Name: 조밀도 기온 변화도 원심 분리를 사용 하 여 차동 품질의 정자 컬렉션 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 3 min 28 s
Description: 배우세요 조밀도 기온 변화도 원심 분리를 사용하여 정자 품질을 차등 분리하는 방법을. Percoll 그래디언트를 준비하고 원심 분리 후 세 가지 품질 층을 수집하여 생식 생물학 연구에 활용할 수 있습니다.

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여기에 설명 된 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 조지아 대학에 의해 승인 되었습니다.
1. 전통적인 원심 분리를 사용 하 여 세척
<ol><li>인산 염 버퍼 솔루션 (PBS)를 준비 합니다. 8.0 g의 NaCl, KCl, 1.44 g Na2HPO4 의 KH2포4 800 mL의 증류수 (dH2O)의 0.24 g의 0.2 g을 추가 합니다. 0.1 N HCl을 사용 하 여 7.4에 pH를 조정 하 고 1 l dH2o.를 사용 하 여 솔루션을가지고</li>
	<li>운동 성 버퍼를 준비 합니다. 6.5 g의 NaCl, 포도 당, 0.444 g CaCl2 와 n-트리 스-[hydroxymethyl] 11.5 g의 4.5 g 추가 메 틸-2-아미노-ethanesulfonic 산 (TES) dH2오의 800 mL 1 M NaOH를 사용 하 여 7.4에 pH를 조정 하 고 1 l dH2o.를 사용 하 여 솔루션을가지고</li>
	<li>폴 리 프로필 렌 microcentrifuge 관으로 정액의 0.5 mL를 플라스틱. PBS의 1.0 mL를 추가 하 고 부드럽게 혼합.</li>
	<li>실 온 (RT)에서 10 분 동안 1500 x g에서 centrifuge 고는 상쾌한 삭제. PBS 가진 정자 펠 릿 resuspend 최대 1.5 mL.</li>
	<li>실시간 Resuspend 정자 운동 성과 펠 렛에 10 분 동안 1500 x g에서 원심 분리기 0.5 mL를 버퍼링 합니다.</li>
</ol>2. 수행 PDGC 기술
참고: 실 온에서 PDGC의 전체 프로세스를 수행 합니다.
<ol><li>두 개의 별도 튜브에 1.08 g/mL와 1.07 g/mL Percoll 솔루션의 3.0 mL를 확인 합니다.<ol>
<li>깨끗 한 테스트 튜브에서 1.13 g/mL의 1.712 mL 추가 1.5 M NaCl 솔루션의 0.3 mL에 원래 Percoll. DH2O 0.988 mL를 추가 하 고 혼합 밀도 솔루션 1.08 g/mL의 3.0 mL 수 있도록 부드러운 반전 함으로써.</li>
		<li>깨끗 한 테스트 튜브에서 1.13 g/mL의 1.482 mL 추가 1.5 M NaCl 솔루션의 0.3 mL에 원래 Percoll. DH2O 1.218 mL를 추가 하 고 혼합 밀도 솔루션 3.0 mL 1.07 g/mL의 수 있도록 부드러운 반전 함으로써.</li>
	</ol>
</li>
	<li>깨끗 한 테스트 튜브, PBS의 2.0 mL와 정액 샘플 1: 2의 1.0 mL를 희석. 부드럽게 pipetting으로 혼합.</li>
	<li>피펫으로 멸 균 15 mL 원뿔 튜브에 1.07 g/mL 밀도 솔루션의 3.0 mL. 조심 스럽게 피펫으로 1.07 g/mL 밀도 솔루션 아래 1.08 g/mL 밀도 솔루션의 3.0 mL. 두 개의 레이어를 혼합 하지 마십시오 확인 하십시오. (9)에 파스퇴르 피 펫 긴 형태의이 단계를 쉽게 만들 수 있습니다.</li>
	<li>피펫으로 희석된 정액 샘플의 3.0 mL는 PDG을 솟 다. 정액 샘플은 PDG 혼합 하지 되도록 부드럽게 45 ° 각도로 PDG를 포함 하는 원뿔 튜브 기울기. 피펫으로 튜브의 벽을 따라 샘플 튜브는 PDG를 통해 흐름을 허용.</li>
	<li>일치 하는 중첩 샘플 PDG의 질량을 빈 튜브를 준비 합니다. 20 분 조심 균형 그리고 원심 분리기는 벤치에서 튜브를 전송 하는 동안 불연속 그라디언트를 유지 하기 위해 두 튜브 1500 x g에서 원심. 참고: 원심 분리의 끝에는 브레이크를 사용 하지 마십시오.
</li>
	<li>결과 관찰 합니다. 그림 1에서 보듯이 3 가지 정액 레이어는 튜브에 형성을 확인 합니다.</li>
	<li>고립 된 정액 레이어는 피 펫과 발음 정액의 상위 레이어를 먼저 수집, 중간 둘째, 레이어 그리고 마지막으로 튜브의 하단에 하드 펠 릿. 깨끗 하 고 멸 균 폴 리 프로필 렌을 각각 전송microcentrifuge 튜브.
</li>
	<li>1.5 ml PBS 가진 각 샘플을 희석. 10 분 동안 1500 x g에서 원심.</li>
	<li>상쾌한을 붓는 다. 부드러운 pipetting으로 정자 운동 성 버퍼와 펠 릿을 다시 구성. 참고: 대체 밀도 조사 요구에 맞게 사용할 수 있습니다. V0 가 재고 조밀도 솔루션의 볼륨은 다음 수식을 사용 하는 재료의 사용, v 솔루션, p의 최종 볼륨 원하는 최종 밀도 솔루션의 밀도 이며 p0 은 재고 조밀도의 밀도 확인 해결 방법: <img alt="속도 보정 방정식, \(v_0 = v \times \frac{p - 1.0058}{p_0 - 1}\), 과학 공식." src="/files/ftp_upload/58833/58833eq1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 1"> 생리 식 염 수의 NaCl 농도 맞게 1.5 M NaCl의 0.3 mL 밀도 솔루션의 준비에 항상 사용 합니다.</li>
</ol>3. 정자의 품질을 결정
<ol><li>정자 농도 앞22에서 설명한 계산 합니다.</li>
	<li>오신 nigrosin 중요 한 앞에서 설명한12 다음 수정으로 얼룩을 수행:<ol>
