Name: 에듀 신호 증폭 개별 세포 Mitochondrial DNA 복제의 시각화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-15T17:03:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: 학습하세요 에듀 신호 증폭을 이용한 개별 세포 미토콘드리아 DNA 복제 시각화 기법을. 이 방법은 신경세포 내 미토콘드리아 생합성 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 보건 기금의 국립 연구소 NS - 38849과 DK - 076160, 당뇨병의 합병증 연구에 대한 소아 당뇨병 연구 재단 센터에 의해 지원 되었음 : 신경과 연구와 발견과에서 A. 알프레드 타어브먼 의학 연구소에 대한 프로그램 미시간 대학. 이 작품은 형태론과 당뇨병과 소화기 및 신장 질환 국립 연구소에서 보건 부여 5P60 DK - 20572 국립 연구소에 의해 자금 미시간 당뇨병 연구 및 교육 센터의 이미지 분석 코어를 사용했습니다. 저자에 그의 귀중한 조언을 분자 프로브 / Invitrogen에서 스콧 T. 클라크 감사 다양한 클릭 그것이 에듀의 증폭 기술의 초기 개발을 지원하는 키트와 시약의 관대한 기부 라벨 이두.

1. 뉴런의 준비 <ol><li> 도설 루트 신경절 (DRG) 뉴런은 24 웰 플레이트에 문화 멸균 (autoclaved) 12mm 유리 coverslips에서 재배하고 있습니다. </li><li> 이두의 10 MM 재고는 (DMSO, 클릭 IT 에듀 Microplate 어세이 키트)를 (예 : 30 일반적으로 10X 에듀 솔루션 (100 μm의)를 만들어 문화 매체 1:100 희석 후 문화 우물에 1시 10분를 희석합니다 문화 매체 300 μL의 총에 10X 에듀 솔루션)의 μL. DRG의 뉴런은 37에서 10 μm의 정보 에듀의 최종 농도와 incubated 아르 ° C와 5% 2~24시간 사이에 CO 2. 시간의 길이는 치료가 mtDNA 합성의 속도에 영향을 미칠 방법에 따라 달라집니다. </li><li> 4 최대 1 개월에 퓸 후드에서, DRG 뉴런은 실온에서 10-15 분 2 % paraformaldehyde에 고정 각 씻어 1X PBS 2-5분 두 번 씻어 신선한 1X PBS에 저장된 ° C. </li><li> Coverslips가 준비 습기가 실로 미세 밀고 포셉와 함께 전송됩니다 (대비에 대한 검정에 뿌리고 바닥과 코닝 BioAssay 요리, 가벼운 민감한 구성 요소와 물로 포화 Kimwipes와 humidified를 보호하기 위해 알루미늄 호일에 싸서)와 Parafilm M의 시트에 배치 제공 coverslip으로 솔루션 범위를 제한하기 위해 소수성 표면. 아래의 프로토콜은 28 coverslips 위해 설계 및 솔루션는 32 coverslips (14 % 추가 볼륨에 대한) 준비하고 있습니다. 값비싼 또는 제한된 구성 요소와 솔루션은 75-80 μL 각 coverslip에 사용되도록 만들 수 있습니다. 그렇지 않으면, 200-300 μL는 철저하게 이전 솔루션을 씻어 세척 및 차단 솔루션에 대한 사용됩니다. </li><li> 1X PBS 각 coverslip의 표면 (200-300 μL)를 충당하기 위해 다시 적용됩니다. 클릭 IT 분석하고 아래와 제조 업체의 지침에 설명된 tyramide 신호 증폭 키트를 준비합니다. </li></ol> 클릭 IT 에듀 Microplate 어세이 키트의 준비 클릭 IT 에듀 Microplate 분석 키트에서 대부분의 구성 요소와 미리 만들어 4 저장됩니다 ° C [2X 클릭 IT 반응 버퍼 (10X 컴포넌트 E), CuSO4 (100 MM, 구성 요소 F)를 클릭 - IT 이두 정착액 ( 구성 요소 D) 및 차단 버퍼 (2X 구성 요소 H)]. 클릭 IT 에듀 버퍼 첨가제 (10X 구성 요소 G)은 시간이 지남에 따라 노란색 - 갈색 변하는 그것을 방지하기 위해 -20 ° C에 저장됩니다. 이 구성 요소는 반복 동결 - 해동 사이클을 허용합니다. 오레곤 그린 488 azide (컴포넌트 B)은 동결 - 해동 사이클을 최소화하기 위해 작은 aliquots (10-20 μL)으로 나누어 -20 ° C.에 보관해야 안티 - 오레곤 그린 HRP 공액 (구성 요소 I)의 주식 솔루션을 준비하려면, 유리병에 밀리 Q DH 2 O 75 μL를 추가합니다. 거품 방지 및 저장 4 ° C.에 부드러운 pipetting 또는 반전에 의해 믹스 와동하지 마십시오. TSA 키트의 준비 HRP 염소 안티 - 토끼 IgG와 알렉사 플루어 488 Tyramide 키트와 함께 # 12, tyramide 재고 솔루션을 준비하려면, DMSO (구성 요소 B) 150 μL에 (알렉사 플루어 488 tyramide, 구성 요소 A) 고체 물질을 분해. 모든 tyramide 코팅에게 유리병의 측면을 분해하기 위해 유리병 여러 번 반전. ≤ -20에서 작은 aliquots의 상점 재고 솔루션 (10-20 μL) ° C, desiccated과 빛으로부터 보호. 2. 