Name: 실험 전이 및 CTL 입양 전송 Immunotherapy 마우스 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-26T15:03:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: 배우세요 마우스 폐 전이 모델에서 CTL 입양 전송 면역요법의 효능을 평가하는 방법을. 종양 크기 측정과 결절 정량화를 통해 치료 효과를 분석할 수 있습니다.

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국립 보건원 (KL에 CA133085)와 미국 암 협회에서 부여 (KL에 RSG - 09 - 209-01 - TBG) 지원.

1. 실험 전이 마우스 모델 <ol><li> 당일 전에 종양 세포 주사, 최대 1과 씨앗 하나 T75 플라스크 X 10 7 CMS4 - 메트 빠르게 성장하는 종양 세포를 얻기 위해 혈청 10 %를 포함하는 RPMI 매체의 10 ML에 세포를. 37 밤새 품어 ° C. </li><li> 주사 당일, 미디어를 제거하고 PBS로 세포를 한 번 씻어 후 37 0.05 % 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)으로 종양 세포를 수확 ° C를 5 분. 10 % 혈청이 포함된 RPMI 매체 10 ML로 반응을 중지합니다. 원뿔 튜브에 세포를 전송합니다. </li><li> 상온에서 3 분 Sorvall 전설 RT의 원심 분리기에서 1,300 rpm으로 세포를 스핀 다운. 뜨는을 제거합니다. 세차 10 ML 신선한 1X HBSS에있는 세포를 Resuspend, 다시 스핀 다운과 같은 방식으로 resuspend. </li><li> hemocytometer에서 종양 세포를 계산합니다. 각각의 주사에 필요한 세포 100 μL의 총 볼륨 resuspended되도록, HBSS에있는 세포를 희석. </li><li> 꼬리 정맥을 팽창하기 위해 따뜻한 물에 잠겨 비커에 6~8주 이전 BALB / C 마우스를 따뜻하게. 벤치에 꼬리 정맥 restrainer에 마우스를 놓습니다. 측면 꼬리 정맥에 종양 세포 100 μL를 주입하는 microsyringe을 사용합니다. 감염을 피하기 위해 무균 기술을 사용합니다. 출혈이 멈출 때까지 주입 후, 주사 사이트에 약간의 압력을 적용합니다. </li><li> 새장에 마우스를 반환하고, 종양이 원하는 단계로 성장할 수 있습니다. </li></ol> 2. 세포 독성 T - 림프구 (CTL) 입양 전송 Immunotherapy <ol><li> 송금 당일, 정화 T - lymphocytes 세포 독성, 또는 CTLs, 텍스트에서 설명한대로 준비를 resuspend하기 위해 아래 피펫합니다. 볼륨이 더 튜브의 2 / 3 이상을 초과 두지 않을, 15 ML 원뿔 관 한 접시의 세포를 모두 전송합니다. </li><li> 원뿔 관에 멸균 파스퇴르 피펫을 넣고 총 부피 14 ML을 nears 때까지 세포에서 림프구 분리 매체, 또는 LSM 있다고 믿는다. </li><li> 레이어를 방해하지 않도록주의하십시오. 실온에서 20 분 동안 2,000 rpm으로 원심 분리기. 회전 후 회전자을 늦추기 위해 브레이크를 사용하지 마십시오. </li><li> 새로운 15 ML 원뿔 관에 CTLs을 전송합니다. 씻어 약 10 ML의 볼륨 HBSS를 추가합니다. </li><li> 세포를 계산합니다. 실온에서 5 분간 1300 rpm으로 스핀 다운. 100 μL에 주입 당 총 볼륨을 유지, 주사에 필요한 세포 밀도에 HBSS에 Resuspend. </li><li> 종양 - 베어링 생쥐에 CTLs를 삽입하는 이전이 비디오에서 볼 같은 꼬리 사출 기술을 사용합니다. </li><li> 새장에 마우스를 반환하고, CTLs이 종양과 상호 작용 수 있습니다. 마우스는 일반적으로 14-21일 CTL 치료 후 분석을 위해 희생하고 있습니다. </li></ol> 3. 룽 Metastases의 시각화 <ol><li> 폐 metastases를 시각화하기 위해 스티로폼 보드의 뒷면에 희생 마우스를 놓으십시오. 기관에 가리지 접근을 보장하기 위해 다리를 핀. 70 % 에탄올로 복부 측면을 스프레이. </li><li> 중간 복부에서 시작, 침샘쪽으로 최대 ribcage 통해 정중선을 따라 잘라, 및 가위를 사용합니다. 기관을 폭로. 