간단한 폴리 아크릴 아미드 기반 강성 의존 세포 반응의 연구를위한 멀티 웰 강성 분석

이 절차의 전반적인 목표는 멀티웰 플레이트 형식으로 폴리아크릴아마이드 겔을 빠르고 효율적이며 저렴하게 제작하는 것입니다. 이는 먼저 소수성 코팅된 유리 플레이트와 아크릴아마이드 접착제가 도포된 유연한 플라스틱 지지대 사이에 겔 전구체 용액을 샌드위치 형태로 배치함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 중합 시 유연한 플라스틱 지지대에 공유 결합된 겔을 유리 플레이트에서 떼어내어 건조시키는 것입니다.

다음으로, 건조된 겔과 그 아래의 유연한 플라스틱 지지체를 원하는 모양으로 자른 후, 플라스틱 면이 아래로 향하게 하여 멀티웰 플레이트 또는 다른 세포 배양 용기의 웰 바닥에 접착합니다. 마지막 단계는 조립된 폴리아크릴아마이드 겔이 있는 멀티웰 플레이트를 콜라겐 type one 단층과 같은 세포 접착 코팅제로 코팅하는 것입니다. 최종적으로 현미경 관찰 및 기타 세포 특성 분석 기술을 사용하여 하부 폴리아크릴아마이드 기질의 영향을 관찰합니다.

특히, 강성이 세포 거동에 미치는 영향에 주목합니다. 기존 방법 대비 이 방법의 주요 장점은 다른 방법으로는 불가능했던 저비용 및 시간 효율적인 방식으로, 폴리 겔의 모든 강성과 두께를 처리할 수 있을 뿐만 아니라 멀티웰 플레이트 형식으로 조립할 수 있다는 점입니다. 실험 절차 시연은 제 실험실의 학생이 수행할 예정입니다.

먼저 아크릴아마이드, 가교제인 비스-아크릴아마이드, 탈이온수를 혼합하여 폴리아크릴아마이드 겔 전구체 용액을 준비하고, Sul OPA를 디메틸설폭사이드에 50 mg/mL 농도로 용해합니다. 스톡 용액 20 µL를 10개의 마이크로 원심분리 튜브에 각각 분주합니다. 그런 다음 액체 질소에서 용액을 급속 냉동시킨 후 -80 °C에서 보관합니다.

다음으로, 탈이온수에 과황산암모늄을 녹여 최종 과황산암모늄 농도가 10% w/v가 되도록 합니다. 과황산암모늄 용액 25 µL를 10개의 마이크로 원심분리 튜브에 분주하여 -20 °C에서 보관합니다. pH 7.4의 1X PBS에서 콜라겐 type I 스톡 용액을 희석하여 0.2 mg/mL의 콜라겐 용액을 준비합니다.

모든 용액은 사용 전까지 얼음 위에 보관합니다. 이제 유리 플레이트에 소수성 용액을 몇 방울 떨어뜨리고 티슈 페이퍼를 사용하여 표면 전체에 펴 바릅니다. 플레이트를 자연 건조시킨 후, 티슈 페이퍼로 다시 닦아 소수성 코팅을 균일하게 만듭니다.

소수성 코팅 유리 플레이트의 크기에 맞게 유연한 플라스틱 지지체를 자릅니다. 그런 다음, 메스 것과 같은 날카로운 도구로 표면을 가볍게 긁어 유연한 플라스틱 지지체의 소수성 면을 표시합니다. 겔 준비를 위해, 원하는 최종 농도의 poly acrylamide 전구체 용액 4972.5 µL를 50 mL 원추형 튜브에 넣습니다.

캡을 연 상태로 튜브를 탈기 챔버에 30분 동안 둡니다. 그 다음, 최종 ammonium per sulfate 농도가 0.05%가 되도록 이전에 준비한 ammonium per sulfate 용액 25 µL를 DGA 겔 용액에 첨가합니다. 이어 최종 TM ME 농도가 0.5%가 되도록 TM ME 2.5 µL를 첨가합니다. 피펫팅으로 용액을 3~5회 천천히 섞어줍니다. 다음으로, 유연한 플라스틱 지지체의 친수성 쪽에 원하는 두께의 실리콘 스페이서를 배치합니다.