클릭 IT 5 - ethynyl - 2 - deoxyuridine (이두) 레이블 참고 : 모든 솔루션 부드럽게 상실 세포없이 액체를 제거하는 끝에 부착된 200 μL 팁과 벌브 전송 피펫과 함께 제거됩니다. 보통 너무 적극적으로 해결책을 제거하는 진공 라인을 사용하지 마십시오. 전구의 피펫은 부드럽게 철저 이전 솔루션을 씻어 씻으 솔루션의 200-300 μL와 coverslips을 범람하는 데 사용됩니다. <ol><li> 세포는 0.1 % 적용 습한 실내에 상온에서 10 분 1X PBS 용액에서 트리톤 - X - 100 permeabilized 있습니다. 1퍼센트 트리튼 - X - 100 재고 솔루션을 사용합니다. <ul><li> 2700μL 1X PBS로 트리톤 - X - 100 재고 없음 300 μL 1 %를 추가하여 0.1 % 트리톤 - X - 100 3,000 μL를 확인합니다. </li><li> coverslip 당 75-80 μL를 사용하십시오. </li></ul></li><li> 트리톤 X - 100 용액을 제거하고 1X PBS로 두 번 씻어. </li><li> 내생 퍼옥시데이즈 활동은 1 %의 실온에서 30 분 1X PBS 용액에 H 2 O 2에 의해 침묵이다. 1X PBS로 30% H 2 O 2 용액을 희석. 이 솔루션은 신선한되어야하지만 위의 10 분 permeabilization 단계 (단계 3.1) 동안에 만들 수 있습니다. <ul><li> 2900 μL 1X PBS 100 μL 30% H 2 O 2를 추가하여 1 %의 H 2 O 2 3,000 μL를 확인합니다. </li><li> coverslip 당 75-80 μL를 사용하십시오. </li><li> 퍼옥시데이즈 솔루션을 제거하고 1X PBS로 두 번 씻어. </li></ul></li><li> 클릭 IT 이두 반응 <ul><li> 32 coverslips (32 X 80 μL = 들어2560 μL) 2,560 μL의 총 필요합니다. 2X 반응은 반응의 전체 볼륨의 절반이다 1,280 μL에서 이루어집니다. </li><li> 갓 5 분 게시 수정 (아래의 단계 3.5) 시작하기 전에 클릭 IT 반응 칵테일을 준비합니다. </li><li> 최대 pipetting 아래로 칵테일을 섞는다. 이 반응을 할 때 와동하지 마십시오. <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 2 X 반응 칵테일 구성 요소를 클릭합니다 - IT 에듀 Microplate 어세이 키트에서 아르 </td><td> 하프 볼륨 : 1280 μL </td></tr><tr><td> 밀리 Q DH 2 O </td><td> 1132.8 μL </td></tr><tr><td> 2X 클릭 IT 반응 버퍼 (10X 컴포넌트 E) </td><td> 100.3 μL </td></tr><tr><td> 클릭 IT 에듀 버퍼 첨가제 (10X 컴포넌트 G) </td><td> 25.6 μL </td></tr><tr><td> CuSO 4 (100 MM, 컴포넌트 F) </td><td> 25.6 μL </td></tr><tr><td> 오레곤 그린 Azide (구성 요소) </td><td> 6.4 μL </td></tr><tr><td> 합계 </td><td> 1290.7 μL </td></tr></tbody></table> 참고 : 위에서 사용된 볼륨이 클릭 IT 에듀 Microplate 분석 키트 방향에있는 볼륨에 비례합니다. 반응 칵테일의 최종 부피는 1,280 μL보다 약간 더 있습니다. </li><li> 2X 클릭하여이 - IT 반응은 클릭 그것의 동등 볼륨 에듀 정착액 (구성 요소 D) 바로 사용하기 전에 함께 희석 수 있습니다. 이 함께 혼합하면 모든 coverslips에 대한 균일한 반응 솔루션을합니다. </li><li> 1290.7 μL 반응 칵테일에 1290.7 μL 클릭 IT 에듀 정착액을 (구성 요소 D) 추가합니다. coverslip 당 75-80 μL를 사용하십시오. </li></ul></li><li> 클릭 IT 상온에서 5 분 에듀 정착액 (구성 요소 D)과 뉴런을 게시 - 수정. </li><li> 삭제 수정과 (3.4 단계) 위의 반응 칵테일을 추가합니다. 빛과 보호하고 실온에서 25 분 부화 커버. 부드럽게 반응 칵테일을 제거합니다. 희석 1X 차단 버퍼 (2X 구성 요소 H)와 함께 두 번 씻으십시오. <ul><li> MilliQ D H 2 O (2600 μL)의 동일한 볼륨 2,600 μL 차단 버퍼 (2X 구성 요소 H)를 diluting하여 1X 차단 버퍼의 5200 μL를 확인합니다. coverslip 당 75-80 μL를 사용하십시오. </li></ul></li><li> 에피 형광 현미경, mitotically 활성 제어 세포의 핵에있는 오레곤 그린 얼룩 확인하십시오. </li></ol> 3. 