Name: 간단한 폴리 아크릴 아미드 기반 강성 의존 세포 반응의 연구를위한 멀티 웰 강성 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: 배우세요 폴리아크릴아미드 겔을 멀티웰 플레이트 형식으로 빠르고 효율적으로 제조하는 방법을. 이 기술은 기질 강성에 따른 세포 반응 연구에 활용되며, 특수 장비 없이도 세포 역학 및 생물재료 연구에 적용할 수 있습니다.

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이 연구는 세인트루이스 대학교가 Silviya Zustiak 박사에게 제공한 창업 자금과 세인트루이스 대학교가 Silviya Zustiak 박사에게 수여한 대통령 연구 기금(PRF) 보조금으로 자금을 지원받았습니다. 기술 지원을 제공해 주신 Naveed Ahmed와 Keval Shah에게 감사드립니다.

하이드로 겔 관련 솔루션 및 분취 1. 준비 <ol><li> 폴리 아크릴 아미드 겔 전구체 용액의 제조. <ol><li> 아크릴 아미드 (A)을 혼합하여 폴리 아크릴 아미드 겔 전구체 용액을 준비한다 (V / w 40 %, M은 r에 71.08 g / ㏖), 가교제 비스 아크릴 아미드 (B) (V / w 2 %, M은 154.17 g / mol 인 R), 및 탈 표 1에 규정 된 부피 백분율에서 이온수. 참고 :이 솔루션은 큰 일괄 적으로 준비하고 몇 개월까지 4 ° C에 저장할 수 있습니다. <ol><li> 주의 : 아크릴 아마이드는 흡입 또는 섭취시 독성, 특히 분말 형태로 할 때 : 따라서, 바람직하게는 독성의 위험을 줄이기 위해 / V 솔루션 w 40 %를 사용합니다. 이러한 장갑, 고글, 및 실험실 코트로, 보호 옷을 입고있는 동안 만 처리합니다. 냉장고에 차광, 밀폐 된 용기에 보관할 것 (&lt;23 ° C, 영역을 통풍이 잘되는). </li><li> 주의 : 비스 - 아크릴 아미드, 특히, 흡입하거나 섭취시 유독분말 형 : 따라서, 바람직하게는 독성의 위험을 줄이기 위해 / V 솔루션 w 2 %를 사용합니다. 이러한 장갑, 고글, 및 실험실 코트로, 보호 옷을 입고있는 동안 만 처리합니다. 냉장고 (&lt;4 ° C에서, 환기가 잘되는 장소)에서 차광, 밀폐 된 용기에 보관할 것. </li></ol></li></ol></li><li> 제조 및 N -Sulfosuccinimidyl -6- (4&#39;- 아지도 -2&#39;- 니트로 페닐 아미노) 헥사 노 에이트의 사용량 분취 (설포 SANPAH는 M은 492.40 g / 몰 R). 주의 : 설포 SANPAH 눈에 심한 자극을 일으킴; 장갑과 적절한 보안경 · 안면 보호구로 처리합니다. 스토어 수령시 -20 ° C에서 이전, 분취한다. <ol><li> 설포 - SANPAH를 저장하려면 : 50 ㎎ / ㎖에서 dimethylsulfoxane (DMSO)에 설포 SANPAH을 용해. 튜브 당 20 μl를 50 마이크로 원심 분리기 튜브에 원액을 나누어지는. 드라이 아이스 나 액체 질소에 플래시 동결 -80 ° C에서 저장 (최대 가교제 효율을 유지하기위한 선택 사항이지만 선호 단계). 참고 : 분취 캘리포니아N 수개월 동안 저장 될 수있다. </li><li> 설포 - SANPAH를 사용하려면 : 나누어지는 잠시 해동 및 탈 이온수 480 μL에 희석. 즉시 사용합니다. 설포 SANPAH 물에 빠르게 가수 분해 : 따라서 신속하게 위의 단계를 모두 수행 할주의하십시오. </li></ol></li><li> 과 황산 암모늄 (M R 228.18 g / mol)을 분취의 준비. 참고 :과 황산 암모늄이 눈, 피부, 호흡기에 자극을 일으킴. 취급시 적절한 개인 보호 장비를 착용 할 것. 화학 흄 후드에서과 황산 암모늄 분말을 처리합니다. 건조하고 통풍이 잘되는 곳에 보관 분말. 분취하면, 희석 용액은 작업대에 사용될 수있다. <ol><li> / V w 10 %의 최종 황산 암모늄 농도를 달성하기 위해 증류수에 황산 암모늄을 녹인다. -20 ° C에서 나누어지는 및 저장. 사용하기 직전에 해동. </li></ol></li><li> 콜라겐 타입 I 용액의 조제. <ol><li> 그래서 주식을 희석하여 0.2 ㎎ / ㎖ 콜라겐 솔루션을 준비합니다산도 7.4의 1 배 인산 완충 식염수 (PBS)의 기술인 것. 얼음에 잠시 보관 또는 희석 즉시 사용한다. </li></ol></li></ol> 2. 하이드로 겔 준비 (그림 1 참조) <ol><li> 소수성 유리 슬라이드의 준비. <ol><li> 유리판 상에 소수성 용액의 몇 방울을 넣고 표면을 가로 질러 확산하는 휴지를 사용한다. 공기를 건조 시키과 소수성 코팅을 균일하게 다시 티슈로 닦아냅니다. 참고 : RT에서 가연성 캐비닛에 보관 소수성 솔루션입니다. 취급시 개인 보호 장비를 착용 할 것. 환기가 잘되는 곳에서 작업 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 유연한 플라스틱 지원 준비. <ol><li> 소수성 코팅 된 유리판의 크기에 맞게 유연한 플라스틱 지지체를 잘라. </li><li> 가볍게 같은 메스와 같은 날카로운 도구로 표면을 긁어서 유연한 플라스틱 지원의 소수성 측면을 표시합니다. 