<li>1 x 108 셀/mL의 농도에서 정자 솔루션의 100 µ L를 준비 합니다.</li>
		<li>피펫으로 50 µ L 오신 nigrosin 얼룩의 동일한 볼륨을 포함 하는 폴 리 프로필 렌 microcentrifuge 관에서 정자 솔루션의. 실 온에서 5 분을 위한 혼합물을 품 어.</li>
		<li>20 µ L 유리 슬라이드의 한쪽 끝에 묻은 정액 샘플의 드롭 고 혈액 사용에 유사한 방식으로 균일 하 게 얼룩 얼룩. 흔들린된 슬라이드 3-5 분 동안 실 온에서 건조</li>
		<li>현미경 얼룩을 관찰 합니다. 라이브 정자 (얼룩) 및 (핑크 스테인드) 죽은 정자의 수를 계산 하 고 라이브 정자의 비율을 계산.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Accudenz 분석 결과, 이전 치킨 정자, 정자 이동성8 다음 수정를 객관적으로 평가 대 한 유효성 검사를 수행.<ol>
<li>그림 2에서 볼 수 있듯이 6%의 1.0 mL를 피펫으로 폴리스 티 렌 큐 벳에 솔루션 분석 결과. 41 ° c.에 품 어 참고: 41 ° C는 암 탉의 내부 온도 일치 하는 데 사용 됩니다. 부 화 온도 조사 되 고 종족의 여성 생식 관의 일치 해야 합니다.</li>
		<li>5 x 108 셀/mL의 농도에서 정액 샘플의 100 µ L로 preheated 분석 결과 솔루션을 오버레이.</li>
		<li>장소 베트를 포함 하는 분 광 광도 계에 정자 샘플을 중첩. 550에서 흡 광도 값 기록 nm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>앞에서 설명한11 다음 수정으로 IPVL 침투 시험을 수행.<ol>
<li>그대로 IPVL의 비 새싹 디스크 영역의 조각 (0.5 cm x 0.5 cm)를 잘라.</li>
		<li>4 x 106 셀/mL을 정자 농도 조정</li>
		<li>그림 3에서 볼 수 있듯이 37 ° C에서 15 분 동안 유리 제 작은 유리병에서 IPVL와 운동 성 버퍼에 정자를 품 어.</li>
		<li>3%에서 IPVL 부분을 담가 NaCl IPVL과 정자 사이 상호 작용을 중지.</li>
		<li>IPVL 조각 현미경 슬라이드와 20에 대 한 10% 포 르 말린으로 고정을 다음 10 분 동안 Schiff의 시 약으로 얼룩에 탑재 s.</li>
		<li>성공적인 정자에 대 한 현미경 IPVL 침투 구멍을 관찰 하 고 40 배 확대에 0.25 m m2 당 모든 보이는 구멍의 수를 계산.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Spargo, S. C., Hope, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+and+nomenclature+of+the+zona+pellucida+gene+family%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Evolution and nomenclature of the zona pellucida gene family.</a> Biology Reproduction. 68, 358-362 (2003).</li>
<li>Okamura, F., Nishiyama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+passage+of+spermatozoa+through+the+vitelline+membrane+in+the+domestic+fowl%2C+Gallus+gallus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">The passage of spermatozoa through the vitelline membrane in the domestic fowl, Gallus gallus.</a> Cell and Tissue Research. 188 (3), 497-508 (1978).</li>
<li>Henkel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm+function+and+assisted+reproduction+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Sperm function and assisted reproduction technology.</a> Reproductive Medicine and Biology. 4, 7-30 (2005).</li>
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<li>Ahammad, M. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturational+changes+in+motility%2C+acrosomal+proteolytic+activity%2C+and+penetrability+of+the+inner+perivitelline+layer+of+fowl+sperm%2C+during+their+passage+through+the+male+genital+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Maturational changes in motility, acrosomal proteolytic activity, and penetrability of the inner perivitelline layer of fowl sperm, during their passage through the male genital tract.</a> Theriogenology. 76 (6), 1100-1109 (2011).</li>