에듀 신호의 Tyramide 신호 증폭 (TSA) <ol><li> 각 coverslip에 1% TSA 블록 솔루션을 추가하고 실온에서 30 분 알을 품다. <ul><li> TSA 차단 시약의 0.06 G (TSA 키트 # 12 구성 요소 D)를 무게와 6000 1X PBS μL에 추가 1 % TSA 블록 솔루션의 6000 μL을 만듭니다. 섞어 와동. 1퍼센트 TSA 블록 솔루션에 5 % 염소 혈청 또한 종종 아닌 특정 바인딩을 줄이기 위해 도움이 될 것입니다. </li></ul></li><li> 간단히 방지 오레곤 그린 양고추냉이 퍼옥시데이즈 복합 항체 재고 (클릭 IT 에듀 Microplate 분석의 구성 요소 나), TSA 미리 2~24시간을 준비 스핀. 1퍼센트 TSA 차단 솔루션에서 기본 항체 1:300을 희석하고 반전이나 믹스로 부드럽게하고 아래로 피펫. HRP - 복합 항체를 방해하지 않도록 와동하지 마십시오. 1퍼센트 TSA 블록 솔루션을 제거, 각 coverslip 75 μL를 추가하고 4 박 품어 ° C. <ul><li> 항체가 같은 1:150으로, 더 집중적으로 사용할 수 있지만이 제한 금액을 제공하므로 그것을 아껴서 사용합니다. 다시 1% TSA 블록 솔루션에 5 % 염소 혈청 또한 종종 방지 오레곤 그린 양고추냉이 퍼옥시데이즈 복합 항체가 아닌 특정 바인딩을 줄이기 위해 도움이 될 것입니다. </li><li> 주식 래빗 방지 오레곤 그린 - HRP (의 8.53 μL를 추가하여 1:300 항체 솔루션의 2560 μL 만들기를 누릅니다 - I2560 μL 1퍼센트 TSA 차단 T 에듀 Microplate 어세이). 부드러운 pipetting 또는 역전하여 섞는다. </li></ul></li><li> 다음날 항체 솔루션을 제거하고 1X PBS로 세 번 씻어. 언바운드 기본 항체가 제거되도록 실온에서 추가 30-60분의 최종 세척에 coverslips을 품어. </li><li> 2,560 μL (32 coverslips X 80 μL)에 대한 Tyramide 반응을 준비합니다. <ul><li> 398 μL 증폭 버퍼 (TSA 키트 # 12 컴포넌트 E)로 30% H 2 O 2 (TSA 키트 # 12 구성 요소 F) 2 μL를 추가하여 0.15 % H 2 O 2 용액 (100X) 400 μL 만들기 . 이것은 바로 직전에 필요한하여야한다. </li><li> 2560 μL의 최종 볼륨에 결합 : <ul><li> 25.6 μL Tyramide - 488 (TSA 키트 구성 요소) </li><li> 2508.8 μL 증폭 버퍼 (TSA 키트 구성 요소 E) </li><li> 25.6 μL 0.15 % H 2 O 2 (최종 0.0015 % H 2 O 2 위에서) </li><li> 실온에서 15 분 Tyramide 반응과 1X PBS과 부화를 제거합니다. </li></ul></li></ul></li><li> Tyramide 반응을 제거하고 이전처럼 실온에서 30-60분의 최종 세척의 잠복기, 1X PBS로 세 번 씻어. </li><li> 에피 형광 현미경으로 mtDNA 라벨 확인합니다. <ul><li> 같은 antifade 장착 매체와 유리 현미경 슬라이드에 마운트 coverslips는 DAPI와 골드를 연장. 또는, 에듀 라벨과 증폭이 다른 세포 마커를 라벨 표준 형광등 immunocytochemistry 다음 수 있습니다. </li></ul></li></ol> 4. 대표 결과 : Mitochondrial DNA 복제의 시각화 Mitochondrial Biogenesis의 마커로 우리는 감각 뉴런 (그림 1)는 mitochondria의 수를 조절하는 방법에 관심이 있습니다. 이 프로토콜은 새로운 mitochondria을 측정하는 방법으로 형광 마커와 새로 합성된 mtDNA 레이블을 것입니다. 녹색 형광 신호 (그림 2)와 mtDNA의 라벨에있는 알렉사 - 플루어 488 tyramide 결과 오레곤 그린 - azide와 후속 증폭의 Click 화학 다음에 합성 염기 에듀의 결합. 제대로하면, 증폭 녹색 신호는 형광 배경 (예 : 셀룰러 autofluorescence 또는 HRP - TSA 반응의 부작용 등)보다 충분히 높다. 이 기술은 뉴런 (그림 3)의 subcellular 구획 내에 mtDNA biogenesis를 시각화하고 계량하기 위해 새로 복제 mtDNA 레이블을하도록 설계되었습니다. 에듀 라벨은 neurofilament (그림 3D) 등 다른 세포 마커를 라벨 이후 형광등 immunocytochemistry를 허용합니다. TSA 반응은 이러한 알렉사 플루어 594 - tyramide 등 다른 형광 알렉사 플루어의 tyramides와 함께 할 수 있습니다. 핵에있는 오레곤 그린 - azide 클릭 반응하지만 전에 TSA에 감지됩니다 mtDNA에없이 녹색 신호에서 녹색 형광 신호를 핵이 발생합니다. 알렉사 플루어 594 - tyramide로 증폭이 핵 라벨을 intensifies과 빨간색 형광 신호 (그림 4)와 mtDNA의 통합 에듀를 보여준다. 