밀도 구배 원심분리법: 말초 혈액에서 CLL 세포를 분리하는 방법

- 만성 림프구성 백혈병(CLL 환자)에서 B 세포 림프구는 골수와 혈액에서 크게 증가합니다. 혈액 샘플에서 이러한 CLL 세포를 분리하려면 먼저 음성 선택을 사용하여 B 세포를 분리하는 인간 B 세포 농축 칵테일로 샘플을 처리합니다. 칵테일의 항체는 비 B 세포와 적혈구에 의해 발현되는 항원을 특이적으로 인식하고 교차 결합하여 조밀한 복합체를 형성합니다.

다음으로, 림프구 분리에 최적화된 밀도를 갖는 밀도 구배 배지 위에 샘플을 층을 이룹니다. 후속 원심분리를 통해 서로 다른 혈액 성분은 구배 매질에 대한 밀도의 변화에 따라 분리됩니다. 밀도가 더 높은 RBC-비-B-세포 복합체는 배지를 통해 침전되어 펠릿을 형성합니다. 가장 밀도가 낮은 플라즈마 분율이 최상층을 형성합니다. 밀도가 낮은 CLL 세포는 혈장 밀도 매체 계면에서 흰색 층을 형성합니다.

흰색 층을 새 튜브에 조심스럽게 옮깁니다. 정제된 CLL 세포를 포함하는 펠릿을 얻기 위해 다시 원심분리기를 사용합니다. 다음 프로토콜에서는 환자의 혈액 샘플에서 만성 림프구성 백혈병 세포를 분리하는 방법을 보여줍니다.

- 이전에 동의한 만성 림프구성 백혈병 환자의 말초 혈액 샘플을 EDTA 혈액 채취 튜브에서 백혈구 수와 함께 얻습니다.

- 인간의 혈액 샘플에는 혈액 매개 바이러스가 포함되어 있을 수 있으므로 위험한 것으로 간주해야 합니다. 이러한 샘플이 Class II Biosafety Cabinet에서 취급되고 사용자가 항상 실험실 가운과 장갑을 착용하고 있는지 확인하십시오. 혈액에 오염된 물질은 폐기하고 소독하십시오.

- 백혈구 수가 밀리리터당 4천만 개 이상의 세포인 경우 RT CLL 세척 버퍼를 사용하여 샘플을 1:1의 비율로 희석합니다. 그런 다음 RT 밀도 구배 배지를 시료를 위한 적절한 크기의 원추형 원심분리 튜브에 분취합니다. 샘플을 배지 위에 조심스럽게 층을 이루고 RT에서 30분 동안 400배 G로 원심분리합니다.

플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 밀도 구배 매체와 CLL 세척 완충액의 계면에서 수집된 단핵 세포의 흰색 층을 부드럽게 수확합니다. 이 분리된 단층을 새로운 50ml 원추형 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 세포를 세척하려면 이 단층에 40ml의 CLL 세척 버퍼를 추가하고 실온에서 10분 동안 300배 G로 원심분리합니다.

상등액을 버리고 튜브 바닥을 튕겨 펠릿을 다시 매달고 이 세척을 반복합니다. 상층액을 버리고 튜브 바닥을 다시 튕긴 다음 펠릿의 크기에 따라 설정된 부피의 CLL 세척 버퍼에 세포 펠릿을 다시 현탁합니다. 세포 계수 후 유세포 분석 후 세포 순도를 확인한 후 필요한 세포 밀도로 조직을 배양판에 넣어 자극 또는 약물 치료를 준비합니다.