에듀 신호 증폭 개별 세포 Mitochondrial DNA 복제의 시각화

이 실험 절차의 전반적인 목표는 배양된 뉴런에서 mtDNA 복제를 표지하고 시각화하는 것입니다. 우선 뉴런을 티미딘 유사체인 EDU와 2~24시간 동안 함께 배양하여 이를 수행합니다. 절차의 두 번째 단계는 구리 촉매 공유 결합 반응을 통해 알킨을 포함하는 EDU를 형광 물질인 Oregon Green 488 azide로 표지하는 것입니다.

절차의 마지막 단계는 새로 합성된 MT DNA에 통합된 EDU를 시각화하기 위해 아라미드 신호 증폭 단계를 통해 orgon green 신호를 증폭하는 것입니다. 최종적으로, clicka EDU 화학 반응과 이어지는 tear mind 신호 증폭의 조합을 통해 뉴런의 특정 세포 내 구획에서 일어나는 MT DNA 복제를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. BRDU 라벨링과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 EDU 라벨링이 더 쉽고 완만하여 뉴런 마커의 추가적인 면역형광 염색이 가능하다는 점입니다.

이 방법은 신경세포가 세포체, 축삭, 수지상돌기 및 시냅스 말단을 포함한 세포 내 구획의 변화하는 에너지 부하에 어떻게 대응하는지와 같이 미토콘드리아 수 조절에 관한 핵심적인 질문들에 답할 수 있습니다. 따라서 이 방법은 신경병증 및 신경퇴행을 포함하여 미토콘드리아 기반의 다양한 신경계 질환의 발병 기전에 대한 통찰을 제공할 수 있습니다. 또한 중요하게는, 약물 독성, 암, 노화를 포함하여 미토콘드리아 DNA 복제수 변화가 질병 상태의 발병 기전의 기초가 될 가능성이 높은 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다.

본 영상에서는 멸균된 12 millimeter 유리 커버슬립에서 배양한 후근신경절 뉴런 내에서 새롭게 합성된 미토콘드리아 DNA(M-T-D-N-A로 약칭)를 표지하는 방법을 보여드리겠습니다. 24-well 배양 플레이트에서 Clicka EDO Microplate assay kit의 10 millimolar 5-ethynyl-2'-deoxyuridine(EDU로 약칭) 스톡 용액을 배양액으로 1:100 비율로 희석하여 10 XEDU 스톡을 제조합니다. 그다음 10 XEDU 스톡을 각 웰의 배양액에 직접 첨가합니다. 처리된 뉴런을 흄후드 내 37 °C, 5% CO2 조건에서 2~24시간 동안 배양합니다.

뉴런을 2% Paraform aldehyde에 넣고 상온에서 10~15분 동안 고정합니다. 1X PBS로 2~5분씩 2회 세척합니다. 고정된 뉴런은 신선한 1X PBS에 담아 4°C에서 최대 한 달 동안 보관할 수 있습니다.

동반된 텍스트에 설명된 대로 습윤 챔버를 준비합니다. 끝이 가는 핀셋을 사용하여 양성 및 음성 EDU 대조군을 포함한 고정된 커버슬립 28개를 습윤 챔버 내부의 소수성 파라폼 M 시트로 옮깁니다. 각 커버슬립의 표면을 덮도록 1xPBS 200 ~ 300 µL를 다시 도포합니다.

본문 및 제조사의 지침에 따라 Click-it 분석 키트를 준비하고, 1XPBS에 0.1% Triton X가 포함된 투과성 용액 75~80 µL를 각 커버슬립에 가하여 미토콘드리아 DNA를 표지한 후, 실온에서 10분 동안 배양합니다. 세포 손실 없이 액체를 부드럽게 제거하기 위해 200 µL 팁을 끝에 부착한 벌브 전송 피펫을 사용하십시오.

벌브 피펫을 사용하여 커버를 부드럽게 채웁니다. 200~300 µL의 1x PBS를 흘려보내 이전 용액을 완전히 씻어냅니다. 각 커버슬립을 두 번 세척합니다.

각 커버슬립 위에 신선한 1% hydrogen peroxide in 1X PBS 75 to 80 µL를 피펫으로 분주합니다. 내인성 peroxidase 활성을 억제하기 위해 덮개를 덮은 상태로 실온에서 30분 동안 배양합니다. 이전과 같이 1X PBS로 두 번 헹군 후, 함께 제공된 텍스트에 기술된 상세 내용에 따라 click reaction cocktail을 신선하게 조제합니다.