<li>Chalah, T., Brillard, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+assessment+of+fowl+sperm+viability+by+eosin-nigrosin+and+dual+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Comparison of assessment of fowl sperm viability by eosin-nigrosin and dual fluorescence.</a> Theriogenology. 50 (3), 487-493 (1998).</li>
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<li>Qingling, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+of+semen+by+density+gradient+centrifugation+selects+spermatozoa+with+longer+telomeres+for+assisted+reproduction+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+BioMedicine+Online%22%5BJournal%5D)">Processing of semen by density gradient centrifugation selects spermatozoa with longer telomeres for assisted reproduction techniques.</a> Reproductive BioMedicine Online. 31, 44-50 (2015).</li>
<li>Moohan, J. M., Lindsay, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spermatozoa+selected+by+a+discontinuous+Percoll+density+gradient+exhibit+better+motion+characteristics%2C+more+hyperactivation%2C+and+longer+survival+than+direct+swim-up%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Spermatozoa selected by a discontinuous Percoll density gradient exhibit better motion characteristics, more hyperactivation, and longer survival than direct swim-up.</a> Fertility and Sterility. 64 (1), 160-165 (1995).</li>
<li>Paulson, J. D., Polakoski, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+glass+wool+column+procedure+for+removing+extraneous+material+from+human+ejaculate%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">A glass wool column procedure for removing extraneous material from human ejaculate.</a> Fertility and Sterility. 28, 178-181 (1977).</li>
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<li>Lucena, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+motile+sperm+using+the+migration-sedimentation+technique+in+an+in+vitro+fertilization-embryo+transfer+programme%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Recovery of motile sperm using the migration-sedimentation technique in an in vitro fertilization-embryo transfer programme.</a> Human Reproduction. 4 (2), 163-165 (1989).</li>
<li>Henkel, R. Sperm Processing for IVF. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHenkel%2C+R+%22Clinical+Embryology%3A+A+Practical+Guide%22">Clinical Embryology: A Practical Guide</a>. , Springer Science and Business Media. New York, USA. (2013).</li>
<li>Sherman, J., Paulson, D., Liu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+glass+wool+filtration+on+ultrastructure+of+human+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Effect of glass wool filtration on ultrastructure of human spermatozoa.</a> Fertility and Sterility. 36, 643-647 (1981).</li>
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</ol>

