준비한 피브로넥틴 용액 2ml로 덮고 섭씨 37도의 세포 배양 인큐베이터에서 최소 3시간 동안 배양하고 이산화탄소

인큐베이션이 끝나면 피브로넥틴 용액을 6ml의 완전한 ECM-b 배지에서 4번째 인간 뇌 미세혈관 내피 세포(HBMEC)의 7.2배로 교체하고 플라스크를 인큐베이터로 다시 넣습니다. HBMEC가 80% 포화도에 도달하면 상등액을 15ml 원추형 튜브로 옮기고 5ml의 PBS로 부착 세포를 세 번 세척합니다. 세 번째 세척 후 섭씨 37도에서 2분 동안 예열된 Accutase 용액 2ml를 세포에 추가합니다.

그런 다음 플라스크를 여러 번 단단히 두드려 광학 현미경으로 세포 분리를 확인합니다. 세포가 플라스크 바닥에서 들어 올려지기 시작하면 수확된 상등액을 사용하여 대부분의 HBMEC가 재현탁될 때까지 플라스크를 반복적으로 헹굽니다. 그런 다음 원심분리를 위해 세포 현탁액을 15ml 원추형 튜브로 옮기고 계수를 위해 1ml의 새로운 ECM-b 배지에 펠릿을 재현탁합니다.

전이(transmigration) 분석을 위해 세포 배양 삽입물을 준비하려면 먼저 각 삽입물에 100마이크로리터의 피브로넥틴 용액을 추가하고 96웰 평평한 바닥 플레이트의 한 웰에 추가합니다. 섭씨 37도에서 3시간 후 피브로넥틴 용액을 100마이크로리터의 HBMEC로 교체하고 600마이크로리터의 새 ECM-b 배지를 세포 배양 삽입물의 하단 구획에 추가합니다. 그런 다음 플레이트를 3-4일 동안 세포 배양 인큐베이터에 다시 넣습니다.

장벽 무결성에 도달했는지 여부를 테스트하려면 한 세포 배양 삽입체의 하부 및 상부 격실에서 배지를 흡인하고 새로 준비된 Evans 블루 용액 100마이크로리터를 인서트에 추가합니다. B27이 보충된 PBS 600마이크로리터를 하단 격실에 추가하고 플레이트를 인큐베이터에 다시 넣습니다. 1시간 후 집게를 사용하여 인서트를 조심스럽게 제거하고 하단 격실에서 100마이크로리터의 PBS B27을 검은색 폴리스티롤 96웰 플랫 바닥 플레이트의 두 개별 웰로 옮깁니다.

그런 다음 플레이트를 다중 모드 마이크로플레이트 리더에 로드하고 최적의 z 위치를 결정합니다. HBMEC 장벽 함수를 확인하려면 적절한 설정을 사용하여 Evans blue dye solution의 excitation을 측정하고, 획득한 데이터를 seeding 후 다른 시점에서 HBMEC를 가로지르는 Evans blue permeation을 나타내는 표준 곡선과 비교합니다. 세포 단층의 형성을 확인한 후, B27이 보충된 RPMI 배지에서 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 샘플을 10-1밀리리터당 6번째 세포 농도의 5배로 재현탁합니다.

다음으로, confluent HBMEC 단층을 포함하는 적절한 수의 세포 배양 삽입물의 하부 및 상부 구획에서 배지를 흡인하고, 세포 배양 삽입물 및 in vitro control당 24웰 플레이트의 1웰에 공여자당 100마이크로리터의 PBMC를 추가합니다. 600마이크로리터의 RPMI와 B27을 세포 배양 인서트의 하단 격실에 추가하고 500마이크로리터를 체외 대조 웰에 추가한 다음 플레이트를 6시간 동안 세포 배양 인큐베이터에 다시 넣습니다. 배양이 끝나면 집게를 사용하여 세포 배양 삽입물을 제거하고 멤브레인을 건드리지 않고 400마이크로리터의 PBS로 바닥을 조심스럽게 헹굽니다.

그런 다음 20마이크로리터의 Flow-Count Fluorospheres를 실험 및 체외 제어 웰의 세포와 철저히 혼합하고 생성된 PBMC 현탁액 1ml를 적절한 해당 유세포 분석 튜브로 옮깁니다. 원심분리로 세포를 수집하고 100마이크로리터의 유세포 분석 완충액에 관심 있는 형광 접합 항체를 각 샘플에 추가합니다. 섭씨 4도에서 30분 후, 250마이크로리터의 새로운 유세포 분석 버퍼로 세포를 세척하고 분석을 위해 적절한 부피의 유세포 분석 버퍼에 펠릿을 재현탁합니다.

모든 데이터가 수집되면 적절한 유세포 분석 소프트웨어를 엽니다. NK cell subset transmigration을 분석하려면 먼저 측면 대 전방 산란 채널 플롯에서 림프구를 선택하고 CD3 대 CD56 점도표로 세포를 표시합니다. 그런 다음 CD56 양성, CD3 음성 NK 세포를 선택합니다.

형질전환된 NK cell subset을 구별하기 위해 CD56 대 CD16 플롯에 세포를 표시하고 CD56bright, CD16dim 또는 negative 및 CD56dim, CD16 positive cell에 대한 게이트를 표시합니다. 그런 다음 전방 대 측면 산점도에서 Flow-Count Fluorospheres를 선택합니다. 비드 수를 확인하려면 선택한 데이터를 시간과 비교하여 525 및 700 나노미터 사이의 방출 파장을 포함하는 채널 플롯에 표시합니다.

마지막으로, 마이그레이션된 NK 세포의 백분율을 in vitro control에서 마이그레이션된 총 세포 수와 총 세포 수 간의 비율로 결정합니다. 3-4일간의 배양 후 HBMEC는 밀접연접 분자 Zonula occludens-1을 발현하고 경내피 전기 저항을 나타내고 Evans blue 염료 투과를 감소시키는 단층으로 성장합니다. 전체 PBMC 형질전환 분석 전 24시간 동안 인터페론 감마 및 TNF 알파로 내피 세포 단층을 자극하면 분석된 모든 림프구 집단의 이동이 증가합니다.

흥미롭게도, CD56bright, CD16dim 또는 negative NK cell은 unstimulated HBMEC와 cytokine-activated HBMEC 모두에서 CD56dim, CD16-positive NK보다 더 높은 이동 능력을 나타냅니다. 염증이 있는 세포 단층을 통한 전이의 상대적 증가는 CD56dim 세포에서 전체적으로 더 높지만, CD56bright, CD16dim-negative NK 세포가 척추내 구획에서 풍부하다는 생체 내 관찰을 모방합니다. 이 기술을 숙달하면 10시간 이내에 완료할 수 있습니다.

인터페론 감마 및 TNF 알파를 사용한 체외 이식 설정의 전처리는 염증성 조건에서 림프구 이동을 연구할 수 있습니다. 우리의 프로토콜은 전단력을 가하거나 성상세포와 같은 혈액-뇌 장벽의 다른 세포와 공동 배양하여 림프구가 중추 신경계로 이식되기 위한 정제된 모델을 제공함으로써 수정될 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 인간 혈액-뇌 장벽의 체외 모델을 사용하여 림프구 이식을 조사하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.