기관 주위 조직을 제거하는 집게를 사용하십시오. </li><li> 기관 밑에 200 μL 피펫 팁을 실. 한손으로 팁을 개최하는 것은 부드럽게 신체의기도를 들어갑니다. </li><li> 플랫폼 180도 회전 °. 기관을 통해 폐로 인도 잉크를 주입하기 위해 50 ML의 주사기를 사용합니다. 당신은 강한 저항을 느낄 때까지 완전히 잉크와 폐가 팽창. </li><li> 기관를 잘라 가위를 사용합니다. 폐 아래 포셉 한 쌍의 슬라이드 그들을 마우스 밖으로 리프트. 물 1L 비커에 간단히 폐가 린스. </li><li> 화학 펌 모자, Fekete의 솔루션의 5 ML를 포함하는 유리 섬광 약병에 폐을 전송하기만하면됩니다. 종양 조직은 몇 분 후에 검은 폐에 흰색 nodules로 등장할 것입니다. 종양은 이제 계산하고 무기한 Fekete의 솔루션에 저장할 수 있습니다. </li></ol> 4. 시각 폐에 대표 Metastases <ol><li> 여기, 내유 암종 세포 라인 4T1로 주입했다 생쥐의 폐 종양을 나타내는 흰 반점을 보여줍니다. IRF8 지배 - 부정적인 돌연변 K79E와 transfected 4T1 세포로 주입했다 생쥐는 종양 세포의 향상된 전이성 잠재력을 보여줍니다. </li><li> 이러한 이미지는 CTL 입양 전송 immunotherapy의 효능 histological 분석을 보여줍니다. 식염수에 주입 종양 베어링 마우스는 노란색 화살표 (A)로 표시, 6 일 후 여러 종양을 보여주었다. 종양 특정 T 세포로 주입 생쥐는 반면에, 종양의 감소 (B)를 보여주었다. </li><li> 같은 실험에서, 인도 잉크 치료 CTL 입양 전송의 효능을 측정하는 간단한 방법을 제공합니다. 여기, 종양 - 베어링 폐에 하얀 종양의 nodules 확실히 성공적으로 CTL 입양 전송받은, 그리고 nodules을 계산해야 폐가에서 그들을 구분하는 것은 학위 허용조직학과 quantitation의 수 없습니다. </li></ol> 5. 대표 결과 <img src="/files/ftp_upload/2077/2077fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 실험 종양 전이 및 CTL 적응 전송 immunotherapy 마우스 모델 실험 계획. 레드 점들은 종양 세포와 녹색 점들은 CTLs를 나타냅니다 나타냅니다. <img src="/files/ftp_upload/2077/2077fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. IRF8 기능의 장애는 종양 세포의 전이성 잠재력을 향상. 마우스 내유 암종 세포 라인 4T1은 안정 벡터 (4T1.Vector) 또는 벡터 IRF8 지배 - 부정적인 돌연변이 K79E (4T1.IRF8K79E)를 (15, 16) 표현과 transfected했다. 종양 세포는 마우스 측면 꼬리 정맥에 주입 IV했다. 종양 베어링 폐에 종양 nodules을 시각화하기 위해 인도 잉크로 비정상적으로 증가했다. 종양 nodules 쉽게 검은 폐 조직 배경에 흰색 반점으로 볼 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2077/2077fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. CTL 입양 전송 immunotherapy의 효능 Histological 분석. 마우스 육종 세포 라인 CMS4 - 메트는 마우스 측면 꼬리 정맥에 주입 IV를했다. 사흘 후, 호수 (A) 또는 종양 특정 T 세포 (B)은 종양 베어링 생쥐에 주입했다. 폐 6 일 기존의 H &amp; E histological 얼룩하여 CTL 치료 후 분석했다. 종양 nodules는 화살표로 표시됩니다. <img src="/files/ftp_upload/2077/2077fig4.jpg" alt="그림 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 4"> 그림 4. 인도 잉크 인플레이션에 의해 종양 nodules의 시각화. 마우스 육종 세포 라인 CMS4 - 메트는 마우스 측면 꼬리 정맥에 주입 IV를했다. 사흘 후, 생리 (컨트롤) 또는 종양 특정 T 세포는 (+ CTL) 종양 베어링 생쥐에 주입했다. 폐가 십사일 CTL 치료 후에 분석했다. 종양 nodules있는 하얀 명소, CTL 치료의 효능에 대해 쉽게 부량 수 있습니다.