유사한 증폭 절차가 새로 합성 mtDNA (그림 5)에 BrdU의 설립을 시각화하는 데 사용됩니다 그러나,이 방법은 추가 단계 에듀에 필요한도 않았습니다 가혹한 산성 (HCL) 또는 효소 소화에 의해 BrdU 에피토프를 복구할 필요 라벨. <img src="/files/ftp_upload/2147/2147fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 대표 차등 간섭 대비 (DIC) 배아의 이미지 (왼쪽)와 성인 (오른쪽) 일반적으로 분석. 바 = 10 μm의에 사용되는 등의 루트 신경절 (DRG) 뉴런. <img src="/files/ftp_upload/2147/2147fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 녹색 형광 신호와 mtDNA의 이두를 라벨에 대한 절차를 나타내는 설계도를 그림. 도식은 녹색 형광 신호와 mtDNA의 이두를 라벨에 대한 3 단계 프로토콜을 나타냅니다. Mitotically 활성 F11 neuroblastoma 세포는 긍정적인 제어 역할과 핵 및 mitochondrial DNA에 통합되었다 에듀의 상표 패턴을 보여줍니다. 첫 번째 단계 (P1)은 에듀의 존재의 세포를 잠복기가 새로 합성 mtDNA에 thymidine 아날로그를 포함하는 것입니다. 두 번째 단계 (P2)는 오레곤 그린 - azide와 통합 에듀 레이블을 클릭하여 화학을 기반으로합니다. 녹색 신호는 핵 DNA를 복제 세포의 핵에서 볼 수 있습니다. 마지막 단계는 (P3) 오레곤 할머니를 증폭하는 것입니다오레곤 그린에 대한 HRP - 복합 토끼 항체와 잠복기에 의해 een - azide 신호는 알렉사 플루어 mtDNA에서 녹색 신호를 시각화하는 과산화수소의 존재에 표시된 tyramide 488 (H 2 O 2)와 부화하여 따라갔다. <img src="/files/ftp_upload/2147/2147fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. 지느러미 루트 신경절에서 mtDNA의 에듀 라벨 (DRG) 뉴런. 뉴런은 에듀와 함께 incubated되며 신호가 연속적으로 mtDNA되는 통합 EDU을 나타내기 위해 증폭됩니다. 배아 (A)와 성인 (BD) DRG의 신경 모두 새로 합성된 mtDNA에 포함 증폭 에듀 (EDU - OG - TSA, 녹색)의 작은 반점이있는 녹색 신호를 보여주는 전송 조명에 중첩 대표 형광 이미지. 에듀 라벨 절차는 neurofilament (D, αNF, 빨간색)으로의 연결을 마커의 후속 immunofluorescence 얼룩을 허용합니다. 스케일 바 = 10 μm의. <img src="/files/ftp_upload/2147/2147fig4.jpg" alt="그림 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 4"> 그림 4. 붉은 형광 신호와 mtDNA의 이두를 라벨에 대한 절차를 나타내는 설계도를 그림. 개략도 붉은 형광 신호와 mtDNA의 이두를 라벨에 대한 3 단계 프로토콜을 나타냅니다. Mitotically 활성 F11 neuroblastoma 세포는 긍정적인 제어 역할과 핵 및 mitochondrial DNA에 통합되었다 에듀의 상표 패턴을 보여줍니다. 첫 번째 단계 (P1)은 에듀의 존재의 세포를 잠복기가 새로 합성 mtDNA에 thymidine 아날로그를 포함하는 것입니다. 두 번째 단계 (P2)는 오레곤 그린 - azide와 통합 에듀 레이블을 클릭하여 화학을 기반으로합니다. 녹색 신호는 핵 DNA를 복제 세포의 핵에서 볼 수 있습니다. 마지막 단계는 (P3) 오리건 그린에 대한 HRP - 복합 토끼 항체와 잠복기하여 오레곤 그린 - azide 신호를 증폭하는 것은 알렉사 플루어 시각화하는 과산화수소의 존재에 594 표시 tyramide (H 2 O 2)와 인큐베이션 다음 mtDNA의 빨간 신호. <img src="/files/ftp_upload/2147/2147fig5.jpg" alt="그림 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 5"> 그림 5. BrdU 분류 및 mtDNA에 녹색 또는 빨간색 형광 신호 tyramide 신호 증폭. 설계도 그림 중 녹색 또는 빨간색 형광 신호를 새롭게 합성 mtDNA에 BrdU를 라벨에 대한 절차를 나타냅니다. 초기 단계는 에듀 라벨에 대한 필요하지 않습니다 중 하나 산성 (HCL) 또는 효소 소화에 의해 BrdU 에피토프를 복구해야합니다. 다음 단계는 마우스 기본 방지 BrdU 항체와 잠복기 있습니다. 이 양고추냉이 퍼옥시데이즈 (HRP) 복합 염소 항 마우스 항체와 잠복기옵니다. 마지막으로, 신호는 mtDNA의 신호를 시각화하는 과산화수소의 존재에 녹색 또는 빨간색 찬란 분류 tyramide (H 2 O 2)와 함께 증폭됩니다.

