Name: 표현, 세제 Solubilization 및 멤브레인 전송, MexB의 Multidrug 저항 단백질의 정제 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: 배우세요 MexB 막 단백질의 발현, 세제 용해 및 정제 방법을 E. coli에서. 이 기술은 다제내성 전달체 연구와 항생제 내성 메커니즘 이해에 활용됩니다.

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이 프로젝트는 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 및 Biomolecular 과학 협회에서 CJJ 부여에 의해 지원되었다.

1. 1 일 : 녹농균의 MexB는 pFB101에 의해 인코딩됩니다. MexB 유전자가 증폭되었다 P.부터 녹농균이라는 박테리아의 게놈의 DNA와 NdeI과 pET30b + 벡터의 XhoI 제한 사이트에 삽입. 구조는 C - 터미널 hexahistidine 태그를 포함하고 있습니다. <ol><li> 플라스미드가 E.을 변환하는 데 사용됩니다 대장균은 C43 (DE3) 12 변형율과 transformants 30 UG / ML kanamycin이 포함된 LB 한천에 도금입니다. </li></ol> 2. 일 2 : 숙박 문화 : <ol start="2"><li> 저녁에는, 30 UG / ML kanamycin이 포함된 4 X 3 ML의 LB 문화는 신선한 transformant의 식민지에서 주사를하고 있습니다. 또는 문화가 얼어 파마에서 주사 수 있습니다. 이러한 작은 문화가 ° C 야간 37 롤러에 성장하고 있습니다. </li></ol> 3. 3 일 : 6 리터 문화를 성장 : <ol start="3"><li> 아침에, 30 UG / ML kanamycin을 포함한 150 ML의 LB를 예방하기 위해 야간 문화를 사용합니다. 37 흔드는에서 ° C에서 문화를 성장. </li><li> 오후에는, 30 UG / Fernbach의 flasks의 ML의 kanamycin이 포함된 6 X 1L 2XYT 미디어를 예방하기 위해 작은 문화를 사용합니다. (1시 40분 희석을위한 문화 당 25 ML을 사용합니다.) 37 문화를 성장 ° C들은 1.5 시간 약 0.4-0.6의 OD 600에 도달할 때까지 </li><li> 문화가 적절한 밀도에 도달하면, 0.5 ML 1M IPTG를 추가하여 단​​백질 발현을 유도. 쉐이크에 다시 모든 flasks을 넣고 ° C 야간 30 그들을 계속 성장하고 있습니다. </li></ol> 4. 일 4 : 전지를 착취하고 단백질을 퓨리화잉 : <ol start="6"><li> 다음과 같이 버퍼 솔루션 테아제 억제제, DNAse하고, 라이 소 자임 추가 : 셀 resuspension 버퍼 50 ML하기 위해, 10 MG DNaseI (0.1 MG / ML 최종 농도), 라이 소 자임 1 완전한 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 무료 테아제 억제제의 정제 및 핀치를 추가 . 막 resuspension 버퍼 60 ML 위해 1 테아제 억제제의 정제를 추가합니다. 막 resuspension 버퍼의 또 다른 50 ML하려면 1 테아제 억제제의 정제를 추가합니다. 얼음 세 솔루션을 유지. </li><li> 문화에게 세포를 수확하는 대규모 원심 분리기에서 30 분 5,000 RPM을 원심 분리기. </li><li> 100 ML 세포 resuspension 버퍼 (라이 소 자임 50 MM 낮잠, 산도 7.0, 300 MM NaCl, 2 MM MgCl 2, 1 완료 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 무료 테아제 억제제의 정제, 0.1 MG / ML DNAse I, 핀치)에 세포를 Resuspend </li><li> 12,000 PSI (762 게이지 압력)에 프랑스의 압력 셀을 통해 두 번 세포 솔루션을 전달합니다. 병에서 세포 lysate를 수집 얼음이 차가운 유지. </li><li> SS34 원심 분리기 튜브에 세포 lysate를 전송하고 4 10,000 RPM에서 30 분 세포 파편을 제거하기 위해 원심 분리기 ° C를 SS - 34 로터 인치 </li><li> 조심스럽게 Ti647.5 초원 심 분리기 튜브에 뜨는를 제거합니다. 4C에서 40,000 rpm으로 50 분 원심 분리기. 뜨는 폐기하십시오. </li><li> 약에서 세포 세포막이 들어있는 펠렛을 Resuspend. 