Name: 아크릴 아미드 기반 Hydrogels을 사용하여 세포 기능에 매트릭스 강성의 영향을 공부 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-10T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: 학습하세요 아크릴아미드 하이드로겔을 사용하여 세포 외 기질 강성이 세포 형태와 유전자 발현에 미치는 영향을 분석하는 방법을. 면역형광 현미경, 실시간 정량 PCR, 웨스턴 블롯팅 기법을 활용하여 생체 조직 환경을 모델링합니다.

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작업은 저희 연구실은 국립 보건원에서 기금 지원입니다.

준비 <ul><li> Coverslips는 autoclaved해야합니다. </li><li> 멸균 증류수 또는 탈이온수는 솔루션을 준비하고 세탁 coverslips를 위해서 사용해야합니다. </li><li> AC (40 % W / V) 및 BIS - AC (1 % W / V)이 솔루션은 0.2 μm의 여과 소독을하고 있습니다. 빠른 시일 내에 사용하고 살균 필터를하기 전에, 10 % 암모늄 persulfate (100μg/ml 물을 APS)를 준비합니다. APS 솔루션은 매월 바꿉니다. </li><li> autoclaved 수없는 등 3 APTMS, 클로로포름, glutaradehyde, NHS, 그리고 SurfaSil 같은 화학 시약은 hydrogels의 준비를 위해서만 사용되는 할당 병에 보관하고 있습니다. </li><li> 최상의 결과를 얻으려면, hydrogels는 해당 ECM 단백질과 함께 하룻밤 배양 후 며칠 이내에 이용해야합니다. </li><li> 히드로겔의 따르는 이전 50 ML 폴리 프로필렌 팰컨 튜브 클로로포름 (10 ML은 보통 정도로 20 위로 coverslips입니다)의 10 % SurfaSil 솔루션을 준비합니다. (저희 연구실은 보통 0.5 % 글루 타 알데히드 인큐베이션 단계에서 상단 coverslips을 siliconizes). 최소한 10 분 팔콘 튜브와 바위에 coverslips을 추가합니다. SurfaSil 솔루션을 가만히 따르다하고 공기는 hydrogels가 준비되는 생물 학적 안전 캐비닛에 Kimwipes에 coverslips을 건조. </li><li> 다음과 같이 열 - inactivated BSA 솔루션을 준비 : PBS의 지방산 - 초산 무료 BSA의 20 MG / ML 솔루션은 30 분 68 ° C 물 목욕에 incubated입니다. 이 솔루션은 다음 멸균 4 ° C.에 여과 및 저장 </li></ul> 절차 <ol><li> 150 mm 배양 접시의 절반 아랫부분에 Parafilm의 레이어를 놓습니다. </li><li> Parafilm 위에 9 25 mm coverslips까지 플레이스 1 ML 0.1 M NaOH으로 그들을 커버. 진공 라인 대기음 후 3 분 부화합니다. </li><li> 각 coverslip에 화학 후드, 장소 0.5 ML 3 APTMS에서 근무. 3 분위한 부화 후 APTMS를 대기음. 당신이 너무 오래 기다려야하는 경우, 거품이 형성됩니다. </li><li> 같은 접시 20 ML 탈이온수로 번 coverslips을 씻어. 곡선 집게를 사용하여 요리의 coverslips를 제거하고 자신이 대접 측 새로운 150 mm 요리로, 최대 직면와 함께 그들을 전송합니다. 10 분 각 세척 들어, 로커에 탈이온수 세 번있는 coverslips 씻으십시오. 여러분 모두 APTMS을 제거하지 않으면, 그것은 다음 단계에서 글루 타 알데히드와 반응하여 흰색 침전 클라 우디 (그림 1)을 벗어나게됩니다. </li><li> 글루 타 알데히드를 (사용하기 전에 ~ 10 분) 해동. </li><li> 곡선 포셉 사용 Parafilm와 겹쳐 깨끗한 접시에 coverslips를 전송하고 나머지 액체를 대기음. 필요에 따라 나머지 물을 얼룩에 진공 라인이나 Kimwipe을 사용합니다. </li><li> 무균 탈이온수의 0.5 % 글루 타 알데히드 0.5 ML로 완전히 각 coverslip을 커버 및 화학 후드에서 30 분 알을 품다. 