저자는 공개 없다.

다 산 동물 생산의 수익성 결정 뿐만 아니라 또한의 존재에 대 한 자연 선택의 수단으로 서 역할. 정자 세포의 궁극적인 기능은 ovum를 기름 지 게 하는 것 이다. 여성의 수 란 관 알23,24의 수정 있도록 그 적자 정자만을 선택 합니다. 생체 외에서 연구도 질적 정자 특성과 수정 성공4,11,,2324사이 가까운 상호 관계를 계시 했다. 감소 된 비 옥 정자4,,1125의 품질이와 연결 됩니다. 이와 같이, 그것...

척추 동물, 남성 gametes 받아야 강렬한 선택적 압력; 따라서 남자의 생식 적합성은 달성 성공적인 수정에 대 한. 어떤 주어진 척 추가 있는 종의 남성 수정 요구를 충족 하기 위해 정자 세포와 충분 한 품질의 대량에서 생산을 수 있어야 합니다. 정자 세포, 정자 머리와 편, 본문에 가장 편광된 세포 이다. 그들은 또한 정자의 품질에 매우 이질적인 (살고 죽은, 형태학 상으로 정상적인 비정상적인, 그리고 움직이기 힘 드는, 낮은 모바일 및 모바일)는 수 컷의 생식 효율성에 다양 한 변화를 통해 드러났습니다. 더는, 높은-품질, 성공적으로 ovum를 기름 지 게 하는 데 필요한 matings의 적은 수의 비율 그러나, 비 옥을 달성, 형태학 상으로 정상적인 정자 세포에 의존 그들의 flagella 수정 뿐만 아니라 zona pellucida1 관통로 사이트에 도달 하 여 생성 하는 추진력이 세력 (ZP; 포유류의 경우) 또는 내부 perivitelline 2 레이어 (IPVL; 조류와 파충류) 자연 교배 또는 인공 수정 (AI)에 따라 알의. 정자를 결정 질 보조 생식 기술3 (예술)에 사용 하기 위해 필요 하며 다양 한 번 식 남성 인공 지능에 사용 될 프로그램4. 다른 한편으로, 예술의 성공 정자 품질의 정확한 평가에 전적으로 의존합니다. 실험실 테스트의 여러 정자의 기능적 특성을 결정 하기 위해 개발 되었습니다. 가장 중요 한 매개 변수는 정자 형태, 생존, 이동성, capacitation (조류 정자 capacitation5필요 하지 않습니다), acrosome 반응 (AR; exocytosis 및 정자 머리의 acrosome에서 분해 효소의 방출), 정자 ZP 또는 IPVL, 및 수정6,7,,89,10,11침투 혼자 산의 조치는 정자 인구11의 기름 능력의 정확한 평가 제공 하지 않습니다. 계란의 풍부로 이어지는 여러 이벤트의 개별 spermatocytes7의 성능에 대 한 적절 한 표현을 하실 수 있습니다.
정자 기능을 측정 하기 위한 개발 방법론은 주로 종의. 예를 들어 조류 정자 생존, 이동성 및 IPVL의 침투에 정자 품질8,,1112를 평가 하는 데 사용 하는 가장 일반적인 매개 변수. 라이브 정자는 정액에 수 정액에 죽은 정자의 많은 수의 존재는 정자의 품질에 영향을 정자의 생존을 위해 중요 한 역할을 한다. 이 정액에 반응 산소 종의 생산을 강화 하 고 라이브 정자13에 산화 손상을 초래. 정자 이동성, 체온, 저항에 대 한 조류의 flagellar 움직임에 대 한 용량 수정8에서 직접적인 역할을 알려져 있습니다. 그것은 그 임신과 긍정적으로 상관 성과, 그러므로, 다 산8의 기본 결정 잘 설립. 그러나, 모바일 정자는 AR을 IPVL11을 침투 하는 기능에도 필요 합니다. IPVL 침투 분석 실험 수정11과정 참여 하는 모든 정자에 대 한 고려.