참고 : 젤 번 - 완전히 투명 - 마를스크래치 마크는가요 성 플라스틱 지지체 측을 포함하는 겔을 구별 할 수 있도록한다. 참고 : 유연한 플라스틱 지원은 소수성과 친수성 ​​측면이있다. 일단 침착, 폴리 아크릴 아미드가 영구적으로 쉽게 이후의 하이드로 겔 처리를 용이하게 플라스틱 지원의 친수성 ​​측면을 준수합니다. </li></ol></li><li> 젤 제조 예 (실시 예 5 ㎖ 볼륨 겔 전구체 용액 주어진다). 주 : 겔 초기 두께가 0.5 mm 인 경우는 5 ~ 40 ㎖의 겔을 제조하기에 충분하다. 겔 두께가 감소하는 경우는 겔을 제조 할 수있다. <ol><li> 50 ML 원뿔 튜브에 원하는 최종 농도 (표 1)의 폴리 아크릴 아미드 전구체 용액의 4972.5 μl를 놓습니다. 열린 캡 30 분 동안 탈 가스 챔버에 배치합니다. 주 : 산소 자유 라디칼 트랩으로서 작용하며, 본, 그것을 중합을 억제한다. </li><li> 과 황산 암모늄의 v / w 10 %의 25 μl를 추가 최종를 달성하기 위해 (1.3 포인트 참조)0.05 %의 황산 암모늄 농도. </li><li> N, N, N &#39;, N&#39;- 테트라 메틸 에틸렌 2.5 μl를 추가 0.5 % TEMED 최종 농도를 달성하기 위해 탈기 겔 용액 (TEMED, M은 116.24 g / 몰 R). 참고 : 저장 TEMED 실온에서 가연성 캐비닛. 적절한 개인 보호 장비를 착용 할 때 화학 흄 후드 취급 할 것. 이 높은 공기와 습기 민감로 단단히 불활성 가스 하에서 닫아 보관할 것. </li><li> 5 회 - 아래 3을 피펫 팅에 의해 부드럽게 솔루션을 섞는다. 겔 전구체 용액에 산소 확산을 피하기 위해 와동 마십시오. </li><li> 소수성 코팅 된 유리 슬라이드와 유연한 플라스틱 지원 및 샌드위치의 친수성면에 겔 용액을 피펫. 원하는 두께 (예를 들면, 0.5 mm)의 실리콘 스페이서 두 개의 슬라이드를 분리합니다. 겔화의 지표로서 사용하는 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 폴리머 전구체 용액을 소량 (~ 100 μL)를 떠난다. 참고 :상관 스페이서가 사용될 수있다. 120 μm의 - 예를 들어, 파라 필름의 하나의 스트립 (100)의 최종 두께 팽윤 된 겔을 준다. </li><li> 중합시에도 하이드로 겔 표면을 확인하기 위해 유연한 플라스틱 지원 / 젤 샌드위치 꼭대기 다른 유리 접시를 놓습니다. </li><li> 원하는 경우에 더 적은 시간이 더 높은 중량 %의 겔에 사용될 수 있지만, 겔, 45 분 동안 중합하자. 겔 중합 된 것을 확인하기 위해, 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 남은 용액을 관찰; 나머지 용액을 겔화 한 경우, 그때는 유리판뿐만 아니라, 겔화 개시되었음을 보인다. 그러나, 몰드의 개방 완료 조기 중합을 방지 할 수 있습니다. </li><li> 겔이 형성되면, 상부에 공유 적으로 부착 된 폴리 아크릴 아미드 겔로가요 성 플라스틱 지지체를 박리하고, 자연 건조 겔 - 측 업을 설정한다. 주 : 대류 나 가열 건조는이 공정을 촉진시킬 수있다. 가요 성 플라스틱 지지체 상에 건조 후, 겔 저장소 일 수있다무기한 거라고. <ol><li> 폴리 아크릴 아마이드 젤이 거품으로 인해 형성하지 않은 유연한 플라스틱 지원의 벌거 벗은 반점을 표시합니다. 젤은 건조되면이 유연한 플라스틱 지원 조화 ​​것으로 표시 겔 여전히 수화된다. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. 멀티 웰 플레이트 조립, 콜라겐 코팅 및 살균 <ol><li> 멀티 웰 플레이트 어셈블리. <ol><li> 건조되면, 원하는 모양으로 PA 젤을 잘라. <ol><li> 96- 웰 플레이트를 들어, ~ 6mm 직경의 대형 구멍 펀치를 사용한다. 정사각형 또는 직사각형 모양으로 젤을 잘라 대형 종이 커터를 사용합니다. 또한, 가위를 사용합니다. </li></ol></li><li> 제조업체의 지침에 따라 96 웰 플레이트 당 PDMS의 약 500 μl를 준비합니다. 멀티 웰 플레이트의 바닥에 겔 아교, 각 웰의 중앙에 작은 물방울은 폴리 디메틸 실록산 (PDMS)의 (~ 5 μL)를 올려. 집게를 사용하면, 하나의 폴리 아크릴 아미드를 배치아래 각 웰, 유연한 플라스틱 지원 측면에서 전자 젤. PDMS는, 치료 4 시간의 최소 37 ° C에서 조립 판을 떠날 수 있도록합니다. </li></ol></li><li> 폴리 아크릴 아마이드 겔의 콜라겐 코팅. <ol><li> 전송 피펫으로 소량의 배치 - 설포 - SANPAH (7 8 μl를) 겔 표면에 균일하게 코팅 좌우로 잘 소용돌이 각 (1.2.2를 가리 키도록 참조). 설포 - SANPAH 물 안정되지 않기 때문에 신속하게 작업 할 수 있습니다. </li><li> 5 분 - (365 nm의 강도 = 37 mW의 λ = 302) 고강도 UV 램프에서 잘 플레이트를 놓습니다. 초과 설포 SANPAH을 제거하기 위해 PBS와 젤을 씻어. </li><li> 50 μL 0.2 mg을 피펫 / ㎖ 콜라겐 유형 I 솔루션을 각 웰에 (1.4 포인트 참조). 