막 resuspension 버퍼의 25 ML (50 MM 낮잠, 산도 7.0, 300 MM NaCl, 5 % 글리세롤, 1 완료 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 무료 테아제 억제제의 정제). </li><li> 4시 50 분 Ti647.5 로터에서 40,000 rpm으로 깨끗한 원심 분리기 튜브와 원심 분리기에 막 현탁액을 전송 ° C. </li><li> 뜨는을 취소하고 25 ML 막 resuspension 버퍼에 씻어 멤브레인 펠릿 (50 MM 낮잠, 산도 7.0, 300 MM NaCl, 5 % 글리세롤, 1 완료 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 무료 테아제 억제제 정제) resuspend. </li></ol> 5. TM 단백질 Solublization : <ol start="15"><li> resuspended 점막 (25 ML에 대한)에 6 ML 10 % DDM (최종 세제 농도 = 2 %의 DDM) 록 4 혼합물 ° C 2 시간.을 추가 </li><li> 4 40 분 40,000 RPM의 혼합물을 원심 ° C 불용성 단백질의 수용성 단백질 세제 단지를 분리 Ti647.5 로터 인치 MexB 단백질 세제 단지를 포함 뜨는을 저장합니다. </li></ol> 6. 아이맥 : <ol start="17"><li> resuspension 버퍼에 equilibrated 탈론 금속 친화 비즈와 고속 회전에서 얻은 뜨는을 섞는다. 4 롤러에 1 시간을위한 품어 ° C. </li><li> 중력 흐름 열 본문에 슬러리를 붓고과를 통해 흐름을 폐기. </li><li> 아이맥 바인딩 및 씻으 버퍼 20 ML (10 열 볼륨) (50 MM 낮잠, 산도 7, 300 MM NaCl, 5 % 글리세롤, 0.2 % DDM)와 컬럼을 씻어 </li><li> 아이맥 용출 버퍼 (50 MM 낮잠, 산도 7.0, 300 MM NaCl, 5 % 글리세롤, 250 MM 이미다졸, 0.2 % DDM)와 단백질 Elute. </li><li> 용출 분수 15 μL 샘플을 가지고, polyacrylamide 젤 전기 영동에 의해 분석 15 μL 2X SDS 샘플 버퍼로 각각 섞는다. microcentrifuge에 30sec를 스핀. 각 분획의 MexB의 금액과 순결을 추정하기 위해 10 % polyacrylamide SDS 겔에서 샘플을 분석할 수 있습니다. </li><li> MexB 단백질 세제 단지와 4 회전 농축기에서 그들을 집중을 포함하고있는 분수 수영장 ° C.는 단백질이의 시에 침전하지 않는주의tep. </li></ol> 7. 겔 여과 칼럼 : <ol start="23"><li> 24 ML 실행 버퍼 (50 MM 낮잠, 산도 7.0, 300 MM NaCl, 5 % 글리세롤, 0.2 % 베타 octylglucoside)와 Superose 12 HL 10분의 30 컬럼을 사전 평형 및 평면 기준 나올 때까지 기다리는 것이 좋습니다. </li><li> 실행 버퍼 악타 시스템 로딩 루프 린스. </li><li> 그 결과 해당 컬럼에 그것을 적용하기 전에 주사기 필터를 사용하여 단백질 솔루션을 필터링합니다. </li><li> 5mg / ML 최대의 단백질 농도와 열의에 단백질 용액 240 μL까지로드합니다. </li><li> 버퍼의 1.5 열 볼륨 (36 ML)를 실행, 0.25 ML 분수를 수집합니다. 용출 량의 15 ML - MexB 단백질 세제 단지는 10 시경 최고로 elute해야합니다. </li><li> 정상 분수 5 μL 샘플을 가져가라. 2X SDS 샘플 버퍼 각 샘플 1시 1분를 섞습니다. 각 분획의 MexB의 금액과 순결을 추정하는 10 % polyacrylamide 젤의 샘플을 분석 </li><li> 순수 MexB를 포함하는 분수 수영장. </li></ol> 8. 대표 결과 : 그림 1은 겔 여과 칼럼에서 아이맥 열 및 개별 분수에서 풀링된 열 분수와 polyacrylamide 젤이 포함되어 있습니다. 겔 여과 칼럼 후 단백질 쿠매시 스테인드 polyacrylamide 젤로 순수한 나타납니다. 그림 2는 칼럼에서 단백질 세제 콤플렉스 eluting의 주봉을 보여주는 겔 여과 칼럼에서 추적을 포함하고 있습니다. MexB 단백질의 평균 수확량은 2XYT 문화의 6리터 당 약 2 MG입니다. <img src="/files/ftp_upload/2134/2134fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. SDS - PAGE MexB의 PDCs의 정화의 젤. 레인 1, 분자량 마커. 2, 아이맥 분수를 풀링. 3-7, 젤 여과 칼럼 분수. <img src="/files/ftp_upload/2134/2134fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. MexB 단백질 세제 단지 (PDC)에 대해 젤 여과 결과의 예.