그런 다음 겔 용액을 스페이서 사이의 유연한 플라스틱 지지대 위에 피펫으로 분주하고, 소수성 코팅된 유리 슬라이드로 가볍게 덮어 샌드위치 구조를 만듭니다. 겔을 45분 동안 중합시킨 후, 폴리아크릴아마이드 겔이 공유 결합으로 부착된 유연한 플라스틱 지지대를 떼어내고 겔 면이 위로 향하게 하여 공기 중에 건조시킵니다. 건조가 완료되면 폴리아크릴아마이드 겔을 원하는 모양으로 자릅니다.

제조사의 지침에 따라 96웰 플레이트당 약 500 µL의 polymethyl siloxane을 준비하여 젤을 멀티웰 플레이트 바닥에 접착합니다. 핀셋을 사용하여 각 웰의 중앙에 Polymethyl siloxane을 소량 떨어뜨립니다. 각 웰에 polyacrylamide 젤의 유연한 플라스틱 지지면이 아래로 향하게 하여 배치합니다.

폴리디메틸실록산을 경화시킨 후, 트랜스퍼 피펫을 사용하여 이전에 준비한 셀룰로오스 샘플을 각 웰에 소량씩 넣고 좌우로 흔들어 겔 표면이 고르게 코팅되도록 합니다. 웰 플레이트를 고강도 UV 램프 아래에 5분 동안 둡니다. 완료되면 PBS로 겔을 헹구어 과도한 셀룰로오스를 제거합니다.

이 피펫을 사용하여, 이전에 준비한 collagen Type one 용액 약 50 µL를 각 웰에 분주합니다. 플레이트의 덮개를 닫은 상태로 실온에서 최소 2시간 동안 방치한 후, PBS로 헹구어 과잉 콜라겐 용액을 제거합니다. 조직 배양 후드 내에서 UV 광선으로 겔을 2시간 동안 멸균합니다.

마지막으로 겔을 완전 배지에 하룻밤 동안 담가 수화 및 평형화시킵니다. 세포 안착을 위해 겔을 즉시 사용하거나 냉장고에 최대 2일 동안 보관하십시오. 예상대로 여러 아크릴아마이드 및 bis-아크릴아마이드 농도(각각 A와 B로 표시)에 따른 영률(Young's modulus)의 함수 관계가 여기에 표시되어 있습니다.

저장 탄성률 G'와 손실 탄성률 G''는 모두 주파수와 무관하게 나타났습니다. 또한 겔을 건조시킨 후 재수화시켜도 영률(Young's modulus)에 영향이 없음을 확인하였습니다. 가교제 Sulo sampa를 사용하면 강도에 관계없이 모든 하이드로겔 표면에 균일한 콜라겐 코팅을 구현할 수 있습니다.

유방암 M-D-A-M-B 2 31 세포를 폴리아크릴아마이드 겔에 24시간 동안 배양했을 때, 부드러운 0.5 및 1 kilo pascal 겔에서는 세포가 둥근 형태를 유지했지만, 단단한 100 kilo pascal 겔에서는 세포가 퍼지고 길어지는 것이 관찰되었습니다. 또한, 유연한 플라스틱 지지대 위에 제작된 하이드로겔은 투명하여 시각화 및 현미경 관찰이 용이합니다. 나아가, 유연한 플라스틱 지지대는 자체 형광을 띠지 않으므로 형광 표지된 세포의 이미징을 방해하지 않습니다.

세포 형태는 전체 세포 확장 면적과 세포 원형도 측면에서 추가로 정량화되었습니다. 이 영상을 시청하신 후에는 다공성 플레이트 형식으로 폴리아미드 겔을 얼마나 효율적이고 저렴하게 제작할 수 있는지 충분히 이해하게 될 것입니다. 이는 강성 의존적 세포 생물학 연구를 위한 것입니다.