아크릴 아미드 기반 Hydrogels을 사용하여 세포 기능에 매트릭스 강성의 영향을 공부

아크릴아미드 하이드로겔을 사용하여 생체 내 조직 순응도를 모델링합니다. 이것은 먼저 반응성 하단 커버 슬립과 실리콘화된 상단 커버 슬립을 생성하여 수행됩니다. 절차의 두 번째 단계는 아크릴아미드 하이드로겔을 붓고 만드는 것입니다.

절차의 세 번째 단계는 선택한 세포외 기질 단백질을 하이드로겔에 가교하는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 세포의 배양 및 분석입니다. 궁극적으로, 면역형광 현미경 검사, 실시간 정량 PCR 및 웨스턴 블로팅을 사용한 분석을 통해 다양한 세포외 기질 순응도가 in vitro에서 어떻게 세포 행동을 조절하는지 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.

오늘은 아크릴아미드 하이드로겔의 생성 및 사용 절차를 보여 드리겠습니다. 우리는 실험실에서 이 절차를 사용하여 세포 외 기질 강성을 연구하고 세포 형태, 세포 신호 전달 및 증식을 조절합니다. 시작하겠습니다.

반응성 커버 슬립을 생성하여 이 절차를 시작합니다. 먼저 150mm 페트리 접시의 아래쪽 절반에 파라폼 층을 놓습니다. 그런 다음 최대 9개의 오토클레이브 25mm 커버 슬립을 파라 필름에 옮기고 1밀리리터의 0.1몰 수산화나트륨으로 덮습니다.

커버 슬립을 3분 동안 배양한 후 화학 후드 피펫에서 작동하는 진공 라인으로 수산화나트륨을 흡입하고 각 커버 슬립에 3개의 아미노 프로파일 트리메틸 또는 3개의 A-P-T-M-S 0.5ml를 흡입합니다. 커버 슬립을 3분 동안 배양한 다음 3개의 A-P-T-M-S를 흡인합니다. 덮개에 거품이 형성되지 않도록 너무 오래 배양하지 않도록 주의하십시오.

치료 후 미끄러짐. 같은 접시에 20ml의 탈이온수로 커버 슬립을 한 번 헹굽니다. 구부러진 집게를 사용하여 접시에서 커버 슬립을 제거하고 처리된 면이 새 150mm 접시를 향하도록 옮깁니다.

그런 다음 커버 슬립을 탈이온수로 다시 씻고 10분 동안 로커에 올려 놓습니다. 배양 후에는 물을 제거하고 두 번 더 씻으십시오. 글루타르알데히드와 반응하지 않고 글루타르알데히드에 사용하기 10분 전에 흐린 흰색 침전물을 남겨두도록 3개의 A-P-T-M-S를 모두 제거하는 것이 매우 중요합니다.

구부려진 겸자를 사용하여, 덮개 미끄러짐을 param로 층을 이룬 청결한 접시에 옮기고 진공 선을 사용하여 남아 있는 액체를 흡인하고, 그 후에 3개의 A-P-T-M-S 및 많은 아크릴아미드 젤을 교차 연결하기 위하여 메마른 이온화된 물에 있는 0.5%glutaraldehyde의 0.5 밀리리터로 각 덮개 미끄러짐을 완전히 덮으십시오. 화학 후드에서 커버 슬립을 30분 동안 배양합니다. 그런 다음 글루타르알데히드를 흡인하고 헹구고 탈이온수로 덮개를 다시 씻습니다.

그런 다음 덮개가 미끄러지면 완전히 말리십시오. 클로로포름과 암석에 10% 표면 밀봉 용액이 들어 있는 50ml Falcon 튜브에 최소 10분 동안 새 커버 슬립을 추가합니다. 표면 밀봉 용액을 디캔팅하고 자연 건조시킵니다.

뚜껑은 하이드로겔이 하이드로겔 준비를 시작할 준비가 될 생물 안전 캐비닛의 Kim 물티슈에 미끄러집니다. 구부러진 집게를 사용하여 커버 슬립 반응면을 생물 안전 캐비닛 표면에 테이프로 붙인 파라폼 시트로 옮깁니다. 커버 슬립이 파라폼 표면에 평평한지 확인하십시오.

그런 다음 충분한 톨루엔에 소량의 NHS를 용해시켜 톨루엔에 포화 및 하이드록시 CIN 보조제 또는 NHS 용액을 준비합니다. 특정 실험의 경우 NHS가 더 이상 용해되지 않을 때까지 소량의 NHS를 추가합니다. 포화 용액은 일반적으로 흐리고 분홍색입니다.

다음으로, 아크릴아미드 BIS, 아크릴아미드 물 및 PS를 준비하여 원하는 아크릴아미드 비율에 도달합니다. 서면 프로토콜에 설명된 대로 micro use 튜브에 시약을 추가합니다. 그런 다음 한 번에 하나의 부분 표본.

NHS와 TM me를 추가하십시오. 튜브를 짧고 즉시 소용돌이치십시오 : 생물 안전 캐비닛에 커버 슬립 당 140 마이크로 리터를 사용하여 3-5 개의 젤을 붓습니다. 중합을 시작하기 전에 SILICONIZED 25mm 커버 슬립을 각 젤 위에 빠르게 놓습니다.

