간단한 폴리 아크릴 아미드 기반 강성 의존 세포 반응의 연구를위한 멀티 웰 강성 분석

이 절차의 전반적인 목표는 멀티 웰 플레이트 형식의 폴리 아크릴아미드 겔을 빠르고 효율적이며 저렴하게 준비할 수 있도록 하는 것입니다. 이것은 먼저 소수성 코팅된 유리판과 아크릴아미드 접착제 유연한 플라스틱 지지체 사이에 겔 전구체 용액을 끼워 넣음으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 중합 시 유연한 플라스틱 지지대에 공유 결합 부착된 유리판에서 젤을 벗겨내고 건조시키는 것입니다.

다음으로, 건조 겔과 그 밑에 있는 유연한 플라스틱 지지체를 원하는 모양으로 절단하고 플라스틱 면을 다중 웰 플레이트 또는 기타 세포 배양 용기의 웰 바닥에 접착합니다. 마지막 단계는 다중 웰 플레이트로 조립된 폴리 아크릴아미드 겔을 콜라겐 유형 1의 단층과 같은 셀 접착 코팅으로 코팅하는 것입니다. 궁극적으로 현미경 검사와 다른 세포 특성화 기술을 사용하여 기본 폴리 아크릴아미드 기질의 영향을 관찰합니다.

특히 세포 거동에 대한 강성입니다. 기존 방법에 비해 이 방법의 주요 장점은 다른 방법으로는 감당할 수 없는 저렴한 비용 및 시간 효율적인 방식으로 멀티 웰 플레이트 형식의 폴리겔 어셈블리뿐만 아니라 모든 강성과 두께를 처리할 수 있다는 것입니다. 절차를 시연하는 것은 제 연구실에서 학생으로 이루어질 것입니다.

먼저 아크릴아미드, 가교제인 비스 아크릴아미드 및 탈이온수를 혼합하여 폴리아크릴아미드 겔 전구체 용액을 제조하고 디메틸설폭스에 Sul OPA를 밀리리터당 50밀리그램으로 용해시킵니다. 20마이크로리터의 원액을 10개의 마이크로 원심분리기 튜브에 분취합니다. 그런 다음 플래시를 사용하여 용액을 액체 질소에 동결하고 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오.

다음으로, 황산염 당 암모늄을 탈 이온수에 용해시켜 10 % 중량 중량의 황산염 당 최종 암모늄을 얻습니다. Eloqua 황산염 용액당 25마이크로리터의 암모늄을 10개의 마이크로 원심분리기 튜브에 넣고 섭씨 20도의 음의 온도에서 보관합니다. pH 7.4에서 하나의 XPBS에 콜라겐 유형 1 스톡 용액을 희석하여 콜라겐 용액 1ml당 0.2mg을 준비합니다.

모든 용액은 사용할 때까지 얼음 위에 보관합니다. 이 시점에서 유리판에 소수성 용액 몇 방울을 떨어뜨리고 티슈 페이퍼를 사용하여 표면 전체에 펴 바릅니다. 플레이트를 자연 건조시킨 후 티슈 페이퍼로 다시 닦아 소수성 코팅을 고르게 합니다.

소수성 코팅 유리판의 크기에 맞게 유연한 플라스틱 지지대를 자릅니다. 그런 다음 메스와 같은 날카로운 도구로 표면을 가볍게 긁어 유연한 플라스틱 지지대의 소수성 면을 표시합니다. 겔 준비를 위해 원하는 최종 농도의 폴리 아크릴아미드 전구체 용액 4972.5마이크로리터를 50ml 원추형 튜브에 추가합니다.

캡을 연 상태에서 튜브를 탈기실에 30분 동안 놓습니다. 그 후, 이전에 제조된 황산염 당 암모늄 용액 25마이크로리터를 DGAs 겔 용액에 첨가하여 0.05%의 황산염 당 최종 암모늄 농도를 달성한 다음 0.5%의 최종 TM ME 농도를 달성하기 위해 2.5마이크로리터의 TM ME를 첨가합니다.3-5회 위아래로 피펫팅하여 용액을 부드럽게 혼합합니다. 다음으로 원하는 두께의 실리콘 스페이서를 유연한 플라스틱 지지대의 친수성 쪽에 놓습니다.