4 ℃에서 적어도 2 시간 또는 O / N RT에서 커버 플레이트를 남겨주세요. 주 : 콜라겐 코팅 프로세스 속도, 전송 피펫은 콜라겐 용액을 부가하는데 사용될 수있다. 일반적으로, 1 - 시액 2 방울을 완료하기에 충분합니다LY는 겔 표면을 커버. </li><li> 콜라겐 결합을 가능하도록 적어도 2 시간 동안 RT에서 웰 플레이트를 남겨. </li><li> 2 시간 동안 조직 배양 후드에서 과도한 콜라겐 용액을 제거하고, UV (λ = 200 ㎚) 하에서 멸균 PBS로 씻어. </li><li> 수분과 평형을 O / N (중간 컴포지션 4.1 절 참조) 완전한 매체에 젤을 만끽. 셀은 최대 2 일 동안 냉장고에 바로 저장하거나 시드에 사용합니다. </li></ol></li></ol> PA 강성 분석 4. 셀 시드 음표 : 공통 포유류 세포주 전형적인 있지만,이 섹션에 설명 된 프로토콜을 구체적 유방암 MDA-MB-231 세포주와 함께 사용된다 (도 4 및 5 참조). <ol><li> 37 ° C에서 5 분 동안 5 % 트립신 / EDTA에 노출 조직 배양 플라스크로부터 세포를 수집한다. 문화 플라스크 영역의 각 cm 2 당 트립신 / EDTA의 ~ 80 μl를 사용; 예를 들면, fo를 트립신 / EDTA 2 ㎖를 사용하여라 T25 세포 배양 플라스크. 다시 일시 원하는 최종 세포 농도로 10 % 소 태아 혈청 (FBS) 및 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신이 보충 된 완전 배지에 세포를 수집. 계정 배가 시간 셀뿐만 아니라 세포 분석법에 접종 될 시간의 길이를 고려하여 적절한 서브 - 융합 세포 농도를 선택한다. 추가 매체가 완전히 하이드로 겔 잠수함 충분히 있는지 확인하십시오. 참고 : 하이드로 겔이 매체에 미리 평형 되었기 때문에 충분해야 100 μL 볼륨 (3.2.6 단계를 참조하십시오). 젤 이전 단계에서 언론에 사전 평형 되었기 때문에 멀티 웰 플레이트에 사용되는 일반적인 매체 볼륨은 충분합니다. 주 : 분석은 첨부 파일에 의존하는 세포 유형에 적합한 것입니다. <ol><li> hemacytometer를 사용하여 반전 현미경 세포 수를 계산. 로드 (10) 각각의 포트에 hemacytometer 세포 현탁액 μL 및 적어도 8 사분면에서 세포 수의 평균. 를 얻으려면최종 세포 농도가 10 (4)에 의해 세포 수를 곱한다. 참고 : 각 hemacytometer 사분면에 휴대폰 번호가 20 인 경우 최저 세포 수의 결과를 얻을 수있다 - (50). </li></ol></li><li> 문화 37 ° C에서 가습 인큐베이터에서 PA 강성 분석 상 세포와 5 % CO 2. 3 일 - 매 2 미디어를 변경합니다. 5 분 동안 37 ° C에서 5 % 트립신 / EDTA에 노출 됨으로써 필요할 때 세포를 수집한다. 조직 배양 플라스크의 cm 2 당 트립신 / EDTA의 ~ 80 μl를 사용합니다. 약간 옆으로 멀티 웰 플레이트 팁과 하이드로 겔을 터치 반대로, 잘 각각의 측면 벽에 피펫 팁을 터치하여 흡인 또는 피펫 매체 : 모든 세포 조작 단계 동안, 특별한 하이드로 겔 표면을 방해하지 않도록주의하십시오. 주 : 표준 조직 배양 처리 동안 하이드로 겔의 표면을 손상하지 않도록 특별한주의하면서 제외한 세포들은 시딩에 것처럼 강성 분석법 동일한 방식으로 조작 할 수있는 상으로 접종일반 멀티 웰 플레이트. </li></ol> PA 강성 분석에 시드 세포의 5. 이미징 <ol><li> 직접 PA 강성 분석에 이미지 세포. 주 : 상관 현미경 - 반전, 형광 또는 공 촛점은 세포 이미징을 위해 사용될 수있다. 주 : 강성 분석법을 구성하는 데 사용되는가요 성 플라스틱 지지체는 완전히 투명하며 autofluoresce 또는 세포 이미징을 방해하지 않는다. 그러나,가요 성 플라스틱 지지체 자체가 투명한 경우에도, 결상 성능이 목표의 작동 거리에 의해 제한 될 것이다. 가요 성 플라스틱 지지체는 급격히 감소에 대해 높은 배율, 0.23 mm의 두께 및 10X 대물 렌즈의 작동 거리 전형적인 ~ 4mm 인을 갖는다. <ol><li> 라이브 세포 이미징의 경우, 현미경 플레이트 홀더와 이미지의 위치 PA 강성 분석. 2 시간에서 영상 세션을 유지, 이상 이미징 회 환경 챔버가 장착 된 현미경을 사용합니다. </li><li> 때 살아있는 세포 메신저노화 목표 아니다, 0.1 %의 세제를 보충 4 % 포름 알데히드 용액에 세포를 고정합니다. 2 시간 이상 동안 실온에서 세포를 고정액에 담근다. PBS로 2 회 씻어. 지정 폐기물 용기에 정착 폐기물을 폐기하십시오. 참고 : 세포는 즉시 이미지를 만들 수 있습니다 또는 최대 2 주 동안 4 ° C에서 PBS에 빠져들 저장됩니다. 주의 : 포름 알데히드는 흡입 및 접촉시 독성. 화학 흄 후드 장갑으로 처리합니다. 주 : 특정 고정 제는 일부 세포 단백질을 손상하기 때문에 세포 정착 프로토콜은 후속하는 세포 염색 및 처리 프로토콜에 기초하여 선택되어야한다. </li><li> 형광 이미징의 경우, 얼룩은 멀티 웰 플레이트에서 직접 원하는 셀 얼룩 세포를 고정. 이미지 즉시. </li></ol></li></ol>

