실험 전이 및 CTL 입양 전송 Immunotherapy 마우스 모델

종양 세포 - T 세포 상호 작용의 분석을 위해 실험적인 폐 전이와 CTL immunotherapy 마우스 모델

이 절차의 전반적인 목표는 in vivo에서 종양 특이적 T 세포 채택 전달 면역 요법의 효능을 조사하는 것입니다. 이는 먼저 폐 전이를 확립하기 위해 측면 꼬리 정맥 주입을 통해 종양 세포를 마우스에 이식함으로써 이루어집니다. 절차의 두 번째 단계는 종양 보유 마우스를 종양 특이적 세포독성 T 림프구 CTL로 치료하는 것입니다.

마지막 단계는 종양 결절을 시각화하고 정량화하는 수단으로 인도 잉크를 사용하는 것입니다. 궁극적으로 종양 크기를 측정하고 종양 결절의 수를 정량화하여 다양한 치료의 CIE를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 안녕하세요, 제 이름은 Mary Zimmerman이고 조지아 의과 대학의 Kevin Lu 박사 연구실의 일원입니다.

안녕하세요, 제 이름은 Shelene Hu입니다.저는 2학년이고 Dr.Lou의 연구실에서 일하고 있습니다. 생존 곡선과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 이 절차가 정성적 및 정량적이라는 것입니다. 이 기술의 함의는 인간 암 환자의 T 세포 채택 면역 요법을 모방하기 때문에 암 치료로 확장될 수 있습니다.

자, 시작합시다: 종양 세포 주사 전날, 종양 세포 주입 씨 1 개 T 75 플라스크 1 개까지 10 배에서 7 번째까지. CMS는 10%혈청을 함유한 10ml의 RPMI 배지에서 4개의 세포를 만났습니다. 빠르게 성장하는 종양을 얻기 위해 세포는 주사 당일 섭씨 37도에서 밤새 배양합니다.

배지를 제거하고 PBS로 세포를 한 번 헹구고 5분 동안 섭씨 37도에서 0.05% 트립신 EDTA로 종양 세포를 수확합니다. 10% 혈청을 함유한 10ml의 RPMI 배지로 반응을 중지합니다. 세포를 원뿔형 튜브로 옮깁니다.

val legend RT 원심분리기에서 1300RPM으로 3분 동안 셀을 스핀다운합니다. 실온에서 스내트를 제거하고 10 밀리리터의 신선한 XHB Ss에 세포를 재현탁시켜 세척합니다. 그런 다음 다시 스핀 다운하고 동일한 방식으로 다시 중단합니다.

혈구의 종양 세포를 세십시오. 세포분석기. HBSS에서 세포를 희석하여 각 주입에 필요한 세포가 재현탁되도록 합니다. 총 100 마이크로 리터의 부피로 6-8 주 된 B SEA 마우스를 따뜻한 물에 담근 비커에서 따뜻하게합니다.

꼬리 정맥을 확장하려면 마우스를 벤치의 꼬리 정맥 구속기에 넣으십시오. 마이크로 주사기를 사용하여 100마이크로리터의 종양 세포를 측면 꼬리 정맥에 주입합니다. 주사 후 감염을 피하기 위해 정화조 기술을 사용하십시오.

출혈이 멈출 때까지 주사 부위에 약간의 압력을 가하십시오. 마우스를 케이지로 되돌리고 종양이 원하는 단계로 자랄 수 있도록 합니다. 이송 당일, 정제된 세포독성 T 림프구 또는 CTL을 재현탁하기 위해 위아래로 피펫팅합니다.

텍스트에 설명된 대로 하나의 플레이트에서 모든 셀을 15ml 원추형 튜브로 옮기고 부피가 튜브의 2/3를 초과하지 않도록 합니다. 멸균 파스퇴르 피펫을 원뿔형 튜브에 삽입하고 림프구 분리를 층화합니다. 총 부피가 14 밀리리터에 가까워 질 때까지 세포 아래의 매체 또는 LSM.