<ol><li>Eda, S., Maseda, H., Nakae, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+elegant+means+of+self-protection+in+gram-negative+bacteria+by+recognizing+and+extruding+xenobiotics+from+the+periplasmic+space%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">An elegant means of self-protection in gram-negative bacteria by recognizing and extruding xenobiotics from the periplasmic space.</a> J. Biol. Chem. 278, 2085-2088 (2003).</li>
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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

이온 전달, 세포 - 세포 통신, 소포 수송, 세포 구조의 유지 보수 및 호스트 병원체 상호 작용을 포함한 저항, 많은 중요한 세포 활동을 multidrug뿐만 아니라, 세포막에 포함된 단백질을 포함하고 있습니다. Transmembrane 단백질 알려진 단백질의 30 % 이상 만들어 사용 오늘날 의약품의 대다수에 대한 대상입니다. transmembrane 단백질의 접힘이나 부적 절한 활동은 낭성 섬유증과 당뇨병을 포함하여 중요한 유전 질환,로 이어집니다. transmembrane 단백질의 광대한 중요성에도 불구하고, 수용성 단백질에 비해 자신의 구조와 분자 구조에 대해 훨씬 덜 알려져있다. 소수성 시퀀스의 존재는 그것이 어려운 이러한 단백질의 다량을 표현하고 분리하고 많은 생화학 및 구조 방법들이 내화물하게하실 수 있습니다. 이 프로토콜은 가용성 단백질 세제 복합으로 MDR 막 단백질의 표현, 세제 solubilization과 정화를 보여주었다. 이러한 방법은 많은 re​​c...

<table><tbody><tr><td>SDS 샘플 버퍼</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0737</td><td></td></tr><tr><td>C43(DE3) E. coli 균주</td><td>Lucigen</td><td>60345-1</td><td></td></tr><tr><td>kanamycin sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K4378</td><td></td></tr><tr><td>2XYT 배지</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2466-2</td><td></td></tr><tr><td>LB 배지</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC61189-5000</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6758</td><td></td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP3226-1</td><td></td></tr><tr><td>Lysozyme</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L7651</td><td></td></tr><tr><td>Complete EDTA-free protease inhibitor tablets</td><td>Roche Group</td><td>11 873 580 001</td><td></td></tr><tr><td>NaP monobasic</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6566</td><td></td></tr><tr><td>NaP dibasic</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5136</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6191</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1028</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-1</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;n&lt;/em&gt;-dodecyl-&amp;#946;-D-maltopyranoside</td><td>Anatrace</td><td>D310</td><td></td></tr><tr><td>15ml 튜브</td><td>Corning</td><td>430052</td><td></td></tr><tr><td>See-Saw Rocker</td><td>Fisher Scientific</td><td>SSL 4</td><td></td></tr><tr><td>Talon 금속 친화성 레진</td><td>Clontech Laboratories</td><td>635503</td><td></td></tr><tr><td>imidazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5513</td><td></td></tr><tr><td>10% polyacrylamide SDS PAGE 겔</td><td>Bio-Rad</td><td>161-1454</td><td></td></tr><tr><td>Tris/glycine/SDS PAGE 러닝 버퍼</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0732</td><td></td></tr><tr><td>Kaleidascope prestained 분자량 마커</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0324</td><td></td></tr><tr><td>Superose 12 30/10 컬럼</td><td>GE Healthcare</td><td>12 10/300 GL</td><td></td></tr><tr><td>Amicon 원심분리 농축기</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC801024</td><td></td></tr><tr><td>시린지 필터</td><td>Fisher Scientific</td><td>SLFG R04 NL</td><td></td></tr><tr><td>Fernbach 플라스크</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-552-39</td><td></td></tr><tr><td>Fernbach 플라스크용 쉐이커</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Akta 시스템</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JLA-8.1000 로터가 장착된 J6 대용량 원심분리기</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 l 원심분리 병</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>969329</td><td></td></tr><tr><td>RC-5 원심분리기</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SS34 고정각 로터 및 튜브</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sorvall 플로어 모델 초원심분리기</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T647.5 로터 및 캡 포함 튜브</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>08322</td><td></td></tr><tr><td>French Pressure Cell</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>FA-032</td><td></td></tr></tbody></table>