<ol><li>Ryan, M. H., Bristol, J. A., McDuffie, E., Abrams, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regression+of+extensive+pulmonary+metastases+in+mice+by+adoptive+transfer+of+antigen-specific+CD8%28%2B%29+CTL+reactive+against+tumor+cells+expressing+a+naturally+occurring+rejection+epitope%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Regression of extensive pulmonary metastases in mice by adoptive transfer of antigen-specific CD8(+) CTL reactive against tumor cells expressing a naturally occurring rejection epitope.</a> J Immunol. 167 (8), 4286-4292 (2001).</li>
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</ol>

생쥐는 국립 암 연구소 (Friderick, MD)에서 구입 조지아 동물 시설의 메디컬 칼리지 안에 보관되어 있었다. 실험 및 의료 / 복지 연방 규정 계약 및 조지아 IACUC위원회의 메디컬 칼리지에 의해 승인된 프로토콜되었습니다.

솔루션 : 인도 잉크 솔루션 (17) : <ol><li> 250 ML 플라스크에 증류수 150 ML 하거라. </li><li> 증류수 4 방울의 암모늄 수산화을 추가합니다. </li><li> 암모니아와 물을 혼합 30 ML 인도 잉크 주식 (즉, 샌포드 블랙 매직 방수 그리기 잉크 4,465 44,011 항목) 추가합니다. </li><li> 200 ML의 볼륨에 증류수와 떨어져 톱. 솔루션 주입을위한 준비가 된 것입니다. </li></ol> Fekete의 솔루션 (17) : Fekete의 솔루션은 일반적인 조직의 검은 배경에서 흰색 종양의 nodules을 구분하기 위해 표백제를 인도 잉크 높게 종양 베어링 폐에하는 데 사용됩니다. <ol><li> 1L 유리병에 350ml 95 % EtOH를 추가합니다. </li><li> 150ml 증류수를 추가 </li><li> 50ml 포름 알데히드 추가 </li><li> 25ml 빙하 산성 산성 추가 </li></ol>

실험 전이 및 ctl 입양 전송 immunotherapy 마우스 모델

Experimental Metastasis and CTL Adoptive Transfer Immunotherapy Mouse Model

실험 전이 마우스 모델은 생리학 관련 아직 간단하고 전이 모델입니다. 종양 세포는 마우스 꼬리 정맥에 (4) 정맥 주사하고 종양 세포 자발적인 전이의 마지막 단계를 닮은, 따라서, 폐 이식과 같습니다 말초 장기의 순환, 넘쳐 흐름과 식민지에서 생존합니다. 말초 기관에서 설립 전이성 종양 : 요법의 목표는 종종 전이의 끝 지점이기 때문에보기의 치료 시점에서 실험적 전이 모델은 가장 간단한 이상적 모델입니다. 이 모델에서, 종양 세포는 마우스 꼬리 정맥에 주입 IV 및 폐의 이식과 성장을 사용할 수 있습니다. 종양 특정 CTLs은 다음 metastases 베어링 마우스에 IV를 주입하고 있습니다. 폐 metastases의 번호와 크기는 주입으로 종양 세포의 수와 종양 성장의 시간에 의해 제어하실 수 있습니다. 따라서, 전이의 여러 단계, 광범위한 전이에 최소한의 전이에서 모델 수 있습니다. 룽 metastases 따라서 쉽게 시각 관측 및 부량를 허용, 잉크와 인플레이션에 의해 분석됩니다.