상단 커버 슬립을 추가하면 아크릴아마이드가 하단 커버 슬립을 완전히 덮을 수 있습니다. 아크릴아마이드가 중합될 때까지 이 샌드위치를 실온에서 배양하여 중합이 언제 발생했는지 확인합니다. 마이크로 원심분리기 튜브에 잔류 아크릴아미드 용액이 있는지 확인하십시오.

중합은 뻣뻣한 겔의 경우 몇 분이 걸리고 소프트 젤의 경우 조금 더 오래 걸립니다. 중합이 일어나면 멸균 장갑을 끼고 샌드위치를 조심스럽게 집어 듭니다. 그런 다음 상단 덮개를 밀어 중합된 젤에 돌출될 때까지 밀어 넣습니다.

그런 다음 덮개를 들어 올립니다. 젤을 떼어내고 상단 덮개 슬립을 버립니다. 각 하단 젤 커버 슬립을 이후 하이드로겔이라고 부르는 6웰 플레이트에 놓습니다.

다음으로, 6웰 플레이트의 웰당 2밀리리터의 인산염 완충 식염수 또는 PBS를 추가합니다. 그런 다음 PBS로 하이드로겔을 세척하고 로커에서 5분 동안 배양합니다. 이 세척을 두 번 반복합니다.

실험을 시작하려면 각 하이드로겔을 2밀리리터의 피브로넥틴 용액 또는 기타 세포외 기질 단백질로 덮습니다. 하이드로겔의 단백질을 섭씨 4도에서 밤새 배양하여 하이드로겔에 공유 결합하도록 한 후 하룻밤 동안 ECM 용액을 흡입합니다. 그런 다음 무혈청 배지에 1밀리리터당 1mg의 가열 활성 지방산이 없는 소 혈청 알부민으로 무반응성 NHS를 차단하고 섭씨 37도에서 최소 30분 동안 배양합니다.

배양 후 하이드로겔을 멸균 PBS로 한 번 세척합니다. 다음으로, 소 태아 혈청을 함유한 적절한 배양 배지에 세포를 플레이트화합니다. 여기 하이드로겔에 대해.

마우스 배아 섬유아세포를 확립합니다. 실험에 필요한 세포 확산 정도와 합류 정도에 따라 하이드로겔에 파스할 세포의 수를 결정합니다. 웨스턴 블롯 및 정량적 PCR 분석에 필요한 5개의 세포에 약 10개.

그런 다음 특정 세포 유형에 적합한 조건에서 세포를 배양합니다. 잠복기 이후. 필요에 따라 세포 단백질 또는 mRNA를 추출합니다.

100마이크로리터의 용해 방울을 실험실 벤치의 파라폼 시트에 완충하여 각 방울 사이에 약 2-3cm를 남겨둡니다. 다음으로, 웰에서 하단 덮개 슬립을 들어 올려 각 하이드로겔을 조심스럽게 제거합니다. 구부러진 집게를 사용하여 세포 쪽을 아래로 향하게 하여 물방울 위에 놓습니다.

정확히 1분 동안 lysis buffer로 세포를 배양합니다. 마지막으로 커버 슬립을 제거하고 용해 버퍼를 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 또는 RNA를 추출할 때 각 하이드로겔을 새로운 6웰 플레이트로 옮기고 웰당 1ml의 트리아졸을 추가합니다.

배양 후 3분 동안 겔을 배양합니다. 마이크로 원심분리기 튜브에 보관하기 위해 트리아졸 용액을 제거합니다. A-P-T-M-S를 추가한 후 커버 슬립을 철저히 세척하는 것은 반응성 커버 슬립을 생성하는 데 중요한 단계입니다.

적절하게 세척하고 건조시킨 커버 슬립에는 침전물 잔류물이 없습니다. A-P-T-M-S는 글루타르알데히드와 반응하여 흰색 흐린 침전물을 생성합니다. 침전물이 발생하면 커버 슬립을 더 이상 사용할 수 없으므로 전체 절차를 반복해야 합니다.

하이드로겔 형성 및 ECM 단백질로 코팅한 후 하룻밤 사이에 세포를 파종합니다. 염색에서 FOID에서 볼 수 있듯이 뻣뻣한 하이드로겔과 부드러운 하이드로겔에서 퍼지는 세포와 마우스 배아 섬유아세포에서 퍼지는 세포는 소프트 하이드로겔에 비해 뻣뻣한 곳에서 더 많이 퍼지는 세포 사이에는 뚜렷한 차이가 있습니다. 실제로, 소프트 하이드로겔에 부착되는 대부분의 세포는 컴팩트하게 유지되고 부착 효율이 떨어집니다.

마우스 배아 섬유아세포에서 D one mRNA 수준을 cycling 하는 대표적인 정량적 PCR 결과는 d one cycling이 딱딱한 기질에서는 크게 상향 조절되지만 소프트 기질에서는 그렇지 않음을 보여줍니다. 이는 매트릭스 강성(matrix stiffness)이 in vitro에서 세포주기 진행을 조절한다는 것을 시사합니다. 방금 하이드로겔 절단 강성을 생성하고 생체 내 생리학적 조건을 모델링하는 방법을 보여드렸습니다.이 절차를 수행할 때 사고와 오류가 발생할 수 있으므로 추가 반응성 커버 슬립을 만드는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

그게 다야. 시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.