실험 전이 및 CTL 입양 전송 Immunotherapy 마우스 모델

이 실험 절차의 전반적인 목표는 종양 특이적 T세포 입양 전이 면역요법의 in vivo 효능을 조사하는 것입니다. 이를 위해 먼저 측면 꼬리 정맥 주사를 통해 마우스에 종양 세포를 이식하여 폐 전이를 유도합니다. 절차의 두 번째 단계는 종양이 형성된 마우스에 종양 특이적 세포독성 T 림프구 CTLs를 투여하여 치료하는 것입니다.

마지막 단계는 종양 결절을 시각화하고 정량화하기 위해 인디아 잉크를 사용하는 것입니다. 궁극적으로 종양의 크기를 측정하고 종양 결절의 수를 정량화함으로써 서로 다른 처리군의 CIE를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 안녕하세요, 저는 조지아 의과대학 Kevin Lu 박사님 연구실의 구성원인 Mary Zimmerman입니다.

안녕하세요, 제 이름은 Shelene Hu입니다. 저는 2년 차 학생이며 Lou 박사님 연구실에서 근무하고 있습니다. 생존 곡선과 같은 전통적인 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 이 절차가 정성적 분석과 정량적 분석이 모두 가능하다는 점입니다. 이 기술의 시사점은 인간 암 환자의 T세포 입양 면역 요법을 모방하기 때문에 암 치료 분야까지 확장될 수 있습니다.

이제 시작해 보겠습니다. 종양 세포 주입 전날, 10% serum이 포함된 10 mL의 RPMI 배지에 1×10⁷개의 CMS-4 met 세포를 T 75 플라스크 하나에 분주합니다. 빠르게 성장하는 종양 세포를 얻기 위해 주입 당일까지 37 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다.

배지를 제거하고 PBS로 세포를 한 번 헹군 다음, 37°C에서 0.05% trypsin EDTA를 처리하여 5분 동안 종양 세포를 회수합니다. 10% serum이 포함된 RPMI 배지 10 mL를 가하여 반응을 중단시킵니다. 세포를 코니컬 튜브로 옮깁니다.

val legend RT 원심분리기를 사용하여 세포를 1300 RPM에서 3분 동안 원심분리합니다. 상온에서 상청액을 제거하고, 세척을 위해 10 milliliters의 신선한 one XHB Ss에 세포를 재현탁합니다. 그런 다음 동일한 방식으로 다시 한번 원심분리하고 재현탁합니다.

hemo.Cytometer를 사용하여 종양 세포 수를 측정합니다. 각 주입에 필요한 세포가 현탁되도록 HBSS로 세포를 희석합니다. 6~8주령의 B SEA 마우스를 따뜻한 물에 담근 비커에서 총 부피 100 microliters가 되도록 가온합니다.

미정맥을 확장시키기 위해 마우스를 벤치 위의 꼬리 정맥 보정기에 고정합니다. 마이크로 시린지를 사용하여 100 µL의 종양 세포를 꼬리 외측 정맥에 주입합니다. 주입 후 감염을 방지하기 위해 무균 조작법을 사용하십시오.

출혈이 멈출 때까지 주사 부위를 가볍게 압박합니다. 마우스를 케이지로 돌려보내고 종양이 원하는 단계까지 성장하도록 합니다. 이식 당일, 피펫팅을 통해 준비된 정제된 세포독성 T 림프구(cytotoxic T lymphocytes, CTLs)를 재현탁합니다.

본문에 설명된 대로, 한 플레이트의 모든 세포를 15 milliliter 원추형 튜브로 옮기되, 부피가 튜브의 3분의 2를 넘지 않도록 합니다. 멸균된 파스퇴르 피펫을 원추형 튜브에 삽입하고, 총 부피가 14 milliliters에 가까워질 때까지 세포 아래에 림프구 분리 배지 또는 LSM을 층으로 쌓습니다.