종양 세포 - T 세포 상호 작용의 분석을 위해 실험적인 폐 전이와 CTL immunotherapy 마우스 모델<em&gt; 생체내에</em&gt;.

실험 전이 및 CTL 입양 전송 Immunotherapy 마우스 모델

실험적 전이 마우스 모델은 단순하면서도 생리학적으로 유의미한 전이 모델입니다. 종양 세포를 ...에 정맥 주사(i.v)합니다.

본 절차의 전반적인 목표는 생체 내(in vivo)에서 종양 특이적 T-세포 입양 전이 면역요법의 효능을 검토하는 것입니다. 이를 위해 먼저 쥐의 측면 꼬리 정맥 주사를 통해 종양 세포를 이식하여 폐 전이를 유도합니다. 절차의 두 번째 단계는 종양이 형성된 쥐에게 종양 특이적 세포독성 T 림프구(CTLs)를 투여하여 치료하는 것입니다.마지막 단계는 인디아 잉크(India ink)를 사용하여 종양 결절을 시각화하고 정량화하는 것입니다. 궁극적으로 종양의 크기를 측정하고 종양 결절의 수를 정량화함으로써 서로 다른 치료법의 CIE를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 안녕하세요, 저는 조지아 의과대학(Medical College of Georgia)의 Kevin Lu 박사 연구실 소속 Mary Zimmerman입니다.안녕하세요, 제 이름은 Shelene Hu입니다. 저는 2학년 학생이며 Lou 박사님의 연구실에서 근무하고 있습니다. 생존 곡선과 같은 전통적인 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 이 절차가 정성적 분석과 정량적 분석이 모두 가능하다는 점입니다. 이 기술의 시사점은 인간 암 환자의 T세포 입양 면역 요법을 모방하기 때문에 암 치료 분야로 확대될 수 있습니다.이제 시작하겠습니다. 종양 세포 주입 전날, 10% 혈청이 포함된 10 mL RPMI 배지에 최대 1×10⁷개의 CMS-4MET 세포를 T75 플라스크 하나에 분주합니다. 빠르게 성장하는 종양 세포를 얻기 위해 37°C에서 하룻밤 동안 배양한 후 주입 당일에 사용하십시오.배지를 제거하고 PBS로 세포를 1회 세척한 후, 37°C에서 0.05% trypsin EDTA를 사용하여 5분 동안 종양 세포를 수확합니다. 10% serum이 포함된 RPMI 배지 10 mL를 첨가하여 반응을 중단시킵니다. 세포를 원심분리 튜브(conical tube)로 옮깁니다.val legend RT 원심분리기를 사용하여 1300 RPM에서 3분 동안 세포를 원심분리합니다. 상온에서 상층액을 제거하고, 세포를 세척하기 위해 10 mL의 신선한 1 XHB Ss에 재부유시킵니다. 그런 다음 동일한 방식으로 다시 원심분리하고 재부유시킵니다.hemo.Cytometer를 사용하여 종양 세포 수를 측정하십시오. 각 주입에 필요한 세포가 재현탁되도록 HBSS로 세포를 희석하십시오. 따뜻한 물에 담근 비커 안에서 6~8주 된 B SEA 마우스를 총 100 microliters 부피로 가온하십시오.미미정맥을 확장시키기 위해 마우스를 벤치 위의 미미정맥 보정기에 고정합니다. 마이크로 시린지를 사용하여 종양 세포 100 µL를 미미 외측 정맥에 주입합니다. 주입 후 감염을 방지하기 위해 무균 조작법을 사용하십시오.출혈이 멈출 때까지 주사 부위를 가볍게 압박합니다. 마우스를 케이지로 옮기고 종양이 원하는 단계까지 성장하도록 둡니다. 전이 당일에, 준비된 정제된 세포독성 T 림프구(cytotoxic T lymphocytes) 또는 CTL을 재현탁하기 위해 피펫팅을 수행합니다.본문에 설명된 대로, 모든 세포를 한 플레이트에서 15 milliliter 원추형 튜브로 옮기되, 튜브 부피의 3분의 2를 초과하지 않도록 합니다. 