글루 타 알데히드를 대기음. 린스와 4 단계에서로 coverslips 씻으십시오. 완전히 coverslips 건조. [당신은 건조한 지역의 중지하고 몇 주 동안 coverslips을 남길 수 있습니다]. </li><li> 당신이 hydrogels를 준비 준비가되면, 생물 안전 캐비닛의 표면에 녹화되어 Parafilm의 시트에 coverslips, 반응 측면까지를 전송 곡선 집게를 사용합니다. coverslips이 Parafilm 표면에 평평하게되었는지 확인합니다. </li><li> 톨루엔의 포화 NHS 솔루션을 준비합니다. (특정 실험에 대한 충분한 톨루엔의 NHS의 작은 금액을 디졸브. NHS가 더 이상 해소하지 않을 때까지 비트에 의해 NHS 비트를 추가하는 유지. 포화 솔루션은 일반적으로 흐리고과 분홍색입니다.) </li><li> 다음, 원하는 아크릴 아미드 비율에 도달하는 아크릴 아미드, 비스 - 아크릴 아미드, 물, APS를 준비합니다. 로 0.8ml의 총 볼륨으로 아래에 설명된 microcentrifuge 튜브의 시약을 추가합니다. </li><li> 그런 다음 한 번에 하나 나누어지는가 NHS를 추가하고 0.8 ML AC 솔루션 TEMED, 소용돌이 간략 즉시 생물 학적 안전 모자 coverslip 당 140 μl를 사용하여 3-5 젤 잔. 가능하다면,이 시점에서 모든 단계는 생물 학적 안전 캐비넷에서 수행되어야합니다. [주 : 서로 다른 크기 coverslips는 필요에 따라 이용하실 수 있습니다. 18 mm coverslips를 사용하는 경우, ~ 33 coverslip 당 μl AC 솔루션과 18 mm 최고 siliconized coverslip을 사용합니다.] <table border="1"><tbody><tr><td></td><td colspan="4"> BIS - AC (%) </td></tr><tr><td></td><td> 0.3 (딱딱한) </td><td> 0.15 </td><td> 0.06 </td><td> 0.03 (소프트) </td></tr><tr><td></td><td> μl </td><td> μl </td><td> μl </td><td> μl </td></tr><tr><td> 물 </td><td> 402 </td><td> 522 </td><td> 594 </td><td> 618 </td></tr><tr><td> AC </td><td> 150 </td><td> 150 </td><td> 150 </td><td> 150 </td></tr><tr><td> 비스 - AC </td><td> 240 </td><td> 120 </td><td> 48 </td><td> 24 </td></tr><tr><td> APS </td><td> 8 </td><td> 8 </td><td> 8 </td><td> 8 </td></tr><tr><td> TEMED</td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> NHS </td><td> 228 </td><td> 228 </td><td> 228 </td><td> 228 </td></tr></tbody></table></li><li> 이 중합을 시작하기 전에 신속하게 각 젤 위에 siliconized 25 mm coverslip을 놓으십시오. 상단 coverslip의 추가는 AC 완전히 바닥 coverslip을 충당하기 위해 허용해야합니다. AC가 polymerizes 때까지 실온에서이 "샌드위치"를 품어. (중합이 발생했을 때 결정하는 microcentrifuge 관의 잔류 AC 솔루션을 확인하십시오. 보통 몇 성실히 젤류 분 동안 부드러운 사람을위한 이상 약간 충분이..) </li><li> 조심스럽게 샌드위치를​​ 픽업 (에 멸균 장갑!)하고 overhangs polymerized 젤 때까지 최고 coverslip을 슬라이드. 그런 다음 젤 그것을 캐내다 수 있습니다. 