표현, 세제 solubilization 및 멤브레인 전송, mexb의 multidrug 저항 단백질의 정제

Expression, Detergent Solubilization, and Purification of a Membrane Transporter, the MexB Multidrug Resistance Protein

Multidrug 저항 (MDR), 구조적 및 기능적으로 관련이없는 안티 - 암 약물이나 항생제의 다양한 내성이 될 수있는 암 세포 또는 병원체의 능력이, 공중 보건의 현재의 심각한 문제입니다. 이 multidrug 저항은 에너지 의존 약물 유출 펌프에 크게 때문입니다. 펌프는 독성이 임계값 아래에 자신의 세포 농도를 낮추고, 외부 매체에 방지 암 약물이나 항생제를 추방. 우리는 예를 들어, 화상 또는 낭성 섬유증, 또한 단백질 손상 암, 투석과 이식 환자에서 녹농균, 부상 또는 질병의 많은 종류의 환자에서 감염을 일으키는 기회 세균 병원체에 multidrug 저항을 연구하고있다. P.의 주요 MDR의 유출 펌프 녹농균이라는 박테리아는 내부 멤브레인 프로톤 - 약물 antiporter (RND), 외부 멤브레인 채널 (OMF) 및 periplasmic 링커 단백질 (MFP) 1-8 구성되어 삼자 간의 단지입니다. RND 및 OMF 단백질 transmembrane 단백질입니다. Transmembrane 단백질은 모든 단백질의 30 % 이상을 구성하고 현재의 약물 타겟의 65 %입니다. 소수성 transmembrane 도메인은 수성 버퍼에 단백질이 불용성합니다. transmembrane 단백질을 정화하기 전에, 그것은 단백질이 단백질 세제 단지 (PDC) 9-11로 solubilized 수 있도록 가벼운 세제를 포함하는 버퍼 조건을 찾을 필요가 있습니다. 이 예제에서, 우리는 RND 단백질, P.을 사용 , transmembrane 단백질의 재조합 형태로 표현이 세제를 사용 solubilize 다음 단백질 세제 단지를 정화하는 방법을 보여주는 녹농균이라는 박테리아의 MexB의 transmembrane 수송. 이것은 일반적인 방법은 표현, 정화 및 기타 여러 recombinantly 표현 막 단백질의 solubilization 적용할 수 있습니다. 단백질 세제 단지는 나중에 X - 선 결정 구조의 결정이나 crosslinking 연구를 포함한 생화 학적 또는 biophysical 특성화 사용할 수 있습니다.

이 프로토콜에서 우리는 가용성 단백질 세제 복합으로 표현, solubilization, 그리고 recombinantly 표현 막 단백질, MexB의 정화를 보여줍니다. MexB는 기회 세균성 병원체 녹농균에서 multidrug 저항 막 수송이다.

표현, 세제 Solubilization 및 멤브레인 전송, MexB의 Multidrug 저항 단백질의 정제

다제내성(Multidrug resistance, MDR)은 암세포나 병원균이 구조적 및 기능적으로 서로 관련이 없는 광범위한 약물에 대해 내성을 갖는 능력으로...