아트의 응용 프로그램에서 사정 일반적으로 높은-품질 정자의 농도 극대화 하 고 낮은 품질 정자의 농도 최소화 하기 위해 처리 됩니다. 수령 후 정액의, 높은-품질 정자의 비율 일반적으로 업계 및 연구 관행에 사용 되는 정자 분리 절차를 통해 농축 수 있습니다. 이 절차의 많은 개발 되었습니다, 각각 장점 및 한계, 하지만 모두 높은 기름 능력을 가진 정자만을 수집 하는 정자의 이질적인 본질을 활용. 이러한 절차 등 정자 마이그레이션 방법, 준수 열과 밀도 그라데이션 원심 (DGC)14,15,,1617,18,19 , 20. 사용 가능한 기술 중 DGC 아주 간단 하, 반복, 비용 효율적인 고 수정14 의 기회 확대의 목표와 함께 예술에 사용 하기 위해 높은 품질의 최대 금액을 분리에 효율적인 발견 되었습니다 , 15. 더하여, DGC는 정자 세포 막에 해 롭 다. 대조적으로, 정자 마이그레이션 방법 수집만 점차적으로 모바일 정자18,19, 하지만 수집 된 정자의 수량은 매우 낮은 비효율적인 정자18, 의 큰 볼륨을 수집에 그것을 만드는 20. 준수 열 여과 정액17;에서 높은 모바일 정자 필터링에 매우 효율적입니다 그러나, 그것은 정자 세포 막20,21에 해가 될 경향이 있다.
DGC 기술에 밀도 그라디언트를 생성 하기 위한 가장 일반적으로 사용 되는 기판은 Percoll, polyvinylpryrolidone에 코팅 하는 콜 로이드 실리 카 입자를 이루어져 있는. Percoll 조밀도 기온 변화도 원심 분리 (PDGC) 연속 또는 불연속 수 하지만 불연속 그라데이션은 높은 모바일 정자13,,1620의 고수익 격리에 대 한 가장 일반적으로 사용 된다. 불연속 그라데이션에서 낮은 밀도 미디어 그라디언트는 원뿔 튜브의 하단에 상단에서 밀도 증가 만드는 높은 밀도 미디어 위에 수레. 이 서로 다른 밀도의 두 매체 간의 인터페이스에서 경계를 만듭니다. PDGC의 효율성은 두 가지 요소에서 파생 된: 개별 정자 세포의 2) 경향이 높은 구조적 무결성과 정자 세포의 증가 밀도가지고 1) 추진력이 능력. 더 높은 기동성을 가진 정자 더 낮은 밀도 미디어에서 교차 하 고 더 높은 밀도 미디어에 침투 수 있습니다. 낮은 이동성 정자 서로 다른 밀도의 미디어 간의 인터페이스에 의해 만들어진 경계에서 덫을 놓아 될 가능성이 더 높습니다. 높은 구조적 무결성 및 이동성 정자 세포 죽은, 비정상적인 또는 낮은 모바일 정자 세포 보다 더 높은 밀도가지고 경향이 있다. PDGC에서 원심력을 적용 하면이 그들의 각각 장소에서 서로 다른 밀도와 정자의 이동 용이.
일반적인 연습, PDGC 수행 된 후 원뿔 튜브의 하단에 잠재적인 높은 비 옥을 가진 정자의 부드러운 펠 릿을 수집 하 고 나머지 삭제 됩니다. 그러나,이 기법은 충분히 장점을 품질 차이에 따라 여러 그룹으로 정자 세포를 분리 하는 기능입니다. 연구 목적에 대 한 PDGC 기법을 활용 하 여 품질의 정도 의해 정자의 분리 생리, metabolomic 및 proteomic 다름에 관련 된 정자 품질 연구에 대 한 수 있습니다. 여기, 우리는 성과 정자-IPVL에 대 한 생존 능력에 대 한 중요 한 얼룩 이전 설립된 오신-nigrosin, Accudenz 분석 결과 사용 하 여이 기술을 사용 하 수 있습니다 품질, 이러한 차이 보여 뿐 아니라 품질, 정자를 분리 하는 방법을 자세히을 목표로합니다 관통에 대 한의 상호 작용 시험