당신이 최고 coverslip을 제거하기 전에 너무 오래 기다리지는 경우 coverslip가 제거로 젤이 찢어 것입니다. </li><li> 상단 coverslip 폐기하십시오. 물론이 ML PBS /와 함께 6 - 잘 접시에 바닥 젤 - coverslips을 (이하 히드로겔라고도 함) 놓습니다. PBS는 각 잘 수있는 젤 - coverslip 앞 또는 뒤에 추가할 수 있습니다. 로커, 세차 당 5 분에 PBS로 세 번 hydrogels 씻으십시오. </li><li> hydrogels의 필요한 번호가 준비 때까지 반복 11-14 단계를 반복합니다. </li><li> fibronectin 용액 (PBS 3 μg / ML) 또는 기타 ECM 단백질 (클라인 외를 참조하십시오. 자세한 내용은 13.) 2 ML 각 히드로겔 표지. ECM 단백질은 covalently 4 ° C.에서 하룻밤 배양 동안 히드로겔에 바인딩됩니다 </li><li> 37 최소한 30 분 ECM 솔루션과 혈청이없는 미디어 1mg/ml 열 inactivated 지방산 - 초산 무료 BSA와 블록 unreacted NHS를 대기음 ° C 세포 문화 인큐베이터 인치 멸균 PBS 또는 세포 배양 매체로 한 번 hydrogels을 씻어. </li><li> FBS를 포함하는 적절한 문화 매체 플레이트 세포. 히드로겔에 씨앗을 품고 세포의 숫자는 셀 실험에 필요한 확산과 confluency의 정도에 따라 사용자에 의해 결정되어야합니다. 약 10 5 세포는 일반적으로 모래 바닥 서양 qPCR 분석을 위해 충분합니다. </li><li> 잠복기에 따라, 세포의 단백질이나 mRNA가 추출 수 있습니다. coverslips 신중하게 곡선 집게를 사용하여 우물에서 제거하고 실험실 벤치에서 Parafilm의 시트 따라 (2~3cm) 밖으로 간격되었습니다 용해 완충액 100 μl 방울 위에 (세포 쪽 아래) 위치하고 있습니다. (우리는 서쪽 모래 바닥에 대한 샘플을 준비하고 qPCR에 대한 RNA를 분리하고, 각각 표준 SDS 샘플 버퍼와 TRIzol를 사용합니다.) 정확히 하나 분간 용해 완충액으로 세포를 품어. coverslips를 제거하고 microcentrifuge 관에 용해 버퍼를 전송할 수 있습니다. 또는 전용 RNA 추출을 위해, 사용자는 새로운 6 자 판 각 히드로겔를 전송하고 TRIzol / 음의 1ml를 추가할 수 있습니다. 3 분 부화하고 microcentrifuge 관에 저장 TRIzol 솔루션을 제거합니다. </li></ol> 같은 immunofluorescence 같은 절차에 대한 자세한 내용은 hydrogels의 씨앗 세포 BrdU의 얼룩, transfection 등 클라인 외에 설명되어 있습니다. 2007 13. 대표 결과 APTMS의 또한 다음과 같은 coverslips 철저히 세척은 "반응"coverslips 생산에 중요한 단계입니다. 하나는 완전히 APTMS를 제거하지 못하면, 그것은 다음 단계에서 글루 타 알데히드와 반응하여 그림 1A에서 볼 흰색 클라 우디 침전물을 생산합니다. 그림 1B는 제대로 씻어 말린 coverslip을 보여줍니다. 침전물이 개발하는 경우 coverslip가 더 이상 유용한없는 것처럼, 모든 절차는 처음부터 다시 시작해야합니다. 하룻밤 ECM 단백질과 히드로겔 형성과 코팅에 따라, 세포는 다음날 씨앗 수 있습니다. 그림 2 보여줍로서, 뻣뻣한 비해 부드러운 hy​​drogels에 확산 세포 사이에 뚜렷한 차이가있다. 마우스 배아 섬유아 세포 (MEFs)에 phalloidin의 얼룩에서 볼 수 있듯이 소프트 hydrogels에 비해, 전지는 뻣뻣한에 큰 정도로 확산. 사실, 부드러운 히드로겔에 부착 대부분의 전지는 소형 유지하고 덜 효율적으로 연결합니다. 단 MEF의 형태는 그림 2에 표시된 있지만, 세포 확산의 차이가 다른 여러 세포 라인에 걸쳐 일관가 11-12,14을 테스트했습니다. 