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<li>Magnusson, J., Orth, M., Lestienne, P., Taanman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+of+mitochondrial+DNA+occurs+throughout+the+mitochondria+of+cultured+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell.+Res%22%5BJournal%5D)">Replication of mitochondrial DNA occurs throughout the mitochondria of cultured human cells.</a> Exp. Cell. Res. 289, 133-142 (2003).</li>
<li>Amiri, M., Hollenbeck, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+biogenesis+in+the+axons+of+vertebrate+peripheral+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial biogenesis in the axons of vertebrate peripheral neurons.</a> Dev. Neurobiol. 68, 1348-1361 (2008).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

우리는 이두의 tyramide 신호 증폭을 사용하여 개별 셀을 새로 합성 mtDNA를 라벨에 민감한 분석을 개발했습니다. 이 프로토콜의 최적화 중에 가장 큰 문제 중 하나는 coverslips 사이에 일관성없는 결과가되었다. 변경 사항은 개별 coverslips에 작은 볼륨을 혼합하고 마스터 솔루션은 모든 coverslips에 사용할 수 있도록 피하기 위해 Invitrogen 키트 프로토콜되었다. 각 12mm 원형 유리 coverslip에 사용되는 75-80 μL는 샘플 사이에 일관성있는 결과를 줄 정도로 솔루션을 제공하면서 완전히 표면 영역을 커버하는 이상적인 볼륨입니다. 배양 시간 및 시약의 농도가 최적화된했지만 개선은 그들에게 조정과 함께 볼 수 있습니다. 프로토콜은 한 번 각각의 프로세스를 실행하도록 설계되었습니다. 그러나, 몇 가지 단계는 첫 번째 시도 후 실패 샘플을 복구할 수있는 새로운 솔루션을 반복했습니다. 특히, 에듀 클릭 반응 단계 (3.4-3.6)는 형광 배경에 상당한 증가없이 반복되었습니다. 안티 오레곤 그린 - HRP 항체 보육 (4.1-4.3) 및 tyramide 증폭 (4.4-4.5) 단계는 반복하지만, 더 자주하기 때문에 증가 배경 형광의 노이즈 비율에 가난한 신호를 발생합니다.했습니다 가장 민감한 시약은 클릭 IT 에듀 Microplate 분석 키트에서 클릭 IT 에듀 버퍼 첨가제 (컴포넌트 G)와 토끼 방지 오레곤 그린 - HRP 항체 (구성 요소 I)입니다. ° C 및 6-12 개월 사이가 상당히 어두워 4 저장할 때 클릭 IT 에듀 버퍼 첨가제 점차 시간이 지남에 따라 노란색으로 변합니다. -20 °에서 클릭 IT 에듀 버퍼 첨가제의 스토리지 C는이 문제를 완화합니다. 레이블 및 tyramide 증폭 단계 토끼 방지 오레곤 그린 - HRP 항체가 MilliQ DH 2 O.에서 reconstituting의 4-6개월 이내에 사용할 때 최고의 작품 mtDNA의 이두의 온화 라벨링 추가 셀룰러 마커 9-11과 직접 비교를 허용하고 같은 취급은 복구할 수 있어야합니다 5 - 브로모 - 2 - deoxyuridine (BrdU), 다른 thymidine의 analogs를 통해이 기술의 유틸리티를 향상 DNA 이내에 에피토프. 저희 연구실 11-12과 다른 13-15 성공적으로 mtDNA를 레이블에 BrdU를 사용했습니다. BrdU 라벨 기술은 에듀에 사용되는 것과 비슷하지만 몇 가지 중요한 차이점 (그림 5)을하고 있습니다. 위에 나열된 permeabilization 단계 (3.1-3.2) 후, BrdU 에피토프은 변성 단계로 복구됩니다 (37시 30 분 2 N HCL ° C가 1X PBS 세 세척 다음). BrdU는 다음 BrdU에 대한 일차 항체로 분류된다 (벡터 실험실 TSA 키트에서 1퍼센트 차단 솔루션 1시 50분 희석 4 ° C에서 하룻밤 incubated). 이차 항체 단계 이전에 BrdU 신호 (염소 안티 - 마우스 IgG 1% 차단 솔루션 1:100 희석 TSA 키트 # 2와 # 5에서 HRP을 복합하여 실온에서 45 분 incubated)를 증폭하기 위해 필요 TSA 단계 (위 4.3-4.5). 레이블 mtDNA 두 thymidine의 analogs, 에듀와 BrdU를하는 것이 mtDNA가 순차적으로 펄스 분류 패러다임 11 표시 수있는 이중 레이블 실험을 수행하는 데 유리합니다. 저희 연구실은 당뇨병 신경 장해, 당뇨병의 일반적인 합병증의 맥락에서 mitochondrial biogenesis의 규정을 검토 에듀와 mtDNA의 BrdU 라벨을 사용하고 있습니다. 우리는 성공적으로 개별 뉴런 11-12의 mtDNA biogenesis의 변화를 측정하기 위해 신호 증폭을 사용합니다. 이 기술은 mtDNA 복제 및 매출이나 mtDNA 합성을 억제 약물을 식별을위한 메커니즘을 탐구하기위한 다른 실험에 유용하게 사용될 것입니다. 또한, 확장 에듀와 BrdU 신호의 기본 원리는 다른 연구에 적용할 수 수 측정 DNA 복제 또는 복구합니다.