멸균된 파스퇴르 피펫을 원추형 튜브에 삽입하고, 총 부피가 14 milliliters에 가까워질 때까지 세포 아래에 림프구 분리 배지 또는 LSM을 층지게 추가합니다.층이 흐트러지지 않도록 주의하십시오. 실온에서 2000 RPM으로 20분 동안 원심분리합니다. 회전 후 로터를 감속시키기 위해 브레이크를 사용하지 말고, CTL을 새로운 15 milliliter 코니컬 튜브로 옮기십시오.HBSS를 약 10mL 부피가 되도록 추가합니다. 세척을 위해 세포를 1300 RPM에서 5분 동안 원심 분리합니다. 상온에서 HBSS를 사용하여 주입에 필요한 세포 밀도로 재현탁합니다.주입당 총 부피를 100 microliters로 유지하십시오. 이 비디오 앞부분에서 보여준 것과 동일한 꼬리 주입 기술을 사용하십시오. 종양 보유 마우스에 CTL을 주입한 후, 마우스를 케이지로 되돌려 CTL이 종양과 상호작용하도록 하십시오.마우스는 일반적으로 CTL 처리 후 14~21일 뒤에 분석을 위해 희생시킵니다. 폐 전이를 시각화하려면, 희생된 마우스를 스티로폼 보드 위에 등 쪽이 바닥으로 가게 놓습니다. 기관으로의 접근이 원활하도록 다리를 핀으로 고정합니다.복부 중간 부분부터 시작하여 복측면에 70% ethanol을 분사합니다. 가위를 사용하여 흉곽을 통해 정중선을 따라 침샘 방향으로 절개합니다. 기관을 노출시킵니다.포셉을 사용하여 기관 주변의 조직을 제거합니다. 한 손으로 200 µL 피펫 팁을 잡고 기관 아래로 밀어 넣습니다. 기관을 몸체에서 조심스럽게 들어 올려 분리합니다.플랫폼을 180도 회전시킵니다. 50 milliliter 주사기를 사용하여 기관을 통해 폐에 인디아 잉크를 주입합니다. 강한 저항이 느껴질 때까지 잉크로 폐를 완전히 팽창시킵니다.가위로 기관을 절단합니다. 핀셋을 폐 아래로 밀어 넣어 폐를 마우스에서 들어 올립니다. 화학 흄 후드 내에 있는 1 liter 비커의 물로 폐를 짧게 헹굽니다.폐를 5 mL의 FTI 용액이 담긴 유리 용기로 옮깁니다. 종양 조직은 검은색 폐 위에 흰색 결절로 나타납니다. 몇 분 후, 종양의 수를 세고 FTI 용액 내에서 무기한 보관할 수 있습니다.유선암이 전이된 마우스의 폐. 4T1 세포주에서는 종양을 나타내는 흰색 점들이 관찰됩니다. IRF8 우성 음성 돌연변이체 K79E가 전이된 마우스에서는 종양 세포의 전이 잠재력이 증가한 것을 보여줍니다.이 이미지들은 CTL 입양 전이 면역요법의 효능에 대한 조직학적 분석 결과를 보여줍니다. 생리식염수를 주입한 종양 보유 마우스의 경우, 6일 후에 화살표로 표시된 것처럼 다수의 종양이 나타났습니다. 반면, 종양 특이적 T 세포를 주입한 마우스는 동일한 실험에서 종양이 감소한 것을 확인할 수 있었습니다.인디아 잉크 처리는 CTL 입양 전이의 효능을 측정하는 더 간단한 방법을 제공합니다. 여기서는 종양이 생성된 폐의 흰색 종양 결절이 CTL 입양 전이가 성공적으로 이루어진 폐와 명확하게 구분되며, 결절 수를 세는 것을 통해 조직학으로는 불가능한 수준의 정량화가 가능합니다. 이 절차를 수행할 때, 더 쉽고 정확한 꼬리 정맥 주사를 위해 마우스를 미리 가온하는 것이 중요하다는 점을 기억하십시오.이 영상을 시청하신 후에는, 종양의 크기와 수를 정량화하는 이 간단한 절차를 통해 치료 효능을 평가하는 방법을 충분히 이해하시게 될 것입니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

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실험 전이 및 CTL 입양 전송 Immunotherapy 마우스 모델

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