성공의 비밀 <ol><li> 절차가 시작되면, 그것은 "반응"면을 coverslips를 유지하고 코팅되어있는 면을 염두에 두어야하는 것은 매우 중요합니다. </li><li> 장갑은 가능한 한 무균되는 작업 환경을 제공하기 위해 절차를 수행하는 동안 모든 시간에 착용한다. </li><li> 초기 단계의 대부분은 화학 퓸 후드 및 실험실 벤치 사이에 수행됩니다. coverslips에서 여분의 글루 타 알데히드를 제거하기 위해 이후 모든 단계는 생물 학적 안전 캐비닛에 따라 실행해야합니다. </li><li> 세포 sprea의 차이로 인해뻣뻣한 hydrogels에 비해 땡 (그림 2), 우리는 부드러운 hy​​drogels에 대한 세포의 두 수를을 심는 것이 좋습니다. </li><li> 교류 중합 과정은 매우 빠르다. 처음 사용자의 경우, 하나는 APS의 양을 줄일 수 또는 중합 과정을 연장하는 솔루션 TEMED. 한 번에 몇 coverslips 이상을 준비하려고하지 마십시오. </li><li> G0에서 동기화가 필요한 세포주기 연구에서 우리는 일반적으로 플라스틱 문화 요리 세포를 혈청 - 굶어 세포를 trypsinize하고 mitogens의 존재 (FBS 및 / 또는 성장 요소) 다른 compliances의 hydrogels 그들을 reseed. 이 절차는 G0 - 동기 세포의 시작 인구가 모든 샘플에서 동일 보장합니다. 그러나 많은 신호 전달 연구를 위해, 필요한 mitogen 자극의 기간은 첨부 파일 및 세포의 확산을위한 충분한 길이되지 않을 수 있습니다. 이 경우에, 우리는 hydrogels에있는 세포를 혈청 - 굶어 후 직접 mitogen으로 그들을 자극. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2089/2089fig1a.jpg" alt="그림 1a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1A"> 그림 1A. 부적절 coverslip을 빨기도 했죠. APTMS의 또한 다음, coverslip는 글루 타 알데히드 솔루션뿐만 아니라 전 1~2분에 대한 졌죠. 침전물이 절차에 설명된 단계에 따라 씻어되지 않은 coverslip을 형성한다. <img src="/files/ftp_upload/2089/2089fig1b.jpg" alt="그림 1b" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1B"> 그림 1B. 적절히 coverslip 세탁. APTMS의 다음 또한이 coverslip는 글루 타 알데히드 솔루션뿐만 아니라 전 세 번 십분마다 세탁했습니다. 아무도 침전은 coverslip에 형성하지 않습니다. <img src="/files/ftp_upload/2089/2089fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 강성 변화.의 hydrogels에 대한 세포의 형태 MEFs가 9시간에 대한 높거나 낮은 강성의 fibronectin - 코팅 hydrogels에 씨앗을 품고 있었다 설립. 잠복기에 따라, 세포는 고정 per​​meabilized 및 F - 굴지에 바인딩 FITC - phalloidin 물들일되었습니다. 높은 강성 젤에 MEFs 낮은 강성 hydrogels에 씨뿌린 사람에 비해 스트레스 섬유를 전시하고 잘 확산됩니다. 스케일 바 = 50μm. <img src="/files/ftp_upload/2089/2089fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. 마우스 cyclin의 D1의 mRNA 수준의 대표 양적 PCR 결과. 세럼 굶주린 생쥐 배아 섬유아 세포가 높은 (3 % 아크릴 아미드) 또는 낮은 (0.3 % 아크릴 아미드) 강성 hydrogels에 도금 9 시간 10 % FBS와 자극했다. RNA 추출 다음, 실시간 정량 PCR 분석은 cyclin D1의 mRNA의 수준 (18S RNA에 정규화)을 수행했습니다. G0가 정지 세포에서 cyclin D1의의 mRNA를 나타냅니다. Cyclin D1의 mRNA의 수준이 뻣뻣한 hydrogels에 아니지만 부드러운 hy​​drogels을 크게 향상시킬 수 있습니다. SD 중복 PCR 반응의 - 데이터 + /을 의미합니다.

