표현, 세제 Solubilization 및 멤브레인 전송, MexB의 Multidrug 저항 단백질의 정제

Mex B 막 단백질을 정제하기 위해 Mex B는 먼저 재조합 DNA 방법을 사용하여 대장균에서 발현됩니다. 그런 다음 멤브레인을 분리하고 멤브레인 단백질을 중성 세제로 가용화합니다. 용해된 멤브레인 단백질은 iMac을 통해 정제되고 단백질은 겔 여과 크로마토그래피를 통해 추가로 정제됩니다.

단백질의 정제 수준은 SDS 폴리 아크릴아미드 겔 전기 영동을 사용하여 결정됩니다. 이 절차는 다제내성 막관통 수송체에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만, 오늘날 절차가 제 연구실의 대학원생에 의해 형성될 것임을 보여주는 다른 막 단백질에도 적용할 수 있습니다.이 절차를 위해 슈도모나스 아오사(pseudomonas aosa)의 멕스 B는 PET 30 B 플러스 발현 벡터에 서브클로닝되어 멕스 B가 C 말단 HEXA 히스타민 태그로 발현됩니다. 저녁에 3 밀리리터 파운드 캔 마이신 배양액 4 개에 신선한 형질전환 물질을 접종하거나 냉동 스톡을 사용하여 아침에 밤새 섭씨 37도의 롤러에서 배양

하룻밤 배양물을 사용하여 밀리리터당 30마이크로그램을 함유한 LB 150밀리리터를 접종합니다. Mycin은 오후에 셰이커에서 섭씨 37도에서 배양을 성장시킬 수 있습니까? 작은 배양물을 사용하여 1리터의 6배, 밀리리터당 30마이크로그램을 함유한 2개의 XYT 배지를 접종합니다.

고사리 백 플라스크에 마이신을 넣을 수 있습니까? 1-40 희석을 위해 배양액당 25밀리리터를 사용합니다. 광학 밀도에 도달할 때까지 섭씨 37도에서 배양물을 성장시킵니다.

0.4에서 0.6의 600, 약 1.5 시간. 배양액이 적절한 밀도에 도달하면 1대구치 0.5ml를 첨가하여 단백질 발현을 유도합니다. 증권 시세 표시기. 모든 플라스크를 셰이커에 다시 넣고 다음 날 아침에 박테리아를 수확할 때까지 밤새 섭씨 30도에서 계속 성장시킵니다.

셰이커에서 배양물을 꺼내 식힙니다. 다음 세포를 가을걷기 위하여는, 세포가 분리기를 하고 있는 동안 세포가 원심분리하는 동안 5, 분 당 000 교체에 30 분 동안 4 섭씨 온도에 배양물을 옮기거든 분리기. 100ml의 세포 재현 탁액에 DNA, 프로테아제 억제제 및 라이소자임을 보충합니다.

또한 이 표와 같이 membrane Resus 현탁액 Buffer의 두 부분 표본을 프로테아제 억제제로 보충합니다. 원심분리가 완료되면 세 가지 용액을 모두 얼음 위에 두십시오. Resus는 100ml의 cell resus 현탁액 버퍼에서 세포 펠릿을 소비합니다.

다음으로 세포를 추출합니다. 셀 현탁액은 프렌치 압력 셀에 로드되고 셀은 프렌치 프레스에 배치됩니다. 압력은 12, 평방 인치당 000파운드에 도달할 때까지 적용됩니다.

밸브는 부서진 세포가 흘러나오도록 아주 소량 열립니다. 밸브를 너무 많이 열지 않고 세포가 너무 적은 압력으로 방출되어 효율적으로 파괴되지 않기 때문에 세포가 분출되도록 하는 것이 중요합니다. 세포 용해물을 병에 모아 얼음에 차갑게 보관합니다.

셀 용액을 프렌치 압력 셀을 통해 12, 제곱인치당 000파운드로 다시 전달합니다. 세포 용해물을 SS 34 원심분리기 튜브 및 원심분리기로 옮겨 SS 34 로터에서 섭씨 4도에서 30분 동안 분당 10, 000회 회전으로 세포 파편을 제거합니다. 정화 된 용해물은 다음입니다.