<table><tbody><tr><td>12 mm 커버슬립</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-82</td><td></td></tr><tr><td>245 mm x 245 mm BioAssay Dish</td><td>Corning</td><td>431111</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Fisher Scientific</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-8532</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS) 10X 용액</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP399</td><td></td></tr><tr><td>전이 피펫</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>과산화수소, 30% 수용액</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2633</td><td></td></tr><tr><td>Click-iT EdU Microplate Assay Kit</td><td>Invitrogen</td><td>C10214</td><td></td></tr><tr><td>TSA Kit #12, HRP&amp;#8212;염소 항-토끼 IgG 및 Alexa Fluor 488 tyramide 포함</td><td>Invitrogen</td><td>T20922</td><td></td></tr><tr><td>TSA Kit #15, HRP&amp;#8211;염소 항-토끼 IgG 및 Alexa Fluor 594 tyramide 포함</td><td>Invitrogen</td><td>T20925</td><td></td></tr><tr><td>DAPI 포함 ProLong Gold 안티페이드 시약</td><td>Invitrogen</td><td>P-36931</td><td></td></tr><tr><td>다클론 토끼 Neurofilament 항체</td><td>Chemicon International</td><td>AB1981</td><td></td></tr><tr><td>마우스 단클론 항-BrdU 항체</td><td>Vector Laboratories</td><td>VP-B209</td><td></td></tr><tr><td>TSA Kit #2, HRP&amp;#8212;염소 항-마우스 IgG 및 Alexa Fluor 488 tyramide 포함</td><td>Invitrogen</td><td>T20912</td><td></td></tr><tr><td>TSA Kit #5, HRP&amp;#8212;염소 항-마우스 IgG 및 Alexa Fluor 594 tyramide 포함</td><td>Invitrogen</td><td>T20915</td><td></td></tr></tbody></table>

에듀 신호 증폭 개별 세포 mitochondrial dna 복제의 시각화

Visualization of Mitochondrial DNA Replication in Individual Cells by EdU Signal Amplification

Mitochondria 세포 에너지와 mitochondrial biogenesis의 핵심 규제 1-3 건강한 세포의 mitochondria 번호를 규제의 필수 구성 요소입니다됩니다. mitochondrial biogenesis 모니터링을위한 하나의 접근 방식은 mitochondrial DNA (mtDNA) 복제 4의 속도를 측정하는 것입니다. 우리는 mtDNA의 biogenesis를 공부하기 위해서는 각각의 세포에서 새로 합성 mtDNA를 라벨에 민감한 기술을 개발했습니다. 기술은 뉴런의 subcellular 구획 내에 mtDNA 복제를 시각화하는 tyramide 신호 증폭 (TSA) 8 프로토콜 5월 5일에서 7일까지 - ethynyl - 2&#39; - deoxyuridine (EDU)의 결합이 결합되어 있습니다. 5-7 레이블 에듀에 초기 클릭 반응 BrdU 에피토프 노출에 필요한 거친 산성 트리 트먼트 또는 효소가 소화를 요구하지 않기 때문에 에듀는 등 5 브로모 - 2 - deoxyuridine (BrdU) 같은 다른 thymidine의 analogs에 우수합니다 . 이두의 milder 라벨링은 다른 세포 마커 9-10와의 정관의 직접 비교하실 수 있습니다. mtDNA의 biogenesis를 시각화하고 계량하는 능력은 mitochondrial biogenesis 조절하고 약물 독성, 노화, 암 및 neurodegenerative 질병와 관련된 pathogenesis에 대한 통찰력을 제공하는 데 사용되는 메커니즘을 조사를위한 필수 도구를 제공합니다. 우리의 기술은 감각 뉴런뿐만 아니라 다른 세포 유형에 적용됩니다. mtDNA의 biogenesis를 측정하는이 기법의 사용은 모두 정상 세포 생리학뿐만 아니라 장애인 질병 상태에 대한 이해를 발전에 중요한 의미가 있습니다.