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원래 개발 된 전기 영동 겔은 폴리 아크릴 아미드, (28)은 현재 일상적으로 세포 형태, 운동성 및 다른 전지 특성 간의 통신 3,24,29 기판에 강성의 영향을 연구하는 세포 배양 용 기재로서 사용된다. (그림 2, 표 1도 참조 17,25,26 참조) 고분자 전구체 농도의 간단한 변화 - (300 kPa의 0.3) (1) 폴리 아크릴 아미드는 기판 강성의 조작은 신체의 모든 연부 조직의 강성을 포함 할 수 있습니다. PA 겔은 비교적 저렴​​하고 제조하기 간단하다는 사실에 결합 그들은 강성 - 의존성 세포 - 물질 상호 작용의 연구에서 불가결 플랫폼되었다. 간단한 작업에도 불구 그러나, PA 겔을 제조하는 현재의 기술은 작은 배치로 제한된다. 이 제한은 황산 암모늄에 의해 촉매 자유 라디칼 중합이다 하이드로 겔의 겔화 특성, 유래반응은 자유 라디칼 중합 연쇄이므로 및 TEMED. 30, 그것은 ...

몸에있는 대부분의 조직은 1 ~ 조달 협정 계수가 0.1 kPa 내지 부드러운 연골 100 kPa의 뇌, 아직, 체외 세포 연구에서 대부분의 조직 배양 폴리스티렌 (TCP)에 실시에 대한 범위의 탄성 계수와 부드러운 점탄성 물질이다 . 1이 강성 불일치가 크게 세포가 자신의 환경에 반응하는 방식에 영향을 미친다. 연구 성장 본체, 2,3- 줄기 세포를 포함. 그 결과 4 다양한 세포 유형의 운명에 기판의 강성의 영향을 밝히기에 따라서 전용 인 다중 하이드로 겔 강성 - 의존성 세포의 이해를 돕기 위하여 개발되어왔다 기판 강성 세포 운명에 상당한 영향을 미치고 있다는 증거가 증가하고 있지만, 폴리 아크릴 아미드 (PA), 5-7, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 8,9 디메틸 실록산 (PDMS), (10) 및 알긴산 포함한 생물학. 11, 가장 연구가 실시되고 (S)의 수가 적은 소규모불가능한 명령어. 세포 유형 또는 환경 조건이 드물다의 배열을위한 기판 강성의 효과에 대한 체계적, 다차원 연구. (12) 몇몇 유망 높은 처리량 하이드로 겔 기술은 PEG 계 마이크로 어레이, 강성 마이크로로드의 직경 및 높이에 의해 변조되고, 아가 로스 겔 마이크로 비드 (14) 또는 마이크로 및 나노로드의 제조를위한 (13)의 마이크로 유체 장치를 포함하여, 개발되어있다. (15) 그러나 , 기술은 기판 정교하고 실험실의 수가 제한되어 있습니다 제조한다. 강도 변조 된 세포 반응을 포함하는 많은 연구가 구현뿐만 아니라, 영률, 즉 0.3의 생리 학적으로 중요한 범위 발휘할 만 저렴하고 간단하지 않은 폴리 아크릴 아미드 (PA) 겔 이용한다 -. 300 kPa로를 16-22 그러나 PA를 제조하는 방법을 기존 세포 배양 젤은 노동 집약적 결과적으로 준비하다작은 일괄 ared. 세포 기질로서 PA 겔의 제조와 관련된 문제의 일부가 겔을 제조 할 필요가 요구 유래한다 : 1) 산소의 부재하에 완전한 중합을 허용하기 위해, 2) 평활 한 표면과 균일 한 셀을 허용 부착 및 확산, 3) 부동 영구적 방지 세포 배양 접시의 바닥에 부착. 몇몇 그룹은 대형 일괄 적으로 세포 배양을위한 PA 젤을 생산하려고했습니다. 셈러 등. 홀 펀치 후 &quot;컷&quot;이었고, 96 웰 플레이트에 배치 PA 젤의 준비 두께의 시트. (23) 그러나이 방법은 엄격한 젤, 즉,&gt; 1 kPa의 영률, 부드러워로 제한됩니다 젤은 삭재하고 쉽게 손상 &quot;끈적 끈적한&quot;입니다. MIH가 외. 겔 직접 유리 바닥 멀티 웰 플레이트에서 중합 될 수 있도록 더 정교한 기술을 개발 하였다. <s최대&gt; (6)이 작용 유리 바닥 판에 겔 솔루션을 따르고 사용자 정의 커버 글라스 배열로 &quot;를 사이에두고&quot;에 의해 겔을 형성함으로써 달성되었다. 6 비록 매우 유망한, 약간의 가장자리 효과는 아직이 기술로 관찰되었다. 또한,이 기술은 많은 실험실뿐만 아니라 비용이 많이 드는 유리 바닥 멀티 웰 플레이트에 즉시 액세스 할 수없는 맞춤 설계 배열이 필요합니다. 이 논문은 쉽게 실험실에 의해 채택 될 수있는 멀티 웰 플레이트에서 PA 젤을 조립하는 간단하고 저렴한 방법을 설명합니다. 구충제는 PA 젤에있는 소수성 하나, 및 공유 증착에 PA 젤을 결합하는 친수성 ​​하나, - 여기, 유연한 플라스틱 지원은 두 가지 측면이있는, 사용된다. PA 겔 시트는가요 성 플라스틱 지지체에 부착 된 영구 증착이 된 후, 임의의 두께 나 강성의 겔을 처리하고 임의의 바람직한 형태로 절단 가능하게한다. 이 APPRoach는 PA 결합 액으로, 커버 글라스 또는 비용이 많이 드는 유리 바닥 멀티 웰 플레이트의 우물를 달리 상업적으로 사용할 수없는 크기의 사용자 정의 플라스틱 &#39;된 커버&#39;를 생산하고, 또한 유리 표면 - 치료의 사전 할 필요성을 미연에 방지뿐만 아니라 지루하고 시간 소모적 인 단계를 포함한다. 마지막으로, 균일 PA 겔 시트를 큰 배치로 제조하고, 몇 달 동안 탈 수화 저장 될 수있다. 요약하면, 여기에 제시된 분석은 몇 가지 측면에서 기존의 방법에 비해 개선이다. 첫째, 멀티 웰 플레이트 조립체의 프로세스는 효율적이고, 요구되는 물질의 총 비용은 낮다. 둘째, 하이드로 겔은 하나의 균질 한 겔 필름에 큰 일괄 적으로 생산된다. 마지막으로, 상업적으로 사용할 수있는 유일한 재료가 필요합니다. 분석의 유틸리티는 세포 형태에 강성 기판의 효과를 탐구하고 확산 영역으로 도시된다.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagents</td></tr><tr><td>40% 아크릴아미드</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0140</td><td></td></tr><tr><td>2% 비스-아크릴아미드</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0142</td><td></td></tr><tr><td>과황산암모늄</td><td>Bio-Rad</td><td>161-07000</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-SANPAH</td><td>Thermo Scientific</td><td>22589</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐 타입 1, 쥐 꼬리에서, 3.68 mg/ml</td><td>BD Biosciences</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP231-100</td><td></td></tr><tr><td>소수성 용액 &#8212; Repel Silane</td><td>GE Healthcare