멤브레인 분획을 제조하는 데 사용됩니다. supinate를 ti로 조심스럽게 옮깁니다. 6 4, 7 0.5 초원심분리기 튜브, TI 6 4 7 0.5 로터에서 40, 000 회전으로 섭씨 4도에서 50분 동안 50분 동안 원심분리기.

supinate를 버리십시오. 피펫을 사용하여 약 25 밀리리터의 멤브레인 Resus 현탁액에 세포막을 포함하는 펠릿을 부드럽게 재현탁시키고, 멤브레인 현탁액을 깨끗한 원심분리 튜브로 옮기고, 섭씨 4도의 50분 동안 분당 40, 000 회전의 TI I 6 4 7 0.5 로터에서 원심분리 이득을 얻고, 세척된 멤브레인 팔레트를 25 밀리리터의 멤브레인 Resus 현탁액 버퍼에 다시 현탁시킵니다. 다음으로, 막 단백질을 약 25 밀리리터에서 재현탁된 막에 가용화합니다.

마지막 제정성 농도가 2%DDM 바위 DDM 바위 4 섭씨 온도에 혼합물 DDM 분리기의 면전에서 2 시간 외피 후에 2 시간 동안 혼합물, 40 분 동안 분 당 000 교체 티타늄 I 6 4 7 0.5 회전자에 있는 4 섭씨 온도에 혼합물이다 그래야 10%DDM의 6 밀리리터를 추가하십시오. 불용성 단백질에서 가용성 단백질 세제 복합체를 분리하기 위해. 정제에 사용하기 위해 Mex B 단백질 세제 복합체를 포함하는 앙와위 natant를 저장하고, Mex B 단백질 세제 복합체를 포함하는 supine natant를 Resus 현탁액 완충액에서 2 밀리리터의 lon 금속 친화력 비드와 혼합하고, 단백질을 수지에 결합 한 후 섭씨 4도의 롤러에서 1 시간 동안 배양합니다.

슬러리를 중력 흐름 컬럼 본체에 붓고 흐름을 버립니다. 20ml 또는 10 컬럼 용량의 iMac 바인딩으로 컬럼을 세척하고 컬럼 세척이 완료되면 버퍼를 세척합니다. 결합된 단백질을 10ml의 iMac 용리 완충액으로 용리시킵니다.

각 용리 분획의 10마이크로리터 샘플을 채취합니다. 10마이크로리터의 2배 SDS 샘플, 완충 및 10% 폴리 아크릴아미드에서 분석합니다. SDS 젤.

각 분수에서 mex B의 양과 순도를 추정합니다. Mex B 단백질 세제 복합체를 포함하는 분획을 당겨 섭씨 4도의 스핀 농축기에 농축합니다. 이 단계에서 단백질이 침전되지 않도록 주의하십시오.

몇 번의 짧은 스핀을 사용하고 강수량을 관찰하십시오. 각 스핀 후에는 겔 여과 컬럼을 사용하여 풀링된 분획을 정제합니다. 슈퍼 로즈 12 HL 30 over 10 컬럼을 24ml의 러닝 버퍼로 사전 평형화하고 평평한 기준선을 기다립니다.

다음으로, 실행 중인 버퍼로 액터 시스템 로딩 루프를 헹굽니다. 단백질을 컬럼에 적용하기 전에 주사기 필터를 사용하여 단백질 용액을 여과합니다. 그런 다음 최대 240마이크로리터의 단백질 용액을 밀리리터당 최대 5mg의 단백질이 있는 컬럼에 로드합니다.

1.5 컬럼 부피의 버퍼를 실행하고 0.25 밀리리터 분획을 수집합니다. XB 단백질 세제 복합체는 약 10-15 ml의 용리 부피에서 피크로 용리됩니다. 피크 분율의 5마이크로리터 샘플을 채취합니다.

각 샘플을 2회 SDS 샘플 버퍼와 1:1로 혼합합니다. 10%poly 아크릴아미드 젤에 양을 견적하기 위하여 표본을 분석하고 각 분획에 있는 저 Mex B의 순수성은, 순수한 ME B.This 많은 아크릴아미드 젤에서 당겨진 조각으로 iMac 란 및 젤 여과 란에서 개인적인 조각으로 적재되었습니다. 젤 여과 란 후에, 단백질은 kumasi 얼룩이 진 많은 아크릴아미드 젤에 순수하게 나타납니다.

겔 여과 컬럼의 트레이스는 컬럼에서 용리되는 단백질 세제 복합체의 주요 피크를 보여줍니다. mxb 단백질의 평균 수율은 2개의 XYT 배양 6리터당 약 2밀리그램입니다. 한 번 숙달되면 이 절차를 적절하게 수행하면 8시간 내에 완료할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 막 단백질을 가용화하고 정제하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.