<table><tbody><tr><td>Accudenz</td><td>Accurate Chemical and Scientific Corporation, Westbury, NY, USA</td><td>AN7050</td><td></td></tr><tr><td>Percoll&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA</td><td>P7828</td><td></td></tr><tr><td>쉬프 s 시약</td><td>Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA</td><td>3952016</td><td></td></tr><tr><td>TES</td><td>Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA</td><td>T1375</td><td></td></tr><tr><td>Eosin Y</td><td>Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA</td><td>E4009</td><td></td></tr><tr><td>Nigrosin</td><td>Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA</td><td>198285</td><td></td></tr><tr><td>ST 40R 원심분리기&nbsp;</td><td>Thermo Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>75004524</td><td></td></tr><tr><td>DU 530 Life Sciences UV/Vis 분광 광도계</td><td>Beckman Coulter, Brea, CA, USA</td><td></td><td>카탈로그를 찾을 수 없습니다</td></tr><tr><td>Olympus IX 71 도립 형광 및 위상차 현미경</td><td>Olympus America Inc., PA, USA</td><td></td><td>카탈로그를 찾을 수 없습니다.</td></tr></tbody></table>

조밀도 기온 변화도 원심 분리를 사용 하 여 차동 품질의 정자 컬렉션

Sperm Collection of Differential Quality Using Density Gradient Centrifugation

유성 생식, 남성 배우자 또는 정자 세포의 수정에 대해 여성 배우자와 퓨즈. 그러나, 많은 수의 능력을 기름과 정자 세포 수정 되도록 여성 생식 체와 상호 작용 해야 합니다. 따라서, 개별 정자 세포의 기름 능력은 성공적인 재생산에 대 한 중요 합니다. 조밀도 기온 변화도 원심 분리 수집 보조 생식 기술에 사용 될 양질의 정자를 재현할 수, 빠르고, 효율적, 효과적이 고 매우 융통성 있는 방법으로 몇 십년 동안 활용 되었습니다. 그들의 품질에 의해 닭의 3 가지 인구를 분리 하는 불연속 Percoll 밀도 그라데이션 원심 (PDGC) 기술 활용에 초점을 우리는 여기에 설명 된 프로토콜. 우리는 낮은, 중간 및 높은-품질 정자를 수집할 수 있었다. 우리는 또한 그들의 생존, 이동성 및 관통 성을 평가 하 여 정자의 결정 불 임 가능성을 수반 재현 가능한 프로토콜 설명 합니다. 컬렉션의 PDGC 기술을 사용 하 여 그들의 품질에 의해 정확 하 게 도움이 될 것 이다 고 철저 하 게 차동 임신 가능성과 정자를 특성화 하십시오.

PDGC 기술 모든 매개 변수를 통해 품질의 정도 의해 정자의 3 개의 층의 뚜렷한 구분에서 결과. 정자는 높은 밀도 솔루션, 높은 낮은 밀도 솔루션 및 낮은 밀도 솔루션 위에 낮은 품질 레이어 사이의 중간 품질 계층 아래의 높은-품질 계층으로 분리합니다. 품질에 이러한 차이 생존 (그림 4), 이동성 (그림 5) 관통 (그림 6)의 명확한 차이 의해 입증 됩니다. 정자는 PDG의 높은-품질 계층에서 격리 증가 전통적으로 씻어 샘플의 상대적인 모든 세 개의 매개 변수 전시. 모든 테스트 매개 변수를 통해 그 레이어 PDGC에 의해 분리 시 중간 및 낮은 품질 표시 온건 하 고, 각각,로 감소 합니다.
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이 논문에서 우리 밀도 그라데이션 원심 분리 기술 및 정자 생리학 연구에 응용 프로그램의 성능에 설명 하고자 합니다.