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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

히드로겔 중합 과정의 중요한 요소는 세포가 아니라 ECM - 코팅 히드로겔 자체보다 유리 coverslip에 바인딩 수 있도록 공기 방울 형성​​을 방지하는 것입니다. 이것은 vortexing 시각도 기포가 젤에 갇혀가 없습니다 중일 후 신중하게 중합 솔루션을 pipetting하여 예방할 수 있습니다. 우리는 항상 실험에 대한 충분한 발생시키기 위해 추가 &quot;반응&quot;coverslips 및 hydrogels을 준비하는 것이 좋습니다. 젤은 PBS로 씻은 때마다 특별한 관심을 지불하여야한다. 흡입 프로세스가 잡아서 찢어진 수 있으므로 히드로겔 자체와 긴밀한 접촉을 피해야합니다. perturbing hydrogels없이 액체를 대기음하는 가장 안전한 방법은 suctioning 동안 접시는 힌트를주고있다. 그것은 완전히 수준 hydrogels를 얻는 열심히하고, 히드로겔 두께의 미세한 차이가 힘들보기의 필드를 통해 이...

<table><tbody><tr><td>Glutaraldehyde, 70%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7776</td><td>-20&amp;#x00B0;C에서 보관</td></tr><tr><td>3-APTMS (3-Aminopropyltrimethosysilane 97%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>281778</td><td>실온 보관</td></tr><tr><td>SurfaSil Siliconizing Fluid</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>42800</td><td>실온 보관</td></tr><tr><td>NHS (N-hydroxysucinimide Ester)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-8060</td><td>4&amp;#x00B0;C에서 보관, 매월 교체</td></tr><tr><td>Albumin, bovine serum, essentially fatty acid free</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6003-100G</td><td>4&amp;#x00B0;C에서 보관</td></tr><tr><td>커버슬립 (25mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-86 25 Cir 1D</td><td></td></tr><tr><td>커버슬립 (18mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-84 18 Cir 1D</td><td></td></tr></tbody></table>

아크릴 아미드 기반 hydrogels을 사용하여 세포 기능에 매트릭스 강성의 영향을 공부

Studying the Effects of Matrix Stiffness on Cellular Function using Acrylamide-based Hydrogels

조직 강성은 세포 기능의 중요한 결정자이며, 조직 강성의 변화는 일반적으로 섬유증, 암 및 심장 혈관 질환 1-11와 관련된 있습니다. 세포 기능을 공부하기 위해 전통적인 세포 생물 학적 접근은 탄성 ECM 또는 조직 사이의 ECM의 강성의 변화의 영향에 대해 설명할 수없는 단단한 하층에 culturing 세포를 (플라스틱 요리 또는 유리 coverslips) 포함. 체외에서 생체내 조직 준수 조건 모델에, 우리와 다른 ECM - 코팅 hydrogels을 사용합니다. 우리 연구실에서 hydrogels는 생물학 12 본 조직 compliances의 범위를 모방 수 polyacrylamide를 기반으로합니다. &quot;반응&quot;커버 전표는 3 APTMS의 또한 다음 NaOH와 인큐베이션에 의해 생성됩니다. 글루 타 알데히드는 3 APTMS와 polyacrylamide 젤을 상호 연결하는 데 사용됩니다. 아크릴 아미드 (AC), 비스 - 아크릴 아미드 (BIS - AC)과 암모늄 persulfate의 솔루션은 히드로겔의 중합에 사용됩니다. N - hydroxysuccinimide (NHS)이 히드로겔에 crosslink ECM 단백질에 AC 솔루션에 통합됩니다. 히드로겔의 중합에 따라, 겔 표면은 같은 fibronectin, vitronectin, 콜라겐 등 선택의 ECM 단백질로 코팅되어 히드로겔의 강성은 레올로지 또는 원자 힘 현미경 (AFM)에 의해 결정 및 솔루션 12 AC 및 / 또는 BIS - AC의 비율을 변화하여 조정할 수 있습니다. 이러한 방식으로, 하층의 강성도 레올로지 또는 AFM을 사용하여 계량 수있는 생물 학적 조직의 강성 일치될 수 있습니다. 세포 그런 다음 필요한 실험 조건에 따라 이러한 hydrogels과 교양에 씨앗을하실 수 있습니다. 분자 분석을위한 세포 및 복구의 영상은 간단합니다. 이 기사에 대한, 우리는 20,000 파스칼 &lt;E 분들로 3000 파스칼과 치열한 substrata / 조직&gt; 탄성 moduli (E)를 가지고 그 같은 부드러운 substrata을 정의합니다.