우리는 mtDNA의 biogenesis를 공부하기 위해서는 각각의 세포에서 새로 합성된 DNA mitochondrial (mtDNA)를 라벨에 민감한 기술을 개발했습니다. 기술은 뉴런의 subcellular 구획 내에 mtDNA 복제를 시각화하는 tyramide 신호 증폭 (TSA) 프로토콜과 함께 에듀의 결합이 결합되어 있습니다.

에듀 신호 증폭 개별 세포 Mitochondrial DNA 복제의 시각화

미토콘드리아는 세포 에너지의 핵심 조절자이며, 미토콘드리아 생합성은 건강한 상태에서 미토콘드리아 수를 조절하는 필수적인 구성 요소입니다...

이 실험 절차의 전반적인 목표는 배양된 뉴런에서 mtDNA 복제를 표지하고 시각화하는 것입니다. 우선 뉴런을 티미딘 유사체인 EDU와 2~24시간 동안 함께 배양하여 이를 수행합니다. 절차의 두 번째 단계는 구리 촉매 공유 결합 반응을 통해 알킨을 포함하는 EDU를 형광 물질인 Oregon Green 488 azide로 표지하는 것입니다.절차의 마지막 단계는 새로 합성된 MT DNA에 통합된 EDU를 시각화하기 위해 아라미드 신호 증폭 단계를 통해 orgon green 신호를 증폭하는 것입니다. 최종적으로, clicka EDU 화학 반응과 이어지는 tear mind 신호 증폭의 조합을 통해 뉴런의 특정 세포 내 구획에서 일어나는 MT DNA 복제를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. BRDU 라벨링과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 EDU 라벨링이 더 쉽고 완만하여 뉴런 마커의 추가적인 면역형광 염색이 가능하다는 점입니다.이 방법은 신경세포가 세포체, 축삭, 수지상돌기 및 시냅스 말단을 포함한 세포 내 구획의 변화하는 에너지 부하에 어떻게 대응하는지와 같이 미토콘드리아 수 조절에 관한 핵심적인 질문들에 답할 수 있습니다. 따라서 이 방법은 신경병증 및 신경퇴행을 포함하여 미토콘드리아 기반의 다양한 신경계 질환의 발병 기전에 대한 통찰을 제공할 수 있습니다. 또한 중요하게는, 약물 독성, 암, 노화를 포함하여 미토콘드리아 DNA 복제수 변화가 질병 상태의 발병 기전의 기초가 될 가능성이 높은 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다.본 영상에서는 멸균된 12 millimeter 유리 커버슬립에서 배양한 후근신경절 뉴런 내에서 새롭게 합성된 미토콘드리아 DNA(M-T-D-N-A로 약칭)를 표지하는 방법을 보여드리겠습니다. 24-well 배양 플레이트에서 Clicka EDO Microplate assay kit의 10 millimolar 5-ethynyl-2'-deoxyuridine(EDU로 약칭) 스톡 용액을 배양액으로 1:100 비율로 희석하여 10 XEDU 스톡을 제조합니다. 그다음 10 XEDU 스톡을 각 웰의 배양액에 직접 첨가합니다. 처리된 뉴런을 흄후드 내 37 °C, 5% CO2 조건에서 2~24시간 동안 배양합니다.뉴런을 2% Paraform aldehyde에 넣고 상온에서 10~15분 동안 고정합니다. 1X PBS로 2~5분씩 2회 세척합니다. 고정된 뉴런은 신선한 1X PBS에 담아 4°C에서 최대 한 달 동안 보관할 수 있습니다.동반된 텍스트에 설명된 대로 습윤 챔버를 준비합니다. 끝이 가는 핀셋을 사용하여 양성 및 음성 EDU 대조군을 포함한 고정된 커버슬립 28개를 습윤 챔버 내부의 소수성 파라폼 M 시트로 옮깁니다. 각 커버슬립의 표면을 덮도록 1xPBS 200 ~ 300 µL를 다시 도포합니다.본문 및 제조사의 지침에 따라 Click-it 분석 키트를 준비하고, 1XPBS에 0.1% Triton X가 포함된 투과성 용액 75~80 µL를 각 커버슬립에 가하여 미토콘드리아 DNA를 표지한 후, 실온에서 10분 동안 배양합니다. 세포 손실 없이 액체를 부드럽게 제거하기 위해 200 µL 팁을 끝에 부착한 벌브 전송 피펫을 사용하십시오.벌브 피펫을 사용하여 커버를 부드럽게 채웁니다. 200~300 µL의 1x PBS를 흘려보내 이전 용액을 완전히 씻어냅니다. 각 커버슬립을 두 번 세척합니다.각 커버슬립 위에 신선한 1% hydrogen peroxide in 1X PBS 75 to 80 µL를 피펫으로 분주합니다. 내인성 peroxidase 활성을 억제하기 위해 덮개를 덮은 상태로 실온에서 30분 동안 배양합니다. 