레이어를 방해하지 않도록 주의하십시오. 실온에서 20분 동안 2000RPM으로 원심분리기를 가열합니다. 회전 후 브레이크를 사용하여 로터의 속도를 늦추지 말고 CTL을 새로운 15mm 원추형 튜브로 옮기십시오.

HBSS를 약 10밀리리터의 부피에 추가합니다. 씻기 위해. 5분 동안 1300RPM에서 스핀 다운하는 세포를 세고, 실온에서 HBSS를 주입에 필요한 세포 밀도로 재현탁합니다.

주입 당 총 부피를 100 마이크로 리터로 유지합니다. 이 비디오의 앞부분에서 본 것과 동일한 꼬리 주입 기술을 사용하십시오. 종양이 있는 마우스에 CTL을 주입하려면 마우스를 케이지로 되돌리고 CTL이 종양과 상호 작용할 수 있도록 합니다.

마우스는 일반적으로 CTL 처리 후 14-21일 후에 분석을 위해 희생됩니다. 폐 전이를 시각화하려면 희생된 쥐를 스티로폼 보드에 등을 대고 눕힙니다. 기관에 방해받지 않고 접근할 수 있도록 다리를 고정합니다.

복부 중간에서 시작하여 복부 쪽에 70% 에탄올을 뿌립니다. 가위를 사용하여 정중선을 따라 흉곽을 통해 침샘 쪽으로 자릅니다. 기관을 노출시킵니다.

집게를 사용하여 기관 주변 조직을 제거합니다. 200마이크로리터 피펫 팁을 한 손으로 팁을 잡고 기관 아래에 끼웁니다. 기관을 부드럽게 들어 올려 몸에서 떨어뜨립니다.

플랫폼을 180도 회전합니다. 50ml 주사기를 사용하여 기관을 통해 폐에 인디아 잉크를 주입합니다. 강한 저항이 느껴질 때까지 폐를 잉크로 완전히 팽창시킵니다.

가위를 사용하여 기관을 자릅니다. 한 쌍의 집게를 폐 아래로 밀어 넣고 마우스에서 들어 올립니다. 화학 연기 후드에 있는 1리터의 물 비커로 폐를 잠시 헹굽니다.

폐를 5ml의 FTI 용액이 함유된 유리 주입 담즙으로 옮깁니다. 종양 조직은 검은색 폐에 흰색 결절로 나타납니다. 몇 분 후, 이제 종양을 계수하고 FTI 용액에서 무기한 시작할 수 있습니다. 여기.

유선암(mammary carcinoma)으로 수혈 투여된 쥐의 폐. 세포주 4 T 1은 종양을 나타내는 흰색 반점을 보여줍니다. K 79 E에 대한 IRF 8 우성 음성 면역으로 transfection된 마우스는 종양 세포의 향상된 전이 가능성을 보여줍니다.

이 이미지는 CTL 양자 전달 면역 요법의 효능에 대한 조직학적 분석을 보여줍니다. 식염수를 주입한 종양이 있는 마우스는 6일 후에 화살표로 표시된 여러 개의 종양을 보였다. 반면에, 종양 특이적 T 세포를 주입한 마우스는 동일한 실험에서 종양의 감소를 보였다.

인도 잉크 처리는 CTL 입양 이식의 효능을 측정하는 더 간단한 방법을 제공합니다. 여기서 종양이 있는 폐의 백색 종양 결절은 CTL 채택 이식을 성공적으로 거친 폐와 명확하게 구별되며, 결절을 계수하면 조직학으로는 불가능한 정도의 정량화가 가능합니다. 이 절차를 시도하는 동안 더 쉽고 정확한 꼬리 정맥 주사를 위해 마우스를 워밍업하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

이 비디오를 시청한 후에는 종양의 크기와 수를 정량화하기 위해 이 간단한 절차를 통해 치료의 효능을 평가하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.