In sexual reproduction, a male gamete or sperm cell fuses with a female gamete to bring about fertilization. However, a large number of sperm cells with ...

이 방법은 정자 질의 화학 적 결단체와 같은 정자 생리학 분야의 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 다른 방법에 비해 적응성뿐만 아니라 품질에 의해 샘플의 대량을 분리 할 수있는 능력입니다. 이 방법은 정자 품질의 차이에 대한 통찰력을 제공 할 수 있지만, 그것은 또한 다른 밀도를 가진 혼합 세포 유형 또는 세포 전 성분과 같은 다른 샘플에 적용 될 수있다.시작하려면 두 개의 별도 튜브에 2 개의 3 밀리리터 Percoll 희석기를 만듭니다. 깨끗한 테스트 튜브에서 PBS 2 밀리리터로 정액 샘플 1 밀리리터를 희석시 희석시. 부드럽게 파이프하여 용액을 혼합합니다.멸균 원물 튜브에 낮은 밀도 Percoll 솔루션의 3 밀리리터를 추가합니다. 그런 다음, 조심스럽게 파이펫 3 낮은 밀도 Percoll 솔루션 아래 고밀도 Percoll 용액의 밀리리터. 원문 관을 45도 각도로 기울이는 동안, 페콜 밀도 그라데이션 위에 희석된 정액 샘플의 파이펫 3 밀리리터.빈 튜브를 준비한 후, 원심분리기는 20분 동안 1500 Gs에서 두 튜브를 원심분리합니다. 원심 분리 후 욕조에서 세 개의 뚜렷한 정액 층이 형성되었는지 확인하십시오. 파이펫을 사용하여 맨 위 층부터 시작하여 중간 층으로 시작하여 튜브 의 하단에 하드 펠릿으로 끝나는 세 층의 정액층을 수집합니다.각 층을 멸균 마이크로 원심분리기 튜브로 이송합니다. PBS의 1.5 밀리리터로 각 정액 샘플을 희석시키고 1500 Gs에서 샘플을 1500 Gs로 10분 동안 희석시. 마지막으로, 상체를 부어 운동성 버퍼로 펠릿을 재구성합니다.이 프로토콜에서 Percoll 밀도 그라데이션 원심 분리 기술 또는 PDGC는 정액 샘플을 세 개의 별개의 층으로 분리하는 데 사용되었습니다. 정자는 고밀도 용액, 고밀도 및 저밀도 솔루션 사이의 중간 품질 층, 저밀도 솔루션 위의 낮은 품질 층으로 분리됩니다. 정자 품질에 있는 이 다름은 생존, 이동성 및 침투성에 있는 다름에 의해 입증됩니다.이 절차를 시도하는 동안 샘플을 실온으로 가져와야한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. PDGC의 성공은 그라데이션의 신중한 준비뿐만 아니라 격리 된 레이어의 신중한 수집에 의존한다. 개발 후, 이 기술은 조류 종에서 다산의 바이오 마커를 탐구하는 정자 perdiomics의 분야에서 우리의 연구를위한 길을 열었습니다.

sperm-collection-differential-quality-using-density-gradient

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

마우스 testis에서 높은 정화 가능한 meiotic 분수를 얻는 효과적인 방법은 형광 활성 세포 분류 (외과)와 세련된 세포 분리 프로토콜을 결합하는, 설명되어 있습니다. 이 방법은 DNA의 내용과 개별 meiotic 분수의 핵 밀도의 차이 활용합니다.