Bio-Sciences</td><td>17-1332-01</td><td></td></tr><tr><td>PBS (1x), pH 7.4</td><td>HyClone</td><td>SH30256.01</td><td></td></tr><tr><td>Polydimehylsiloxane (PDMS) [Slygard 182 Elastomer Kit]</td><td>Elsworth Adhesives</td><td>3097358-1004</td><td></td></tr><tr><td>Tyrpsin/EDTA (10x)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>44174</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 Medium (1x)</td><td>HyClone</td><td>SH30027-02</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>HyClone</td><td>SH30073-03</td><td></td></tr><tr><td>페니실린 스트렙토마이신</td><td>MP 바이오메디컬</td><td>1670046</td><td></td></tr><tr><td>세제: Triton-X</td><td>시그마 Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>포름알데히드 37% 용액</td><td>시그마 Aldrich</td><td>F1635</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민(BSA)</td><td>시그마 Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>BSA 기반 세포 접착 차단 키트 &#8212; ECM 세포 접착 어레이 키트</td><td>Chemicon International</td><td>ECM540</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">일회용 실험실 장비</td></tr><tr><td>flexible 플라스틱 지지대 &#8212; 폴리아크릴아미드 겔용 GelBond PAG 필름</td><td>GE Healthcare Bio-Sciences</td><td>309819</td><td></td></tr><tr><td>유리판</td><td>슬럼피</td><td>GBS4100SFSL</td><td></td></tr><tr><td>50ml 원뿔형 튜브</td><td>Fisher Scientific</td><td>3181345107</td><td></td></tr><tr><td>15ml 원뿔형 튜브</td><td>FALCON</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기 튜브</td><td>Fisher Scientific</td><td>2ml: 02681258</td><td></td></tr><tr><td>96웰 플레이트 (평평한 바닥)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12565501</td><td></td></tr><tr><td>일회용 피펫(1&nbsp; ml, 2&nbsp; ml, 5&nbsp; ml, 10&nbsp; ml, 25&nbsp; ml, 50&nbsp; ml)</td><td>Fisher Scientific</td><td>1 ml: 13-678-11B, 2&nbsp; ml: 05214038, 5&nbsp; ml (팔콘) : 357529, 10&nbsp; ml: 13-678-11E, 25&nbsp; ML: 13-678-11, 50&nbsp; ml: 13-678-11F</td><td></td></tr><tr><td>유리 전사 피펫</td><td>Fisher Scientific</td><td>5 3/4": 1367820A, 9":136786B</td><td></td></tr><tr><td>피펫 팁 (1-200&nbsp; &#956; 엘, 101-1000&nbsp; &#956; l)</td><td>Fisher Scientific</td><td>2707509</td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 표준 일회용 전송 피펫</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-9D</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>PARAFILM&nbsp;</td><td>PM992</td><td></td></tr><tr><td>파우더 프리 검사 장갑</td><td>Quest</td><td>92897</td><td></td></tr><tr><td>실리콘 스페이서 &#8212; 실리콘 시트, 0.5mm 두께/13cm x 18cm</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>JTR-S-0.5</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Large/Non-posable lab equipment</td></tr><tr><td>Light and Fluescent Microscope (Axiovert 200M)</td><td>Zeiss</td><td>3820005619</td><td></td></tr><tr><td>현미경 소프트웨어</td><td>Zeiss</td><td>AxioVision Rel. 4.8.2</td><td></td></tr><tr><td>UV 오븐</td><td>UVITRON</td><td>UV1080</td><td></td></tr><tr><td>진공 챔버/탈기 장치</td><td>BelArt</td><td>999320237</td><td></td></tr><tr><td>탈기 장치용 진공 펌프</td><td>KNF Lab</td><td>5097482</td><td></td></tr><tr><td>조직 배양 후드</td><td>NUAIRE</td><td>NU-425-600</td><td></td></tr><tr><td>화학 흄 후드</td><td>KEWAUNEE</td><td>99151</td><td></td></tr><tr><td>도립 현미경(Axiovert 25)</td><td>Zeiss</td><td>663526</td><td></td></tr><tr><td>인큐베이터</td><td>NUAIRE</td><td>NU-8500</td><td></td></tr><tr><td>피펫 에이드</td><td>Drummond Scientific Co.</td><td>P-76864</td><td></td></tr><tr><td>혈구계</td><td>Bright-Line</td><td>383684</td><td></td></tr></tbody></table>