이전과 같이 1X PBS로 두 번 헹군 후, 함께 제공된 텍스트에 기술된 상세 내용에 따라 click reaction cocktail을 신선하게 조제합니다.피펫팅을 통해 위아래로 혼합합니다. 볼텍싱하지 마십시오. 커버슬립당 75 to 80 µL의 click-iT EDU 고정액을 사용하여 뉴런을 후고정하고 실온에서 5분 동안 배양합니다. 후고정 배양 중에 반응 칵테일을 동일한 부피의 click-iT EDU 고정액으로 희석합니다.각 커버슬립 커버에 반응 칵테일을 첨가하여 빛으로부터 보호하고 실온에서 25분 동안 배양합니다. 에피 형광 현미경 하에서 반응 칵테일을 조심스럽게 제거하고 희석된 1x 블로킹 버퍼로 2회 세척합니다. EDU 염색이 완료되면 핵의 orgon green 염색 여부를 확인합니다.TSA(termite signal amplification) 단계를 시작하여, 각 커버슬립에 1% TSA 블로킹 용액을 첨가하고 실온에서 30분 동안 배양합니다. 항-이온 그린(antione green) horseradish peroxidase 접합 항체 스톡을 짧게 원심분리합니다. TSA 단계 2~24시간 전에 준비한 1차 항체를 TSA 블로킹 용액으로 1:300으로 희석하고, 볼텍싱하지 말고 도립 혼합하거나 피펫팅하여 섞습니다. 각 커버슬립에 75 µL를 첨가하고 4 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다.다음 날, 상온에서 1x PBS로 3회 세척합니다. 결합되지 않은 1차 항체가 완전히 제거되도록 마지막 세척 단계에서 커버 슬립을 30~60분 동안 추가로 배양합니다. 사용 직전에 본 프로토콜의 텍스트 부분에 따라 IDE 반응액을 준비합니다.커버슬립을 IDE 반응액과 함께 실온에서 15분 동안 배양합니다. XPBS로 3가지 세척 과정을 거치며, 이전과 동일하게 현미경 하에서 마지막 세척 단계에서 30분에서 60분 동안 배양합니다. MT DNA 라벨링 여부를 확인하고, DPI가 포함된 ANTIFA 마운팅 매질을 사용하여 성공적으로 염색된 뉴런을 유리 슬라이드에 마운팅합니다. 여기에 제시된 이미지는 분석에 일반적으로 사용되는 배아 및 성체 후근 신경절 뉴런의 대표적인 미분 간섭 대비(differential interference contrast) 이미지입니다.이 모식도는 MTD NA의 EDU를 녹색 형광 신호로 표지하는 절차를 나타냅니다. 유사분열 활성 상태의 F 11 신경모세포종 세포가 양성 대조군으로 사용되었으며, 명시야 이미지 위에 겹쳐진 이 대표 형광 이미지들은 핵과 미토콘드리아 DNA에 통합된 EDU의 표지 패턴을 보여줍니다. 녹색의 점상 신호는 배아 및 성체 후근신경절 뉴런 모두의 새로 합성된 M-D-D-N-A에 통합되어 증폭된 EDU 신호를 나타냅니다.EDU 라벨링 절차를 통해 뉴로필라멘트(neurofilament)와 같은 신경세포 마커를 적색으로 면역형광 염색할 수 있습니다. 이 도식도는 EDU와 MTD NA를 적색 형광 신호로 라벨링하는 절차를 나타냅니다. 유사분열 활성 F 11 신경모세포종 세포를 양성 대조군으로 사용하여, 핵 및 미토콘드리아 DNA에 통합된 EDU의 라벨링 패턴을 보여줍니다.이 도식도는 녹색 또는 적색 형광 신호를 사용하여 새로 합성된 M-T-D-N-A의 BRDU를 라벨링하는 절차를 나타냅니다. 이 절차를 수행할 때, MT DNA 라벨링 시각화를 위한 증폭 단계로 진행하기 전, EDU 라벨링과 세포핵이 성공적으로 나타나는지 확인하기 위해 유사분열 활성 세포를 이용한 대조군 실험을 수행하는 것이 중요합니다. 특정 뉴런 하위 집단이나 뉴런 구획에서 미토콘드리아 DNA 합성이 어떻게 조절되는지와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 표준 면역형광법과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이 기술의 개발로 인해 신경생물학 분야의 연구자들은 정상 생리학 배양 모델뿐만 아니라 질환 상태를 모사한 배양 모델에서 미토콘드리아 수의 조절 기전을 탐구할 수 있는 길을 열게 될 것입니다.신경학적 상태.

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학습하세요 에듀 신호 증폭을 이용한 개별 세포 미토콘드리아 DNA 복제 시각화 기법을. 이 방법은 신경세포 내 미토콘드리아 생합성 연구에 활용됩니다.

에듀 신호 증폭 개별 세포 Mitochondrial DNA 복제의 시각화

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