세포 기능에 substrata의 강성의 효과는 모델 수<em&gt; 체외에서</em&gt; compliances 변화의 polyacrylamide의 hydrogels을 사용합니다.

아크릴 아미드 기반 Hydrogels을 사용하여 세포 기능에 매트릭스 강성의 영향을 공부

조직 강도는 세포 기능의 중요한 결정 요인이며, 조직 강도의 변화는 일반적으로 섬유화, 암 및 ...과 관련이 있습니다.

아크릴아마이드 하이드로젤을 사용하여 생체 내 조직 순응도를 모델링합니다. 이는 먼저 반응성 하단 커버 슬립과 실리콘 처리된 상단 커버 슬립을 제작함으로써 수행됩니다. 절차의 두 번째 단계는 아크릴아마이드 하이드로젤을 붓고 생성하는 것입니다.절차의 세 번째 단계는 선택한 세포외 기질 단백질을 하이드로겔에 가교시키는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 세포의 배양 및 분석입니다. 최종적으로 면역형광 현미경, 실시간 정량적 PCR 및 웨스턴 블로팅 분석을 통해 인비트로(in vitro)에서 세포외 기질의 강성 변화가 세포 행동을 어떻게 조절하는지 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.오늘은 아크릴아마이드 하이드로젤의 제조 및 사용 절차를 보여드리겠습니다. 저희 실험실에서는 세포 형태, 세포 신호 전달 및 증식을 조절하는 세포외 기질 강성을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다. 그럼 시작하겠습니다.반응성 커버슬립을 제작하여 이 절차를 시작하십시오. 먼저 150 millimeter 페트리 접시의 하단 절반에 파라필름 층을 배치합니다. 그다음 최대 9개의 오토클레이브 처리된 25 millimeter 커버슬립을 파라필름 위로 옮기고 1 milliliter의 0.1 molar 수산화나트륨으로 덮어줍니다.커버슬립을 3분 동안 배양합니다. 배양 후, 화학 흄후드 내의 진공 라인을 사용하여 수산화나트륨을 흡입 제거합니다. 각 커버슬립에 0.5 milliliters의 3-aminopropyltrimethoxysilane 또는 3-APTMS를 피펫으로 분주합니다. 커버슬립을 3분 동안 배양한 다음 3-APTMS를 흡입 제거합니다. 커버 위에 거품이 형성되는 것을 방지하기 위해 너무 오래 배양하지 않도록 주의하십시오.처리 후의 커버 글라스입니다. 동일한 접시에서 탈이온수 20 milliliters로 커버 글라스를 한 번 헹굽니다. 곡선 핀셋을 사용하여 접시에서 커버 글라스를 꺼내어, 처리된 면이 위를 향하도록 새로운 150 millimeter 접시로 옮깁니다.그런 다음 커버슬립을 탈이온수로 다시 세척하고 로커(rocker) 위에 10분 동안 둡니다. 배양 후, 물을 제거하고 두 번 더 세척합니다. 글루타르알데하이드를 사용하기 10분 전까지 모든 A-P-T-M-S를 제거하는 것이 매우 중요한데, 이는 A-P-T-M-S가 글루타르알데하이드와 반응하여 뿌연 흰색 침전물을 남기는 것을 방지하기 위함입니다.곡선 핀셋을 사용하여 커버슬립을 파라핀이 도포된 깨끗한 접시로 옮기고, 진공 라인을 사용하여 남은 액체를 흡입합니다. 그다음 각 커버슬립이 멸균 탈이온수에 희석된 0.5% glutaraldehyde 0.5 mL로 완전히 덮이도록 하여 APTMS와 polyacrylamide 겔을 가교시킵니다. 화학 흄 후드 내에서 커버슬립을 30분 동안 배양합니다. 그 후 glutaraldehyde 세척액을 흡입하고 커버슬립을 탈이온수로 다시 세척합니다.