간단한 폴리 아크릴 아미드 기반 강성 의존 세포 반응의 연구를위한 멀티 웰 강성 분석

Simple Polyacrylamide-based Multiwell Stiffness Assay for the Study of Stiffness-dependent Cell Responses

현재 대부분의 체외 세포 연구는 경질 조직 배양 폴리스티렌(~1 GPa)에서 수행되는 반면, 신체의 대부분의 세포는 탄력 있고 훨씬 부드러운 매트릭스(0.1 – 100 kPa)에 부착되어 있습니다. 이러한 강성 불일치는 세포 반응에 큰 영향을 미치기 때문에 세포 기질로 사용되는 광범위한 강성을 포괄하는 하이드로겔 물질을 개발하는 데 큰 관심이 있습니다. 폴리아크릴아미드 겔은 저렴하고 신체의 모든 연조직의 뻣뻣함 범위를 커버하며 많은 연구 그룹에서 선택하는 하이드로겔입니다. 그러나 폴리아크릴아미드 겔 제제는 길고 지루하며 소량 배치에만 적합합니다. 여기에서는 영구적이고 유연한 플라스틱 필름을 겔의 구조적 지지체로 활용하여 멀티웰 플레이트 형식의 폴리아크릴아미드 겔을 제조할 수 있는 분석에 대해 설명합니다. 이 기술은 현재 방법보다 빠르고 효율적이며 비용이 적게 들며 다른 방법으로는 사용할 수 없는 맞춤형 크기의 겔을 준비할 수 있습니다. 특수 장비가 필요하지 않기 때문에 이 방법은 모든 연구 실험실에서 쉽게 채택할 수 있으며 강성 의존적 세포 반응을 이해하는 데 중점을 둔 연구에 특히 유용할 것입니다.

폴리 아크릴 아미드 (PA) 하이드로 겔 널리 강성 - 의존성 세포 반응을 테스트하는 데 사용된다. 17,24을 아크릴 아미드 (A), 비스 - 아크릴 아미드 (B) 중 하나는 가장 연조직 강성 범위에 걸쳐 PA 겔을 만들 수있는 다양한 농도의 혼합함으로써 몸 - 0.3 -.. 여기에 300 kPa의 탄성 계수 (1) 그러나, 폴리 아크릴 아마이드 겔의 준비 지루한 시간이 종종 예를 들어 약물 스크리닝으로 &quot;높은 처리량&quot;애플리케이션의 유용성을 제한, 소모 (12), 간단하고 빠른 방법 (도 1) 제시된 멀티 웰 플레이트에서 PA 겔 또는 임의의 다른 바람직한 조직 배양 용기된다 조립.도 2a는 몇몇과 B 농도의 함수 (또한, 표 1에 요약)로서 영률을 나타낸다. 추가적인 B와 조합 계수는 문헌에보고되어있다. 17,25,26 완전히 swolle...

여기에서는 멀티웰 플레이트 형식의 폴리아크릴아미드 겔을 빠르고 효율적이며 저렴하게 준비할 수 있는 방법에 대해 설명합니다. 이 방법은 특수 장비가 필요하지 않으며 모든 연구 실험실에서 쉽게 채택할 수 있습니다. 경직성 의존적 세포 반응을 이해하는 데 중점을 둔 연구에 특히 유용할 것입니다.

Currently, most of the in vitro cell research is performed on rigid tissue culture polystyrene (~1 GPa), while most cells in the body are attached to a ...

