Encyclopedia of Experiments: Biology
JoVE 비디오를 활용하시려면 도서관을 통한 기관 구독이 필요합니다. 전체 비디오를 보시려면 로그인하거나 무료 트라이얼을 시작하세요.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- Begin met een Petrischaal met embryo's in E3-medium. Voeg tricaïne toe om de embryo's te verdoven en fenylthiourie, PTU-oplossing, om pigmentvorming te remmen. Met behulp van een ontleedmicroscoop dechorioneren de embryo's.
Gebruik een glazen pipet om een van de gedechorioneerde embryo's over te brengen naar een kleine Petrischaal met een ondiepe glazen bodem goed in het midden en verwijder het overtollige medium. Plaats vervolgens een agarose-oplossing in een optimale concentratie om embryovervorming en beweeglijkheid in een microfugebuis te minimaliseren en verwarm deze. Breng de temperatuur naar 30 graden Celsius om beschadiging van het embryo door hitte te voorkomen.
Giet de eerste laag agarose over het embryo en vul de ondiepe put volledig. Plaats nog een afdekglas over de put en voeg daar 1% agarose aan toe. De tweede laag houdt het afdekglas op zijn plaats.
Zodra de agarose stolt, vult u de Petrischaal met het E3-medium dat tricaine bevat. Dit is de derde laag en houdt de agarose en het embryo gehydrateerd. In het volgende protocol zullen we gelaagde agarmontage van zebravisembryo's uitvoeren voor langere timelapse-beeldvorming.
- Verwarm de agarose-oplossing vlak voor de montage tot 65 graden Celsius en laat deze vervolgens afkoelen tot ongeveer 30 graden Celsius, zodat het embryo niet wordt beschadigd door de hitte en voeg tricaine toe aan de agarose-oplossing. Gebruik 35 millimeter glazen bodemschalen met een nummer nul bedekte glazen bodem. Plaats voorzichtig een gedechorioneerd embryo met een van de zijkanten naar de bodem van de schaal met een glazen pipet of een micropipet. Verwijder vervolgens voorzichtig de resterende E3 met een micropipet.
Toevoegen De Eerste Agarose Oplossing Aan De Kleine Goed Gemaakt Door De Cover Glas Aangesloten Aan De Onder Van De Schotel Aan Cover De Embryo Maken Zeker Dat De Agarose Omvat De Kleine Goed Maar Doet Niet Overloop Het. Cover De Kleine Goed Met De Cover Glas Aan Maken A Smalle met agarose gevuld Ruimte Met De Embryo Tussen De Twee Cover Glazen. Plaats A Laag Van 1% Agarose Oplossing Op Boven Van De Cover Glas Alle over De Onder Van De Schotel Die Zal Houden De Cover Glas Inch Plaats Als Het Stolt. Dan Vullen De Resterende Gedeelte Van De Schotel Met E3 Met 0.02% tricaine Aan Houden De Systeem Gehydrateerd. Aan Identificeren De Optimale Agarose Concentratie Voor Laag Een Mount De Embryo 's Inch Toenemende Concentraties Van Agarose En Uitvoeren timelapse Imaging Aan Identificeren De Concentratie Dat Minimaliseert Embryo Vervorming En Motility Dan Test A Fijnere Bereik Van Concentraties Gebaseerd Op De Resultaten.
- De meest kritische stap van dit protocol is het identificeren van de optimale concentratie van agarose voor laag één. Test verschillende nanoconcentraties van agarose zoals 0,030%, 0,032%, et cetera, om de optimale concentratie te vinden.