Mex B 막 단백질을 정제하기 위해, 먼저 재조합 DNA 방법을 사용하여 e coli에서 Mex B를 발현시킵니다. 그 다음 막을 분리하고 온화한 계면활성제를 사용하여 막 단백질을 가용화합니다. 가용화된 막 단백질은 iMac을 통해 정제되며, 이후 겔 여과 크로마토그래피를 통해 추가로 정제합니다.단백질의 정제 수준은 SDS 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(SDS poly ACRYLAMIDE Gel electrophoresis)을 사용하여 결정합니다. 이 절차는 다약제 내성 막관통 수송체에 대한 통찰을 제공할 수 있지만, 다른 막 단백질에도 적용될 수 있습니다. 오늘 시연할 절차는 저희 연구실의 대학원생이 수행할 것입니다. 이 절차를 위해, Pseudomonas aeruginosa 유래의 Mex B를 PET 30 B plus 발현 벡터에 서브클로닝하여 Mex B가 C-말단 His-tag와 함께 발현되도록 합니다. 저녁에 신선한 형질전환체 또는 냉동 스톡을 사용하여 3 mL LB kan mycin 배양액 4개에 접종하고, 37 °C의 롤러에서 하룻밤 동안 배양합니다.하룻밤 배양한 배양물을 사용하여 밀리리터당 30 µg의 Kan Mycin이 포함된 150 mL LB 배지에 접종하십시오. 오후에 37 °C 쉐이커에서 배양물을 성장시키십시오. 이 소량 배양물을 사용하여 밀리리터당 30 µg의 Kan Mycin이 포함된 1 L XYT 배지 6개에 접종하십시오.고사리 배양 플라스크에 마이신을 첨가할 수 있습니까? 1:40 희석 비율로 배양당 25 milliliters를 사용하십시오. 배양액의 광학 밀도에 도달할 때까지 37 degrees Celsius에서 배양하십시오.0.4에서 0.6의 600nm 흡광도까지 약 1.5시간 동안 배양합니다. 배양액이 적정 밀도에 도달하면, 0.5 mL의 1 M IPTG를 첨가하여 단백질 발현을 유도합니다. 모든 플라스크를 다시 쉐이커에 넣고 30 °C에서 하룻밤 동안 계속 배양한 후, 다음 날 아침에 박테리아를 회수합니다.셰이커에서 배양액을 꺼내어 냉각합니다. 그 다음 세포를 수확하기 위해, 배양액을 원심분리 튜브로 옮기고 대형 원심분리기를 사용하여 4 °C에서 5,000 rpm으로 30분 동안 원심분리합니다. 세포가 원심분리되는 동안, 100 mL의 세포 재현탁 완충액에 DNAse 단백질 분해 효소 억제제와 라이소자임을 첨가합니다.또한 이 표에 표시된 대로 membrane Resus suspension Buffer 두 분주량에 프로테아제 억제제를 첨가하십시오. 원심분리가 완료되면 세 가지 용액을 모두 얼음에 보관하십시오. 세포 펠렛을 100 milliliters의 cell resus suspension Buffer로 재현탁하십시오.다음으로, 세포를 파쇄합니다. 세포 현탁액을 French 압력 셀에 넣고, 이를 French press에 장착합니다. 압력이 12,000 pounds per square inch에 도달할 때까지 가압합니다.파쇄된 세포가 조금씩 흘러나오도록 밸브를 아주 조금만 엽니다. 밸브를 너무 많이 열어 세포가 갑자기 뿜어져 나오게 하면 압력이 너무 낮은 상태로 방출되어 효율적인 파쇄가 이루어지지 않으므로 주의해야 합니다. 세포 용해물을 얼음 위에 차갑게 보관된 병에 수집하십시오.세포 용액을 12,000 psi의 압력으로 French pressure cell에 다시 통과시킵니다. 세포 용해물을 SS 34 원심분리관으로 옮긴 후, SS 34 로터를 사용하여 4 °C에서 10,000 rpm으로 30분 동안 원심분리하여 세포 파편을 제거합니다. 다음 단계는 정제된 용해물을 준비하는 것입니다.막 분획을 준비하는 데 사용됩니다. 상층액을 ti. 6 4, 7 0.5 초원심분리 튜브에 조심스럽게 옮긴 후, TI 6 4 7 0.5 로터를 사용하여 4°C에서 40,000 rpm으로 50분 동안 원심분리합니다.