이 절차의 전반적인 목표는 멀티웰 플레이트 형식으로 폴리아크릴아마이드 겔을 빠르고 효율적이며 저렴하게 제작하는 것입니다. 이는 먼저 소수성 코팅된 유리 플레이트와 아크릴아마이드 접착제가 도포된 유연한 플라스틱 지지대 사이에 겔 전구체 용액을 샌드위치 형태로 배치함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 중합 시 유연한 플라스틱 지지대에 공유 결합된 겔을 유리 플레이트에서 떼어내어 건조시키는 것입니다.다음으로, 건조된 겔과 그 아래의 유연한 플라스틱 지지체를 원하는 모양으로 자른 후, 플라스틱 면이 아래로 향하게 하여 멀티웰 플레이트 또는 다른 세포 배양 용기의 웰 바닥에 접착합니다. 마지막 단계는 조립된 폴리아크릴아마이드 겔이 있는 멀티웰 플레이트를 콜라겐 type one 단층과 같은 세포 접착 코팅제로 코팅하는 것입니다. 최종적으로 현미경 관찰 및 기타 세포 특성 분석 기술을 사용하여 하부 폴리아크릴아마이드 기질의 영향을 관찰합니다.특히, 강성이 세포 거동에 미치는 영향에 주목합니다. 기존 방법 대비 이 방법의 주요 장점은 다른 방법으로는 불가능했던 저비용 및 시간 효율적인 방식으로, 폴리 겔의 모든 강성과 두께를 처리할 수 있을 뿐만 아니라 멀티웰 플레이트 형식으로 조립할 수 있다는 점입니다. 실험 절차 시연은 제 실험실의 학생이 수행할 예정입니다.먼저 아크릴아마이드, 가교제인 비스-아크릴아마이드, 탈이온수를 혼합하여 폴리아크릴아마이드 겔 전구체 용액을 준비하고, Sul OPA를 디메틸설폭사이드에 50 mg/mL 농도로 용해합니다. 스톡 용액 20 µL를 10개의 마이크로 원심분리 튜브에 각각 분주합니다. 그런 다음 액체 질소에서 용액을 급속 냉동시킨 후 -80 °C에서 보관합니다.다음으로, 탈이온수에 과황산암모늄을 녹여 최종 과황산암모늄 농도가 10% w/v가 되도록 합니다. 과황산암모늄 용액 25 µL를 10개의 마이크로 원심분리 튜브에 분주하여 -20 °C에서 보관합니다. pH 7.4의 1X PBS에서 콜라겐 type I 스톡 용액을 희석하여 0.2 mg/mL의 콜라겐 용액을 준비합니다.모든 용액은 사용 전까지 얼음 위에 보관합니다. 이제 유리 플레이트에 소수성 용액을 몇 방울 떨어뜨리고 티슈 페이퍼를 사용하여 표면 전체에 펴 바릅니다. 플레이트를 자연 건조시킨 후, 티슈 페이퍼로 다시 닦아 소수성 코팅을 균일하게 만듭니다.소수성 코팅 유리 플레이트의 크기에 맞게 유연한 플라스틱 지지체를 자릅니다. 그런 다음, 메스 것과 같은 날카로운 도구로 표면을 가볍게 긁어 유연한 플라스틱 지지체의 소수성 면을 표시합니다. 겔 준비를 위해, 원하는 최종 농도의 poly acrylamide 전구체 용액 4972.5 µL를 50 mL 원추형 튜브에 넣습니다.캡을 연 상태로 튜브를 탈기 챔버에 30분 동안 둡니다. 그 다음, 최종 ammonium per sulfate 농도가 0.05%가 되도록 이전에 준비한 ammonium per sulfate 용액 25 µL를 DGA 겔 용액에 첨가합니다. 이어 최종 TM ME 농도가 0.5%가 되도록 TM ME 2.5 µL를 첨가합니다. 피펫팅으로 용액을 3~5회 천천히 섞어줍니다. 다음으로, 유연한 플라스틱 지지체의 친수성 쪽에 원하는 두께의 실리콘 스페이서를 배치합니다.그런 다음 겔 용액을 스페이서 사이의 유연한 플라스틱 지지대 위에 피펫으로 분주하고, 소수성 코팅된 유리 슬라이드로 가볍게 덮어 샌드위치 구조를 만듭니다. 겔을 45분 동안 중합시킨 후, 폴리아크릴아마이드 겔이 공유 결합으로 부착된 유연한 플라스틱 지지대를 떼어내고 겔 면이 위로 향하게 하여 공기 중에 건조시킵니다. 건조가 완료되면 폴리아크릴아마이드 겔을 원하는 모양으로 자릅니다.제조사의 지침에 따라 96웰 플레이트당 약 500 µL의 polymethyl siloxane을 준비하여 젤을 멀티웰 플레이트 바닥에 접착합니다. 핀셋을 사용하여 각 웰의 중앙에 Polymethyl siloxane을 소량 떨어뜨립니다. 각 웰에 polyacrylamide 젤의 유연한 플라스틱 지지면이 아래로 향하게 하여 배치합니다.폴리디메틸실록산을 경화시킨 후, 트랜스퍼 피펫을 사용하여 이전에 준비한 셀룰로오스 샘플을 각 웰에 소량씩 넣고 좌우로 흔들어 겔 표면이 고르게 코팅되도록 합니다. 웰 플레이트를 고강도 UV 램프 아래에 5분 동안 둡니다. 완료되면 PBS로 겔을 헹구어 과도한 셀룰로오스를 제거합니다.이 피펫을 사용하여, 이전에 준비한 collagen Type one 용액 약 50 µL를 각 웰에 분주합니다. 플레이트의 덮개를 닫은 상태로 실온에서 최소 2시간 동안 방치한 후, PBS로 헹구어 과잉 콜라겐 용액을 제거합니다. 조직 배양 후드 내에서 UV 광선으로 겔을 2시간 동안 멸균합니다.마지막으로 겔을 완전 배지에 하룻밤 동안 담가 수화 및 평형화시킵니다. 세포 안착을 위해 겔을 즉시 사용하거나 냉장고에 최대 2일 동안 보관하십시오. 예상대로 여러 아크릴아마이드 및 bis-아크릴아마이드 농도(각각 A와 B로 표시)에 따른 영률(Young's modulus)의 함수 관계가 여기에 표시되어 있습니다.저장 탄성률 G'와 손실 탄성률 G''는 모두 주파수와 무관하게 나타났습니다. 또한 겔을 건조시킨 후 재수화시켜도 영률(Young's modulus)에 영향이 없음을 확인하였습니다. 가교제 Sulo sampa를 사용하면 강도에 관계없이 모든 하이드로겔 표면에 균일한 콜라겐 코팅을 구현할 수 있습니다.유방암 M-D-A-M-B 2 31 세포를 폴리아크릴아마이드 겔에 24시간 동안 배양했을 때, 부드러운 0.5 및 1 kilo pascal 겔에서는 세포가 둥근 형태를 유지했지만, 단단한 100 kilo pascal 겔에서는 세포가 퍼지고 길어지는 것이 관찰되었습니다. 또한, 유연한 플라스틱 지지대 위에 제작된 하이드로겔은 투명하여 시각화 및 현미경 관찰이 용이합니다. 나아가, 유연한 플라스틱 지지대는 자체 형광을 띠지 않으므로 형광 표지된 세포의 이미징을 방해하지 않습니다.세포 형태는 전체 세포 확장 면적과 세포 원형도 측면에서 추가로 정량화되었습니다. 이 영상을 시청하신 후에는 다공성 플레이트 형식으로 폴리아미드 겔을 얼마나 효율적이고 저렴하게 제작할 수 있는지 충분히 이해하게 될 것입니다. 이는 강성 의존적 세포 생물학 연구를 위한 것입니다.

simple-polyacrylamide-based-multiwell-stiffness-assay-for-study

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

세포 기능에 substrata의 강성의 효과는 모델...