그런 다음 커버슬립을 완전히 건조시킵니다. 클로로포름에 포함된 10% surface seal 용액이 들어 있는 50 milliliter Falcon 튜브에 새 커버슬립을 넣고 최소 10분 동안 흔들어 줍니다. surface seal 용액을 따라내고 공기 중에서 건조시킵니다.하이드로젤 제작을 시작하기 위해, 생물안전작업대(BSC) 내의 Kim wipes 위에 놓인 커버슬립을 준비합니다. 곡선 핀셋을 사용하여 커버슬립의 반응면이 위로 향하도록 하여 생물안전작업대 표면에 테이프로 고정된 파라폼 시트로 옮깁니다. 커버슬립이 파라폼 표면에 평평하게 놓였는지 확인하십시오.그런 다음, 소량의 NHS를 충분한 양의 toluene에 녹여 saturated hydroxy CIN aide 또는 NHS solution을 toluene으로 준비합니다. 구체적인 실험을 위해, NHS가 더 이상 녹지 않을 때까지 소량의 NHS를 계속해서 첨가합니다. 포화 용액은 보통 탁한 분홍색을 띱니다.다음으로, 원하는 아크릴아마이드 농도에 도달하도록 아크릴아마이드, BIS 아크릴아마이드, 물 및 PS를 준비합니다. 서면 프로토콜에 설명된 대로 시약을 마이크로 튜브에 넣습니다. 그런 다음 한 번에 하나의 분주량씩 추가합니다.NHS와 TM me를 첨가합니다. 튜브를 짧게 볼텍싱한 후, 생물안전작업대 내에서 커버슬립당 140 µL씩 세 개에서 다섯 개의 젤에 즉시 분주합니다. 중합이 시작되기 전에 25 mm 실리콘 처리된 커버슬립을 각 젤 위에 빠르게 덮어줍니다.상단 커버 슬립을 덮어 아크릴아마이드가 하단 커버 슬립을 완전히 덮도록 합니다. 아크릴아마이드가 중합될 때까지 이 샌드위치 구조를 실온에서 배양하여 중합 완료 시점을 확인합니다. 마이크로 원심 분리 튜브에 남은 아크릴아마이드 용액을 확인하십시오.중합 과정은 단단한 젤의 경우 몇 분 정도 소요되며, 부드러운 젤의 경우 시간이 조금 더 걸립니다. 중합이 완료되면 멸균 장갑을 착용한 상태에서 샌드위치 구조물을 조심스럽게 들어 올립니다. 그런 다음 상단 커버 슬립을 중합된 젤 밖으로 걸쳐질 때까지 밀어내어 제거합니다.그런 다음 커버를 들어 올립니다. 겔을 조심스럽게 분리하고 상단 커버 슬립은 폐기합니다. 이후 하이드로겔이라고 명명할 각 바닥 겔 커버 슬립을 6웰 플레이트에 넣습니다.다음으로, 6-웰 플레이트의 웰당 2 mL의 인산 완충 식염수(PBS)를 넣습니다. 그런 다음 하이드로젤을 PBS로 세척하고 로커(rocker) 위에서 5분 동안 배양합니다. 이 세척 과정을 2회 반복합니다.실험을 시작하려면 각 하이드로겔을 2 mL의 피브로넥틴 용액 또는 다른 세포외 기질 단백질로 덮습니다. 단백질이 하이드로겔에 공유 결합할 수 있도록 4 °C에서 하룻밤 동안 배양한 후, ECM 용액을 흡입하여 제거합니다. 그다음, 무혈청 배지 내의 1 mg/mL 열 활성화 지방산 제거 소 혈청 알부민으로 반응하지 않은 NHS를 블로킹하고 37 °C에서 최소 30분 동안 배양합니다.배양 후, 하이드로겔을 멸균된 PBS로 한 번 세척하십시오. 다음으로, 태아 송아지 혈청이 포함된 적절한 배양 배지에 세포를 분주하여 하이드로겔 위에 도말하십시오.확립된 마우스 배아 섬유아세포를 사용합니다. 실험에 필요한 세포의 퍼짐 정도와 합류도(confluence)를 바탕으로 하이드로젤에 파종할 세포 수를 결정합니다. 웨스턴 블롯 및 정량적 PCR 분석에는 약 10⁵개의 세포가 필요합니다.그다음 해당 세포 유형에 적합한 조건에서 세포를 배양합니다. 