상층액을 버립니다. 피펫을 사용하여 약 25 milliliters의 membrane Resus suspension buffer에 세포막이 포함된 펠렛을 부드럽게 재현탁합니다. 막 현탁액을 깨끗한 원심분리 튜브로 옮기고, 4°C에서 40,000 rpm의 TI I 6 4 7 0.5 로터를 사용하여 50분 동안 다시 원심분리한 후, 세척된 막 펠렛을 25 milliliters의 membrane Resus suspension buffer에 재현탁합니다. 다음으로, 재현탁된 막에 약 25 milliliters를 가하여 막 단백질을 가용화합니다.최종 세제 농도가 2% DDM이 되도록 10% DDM 6 mL를 첨가하고, 4°C에서 2시간 동안 혼합물을 천천히 흔들어 줍니다. DDM 존재 하에 2시간 동안 배양한 후, 용해성 단백질 세제 복합체를 불용성 단백질로부터 분리하기 위해 TI I 6 4 7 0.5 로터를 사용하여 4°C에서 40,000 rpm으로 40분 동안 혼합물을 원심분리합니다. MexB 단백질 세제 복합체가 포함된 상층액을 보관하여 정제에 사용합니다. MexB 단백질 세제 복합체가 포함된 상층액을 Resus 현탁 완충액으로 평형화된 이온 금속 친화성 비드 2 mL와 혼합합니다. 4°C의 롤러에서 1시간 동안 배양하여 단백질을 수지에 결합시킵니다.슬러리를 중력 흐름 컬럼 본체에 붓고 통과액은 버립니다. 컬럼 세척이 완료되면 20 mL 또는 10 컬럼 부피의 iMac 결합 및 세척 버퍼로 컬럼을 세척합니다. 10 mL의 iMac 용출 버퍼를 사용하여 결합된 단백질을 용출합니다.각 용출 분획에서 10 µL의 샘플을 취합니다. 2배 농도의 SDS 샘플 버퍼 10 µL와 혼합한 후, 10% 폴리아크릴아마이드 SDS 젤에서 분석합니다.각 분획 내 mex B의 양과 순도를 추정하십시오. Mex B 단백질 세제 복합체가 포함된 분획을 회수하고 4°C에서 원심분리 농축기로 농축하십시오. 이 단계에서 단백질이 침전되지 않도록 주의하십시오.여러 번의 짧은 원심분리를 수행하며 침전물이 생기는지 확인하십시오. 각 원심분리 후, 모아진 분획들을 젤 여과 컬럼을 사용하여 정제하십시오. super rose 12 HL 30 over 10 컬럼을 24 milliliters의 running buffer로 사전 평형화하고 베이스라인이 안정될 때까지 기다리십시오.다음으로, 액터 시스템 로딩 루프를 러닝 버퍼로 헹굽니다. 단백질을 컬럼에 적용하기 전에 시린지 필터를 사용하여 단백질 용액을 여과합니다. 그런 다음, 단백질 농도가 최대 5 mg/mL인 단백질 용액을 최대 240 µL까지 컬럼에 로딩합니다.1.5 컬럼 부피의 완충액을 흘려주고 0.25 mL씩 분획하여 수집합니다. XB 단백질 세제 복합체는 용출 부피 약 10에서 15 mL 부근에서 피크 형태로 용출됩니다. 피크 분획에서 5 µL의 샘플을 취합니다.각 샘플을 2배 농도의 SDS 샘플 버퍼와 1:1 비율로 혼합합니다. 10% poly acrylamide gel에서 샘플을 분석하여 각 분획 내 Mex B의 양과 순도를 추정하고, 순수한 Mex B가 포함된 분획을 회수합니다. 이 poly acrylamide gel에는 iMac 컬럼에서 회수한 분획과 겔 여과 컬럼의 개별 분획들이 로딩되었습니다. 겔 여과 컬럼 단계를 거친 후, Coomassie 염색된 poly acrylamide gel에서 단백질이 순수하게 나타납니다.겔 여과 컬럼의 트레이스(trace)는 컬럼에서 용출되는 단백질-계면활성제 복합체의 메인 피크를 보여줍니다. mxb 단백질의 평균 수율은 2 XYT 배양액 6L당 약 2mg입니다. 이 절차를 충분히 숙달하고 적절하게 수행한다면 8시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 막 단백질을 발현, 가용화 및 정제하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