피펫팅을 통해 위아래로 혼합합니다. 볼텍싱하지 마십시오. 커버슬립당 75 to 80 µL의 click-iT EDU 고정액을 사용하여 뉴런을 후고정하고 실온에서 5분 동안 배양합니다. 후고정 배양 중에 반응 칵테일을 동일한 부피의 click-iT EDU 고정액으로 희석합니다.

각 커버슬립 커버에 반응 칵테일을 첨가하여 빛으로부터 보호하고 실온에서 25분 동안 배양합니다. 에피 형광 현미경 하에서 반응 칵테일을 조심스럽게 제거하고 희석된 1x 블로킹 버퍼로 2회 세척합니다. EDU 염색이 완료되면 핵의 orgon green 염색 여부를 확인합니다.

TSA(termite signal amplification) 단계를 시작하여, 각 커버슬립에 1% TSA 블로킹 용액을 첨가하고 실온에서 30분 동안 배양합니다. 항-이온 그린(antione green) horseradish peroxidase 접합 항체 스톡을 짧게 원심분리합니다. TSA 단계 2~24시간 전에 준비한 1차 항체를 TSA 블로킹 용액으로 1:300으로 희석하고, 볼텍싱하지 말고 도립 혼합하거나 피펫팅하여 섞습니다. 각 커버슬립에 75 µL를 첨가하고 4 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다.

다음 날, 상온에서 1x PBS로 3회 세척합니다. 결합되지 않은 1차 항체가 완전히 제거되도록 마지막 세척 단계에서 커버 슬립을 30~60분 동안 추가로 배양합니다. 사용 직전에 본 프로토콜의 텍스트 부분에 따라 IDE 반응액을 준비합니다.

커버슬립을 IDE 반응액과 함께 실온에서 15분 동안 배양합니다. XPBS로 3가지 세척 과정을 거치며, 이전과 동일하게 현미경 하에서 마지막 세척 단계에서 30분에서 60분 동안 배양합니다. MT DNA 라벨링 여부를 확인하고, DPI가 포함된 ANTIFA 마운팅 매질을 사용하여 성공적으로 염색된 뉴런을 유리 슬라이드에 마운팅합니다. 여기에 제시된 이미지는 분석에 일반적으로 사용되는 배아 및 성체 후근 신경절 뉴런의 대표적인 미분 간섭 대비(differential interference contrast) 이미지입니다.

이 모식도는 MTD NA의 EDU를 녹색 형광 신호로 표지하는 절차를 나타냅니다. 유사분열 활성 상태의 F 11 신경모세포종 세포가 양성 대조군으로 사용되었으며, 명시야 이미지 위에 겹쳐진 이 대표 형광 이미지들은 핵과 미토콘드리아 DNA에 통합된 EDU의 표지 패턴을 보여줍니다. 녹색의 점상 신호는 배아 및 성체 후근신경절 뉴런 모두의 새로 합성된 M-D-D-N-A에 통합되어 증폭된 EDU 신호를 나타냅니다.

EDU 라벨링 절차를 통해 뉴로필라멘트(neurofilament)와 같은 신경세포 마커를 적색으로 면역형광 염색할 수 있습니다. 이 도식도는 EDU와 MTD NA를 적색 형광 신호로 라벨링하는 절차를 나타냅니다. 유사분열 활성 F 11 신경모세포종 세포를 양성 대조군으로 사용하여, 핵 및 미토콘드리아 DNA에 통합된 EDU의 라벨링 패턴을 보여줍니다.

이 도식도는 녹색 또는 적색 형광 신호를 사용하여 새로 합성된 M-T-D-N-A의 BRDU를 라벨링하는 절차를 나타냅니다. 이 절차를 수행할 때, MT DNA 라벨링 시각화를 위한 증폭 단계로 진행하기 전, EDU 라벨링과 세포핵이 성공적으로 나타나는지 확인하기 위해 유사분열 활성 세포를 이용한 대조군 실험을 수행하는 것이 중요합니다. 특정 뉴런 하위 집단이나 뉴런 구획에서 미토콘드리아 DNA 합성이 어떻게 조절되는지와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 표준 면역형광법과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이 기술의 개발로 인해 신경생물학 분야의 연구자들은 정상 생리학 배양 모델뿐만 아니라 질환 상태를 모사한 배양 모델에서 미토콘드리아 수의 조절 기전을 탐구할 수 있는 길을 열게 될 것입니다.

신경학적 상태.