배양 기간이 끝난 후, 필요에 따라 세포 단백질 또는 mRNA를 추출합니다.실험대 위의 파라폼 시트 위에 용해 버퍼(lysis buffer)를 100 µL씩 떨어뜨리되, 각 방울 사이에 약 2~3 cm의 간격을 둡니다. 그다음, 웰에서 하단 커버 슬립을 들어 올려 각 하이드로젤을 조심스럽게 꺼냅니다. 곡선 핀셋을 사용하여 하이드로젤의 세포 면이 아래로 향하게 하여 버퍼 방울 위에 놓습니다.세포를 용해 버퍼(lysis buffer)와 함께 정확히 1분 동안 배양합니다. 마지막으로, 커버슬립을 제거하고 용해 버퍼를 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 또는 RNA를 추출할 때는 각 하이드로겔을 새로운 6-웰 플레이트로 옮기고 웰당 1 mL의 triazole을 첨가합니다.배양 후 겔을 3분 동안 반응시킵니다. 트리아졸 용액을 제거하여 마이크로 원심분리 튜브에 보관합니다. APTMS 첨가 후 커버슬립을 철저히 세척하는 것은 반응성 커버슬립을 제작하는 데 있어 중요한 단계입니다.적절하게 세척하고 건조시킨 커버슬립에는 침전물 잔여물이 없어야 합니다. APTMS는 글루타르알데히드와 반응하여 흰색의 탁한 침전물을 형성합니다. 침전물이 발생한 경우 커버슬립을 더 이상 사용할 수 없으므로 전체 과정을 반복해야 합니다.하이드로젤 형성 및 ECM 단백질 코팅 후, 세포를 파종하여 하룻밤 동안 배양합니다. 염색 결과에서 볼 수 있듯이, 단단한 하이드로젤과 부드러운 하이드로젤에서 세포가 퍼지는 양상에는 뚜렷한 차이가 있으며, 생쥐 배아 섬유아세포는 부드러운 하이드로젤에 비해 단단한 하이드로젤에서 더 광범위하게 퍼집니다. 실제로 부드러운 하이드로젤에 부착되는 대부분의 세포는 응축된 상태를 유지하며 부착 효율이 떨어집니다.마우스 배아 섬유아세포에서 cycling D one mRNA 수준에 대한 대표적인 정량 PCR 결과는 cycling D one이 강성 매트릭스에서는 유의미하게 상향 조절되지만, 연성 매트릭스에서는 그렇지 않음을 보여줍니다. 이는 매트릭스 강성이 인 비트로(in vitro)에서 세포 주기 진행을 조절한다는 것을 시사합니다. 지금까지 생체 내 생리학적 조건을 모델링하여 강성이 다른 하이드로젤을 생성하는 방법을 보여드렸습니다. 이 절차를 수행할 때는 사고나 오류가 발생할 수 있으므로 추가의 반응성 커버 슬립을 제작하는 것이 중요하다는 점을 기억하시기 바랍니다.이상입니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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이 비디오에서는, 우리는 세포 배양에 적합 규격, 세포외 매트릭스 (ECM) 코팅 기판을 조작하는 데 사용되는 실험 기법을 설명하고, 견인 힘 현미경 의무가 있으며, 세포 행동 ECM의 강성의 영향을 관찰하는.

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상세한 단계별 프로토콜은 다성 성 O9-1 신경 문장 세포및 다양한 강성의 폴리 아크릴아미드 하이드로겔을 사용하여 시험관 내 기계적 신호를 연구하기 위해 여기에 설명되어 있습니다.

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의 유사 분열 유학을위한 Microinjection 기법 Drosophila melanogaster Syncytial 엠브료

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