expression-detergent-solubilization-purification-membrane-transporter

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

우리는 녹농균에서 유출 펌프의 체외 조사에 대한 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 리포좀 막 내에서 강력한 가역 및 조정할 수있는 양성자 기울기의 생성을 허용하고 따라서 protomotive 힘에 의해 격려하는 막 단백질에 적용 할 수 있어야한다.

녹농균에서 MexAB 유출 펌프의 체외 조사

녹색 형광 단백질에 융합을 기반으로 대장균에서 재조합 막 단백질의 발현에 대한 심사에 대한 효율적인 접근 방법이 제시된다.

막 단백질의 녹색 형광 단백질 기반의 표현 상영에<em&gt; 대장균</em

Proteoliposomes는 잘 정의된 생화학적 환경에서 재구성된 정제된 채널과 수송체를 연구하는 데 사용됩니다. 이러한 단백질에 의해 매개되는 유출을 측정하기 위한 실험적 절차가 설명됩니다. 프로테오리포좀을 준비하고, 기록을 수행하고, 데이터를 분석하여 재구성된 단백질의 기능적 특성을 정량적으로 결정하는 단계가 설명됩니다.

Proteoliposome 기반 유출 분석은 CL의 단일 분자의 속성을 확인하는<sup&gt; -</sup&gt; 채널 및 전송기

제시된 프로토콜은 공극 스패닝 무용매 지질 이중층을 사용하여 단일 수송체 수준에서 막 단백질 매개 수송을 분석하는 방법을 설명합니다. 이는 대단히 병렬적인 데이터 수집 및 분석과 결합된 대량 생산된 나노포어 어레이 칩을 생성함으로써 달성되며, 향후 멤브레인 단백질 이펙터 스크리닝의 확립을 가능하게 합니다.

멤브레인 운송은 단일 단백질 해상도에서 고도의 병렬 나노 기공 칩 시스템에 의해 분석 처리합니다

여기 postfusion bilayer에이 막 단백질의 세제 무료 배달 대상 지질 bilayers와 fusogenic proteoliposomes에 막 단백질의 재구성 및 같은 proteoliposomes의 융합에 대 한 두 개의 초고속 프로토콜 선물이. 이러한 방법의 복잡 한 다중 구성 요소 막 시스템의 신속 하 고 쉽게 제어 조립이 있습니다.

세제 없는 보완 청구 Proteoliposomes Fusogenic를 사용 하 여 지질 Bilayers에 막 단백질의 초고속 재구성.

여기 우리가 제시 익스프레스, solubilize, 누 룩을 사용 하 여 SLC4 운송업 자 가족에 상 동으로 여러 진 핵 borate 전송기를 정화 하는 프로토콜. 우리는 또한 multimeric 어셈블리에 대 한 정화 homomeric 단백질을 평가 하기 위해 화학 가교 분석 결과 설명 합니다. 이러한 프로토콜은 다른 도전 막 단백질에 대 한 적용할 수 있습니다.

표현, 가용 화, 그리고 진 핵 Borate 전송기의 정화

우리는 프랑스 프레스를 사용하여 대장균 및 세포의 용해에서 이종 발현에 의해 생성된 막 소포 제제에서 양성자 구동 막 수송기의 특성화 방법을 설명합니다.

대장균의 이종 식에 의한 멤브레인 수송기의 특성화 및 멤브레인 소포 생산

이 문서는 칸디다 알비칸스 ABC (ATP 결합 카세트) 단백질 Cdr1의 특성화를위한 소규모 플라즈마 막 격리 프로토콜을 제시, 사카로미세스 cerevisiae에서 과발현. 프로테아제-클레이블 C-단말 mGFPCdr1과 태그 사이에 16잔류 링커를 장착한 이중 태그는 Cdr1의 정제 및 세제 스크리닝을 용이하게 하도록 설계되었습니다.

칸디다 알비칸스 Cdr1-mGFPHis 분석을 위한 소규모 플라즈마 멤브레인 준비

인간 막 수송체의 구조 및 생화학적 연구에는 밀리그램 단위의 안정적이고 온전하며 균질한 단백질이 필요합니다. 여기서는 코돈 최적화 유전자를 사용하여 인간 용질 운반체 수송체를 스크리닝, 발현 및 정제하는 확장 가능한 방법을 설명합니다.

구조 및 생화학 연구를 위한 Human Solute Carriers의 High-Throughput Expression and Purification of Human Solute Carriers for Structural and Biochemical Studies(구조 및 생화학 연구를 위한 인간 용질 담체의 고처리량 발현 및 정제)

이 프로토콜은 최종 원심분리 단계에서 이당류 트레할로스를 포함하는 개선된 SERCA 정제 방법을 설명합니다. 이 탄수화물은 가혹한 조건에서 단백질을 안정화시킵니다. 정제된 SERCA는 촉매 활성을 보였고 순도가 높았기 때문에 구조 및 기능 연구에 적합했습니다.

토끼 근육에서 육-소포체 Ca2+-ATPase의 정제

배우세요 MexB 막 단백질의 발현, 세제 용해 및 정제 방법을 E. coli에서. 이 기술은 다제내성 전달체 연구와 항생제 내성 메커니즘 이해에 활용됩니다.

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