층이 흐트러지지 않도록 주의하십시오. 실온에서 2000 RPM으로 20분 동안 원심분리합니다. 회전 후 로터를 감속시킬 때 브레이크를 사용하지 말고, CTL을 새로운 15 milliliter 원추형 튜브로 옮기십시오.

HBSS를 약 10 mL 부피가 되도록 추가합니다. 세척 단계입니다. 세포 수를 측정하고 실온에서 1300 RPM으로 5분간 원심분리합니다. 주입에 필요한 세포 밀도가 되도록 HBSS로 재현탁합니다.

주입당 총 부피를 100 microliters로 유지하십시오. 이 영상의 앞부분에서 확인한 것과 동일한 꼬리 주입 기술을 사용하십시오. CTL을 종양 보유 마우스에 주입한 후, 마우스를 케이지로 돌려보내 CTL이 종양과 상호작용하도록 합니다.

마우스는 일반적으로 CTL 처리 14~21일 후에 분석을 위해 희생시킵니다. 폐 전이를 시각화하려면, 희생시킨 마우스를 스티로폼 보드 위에 등으로 눕힙니다. 기관에 방해 없이 접근할 수 있도록 다리를 핀으로 고정합니다.

복부 중간 부분부터 시작하여 복측에 70% ethanol을 분사합니다. 가위로 흉곽을 지나 타액선 방향으로 정중선을 따라 절개합니다. 기관을 노출시킵니다.

포셉을 사용하여 기관 주변의 조직을 제거합니다. 한 손으로 200 µL 피펫 팁을 잡고 기관 아래로 밀어 넣습니다. 기관을 몸체로부터 조심스럽게 들어 올립니다.

플랫폼을 180도 회전시킵니다. 50 milliliter 주사기를 사용하여 기관을 통해 폐에 인디아 잉크를 주입합니다. 강한 저항이 느껴질 때까지 잉크로 폐를 완전히 팽창시킵니다.

가위로 기관을 절단합니다. 핀셋을 폐 아래로 밀어 넣어 폐를 마우스에서 들어 올립니다. 화학 흄 후드 내에 있는 1 L 비커의 물로 폐를 짧게 세척합니다.

폐를 5 mL의 FTI 용액이 담긴 유리 용기로 옮깁니다. 종양 조직은 검은색 폐 위에서 흰색 결절 형태로 나타납니다. 몇 분 후, 종양의 수를 측정할 수 있으며 FTI 용액 내에 무기한 보관할 수 있습니다.

유선암이 전이된 생쥐의 폐. 4T1 세포주에서는 종양을 나타내는 흰색 반점이 관찰됩니다. IRF8 dominant negative mutant K79E가 도입된 생쥐에서는 종양 세포의 전이 능력이 향상된 것이 확인됩니다.

이 이미지들은 CTL 입양 이식 면역요법의 효능에 대한 조직학적 분석 결과를 보여줍니다. 생리식염수를 주입한 종양 유발 마우스는 6일 후 화살표로 표시된 바와 같이 다수의 종양이 관찰되었습니다. 반면, 종양 특이적 T 세포를 주입한 마우스는 동일한 실험에서 종양이 감소한 것을 보여주었습니다.

인도 잉크(India ink) 처리는 CTL 입양 이식의 효능을 측정하는 더 간단한 방법을 제공합니다. 여기서는 종양 유발 폐에 나타난 흰색 종양 결절이 CTL 입양 이식에 성공한 폐와 명확하게 구분되며, 결절 수를 세는 것을 통해 조직학적 분석으로는 불가능한 수준의 정량화가 가능합니다. 이 절차를 수행할 때는 꼬리 정맥 주사를 더 쉽고 정확하게 하기 위해 마우스를 미리 가온해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.

이 영상을 시청하신 후, 여러분은 종양의 크기와 수를 정량화하는 이 간단한 절차를 통해 치료 효능을 평가하는 방법에 대해 충분히 이해하시게 될 것입니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.