아크릴 아미드 기반 Hydrogels을 사용하여 세포 기능에 매트릭스 강성의 영향을 공부

여기 셀 강성을 측정 할 수있는 빠르고 간단한 방법을 설명합니다. 이 방법의 일반적인 원리는 세포 표면에 micropipette를 통해 적용 잘 정의 된 부정적인 압력에 대한 응답으로 막 변형을 측정하는 것입니다. 이 방법은 기판에 연결된 세포의 biomechanical 속성을 연구 할 수있는 강력한 도구를 제공합니다.

기판에 연결된 전지의 Micropipette의 열망은 셀 강성을 추정하기 위해

이 비디오는 부착 세포의 박테리아 감염에 대한 세포외 기질(ECM) 강성의 영향을 연구하기 위한 분석을 보여줍니다. 콜라겐이 중첩된 다양한 강성의 폴리아크릴아미드 하이드로겔은 생리학적 ECM의 강성을 모방하기 위해 멀티웰 플레이트에 층을 이룹니다. 하이드로겔에 인간 내피 세포를 오버레이하고 세포 내 형광 단백질을 발현하도록 조작된 리스테리아 모노사이토제네스 박테리아로 세포를 감염시킨 후, 유세포 분석을 사용하여 더 단단한 하이드로겔에 존재하는 세포와 더 부드러운 하이드로겔에 존재하는 세포의 내재화된 박테리아를 비교합니다.

세포외 기질 강성이 박테리아 감염에 미치는 영향을 연구하기 위한 분석

이 비디오는 내피 세포를 통한 세포 외 기질 강성 의존성 리스테리아 모노사이토제네스 전파를 평가하기 위한 정량적 타임 랩스 현미경을 보여줍니다. 더 부드러운 하이드로겔은 더 단단한 하이드로겔에 비해 내피 세포를 통한 더 빠른 박테리아 전파를 촉진하며, 이는 박테리아 전파에 대한 매트릭스 강성의 영향을 강조합니다.

세포외 기질 강성에 따른 박테리아 전파를 평가하기 위한 정량적 타임랩스 현미경

종양 미세 환경에서 기계 강성이 invadopodia 활동을 증가시키고 수축력을 액토 마이 오신으로 악성 동작을 운전에 중요한 역할을한다. 사용하는 폴리 아크릴 아미드 겔 (PAAS)는, invadopodia 및 견인력 분석은 강성 매트릭스에 응답하여 암세포의 침윤 및 수축 특성을 연구하기 위해 이용 될 수있다.

암 세포에 Invadopodia 및 견인 포스 시험 법에 대한 폴리 아크릴 아마이드 젤

우리는 다 잘 형식 polyacrylamide 기반 분석 결과 부착 세포의 세균성 감염에 기질 경직성의 영향 조사에 대 한 개발 했습니다. 이 분석 결과 cytometry, immunostaining, 그리고 견인 힘 현미경 검사 법, 양적 측정 셀, 그들의 기질, 및 병원 성 박테리아 사이 biomechanical 상호 작용의 수와 호환 됩니다.

부착 세포의 세균성 감염에 기질 경직성의 영향을 공부 다 잘 형식 Polyacrylamide 기반 분석

Kilopascal 범위에 있는 강성과 기판은 순수 관련 마이크로 환경 강성을 세포의 반응을 유용 합니다. Widefield 형광 현미경을 사용 하 여, 소프트 실리콘 젤의 영의 계수는 들여쓰기를 사용 하 여 적합 한 영역을 확인할 수 있습니다.

Widefield 형광 현미경을 사용 하 여 Mechanobiology 연구에 대 한 부드러운 실리콘 기판의 강성 측정

기계적 힘은 세포 이동을 제어하는 데 중요합니다. 이 프로토콜은 유리 마이크로파이펫 및 마이크로매니퓰레이터를 사용하여 변형될 수 있는 탄성 하이드로겔의 사용을 입증하여 세포 구조 및 이동의 변화를 유도하기 위해 국소 강성 구배를 가진 세포를 자극한다.

세포 운동 및 관련 신호 이벤트의 기계적 제어를 평가하기위한 단일 세포 Durotaxis 분석

상세한 단계별 프로토콜은 다성 성 O9-1 신경 문장 세포및 다양한 강성의 폴리 아크릴아미드 하이드로겔을 사용하여 시험관 내 기계적 신호를 연구하기 위해 여기에 설명되어 있습니다.

신경 문장 세포에서 기계적 신호를 연구하기 위한 최적화된 O9-1/하이드로겔 시스템

엔지니어링된 심장 조직 이식 다음과 같은 면역 반응의 평가 (EHT)에 대한 Bioluminescence 이미징

배우세요 폴리아크릴아미드 겔을 멀티웰 플레이트 형식으로 빠르고 효율적으로 제조하는 방법을. 이 기술은 기질 강성에 따른 세포 반응 연구에 활용되며, 특수 장비 없이도 세포 역학 및 생물재료 연구에 적용할 수 있습니다.

간단한 폴리 아크릴 아미드 기반 강성 의존 세포 반응의 연구를위한 멀티 웰 강성 분석

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