마우스 Meiotic 셀 유동세포계측법의 정제

이 비디오는 말초 혈액에서 만성 림프구성 백혈병(CLL) 세포를 분리하는 기술에 대해 설명합니다. 이 프로토콜을 통해 인간 환자의 혈액 샘플에서 CLL 세포를 분리하여 핵 및 세포질 분획을 효율적으로 생성할 수 있습니다.

밀도 구배 원심분리법: 말초 혈액에서 CLL 세포를 분리하는 방법

STA-PUT 방법은 크기와 밀도에 따라 정자 형성 세포의 다른 인구의 분리 할 수​​ 있습니다.

STA-PUT 속도의 침전을 사용하여 정자 형성 세포 유형의 분리

유세포 분석을 사용하여 마우스 정자에 대한 정렬 전략을 설명합니다. 정자류는 둥글게(정자형성 단계 1-9), 초기신장(정자형성 단계 10-12), 후기신장(정자형성 단계 13-14) 및 길쭉한 정자류(정자형성 단계 15-16)를 포함하여 4개의 매우 순수한 개체군으로 분류됩니다. DNA 염색, 크기 및 입도는 선택 매개변수로 사용됩니다.

단계 별 마우스 정자의 정렬을 유동 세포 계측법에 의해

이 연구는 다른 포유 동물 종의 고환 조직으로부터 정제 된 배아 세포 집단을 얻는 방법의 표준화를 기술한다. Hoechst-33342 및 propidium iodide로 염색하는 기계적 고환 해리와 남성 생식 생물학의 비교 연구에서 폭넓게 응용할 수있는 FACS 분류법을 결합한 간단한 프로토콜입니다.

기계 조직 해리 및 유동 세포 계측법에 의한 포유 동물 수컷 세포의 다중 종 정제에 대한 표준화 된 접근법

캡슐 생산에 따라 세균성 인구를 분리 하기 위하여 불연속 밀도 그라디언트를 사용 하 여를 설명 합니다. 이 메서드는 문화 사이 캡슐 금액 비교, 특정 캡슐 형으로 돌연변이 체를 분리 하거나 캡슐 레 귤 레이 터를 식별 하기 위해 사용 됩니다. 여기에 설명 된 최적화 및 분석 결과의 실행 이다.

불연속 밀도 그라디언트를 사용 하 여 캡슐 양만큼 박테리아를 분리

여기에 제시된 것은 표준 실험실 장비와 불연속 소 혈청 알부민 밀도 그라데이션을 사용하여 성인 마우스 고환에서 파키틴 정자 세포, 둥근 정자 및 길쭉한 정자를 풍부하게하기위한 프로토콜입니다.

표준 실험실 장비를 사용하여 마우스 고환에서 파키텐 정자 세포와 정자의 농축

이 연구는 밀도 구배 원심분리(DGC)를 통해 인간의 대변에서 농축된 박테리아 세포외 소포체(BEV)를 분리 및 정제하는 방법을 설명하고, 형태, 입자 크기 및 농도에서 BEV의 물리적 특성을 식별하고, 임상 및 과학 연구에서 DGC 접근 방식의 잠재적 응용 분야에 대해 논의합니다.

Density Gradient Centrifugation을 사용한 인간 대변에서 박테리아 세포외 소포의 분리 및 정제

이 프로토콜은 정자 운동성 특성과 thigmotaxis를 활용하여 DNA 단편화 지수가 낮은 고품질 정자를 스크리닝하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 U자형 수평 수영 레인을 사용하여 고품질 정자가 완충 방울을 통해 반대쪽에 도달할 수 있도록 하고 죽은 정자, 세포 파편 및 불순물은 배제합니다.

낮은 DNA 단편화 지수로 고품질 정자를 준비하기 위한 U자형 수평 수영 기술

Denaturing 그라디언트 젤 전기 영동 (DGGE)

배우세요 조밀도 기온 변화도 원심 분리를 사용하여 정자 품질을 차등 분리하는 방법을. Percoll 그래디언트를 준비하고 원심 분리 후 세 가지 품질 층을 수집하여 생식 생물학 연구에 활용할 수 있습니다.

조밀도 기온 변화도 원심 분리를 사용 하 여 차동 품질의 정자 컬렉션

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