그런 다음 겔 용액을 스페이서와 샌드위치 사이의 유연한 플라스틱 지지대에 소수성 코팅된 유리 슬라이드 라이트로 피펫으로 끼웁니다. 젤이 45분 동안 중합되도록 한 후 공유 결합 폴리아크릴아미드 젤이 위에 있는 유연한 플라스틱 지지대를 벗겨내고 젤 면이 위로 향하게 하여 자연 건조시킵니다. 건조되면 폴리 아크릴아미드 겔을 원하는 모양으로 자릅니다.

제조업체의 지침에 따라 96 웰 플레이트당 약 500마이크로리터의 폴리메틸 소안을 준비하여 겔을 멀티 웰 플레이트의 바닥에 붙입니다. 집게를 사용하여 각 웰의 중앙에 Polymethyl soane의 작은 방울을 놓습니다. 하나의 폴리 아크릴아미드 젤을 각 웰 유연한 플라스틱 지지대 면이 아래로 향하게 놓습니다.

폴리디메틸 수복산을 경화시킨 후, 미리 제조된 소량의 셀룰로오스 삼파를 전사 피펫으로 각 웰에 넣고 좌우로 휘젓기 위해 겔 표면을 균일하게 코팅합니다. 웰 플레이트를 고강도 UV 램프 아래에 놓고 5분 동안 기다립니다. 완료되면 PBS로 젤을 헹구어 여분의 첼로를 제거합니다.

이 피펫에 이어, 약 50 마이크로 리터의 이전에 제조 된 콜라겐 유형 1 용액을 각각에 넣습니다. 과도한 콜라겐 용액을 제거하기 위해 PBS로 헹구기 후 최소 2시간 동안 접시를 실온에서 덮은 상태로 두십시오. 조직 배양 후드에서 자외선 아래에서 2시간 동안 젤을 살균합니다.

마지막으로, 수분을 공급하고 평형을 이루기 위해 젤을 완전한 중간 두께에 밤새 담가둡니다. 세포 착석을 위해 젤을 즉시 사용하거나 여러 아크릴아마이드와 비스의 함수로 최대 2일 동안 냉장고에 보관하십시오. 각각 A와 B로 지정된 아크릴아마이드 농도는 예상된 대로 여기에 나와 있습니다.

저장 탄성률 G 프라임과 손실 탄성률 G 더블 프라임은 모두 주파수와 무관합니다. 또한 젤을 건조시킨 다음 재수화하는 것이 새끼의 계수에 영향을 미치지 않는 것이 확인되었습니다. Crosslinker Sulo sampa를 사용하면 모든 강성의 하이드로겔에 균일한 콜라겐 코팅을 달성할 수 있습니다.

폴리아크릴아미드 겔에 24시간 동안 파종했을 때 유방암 M-D-A-M-B 2 31 세포가 부드러운 0.5 및 1kg 파스칼 겔에서 둥글게 유지되었지만 뻣뻣한 100kg 파스칼 겔에서 퍼지고 늘어날 수 있는 것이 관찰되었습니다. 또한 유연한 플라스틱 지지대 위에 만들어진 하이드로겔은 투명하여 쉽게 시각화하고 현미경을 관찰할 수 있습니다. 또한, 유연한 플라스틱 지지대는 자동 형광을 발하지 않으므로 형광 표지된 세포의 이미징을 방해하지 않습니다.

세포 형태학은 전체 세포 확산 면적 및 세포 순환성 측면에서 추가로 정량화되었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 멀티웰 플레이트 형식으로 폴리아미드 겔을 얼마나 효율적이고 저렴하게 조립할 수 있는지 잘 이해하게 될 것입니다. 강성 의존성 세포 생물학 연구를 위해.